CS259230B1 - Myší lymfocytámy hybridóm produkujúci monoklonálne protilátky proti virusu Newcastleskej choroby - Google Patents

Description

Ž59230

Vynález sa týká myšieho lymfocytárneho hybridórau produktujúceho monoklonálne protilátkyproti virusu Newcastleskej choroby.

Doposial sa protilátky proti virusu Newcastleskej choroby pripravujú tak, že virussa injikuje pokusným zvieratám, najmS králikom a ovčiam. Vzhladom na to, že nestačí jednadávka virusu pre vyvolanie dostatočne vysokej protilátkovej odpovede, je potřebné hoinjikovať viackrát opakované v různých dávkách a časových intervaloch. Sérum takto imunizova-ných zvierat slúži ako zdroj protilátok najmS pri diagnostickom vyšetřovaní chovov hydiny.Zmienený postup imunizácie má niekolko nevýhod. Získává sa heterogénna zmes protilátok,ktorej rozloženie sa v organizme producenta mění, je velmi různorodé, kvalitativně akvantitativné kolíše od jedného odběru po druhý a je neopakovatelné.

Okrem toho sérum obsahuje vela protilátok proti nežiadúcim prímesiam, ktoré sa nachádzajúvo vírusovom materiál! použitom pre imunizáciu. V důsledku toho je potřebné séra upravovatzložitými postupmi, čím získáváme heterogénne a neštandardné preparáty. Využivatelnosttakto připraveného diagnostického séra je znížená aj tým, že jeho Specifické polyklonálneprotilátky sú z hladíska interakcie s vírusom velmi různorodé. Naviac přípravu virusu preimunizačné účely je nákladná.

Hybridům NDV-NTP-1 bol připravený známým spůsobom, klonováním skupiny hybridómov v mSkkomagare, vzniklých fúziou buniek myšej 2-amíno-6-hydroxy-8-azapurin /8-azagua'nín/ rezistentnějmyelómovej linie označenej NSO a slezinových buniek inbrednej linie myší BALB/c, imunizova-ných purifikovaným vírusom NDV, kmeň L Kansas /G. Kůhler, C. Milstein, G. W. Butcher, J. C.Howard: Nátuře 286, 550 /1977//.

Uvedené nevýhody v podstatnéj miere odstraňuje vynález, ktorého podstata spočívá v myšomlymfocytárnom hybridóme NDV-NTP-1, produkujúcom monoklonálnu protilátku podtriedy IgGl,kappa, viažucu virus Newcastleskej choroby. Tento hybridům je uložený vo Virologickom ústaveSAV, Mlýnská dolina 1, 817 03 Bratislava. Výhodou hybridňmu je, že produkuje izotypovo a idiotypovo homogénnu protilátku, tzv.monoklonálnu protilátku, ktorá Specificky sa viaže s vírusom Newcastleskej choroby a týmje ho možné použit na jeho identifikáciu vo vyšetřovaných vzorkách z různých chovov hydiny.

Jednobunkový lymfocytárny hybridům NDV-NTP-1 rastie in vivo v peritoneálnej dutiněBALB/c myší za súčasnej tvorby ascites. Rastie aj in vitro v kultivačných médiach vhodnýchpre živočišné buňky. Taktiež po zmrazení a uložení v tekutom dusíku a po opStovnom rozmraženísi zachovává svoju schopnoť produkovat monoklonálnu protilátku viažucu virus Newcastleskejchoroby. Neobsahuje na rozdiel od konvenčných antisér nevhodné, balastné protilátky. Příklad 1

Pre přípravu hybridnej bunkovej linie sa použije 2.107 buniek myšej 2-amino-6-hydroxy--8-azapurín /8-azaguanin/ rezistentnej myelómovej bunkovej linie, ktoré sa pomocou 1 ml p 50 % hirot. polyetylénglykolu spoja s 1.10 slezinových lymfoidných buniek myši imunizovanej10 jig virusu. V priebehu 14 dní vyrastú pod selektívnym tlakom kyseliny 4-amino-pteroyl-glutámovej /aminopterinu/ hybridně buňkové linie, ktoré produkujú monoklonálne protilátkyproti virusu Newcastleskej choroby, ktoré sa s nim viažu, ale neovplyvňujú jeho biologickúaktivitu.

