CS259232B1 - Myáf lymfocytámy hybridóm produkujúci monoklonálnu protilátku proti povrchovým antigóňom lymfocytov hydiny - Google Patents

Abstract

Očelom riešenia je příprava izotypovo a idiotypovo homogénnej protilátky o vysokej čistotě. Uvedeného účelu sa dosiahne použitím myšieho lymfocytárneho hybridómu MSB-NTP-3 produkujúceho monoklonálnu protilátku rozpoznávejúcu povrchové antigény lymfoblastoidnej bunkovej linie označenej skratkou MSB1 a normálnych slezinových buniek hydiny. Myší lymfocytámy hybridóm má použitie vo veterinárněj medicíně.

Description

Vynález sa týká myšieho lymfocytárneho hybrldomu produkujúceho monoklonálnu protilátku rozpoznávajúcu povrchové antigény lymfoblastoidnej bunkovej linie označenej skratkou MSB1 a normálnych slezinových buniek hydiny.

Doposial sa protilátky proti lymfoblastoidnej bunkovej linii MSB1, ktorá nesie na svojom povrchu diagnostický antigén MATSA připravovali tak, že sa pokusným zvieratám /králik, ovca/ aplikovali živé MSB1 buňky. Vzhládom na to, že nestačí jedna dávka buniek pre vyvolanie dostatočne vysokej protilátkovej odpovede, je potřebné ich injikovať viackrát opakované v róznych dávkách a časových intervaloch. Sérum takto imunizovaných zvierat slúži ako zdroj protilátok najmS pri diagnostickom vyšetřovaní ohovov hydiny. Zmienený postup imunizácie má niekolko nevýhod. Získává sa heterogénna zmes protilátok, ktorých rozloženie sa v organizme producenta mění, je velmi róznorodé, kvalitativně a kvantitativné kolíše od jedného odběru po druhý a je neopakovatelné. Okrem toho sérum obsahuje nežiadúoe protilátky proti povrchovým antigénom, ktoré sa vyskytujú aj na normálnych buňkách. V dósledku toho je potřebné séra upravovat zložitými postupmi vysýtenia, aby sérum obsahovalo protilátky len proti povrchovým antigénom lymfoblastoidnej bunkovej linie označenej skratkou MSB1 a normálnýoh slezinových buniek hydiny.

Touto úpravou dochádza k velkým stratám na sére a výraznému zníženiu titra Specifických protilátok. Pochopitelné proces vysýtenia nie je možné Standardizovat, v důsledku čoho sa i tak vysoká heterogenita konvenčnýoh sér ešte prehlbi. Okrem toho využitelnost takto připraveného diagnostického séra je znížená aj tým, že jeho Specifické polyklonálne protilátky sú z hladiska interakcie s povrchovými buňkovými antigénmi velmi různorodé. Naviac příprava dostatočného množstva lymfoblastoidných buniek MSB1 pre imunizačné účely je náročná na technické vybavenie pracoviska, kvalifikovaný personál a finančně prostriedky.

Hybridom MSB-NTP-3 bol připravený známým spósobom, klonováním skupiny hybridómov v mSkkom agare, vzniklých fúziou buniek myšej 2-amino-6-hydroxy-8-azapurín /8-azaguanín/ rezistentnej myelómovej linie označenej NSO a slezinových buniek inbrednej linie myší BALB/c, imunizovaných lymfoblastoidnou buňkovou líniou MSB1 /G. Kóhler, C. Milstein,

G. W. Butcher, J. C. Howard: Nátuře 286, 550 /1977//.

Uvedené nevýhody v podstatnej miere odstraňuje vynález, ktorého podstata spočívá v myšom lymfocytárnom hybridóme MSB-NTP-3, produkujúcom monoklonálnu protilátku rozpoznávajúcu povrchové antigény lymfoblastoidnej bunkovej linie označenej skratkou MSB1 a normálnych slezinových buniek, podtriedy IgGl, kappa. Tento hybridom je uložený vo Virologiftkom ústave SAV, Mlýnská dolina 1, 817 03 Bratislava.

Výhodou hybridómu je že produkuje izotypovo homogénnu protilátku, tzv. monoklonálnu protilátku, ktorá rozpoznává povrchové antigény lymfoblastoidnej bunkovej linie označenej skratkou M3B1 a normálnych slezinových buniek hydiny. Jednobunkový lymfocytárny hybridom MSB-NTP-3 rastie in vivo v peritoneálnej dutině BALB/c myší za súčasnej tvorby ascites.

