CS259232B1 - Myáf lymfocytámy hybridóm produkujúci monoklonálnu protilátku proti povrchovým antigóňom lymfocytov hydiny - Google Patents

Description

259232

Vynález sa týká myšieho lymfocytárneho hybridómu produkujúceho monoklonálnu protilátkurozpoznávajúcu povrchové antigény lymfoblastoidnej bunkovej linie označenej skratkou MSB1a normálnych slezinových buniek hydiny.

Doposial sa protilátky proti lymfoblastoidnej bunkovej linii MSB1, ktorá nesie na svojompovrchu diagnostický antigén "MATSA" připravovali tak, že sa pokusným zvieratám /králik,ovca/ aplikovali živé MSB1 buňky. Vzhladom na to, že nestačí jedna dávka buniek pre vyvolaniedostatočne vysokej protilátkovej odpovede, je potřebné ich injikovať viackrát opakovanév různých dávkách a časových intervaloch. Sérum takto imunizovaných zvierat slúži ako zdrojprotilátok najma pri diagnostickom vyšetřovaní chovov hydiny. Zmienený postup imunizáciemá niekolko nevýhod. Získává sa heterogénna zmes protilátok, ktorých rozloženie sa v orga-nizme producenta mění, je velmi různorodé, kvalitativně a kvantitativné kolíše od jednéhoodběru po druhý a je neopakovatelné. Okrem toho sérum obsahuje nežiadúce protilátky protipovrchovým antigénom, ktoré sa vyskytujú aj na normálnych buňkách. V důsledku toho jepotřebné séra upravovat zložitými postupmi vysýtenia, aby sérum obsahovalo protilátky lenproti povrchovým antigénom lymfoblastoidnej bunkovej linie označenej skratkou MSB1 a normál-ných slezinových buniek hydiny.

Touto úpravou dochádza k velkým stratám na sére a výraznému zníženiu titra Specifickýchprotilátok. Pochopitelné proces vysýtenia nie je možné Standardizovat, v důsledku čoho sai tak vysoká heterogenita konvenčných sér ešte prehlbi. Okrem toho využitelnost takto přip-raveného diagnostického séra je znížená aj tým, že jeho Specifické polyklonálne protilátkysú z hladiska interakcie s povrchovými buňkovými antigénmi velmi různorodé. Naviac pripravadostatočného množstva lymfoblastoidných buniek MSB1 pre imunizačné účely je náročná na tech-nické vybavenie pracoviska, kvalifikovaný personál a finančné prostriedky.

Hybridóm MSB-NTP-3 bol připravený známým spůsobom, klonováním skupiny hybridómovv mSkkom agare, vzniklých fúziou buniek myšej 2-amino-6-hydroxy-8-azapurín /8-azaguanín/rezistentnej myelómovej linie označenej NSO a slezinových buniek inbrednej linie myšíBALB/c, imunizovaných lymfoblastoidnou buňkovou líniou MSB1 /G. Kůhler, C. Milstein, G. W. Butcher, J. C. Howard: Nátuře 286, 550 /1977//.

Uvedené nevýhody v podstatnéj miere odstraňuje vynález, ktorého podstata spočíváv myšom lymfocytárnom hybridóme MSB-NTP-3, produkujúcom monoklonálnu protilátku rozpoznávajúcupovrchové antigény lymfoblastoidnej bunkovej linie označenej skratkou MSB1 a normálnychslezinových buniek, podtriedy IgGl, kappa. Tento hybridóm je uložený vo Virologičkom ústaveSAV, Mlýnská dolina 1, 817 03 Bratislava. Výhodou hybridómu je že produkuje izotypovo homogénnu protilátku, tzv. monoklonálnuprotilátku, ktorá rozpoznává povrchové antigény lymfoblastoidnej bunkovej linie označenejskratkou M3B1 a normálnych slezinových buniek hydiny. Jednobunkový lymfocytárny hybridómMSB-NTP-3 rastie in vivo v peritoneálnej dutině BALB/c myší za súčasnej tvorby ascites.