Tieto buňky sa potom klónujú tka, že sa zmieša 0,5 % hmot. agaru s 5.10® až 10.10® myších slezinových buniek v médiu RPMI 1 640, ktoré obsahuje 100 mg.ml-1 tetrahydrátu dusičnanu — 1 —1 —1 vápenatého, 2 000 mg.ml D-glukózy, 100 mg.ml heptahydrátu síranu horečnatého, 400 mg.ml chloridu draselného, 1 512 mg.ml-1 hydrogenfosforečnanu sodného, 6 000 mg.ml-1 monohydrátu dihydrogenfosforečnanu sodného, 100 mg.ml-1 kyseliny 2-amino-5-guanidínovalérovej /arginínu/, 50 mg.ml-1 kyseliny 2-aminosukcínamovej /asparagínu/, 20 mg.ml“1 kyseliny 2-aminojantárovej 3 259230 /kyseliny asparágovej/, 50 mg.ml 1 kyseliny 3* , 3'-ditiobis/2-aminopropánovej/ /cystínu/, 20 mg.ml-1 kyseliny 2-aminoglutárovej /kyseliny glutamovej/, 300 mg.ml-·1 kyseliny 2-amino-glutarámove j /glutamínu/, 1 mg.ml 1 kyseliny 2-aminoglutaraminyl-2-merkaptopropionyl-amino-octovéj /glutationu t j . glutaminyl-cysteinyl-glycínu/, 10 mg.ml-''’ kyseliny aminooctovej/glycínu/, 15 mg.ml 1 kyseliny alfa-amino-l-imidazol-4-propiónovej /histidínu/, 50 mg.ml-1kyseliny 2-amino-3-metylvalérovej /izoleucínu/, 50 mg.ml-'1' kyseliny 2-amino-4-metylvalérove j/leucínu/, 40 mg.ml 1 kyseliny 2,6-diaminohexánovej /lyzínu/, 15 mg.ml-1 kyseliny 2-amino--4-/metyltio/-máslovéj /metioninu/, 15 mg.ml 1 kyseliny 2-amino-3-fenylpropiónovej /fenyl-alanínu/, 20 mg.ml x kyseliny 2-pyrolidínkarboxylovej /prolinu/, 30 mg.ml-'1' kyseliny 2- -amino-3-hydroxypropiónovej /serínu/, 20 mg.ml-'1' kyseliny 2-amino-3-hydroxymaslovej /treonínu/, -1 -15 mg.ml kyseliny 2-amino-3/3-indolyl/propionovej /tryptofánu/, 20 mg.ml kyseliny 2- -amino-3-/4-hydroxyfenyl/-propiónovej /tyrozínu/, 20 mg.ml 1 kyseliny 2-amino-3-metylmaslovej/valínu/, 0,2 mg.ml-1' kyseliny 5-/2-oxoimidazolidíno/4,5-c/tiol-2-yl/pentánovej /biotínu/, 0,005 mg.ml-·1 kobalt alfa/afla-/5,6-dimetylbenzimidazolyl//-kobalt-beta-kyanokobamidVitamínu B^j/, 0,250 mg.ml-1 D-N-/2,4-dihydroxy-3,3-dimetylbutyryl/-beta-2-aminopropionátvápenatý /pantotenát vápenatý/, 3 mg.ml-1 2-hydroxyetyltrimetylamóniumchlorid /oholinchlorid/, 1 mg.ml 1 kyseliny N-/2-amino-4-hydroxypteridín-6-ylmetyl/-p-aminobenzoovej /kyseliny -1 -1listovej/, 35 mg.ml /1,2,3,5/4,6/cyklohexándexol/ /myoinozitolu/, 1 mg.ml pyridin-3--karboxyamidu /nikotínamidu/, 1 mg.ml 1 kyseliny 4-aminobenzoovej /kyseliny p-aminobenzoovej/, 1 mg.ml-1 3-hydroxy-4,5-bis/hydroxymetyl/2-metylpyridínchloridu /pyridoxínchloridu/, 0,2 mg.ml-1 7,8-dimetyl-10-/l'-D-ribityl/izoaloxazínu /riboflavínu/, 1 mg.ml-1 3-/4-amino-2--metyl-pyrimidyl-5-metyl/-5-/2-hydroxyetyl/-4-metyltiazolu /tiamínchloridu/, 