Rastie aj in vitro v kultivačných médiách vhodných pre živočišné buňky. Taktiež po zmrazení a uložení v tekutom dusíku a opStovnom rozmražení si zachovává svoju schopnost produkovat monoklonálnu protilátku rozpoznávajúcu povrchové antigény lymfoblastoidnej bunkovej linie označenej skratkou MSB1 a normálnych slezinových buniek hydiny. Neobsahuje na rozdiel od konvenčných antisér nevhodné, nešpecifické, balastné protilátky.

Příklad 1

Pre přípravu hybridnej bunkovej linie sa použije 2.10? buniek myšej 2-amino-6-hydroxy-8-azapurín /8-azaguanín/ rezistentnej myelómovej bunkovej linie, ktoré sa pomocou 1 ml p

% hmot. polyetylénglykolu spoja s 1.10 slezinových lymfoidných buniek myši imunizovanej

Q

3.10 MSB1 lymfoblastoidných buniek. V priebehu 14 dní vyrastú pod selektívnym tlakom kyseliny

4-amino-pteroylglutámovej /aminopterínu/ hybridně buňkové linie, ktoré produkujú monoklonálne protilátky rozpoznávajúo povrchové antigény lymfoblastoidnej bunkovej linie označenej skratkou MSB1 a normálnych - o-lnových buniek hydiny.

259232 6 fí

Tieto buňky sa potom klónujú tak, že sa zmieša 0,5 % hmot. agaru s 5.10 až 10.10 myších slezinových buniek v médiu RPMI 1 640, ktoré obsahuje 100 mg.ml“¹ tetrahydrátu dusičnanu vápenatého, 2 000 mg.ml ¹ D-glukózy, 100 mg.ml ¹ heptahydrátu síranu horečnatého,

400 mg.ml ¹ chloridu draselného, 1 512 mg.ml ¹ hydrogenfosforečnanu sodného, 6 000 mg.ml^-1 monohydrátu dihydrogenfosforečnanu sodného, 100 mg.ml^-1 kyseliny 2-amino-5-guanidínovalérovej /arginínu/, 50 mg.ml ¹ kyseliny 2-aminosukcinamovej /asparagínu/, 20 mg.ml^-1 kyseliny 2-aminojantarovej /kyseliny asparágovej/, 50 mg.ml^-1 kyseliny 3',3'-ditiobis/2-aminopropánovej/, /cystínu/, 20 mg.ml^-1 kyseliny 2-aminoglutárovej /kyseliny glutamovej/,- 300 mg.ml^-1 kyseliny 2-aminoglutarámovej /glutamínu/, 1 mg.ml”¹ kyseliny 2-aminoglutaraminyl-2-merkaptopropionyl-aminooctovej /gjutationu tj. glutaminyl-cysteinyl-glycínu/, 10 mg.ml^-1 kyseliny aminooctovej /glycínu/, 15 mg.ml”¹ kyseliny α-amino-l-imidazol-propiónovej /histidfnu/, 50 mg.ml“¹ kyseliny 2-amino-3-metylvalérovej /izoleucínu/, 50 mg.ml”¹ kyseliny 2-amino-4-metylvalérovej /leucínu/, 40 mg.ml”¹ kyseliny 2,6-diaminohexánovej /lyzínu/, 15 mg.ml^-1 kyseliny 2-amino-4-/metyltio/maslovej /metionínu/, 15 mg.ml”¹ kyseliny 2-amino-3-fenylpropiónovej /fenylalanínu/, 20 mg.ml”¹ kyseliny 2-pyrolidínkarboxylovej /prolinu/, 30 mg.ml^-1 kyseliny 2-amino-3-hydroxypropiónovej /serínu/, 20 mg.ml ¹ kyseliny 2-amino-3-hydroxymaslovej /treonínu/j 5 mg.ml kyseliny 2-amino-3-/3-indolyl/propionovej /tryptofanu/, 20 mg.ml kyseliny 2-amino-3/4-hydroxyfenyl/-propiónovej /tyrozínu/, 20 mg.ml ¹ kyseliny 2-amino-3-metylmaslovej /valfhu/, 0,2 mg.ml”¹ kyseliny 5-/2-oxoimidazolidíno/4,5-c/tiol-2-yl/pentánovej /biotínu/,

0,005 mg.ml”¹ kobalt<X/K-/5,6-dimetylbenzimidazolyl//-kobaltβ-kyanokobamid vitamínu Bj^/,

