CS259233B1 - Myší lymfocytámy hybridóm produkujúci monoklonálnu protilátku proti MSBI íymfoblastoidnej bunkovej linii - Google Patents

Abstract

Očelom riešenia je příprava izotypovo a idiotypovo homogénnej protilátky o vysokej čistotě. Uvedeného účelu sa dosiahne použitím myšieho lymfocytárneho hybridómu MSB-NTP-1, produkujúeeho monoklonálnu protilátku rozpoznávajúcu povrchové antigény Íymfoblastoidnej bunkovej linie označenej skratkou MSBI. Myší lymfocytámy hybridóm má použitie vo veterinárnej medicíně.

Description

Vynález sa týká myšieho lymfocytárneho hybridómu produkujúceho monoklonálnu protilátku rozpoznávejúcu povrchové antigény lymfoblastoidnej buňkovéj linie označenéj skratkou MSB1.

Doposial sa protilátky proti lymfoblastoidnej buňkovéj linii MSB1, ktorá nesie na svojom povrchu diagnostický antigén MATSA připravovali tak, že sa pokusným zvieratám /králík, ovca/ aplikovali živé MSBl buňky. Vzhladom na to, že nestačí jedna dávka buniek pre vyvolanie dostatočne vysokej protilátkovej odpovede, je potřebné ich injikovat viackrát opakované v rdznych dávkách a časových intervaloch. Sérum takto imunizovaných zvierat slúži ako zdroj protilátok najmS pri diagnostickém vyšetřovaní chovov hydiny. Zmienený postup imunizácie má niekolko nevýhod. Získává sa heterogénna zmes protilátok, ktorých rozloženie sa v organizme producenta mění, je velmi rĎznorodé, kvalitativně a kvantitativné kolíše od jedného odběru po druhý a je neopakovatelné. Okrem toho sérum obsahuje nežiadúce protilátky proti povrchovým antigénom, ktoré sa vyskytujú aj na.normálnych buňkách. V dósledku toho je potřebné séra upravovat zložitými postupmi vysýtenia pomocou normálnych slezinových buniek tak, aby sérum obsahovalo protilátky len proti povrchovým antigénom lymfoblastoidnej buňkové j linie označenéj skratkou MSBl.

Touto úpravou dochádza k velkým stratám na sére a výraznému zníženiu titra Specifických protilátok. Pochopitelné proces vysýtenia nie je možné Standardizovat, v důsledku čoho sa i tak vysoká heterogenita konvenčných sér ešte prehlbi. Okrem toho využitelnosť takto připraveného diagnostického séra je znížená aj tým, že jeho Specifické polyklonálne protilátky sú z hladiska interakcie s povrchovými buňkovými antigénmi velmi různorodé. Naviac příprava dostatočného množstva lymfoblastoidných buniek MSBl pre imunizačné účely je náročná na technické vybavenie pracoviska, kvalifikovaný personál a finančně prostriedky.

Hybridóm MSB-NTP-2 bol připravený známým spůsobom, klonováním skupiny hybridómov v mSkkom agare, vzniklých fúziou buniek myšej 2-amino-hydroxy-8-azapurfn /8-azaguanín/ rezistentnej myelómovej linie označenej NSO a slezinových buniek inbrédnej linie myši BALB/c, imunizovaných lymfoblastoidnou buňkovou líniou MSBl /G. Kčhler, C. Milstein,

G. W. Butcher, J. C. Howard: Nátuře 286, 550 /1977//.

Uvedené nevýhody v podstatnej miere odstraňuje vynález, ktorého podstata spočívá v myšom lymfocytárnom hybridóme MSB-NTP-2 produkujúcom monoklonálnu protilátku podtriedy IgGl, kappa, rozpoznávájúcu povrchové antigény lymfoblastoidnej buňkovéj linie označenej skratkou MSBl. Tento hybridóm je uložený vo Virologickom ústave SAV, Mlýnská dolina 1,

817 03 Bratislava.

Výhodou hybridómu je že produkuje izotypovo homogénnu protilátku, tzv. monoklonálnu protilátku, ktorá rozpoznává povrchové antigény lymfoblastoidnej bunkovej linie označenej skratkou MSBl a tým je ju možné použit v diagnostických testoch vyhladávajúcich protilátky proti nádorovým antigénom asociovaným s Marekovou chorobou. Jednobunkový lymfocytárny hybridóm MSB-NTP-2 rastie in vivo v peritoneálnej dutině BALB/c myši za súčasnej tvorby ascites.