2 000 mg.ml 1hydrogenuhličitanu sodného doplnenom s 2 mmol kyseliny 2-aminoglutarámovej /glutamínu/, 5.10-5 mol 2-merkaptoetanolu, 100 jug.ml-1 0-alfa-L-2-deoxy-2-/metylamino/-glukopyranozyl-/-l-2/-0-alfa-L-deoxy-3-C-formyllyxofuranozyl-/1-4/-1,3-deoxy-l,3-diguanidosoyloinozitsulfátu/streptomycínsulfátu/, 100 jednotiek na mililiter kyseliny 6-/N-fenylacetoamido/-penicilánovej/penicilínu G/, 1 mmol kyseliny N-2-hydroxyetylpiperazín-N'-2-etán sulfónovej /Hepesu/sa rozpustí v trikrát redestilovanej vodě a doplní trikrát redestilovanou vodou na objem900 ml roztoku, ktorý sa doplní 100 ml normálneho inaktivovaného koňského séra. Výsledné pH takto připraveného kultivačného média je 7,2. Po zatuhnutí agaru sa navrstvu 0,5 % hmot. agaru nanesie 100 hybridných buniek v 0,25 % hmot. agare. Po 10 dňochvyrastú kolonie, ktoré sa pomnožia v médiu RPMI 1 640 doplnenom s 2 mmol kyseliny 2-amino-glutarámovej /glutamínu/, 5.10-® mol 2-merkaptoetanolu, 100 jug.ml 1 0-alfa-L-2-deoxy-2-/metyl-amino/-glukopyranozy1-/1-2/-0-afla-L-deoxy-3-C-formyllyxofuranozy1-/1-4/-1,3-deoxy-l,3--diguanidoscyloinozitsulfátu /streptomycínsulfátu/, 100 jednotiek na mililiter kyseliny6-/N-fenylacetamido/-penicilánovej /penicilínu G/, 1 mmol kyseliny N-2-hydroxyetylpiperazín--N'-2-etánsulfónovej /Hepesu/ sa rozpustí v trikrát redestilovanej vodě a doplní třikrátredestilovanou vodou na objem 900 ml roztoku, ktorý sa doplní 100 ml normálneho inaktivované-ho koňského séra. Výsledné pH takto připraveného kultivačného média je 7,2. V 1 ml kultivačného médiasa nachádza 350 až 700 tisíc hybridómov NDV-NTP-1 produkujúcich 10 až 100 jug monoklonálnejIgGl, kappa, protilátky. Příklad 2

Postupuje sa ako v příklade 1 s tým rozdielom, že sa v kultivačnom médiu použijenepredtestované běžné telacie fetálne sérum,. Do takto připraveného kultivačného prostřediapřenesené buňky po fúzii nie sú schopné rást a produkovat monoklonálne protilátky.

Myší lymfocytárny hybridóm NDV-NTP-1 sa kultivuje pri teplotě 37 °C. Stredný generačnýčas je 22,4 h, modálny počet chromozómov je 24 mesiacov po fúzii 73 chromozómov. Produkovanámonoklonálna protilátka je myší imunoglobulín triedy IgGl, kappa.

Claims (1)

1. 259230 Monoklonálna protilátka produkovaná myším lymfooytárnym hybridómom NDV-NTP-1 móžebyt použitá vo veterinátnej praxi pre zistovanie virusu Newcastleskej choroby v chovochhydiny. PREDMET VYNALEZU Myší lymfocytárny. hybridóm NDV-NTP-1, produkujúci monoklonálne protilátky proti virusuNewcastleskej choroby, podtriedy IgGl, kappa. Severografia, n. p., MOST Cena 2,40 Kčs