0,250 mg.ml^-1 D-N-/2,4-dihydroxy-3,3-dimetylbutyryl/-p-2-aminopropionát vápenatý /pantotenát vápenatý/, 3 mg.ml”¹ 2-hydroxyetyltrimetylamóniumchlorid /cholinchlorid/, 1 mg.ml”¹ kyseliny N-/2-amino-4-hydroxypteridín-6-ylmetyl/-p-aminobenzoovej /kyseliny listovéj/, 35 mg.ml”¹ /1,2,3,5/4,6/cyklohexándexol/ /myoinozitolu/, 1 mg.ml”¹ pyridin-3-karboxyamidu /nikotínamidu/, 1 mg.ml“¹ kyseliny 4-aminobenzoovej /kyseliny p-aminobenzoovej/, 1 mg.ml ¹ 3-hydroxy-4,5-bis/hydroxymetyl/-2-metylpyridínchloridu /pyridoxínchloridu/, 0,2 mg.ml”¹ 7,8-dimetyl-10-/l'-D-ribityl/izoaloxazinu/riboflavínu/, 1 mg.ml”¹ 3-/4-amino-2-metyl-pyrimidyl-5-metyl/-5-/2-hydroxyetyl/-4-metyltiazolu /tiamínchloridu/, 2 ,000 mg.ml ¹ hydrogenuhličitanu sodného doplnenom s 2 mmol kyseliny 2-aminoglutarámovej /glutamínu/, 5.10 mol 2-merkaptoetanolu,

100 pg.ml^-1 0-B-L-2-deoxy-2-/metylamino/~glukopyranozyl-/l-2/-0-«-L-deoxy-3-C-formyllyxofuranozyl-/l-4/-l,3-deoxy-l,3-diguanidoscyloinozitsulfátu_/streptomycínsulfátu/, 100 jednotiek na mililiter kyseliny 6-/N-fenylacetoamido/-penicilánovej /penicilínu G/, 1 mmol kyseliny N-2-hydroxyetylpiperazín-N'-2-etán sulfonovej /Hepesu/ sa rozpustí v trikrát redestilovanej vodě a doplní trikrát redestilovanou vodou na objem 900 ml roztoku, ktorý sa doplní 100 ml normálneho inaktivovaného koňského séra.

Výsledné pH takto připraveného kultivačného média je 7,2. Po zatuhnutí agaru sa na vrstvu 0,5 % hmot. agaru nanesie 100 hybridných buniek v 0,25 % hmot. agare. Po 10 dňoch vyrastú kolonie, ktoré sa pomnožia v médiu RPMI 1 640 doplnenom s 2 mmol kyseliny 2-amimoglutarámovej /glutamínu/, 5.10^-^ mol 2-merkapto$tanolu, 100 jug.ml ¹ 0-K-L-2-deoxy~2-/metylamino/-glukopyranozyl-/1-2/-0-a-L-deoxy-3-C-formyllyxofuranozyl-/1-4/-1,3-deoxy-l,4-diguanidoscyloinozitSulfátu /streptomycínsulfátu/, 100 jednotiek na mililiter kyseliny 6-/N-fenylaceta~ miďo/-penicilánovej/ /penicilínu G/, 1 mmol kyseliny N-2-hydroxyetylpiperazín-N'-2-etán sulfonovej /Hepesi|/ sa rozpustí v trikrát redestilovanej vodě a doplní trikrát redestilovanou vodou na objem 900 ml roztoku, ktorý sa doplní 100 ml normálneho inaktivovaného koňského séra.

Výsledné pH takto připraveného kultivačného média je 7,2. V 1 ml kultivačného média sa nachádza 350 až 700 tisíc hybridómov MSB-NTP-3 produkujúcich 10 až 100 jug monoklonálnej IgGl, kappa, protilátky rozpoznávajucej povrchové antigény lymfoblastoidnej bunkovej linie označenej skratkou MSB1 a normálnych slezinových buniek.

Příklad 2

Postupuje sa tak ako v příklade 1 s tým rozdielom, že sa v kultivačnom médiu použije nepredtestované běžné telacie fetálne sérum. Do takto připraveného kultivačného prostredia přenesené buňky po fúzii .nie sú schopné rást a produkovať monoklonálne protilátky.

Myší lymfocytárny hybridóm MSB-NTP-3 sa kultivuje pri teplote 37 °C. Stredný generačný čas je 19,4 hodin, modálny počet chromozómov je 24 mesiacov po fúzii 78 chromozómov. Produkovaná monoklonálna protilátka je myší imunoglobulln rozpoznávajúci povrchové antigény lymfoblastoidnej bundovéj linie označenej skratkou MSB1 a normálnych slezinových buniek hydiny, triedy IgGl, kappa.

Monoklonálna protilátka produkovaná myším lymfocytárnym hybridómom MSB-NTP-3-mÓže být použitá vo veterinárskej praxi pri vyšetřování a diferenciálnej diagnostike nádorových ochorení hydiny.

Claims (1)

1. Myši lymfocytárny hybridóm MSB-NTP-3, produkujúci monoklonálnu protilátku proti povrchovým antigénom lymfocytov hydiny, podtriedy IgGl, kappa.