Rastie aj in vitro v kultivačných médiách vhodných pre živočišné buňky. Taktiež po zmrazení a uložení v tekutom dusíku a ophtovnom rozmražení si zachovává svoju schopnost produkovat monoklonálnu protilátku rozpoznávajúcu povrchové antigény lymfoblastoidnej bunkovej linie označenej skratkou MSBl. Neobsahuje' na rozdiel od konvenčných antisér nevhodné, nešpecifické, balastné protilátky.

Příklad 1

Pre přípravu hybridnej bunkovej linie sa použije 2.10? buniek myšej 2-amino-6-hydroxy-8-azapurin /8-azaguanín/ rezistentnej myelómovej bunkovej linie, ktoré sa pomocou 1 ml g

% hmot. polyetylénglykolu spoja s 1.10 slezinových lymfoidných buniek myši imunizovanej

O

3.10 MSBl lymfoblastoidných buniek. V priebehu 14 dní vyrastú pod selektívnym tlakom kyseliny

4-amino-pteroylglutámovej /aminopterinu/ hybridně buňkové linie, ktoré produkujú monoklonálne protilátky rozpoznávejúce povrchové antigény lymfoblastoidnej bunkovej linie označenej skratkou MSBl.

Tieto buňky sa potom klónujú tak, že sa zmieša 0,5 % hmot. agaru s 5.10⁶ až 10.10⁶ myších slezinových buniek v médiu RPMI 1 640, ktoré obsahuje 100 mg.ml^-1 tetrahydrátu dusičnanu vápenatého, 2 000 mg.ml^-1 D-glukózy, 100 mg.ml^-1 heptahydrátu síranu horečnatého,

400 mg.ml ’ chloridu draselného, 1 512 mg.ml ’ hydrogenfosforečnanu sodného, 6 000 mg.ml”''' monohydrátu dihydrogenfosforečnanu sodného, 100 mg.ml^-1 kyseliny 2-amino-5-guanidínovalérovej /arginínu/, 50 mg.ml ’ kyseliny 2-aminosukcínamovej /asparagínu/, 20 mg.ml^-’ kyseliny 2-aminojantárove j /kyseliny asparágovej/, 50 mg.ml^-1 kyseliny 3*,3'-ditiobis/2-aminopropánovej/, /cystínu/, 20 mg.ml ¹ kyseliny 2~aminoglutárovej /kyseliny glútamovej/, 300 mg.ml^-'’' kyseliny 2-aminoglutarámovej /glutamínu/, 1 mg.ml^-1 kyseliny 2-aminoglutaraminyl-2-merkaptopropionyl-aminooctovej /glutationu t j. glutaminyl-cysteinyl-glycínu/, 10 mg.ml^-'’· kyseliny aminooctovej /glycínu/, 15 mg.ml^-1 kyseliny α-amino-l-imidazol-propiónovej /histidínu/, 50 mg.ml^-1 kyseliny 2-amino-3-metylvalérovej /izoleucínu/, 50 mg.ml^-1 kyseliny 2-amino-4-metylvalérovej /leucínu/, 40 mg.ml ¹ kyseliny 2,6-diaminohexánovej /lyzínu/, 15 mg.ml^-1 kyseliny 2-amino-4-/metyltio/maslovej /metionínu/, 15 mg.ml ’ kyseliny 2-amino-3-fenylpropiónovej /fenylalanínu/, 20 mg.ml ’ kyseliny 2-pyrolidínkarboxylovej /prolinu/, 30 mg.ml^-'’' kyseliny 2-amino-3-hydroxypropiónovej /serínu/, 20 mg.ml^-1 kyseliny 2-amino-3-hydroxymaslovej /treonínu/, mg.ml ¹ kyseliny 2-amino-3-/3-indolyl/propiónove j /tryptofanu/, 20 mg.ml^-'’' kyseliny 2-amino-3/4-hydroxyfenyl/-propiónovej /tyrozínu/, 20 mg.ml^-1 kyseliny 2-amino-3-metylmaslovej /valínu/, 0,2 mg.ml ¹ kyseliny 5-/2-oxoimidazolidíno/4,5-c/tiol-2-yl/pentánovej /biotínu/,

0,005 mg.ml ¹ kobalt«/W-/5,6-dimetylbenzimidazolyl//-kobalt(5-kyanokobamid vitamínu B,-/,