Rastie aj in vitro v kultivačných médiách vhodných pre živočišné buňky. Taktiež po zmrazenía uložení v tekutom dusíku a opStovnom rozmražení si zachovává svoju schopnost produkovatmonoklonálnu protilátku rozpoznávajúcu povrchové antigény lymfoblastoidnej bunkovej linieoznačenej skratkou MSB1 a normálnych slezinových buniek hydiny. Neobsahuje na rozdiel odkonvenčných antisér nevhodné, nešpecifické, balastné protilátky. Příklad 1

Pre přípravu hybridnej bunkovej linie sa použije 2.10? buniek myšej 2-amino-6-hydroxy--8-azapurín /8-azaguanín/ rezistentnej myelómovej bunkovej linie, ktoré sa pomocou 1 ml p 50 % hmot. polyetylénglykolu spoja s 1.10 slezinových lymfoidných buniek myši imunizovanej

Q 3.10 MSB1 lymfoblastoidných buniek. V priebehu 14 dní vyrastú pod selektivnym tlakom kyseliny 4-amino-pteroylglutámovej /aminopterínu/ hybridně buňkové linie, ktoré produkujú monoklonál- ne protilátky rozpoznávajúo povrchové antigény lymfoblastoidnej bunkovej linie označenej skratkou MSB1 a normálnych - '<··inových buniek hydiny. 2592326 fí

Tieto buňky sa potom klónujú tak, že sa zmieša 0,5 % hmot. agaru s 5.10 až 10.10myších slezinových buniek v médiu RPMI 1 640, ktoré obsahuje 100 mg.ml“1 tetrahydrátudusičnanu vápenatého, 2 000 mg.ml 1 D-glukózy, 100 mg.ml 1 heptahydrátu síranu horečnatého, 400 mg.ml 1 chloridu draselného, 1 512 mg.ml 1 hydrogenfosforečnanu sodného, 6 000 mg.ml-1monohydrátu dihydrogenfosforečnanu sodného, 100 mg.ml-1 kyseliny 2-amino-5-guanidínovalé-rovej /argininu/, 50 mg.ml 1 kyseliny 2-aminosukcinamovej /asparagínu/, 20 mg.ml-1 kyseliny2-aminojantarovej /kyseliny asparágovej/, 50 mg.ml-1 kyseliny 3',3'-ditiobis/2-aminopropánovej/,/cystínu/, 20 mg.ml-1 kyseliny 2-aminoglutárovej /kyseliny glutamovej/,- 300 mg.ml-1 kyseliny2-aminoglutarámovej /glutamínu/, 1 mg.ml”1 kyseliny 2-aminoglutaraminyl-2-merkaptopropionyl--aminooctovej /gjutationu tj. glutaminyl-cysteinyl-glycínu/, 10 mg.ml-1 kyseliny amino-octovej /glycínu/, 15 mg.ml”1 kyseliny α-amino-l-imidazol-propiónovej /histidínu/, 50 mg.ml“1kyseliny 2-amino-3-metylvalérovej /izoleucínu/, 50 mg.ml”1 kyseliny 2-amino-4-metylvalérovej/leucínu/, 40 mg.ml”1 kyseliny 2,6-diaminohexánovej /lyzinu/, 15 mg.ml-1 kyseliny 2-amino--4-/metyltio/maslovej /metionínu/, 15 mg.ml”1 kyseliny 2-amino-3-fenylpropiónovej /fenylalaní-nu/, 20 mg.ml”1 kyseliny 2-pyrolidinkarboxylovej /prolinu/, 30 mg.ml-1 kyseliny 2-amino--3-hydroxypropiónovej /serínu/, 20 mg.ml 1 kyseliny 2-amino-3-hydroxymaslovej /treonínu/j5 mg.ml kyseliny 2-amino-3-/3-indolyl/propionovej /tryptofanu/, 20 mg.ml kyseliny 2-amino- -3/4-hydroxyfenyl/-propiónovej /tyrozínu/, 20 mg.ml 1 kyseliny 2-amino-3-metylmaslovej /va-lfnu/, 0,2 mg.ml”1 kyseliny 5-/2-oxoimidazolidíno/4,5-c/tiol-2-yl/pentánovej /biotínu/, 0,005 mg.ml”1 kobalt«/K-/5,6-dimetylbenzimidazolyl//-kobaltβ-kyanokobamid vitamínu Bj^/, 0,250 mg.ml-1 D-N-/2,4-dihydroxy-3,3-dimetylbutyryl/-p-2-aminopropionát vápenatý /pantotenátvápenatý/, 3 mg.ml”1 2-hydroxyetyltrimetylamóniumchlorid /cholínchlorid/, 1 mg.ml”1 kyselinyN-/2-amino-4~hydroxypteridín-6-ylmetyl/-p-aminobenzoovej /kyseliny listovéj/, 35 mg.ml”1/1,2,3,5/4,6/cyklohexándexol/ /myoinozitolu/, 1 mg.ml”1 pyridin-3-karboxyamidu /nikotínamidu/,1 mg.ml“1 kyseliny 4-aminobenzoovej /kyseliny p-aminobenzoovej/, 1 mg.ml 1 3-hydroxy--4,5-bis/hydroxymetyl/-2-metylpyridínchloridu /pyridoxínchloridu/, 0,2 mg.ml”1 7,8-dimetyl--10-/l'-D-ribityl/izoaloxazinu/riboflavfnu/, 1 mg.ml”1 3-/4-amino-2-metyl-pyrimidyl-5-metyl/- -5-/2-hydroxyetyl/-4-metyltiazolu /tiamínchloridu/, 2 ,000 mg.ml 1 hydrogenuhličitanu sodného -5 doplnenom s 2 mmol kyseliny 2-aminoglutarámovej /glutamínu/, 5.10 mol 2-merkaptoetanolu, 100 jug.ml”1 0-B-L-2-deoxy-2-/metylamino/-glukopyranozyl-/l-2/-0-«-L-deoxy-3-C-formyllyxo-furanozyl-/1-4/-1,3-deoxy-l,3-diguanidoscyloinozitsulfátu_/streptomycínsulfátu/, 100 jednotiekna mililiter kyseliny 6-/N-fenylacetoamido/-penicilánovej /penicilínu G/, 1 mmol kyselinyN-2-hydroxyetylpiperazín-N'-2-etán sulfonovej /Hepesu/ sa rozpustí v trikrát redestilovanejvodě a doplní trikrát redestilovanou vodou na objem 900 ml roztoku, ktorý sa doplní 100 mlnormálneho inaktivovaného koňského séra. Výsledné pH takto připraveného kultivačného média je 7,2. Po zatuhnutí agaru sa navrstvu 0,5 % hmot. agaru nanesie 100 hybridných buniek v 0,25 % hmot. agare. Po 10 dňochvyrastú kolonie, ktoré sa pomnožia v médiu RPMI 1 640 doplnenom s 2 mmol kyseliny 2-amimo-glutarámovej /glutamínu/, 5.10-^ mol 2-merkaptoetanolu, 100 jug.ml 1 0-W-L-2-deoxy~2-/metylami-no/-glukopyranozyl-/1-2/-0-a-L-deoxy-3-C-formyllyxofuranozyl-/1-4/-1,3-deoxy-l,4-diguanidoscy-loinozitSulfátu /streptomycínsulfátu/, 100 jednotiek na mililiter kyseliny 6-/N-fenylaceta~miďo/-penicilánovej/ /penicilínu G/, 1 mmol kyseliny N-2-hydroxyetylpiperazín-N'-2-etánsulfonovej /Hepesi|/ sa rozpustí v trikrát redestilovanej vodě a doplní trikrát redestilovanouvodou na objem 900 ml roztoku, ktorý sa doplní 100 ml normálneho inaktivovaného koňskéhoséra. Výsledné pH takto připraveného kultivačného média je 7,2. V 1 ml kultivačného médiasa nachádza 350 až 700 tisíc hybridómov MSB-NTP-3 produkujúcich 10 až 100 jug monoklonálnejIgGl, kappa, protilátky rozpoznávajucej povrchové antigény lymfoblastoidnej bunkovej linieoznačenej skratkou MSB1 a normálnych slezinových buniek. Příklad 2