0,250 mg.ml D-N-/2,4-dihydroxy-3,3-dimetylbutyryl/-3-2-aminopropionát vápenatý /pantotenát vápenatý/, 3 mg.ml ’ 2-hydroxyetyltrimetylamóniumchlorid /cholínchlorid/, 1 mg.ml^-'’' kyseliny N-/2-amino-4-hydroxypteridin-6-ylmetyl/-p-aminobenzoovej /kyseliny listovej/, 35 mg.ml^-'’' /1,2,3,5/4,6/cyklohexándexol/ /myoinozitolu/, 1 mg.ml^-’' pyridin-3-karboxyamidu /nikotinamidu/, 1 mg.ml^-’ kyseliny 4-aminobenzoovej /kyseliny p-aminobenzoovej/, 1 mg.ml^-’ 3-hydroxy-4,5-bis/hydroxymetyl/-2-metylpyridínchloridu /pyridoxínchloridu/, 0,2 mg.ml^-’ 7,8-dimetyl-10~/l-D-ribytil/izoaloxazínu /riboflavínu/, 1 mg.ml^-’ 3-/4-amino-2-metyl-pyrimidyl-5~metyl/-5-/2-hydroxyetyl/-4-metyltiazolu /tiamínchloridu/, 2 000 mg.ml^-’ hydrogenuhličitanu sodného -5 doplnenom s 2 mmol kyseliny 2-aminoglutarámovej /glutamínu/, 5.10 mol 2-merkaptoetanolu,

100 jug.ml^-’ 0-K-L-2-deoxy-2-/metylamino/-glukopyranozyl-/l-2/-0-fc-L-deoxy-3-C-formyllyxofuranozy1-/1-4/-1,3-deoxy-l,3-diguanidoscyloinozitsulfátu /streptomycínsulfátu/, 100 jednotiek na mililiter kyseliny 6-/N-fenylacetoamido/-penicilánovej /penicilínu G/, 1 mmol kyseliny N-2-hydroxyetylpiperazín-N-2-etán sulfonovej /Hepesu/ sa rozpustí v trikrát redestilovanej vodě a doplní trikrát redestilovanou vodou na objem 900 ml roztoku, ktorý sa doplní 100 ml normálneho inaktivovaného koňského séra.

Výsledné pH takto připraveného kultivačného média je 7,2. Po zatuhnutí agaru sa na vrstvu 0,5 % hmot. agaru nanesie 100 hybridných buniek v 0,25 % hmot. agare. Po 10 dňoch vyrastú kolonie, ktoré sa pomnožia v médiu RPMI 1 640 doplnenom s 2 mmol kyseliny 2-amimoglutarámovej /glutamínu/, 5.10^-^ mol 2-merkapťoetanolu, 100 jug.ml^-’ 0-ft-L-2-deoxy-2-/metylamino/ -glukopyranozy1-/1-2/-0(X-L-deoxy-3-formyllyxofuranozyl-/1-4/-1,3-deoxy-l,4-diguanidoscyloinozitsulfátu /streptomycínsulfátu/, 100 jednotiek na mililiter kyseliny 6-/N-fenylacetamido/-penicilánovej/ /penicilínu G/, 1 mmol kyseliny N-2-hydroxyetylpiperazín-N-2-etán sulfonovej /Hepesu/ sa rozpustí v trikrát redestilovanej vodě a doplní trikrát redestilovanou vodou na objem 900 ml roztoku, ktorý sa doplní 100 ml normálneho inaktivovaného koňského séra.

Výsledné pH takto připraveného kultivačného média je 7,2. V 1 ml kultivačného média sa nachádza 350 až 700 tisíc hybridómov MSB-NTP-2 produkujúcich 10 až 100 jug monoklonálnej IgGl, kappa, protilátky rozpoznávajucej povrchové antigény lymfoblastoidnej bunkovej linie označenéj skratkou MSB1.

Příklad 2

Postupuje sa tak ako v příklade 1 s tým rozdielom, že sa v kultivačnom médiu použije ' nepredtestované běžné telacie fetálne sérum. Do takto připraveného kultivačného prostredia přenesené buňky po fúzii nie sú schopné rást a produkovat monoklonálne protilátky.

Myší lymfocytámy hybridóm MSB-NTP-2 sa kultivuje pri teplote 37 °C. Stredný generačný čas je 20 hodin modálny počet ohromozómov je 24 mesiacov po fúzii 75 chromozómov. Produkovaná monoklonálna protilátka je myší imunoglobulin rozpoznávájúci povrchové antigény lymfoblastoidnej bunkovej linie označenej skratkou MSB1, .triedy IgGl, kappa.

I

Monoklonálna protilátka produkovaná myším lymfooytárnym hybridómom MSB-NTP-2-móže byt použitá vo veterinárskej praxi pri vyšetřovaní a diferenciálnej diagnostike nádorových ochorení hydiny.

Claims (1)

1. PREDMET VYNÁLEZU

   Myši lymfocytámy hybridóm MSB-NTP-2, produkujúci monoklonálnu protilátku proti MSB1, lymfoblastoidnej bunkovej linii, podtriedy IgGl, kappa.