Postupuje sa tak ako v příklade 1 s tým rozdielom, že sa v kultivačnom médiu použijenepredtestované běžné telacie fetálne sérum. Do takto připraveného kultivačného prostrediapřenesené buňky po fúzii .nie sú schopné rást a produkovat monoklonálne protilátky.

Claims (1)

1. 259232 Myší lymfocytárny hybridóm MSB-NTP-3 sa kultivuje pri teplote 37 °C. Stredný generačnýčas je 19,4 hodin, modálny počet chromozómov je 24 mesiacov po fúzii 78 chromozómov. Produ-kovaná monoklonálna protilátka je myší imunoglobulín rozpoznávajúci povrchové antigénylymfoblastoidnej bundovéj linie označenej skratkou MSB1 a normálnych slezinových buniekhydiny, triedy IgGl, kappa. Monoklonálna protilátka produkovaná myším lymfocytárnym hybridómom MSB-NTP-3-mÓže býtpoužitá vo veterinárskej praxi pri vyšetřování a diferenciálnej diagnostike nádorových ocho-rení hydiny. P R E D Μ E T VYNALEZU Myši lymfocytárny hybridóm MSB-NTP-3, produkujúci monoklonálnu protilátku protipovrchovým antigénom lymfocytov hydiny, podtriedy IgGl, kappa. Severografia, n. p., MOST Cena 2,40 Kčs