CS259233B1 - Myší lymfocytámy hybridóm produkujúci monoklonálnu protilátku proti MSBI íymfoblastoidnej bunkovej linii - Google Patents

Description

259233

Vynález sa týká myšieho lymfocytárneho hybridómu produkujúceho monoklonálnu protilátkurozpoznávejúcu povrchové antigény lymfoblastoidnej buňkovéj linie označenéj skratkou MSB1.

Doposial sa protilátky proti lymfoblastoidnej buňkovéj linii MSB1, ktorá nesie na svojompovrchu diagnostický antigén "MATSA" připravovali tak, že sa pokusným zvieratám /králík,ovca/ aplikovali živé MSBl buňky. Vzhladom na to, že nestačí jedna dávka buniek pre vyvolaniedostatočne vysokej protilátkovej odpovede, je potřebné ich injikovat viackrát opakovanév různých dávkách a časových intervaloch. Sérum takto imunizovaných zvierat slúži ako zdrojprotilátok najmS pri diagnostickém vyšetřovaní chovov hydiny. Zmienený postup imunizácie má niekolko nevýhod. Získává sa heterogénna zmes protilátok, ktorých rozloženie sa v orga-nizme producenta mění, je velmi rĎznorodé, kvalitativně a kvantitativné kolíše od jednéhoodběru po druhý a je neopakovatelné. Okrem toho sérum obsahuje nežiadúce protilátky protipovrchovým antigénom, ktoré sa vyskytuji! aj na.normálnych buňkách. V důsledku toho jepotřebné séra upravovat zložitými postupmi vysýtenia pomocou normálnych slezinových buniektak, aby sérum obsahovalo protilátky len proti povrchovým antigénom lymfoblastoidnej buňko-vé j linie označenéj skratkou MSBl.

Touto úpravou dochádza k velkým stratám na sére a výraznému zníženiu titra Specifickýchprotilátok. Pochopitelné proces vysýtenia nie je možné Standardizovat, v důsledku čoho sai tak vysoká heterogenita konvenčných sér ešte prehlbi. Okrem toho využitelnost takto přip-raveného diagnostického séra je znížená aj tým, že jeho Specifické polyklonálne protilátkysú z hladiska interakcie s povrchovými buňkovými antigénmi velmi různorodé. Naviac přípravadostatočného množstva lymfoblastoidných buniek MSBl pre imunizačné účely je náročná na tech-nické vybavenie pracoviska, kvalifikovaný personál a finančné prostriedky.

Hybridům MSB-NTP-2 bol připravený známým spůsobom, klonováním skupiny hybridómovv mSkkom agare, vzniklých fúziou buniek myšej 2-amino-hydroxy-8-azapurin /8-azaguanín/rezistentnej myelómovej linie označenej NSO a slezinových buniek inbrédnej linie myšíBALB/c, imunizovaných lymfoblastoidnou buňkovou líniou MSBl /G. Kóhler, C. Milstein, G. W. Butcher, J. C. Howard: Nátuře 286, 550 /1977//.

Uvedené nevýhody v podstatnéj miere odstraňuje vynález, ktorého podstata spočíváv mySom lymfocytárnom hybridóme MSB-NTP-2 produkujúcom monoklonálnu protilátku podtriedyIgGl, kappa, rozpoznávájúcu povrchové antigény lymfoblastoidnej buňkovéj linie označenejskratkou MSBl. Tento hybridom je uložený vo Virologickom ústave SAV, Mlýnská dolina 1, 817 03 Bratislava. Výhodou hybridómu je že produkuje izotypovo homogénnu protilátku, tzv. monoklonálnuprotilátku, ktorá rozpoznává povrchové antigény lymfoblastoidnej bunkovej linie označenejskratkou MSBl a tým je ju možné použit v diagnostických testoch vyhladávajúcich protilátkyproti nádorovým antigénom asociovaným s Marekovou chorobou. Jednobunkový lymfocytárny hybridůmMSB-NTP-2 rastie in vivo v peritoneálnej dutině BALB/c myši za súčasnej tvorby ascites.

Rastie aj in vitro v kultivačných médiách vhodných pre živočišné buňky. Taktiež po zmrazenía uložení v tekutom dusíku a opStovnom rozmražení si zachovává svoju schopnost produkovatmonoklonálnu protilátku rozpoznávajúcu povrchové antigény lymfoblastoidnej bunkovej linieoznačenej skratkou MSBl. Neobsahuje' na rozdiel od konvenčných antisér nevhodné, nešpecifické,balastné protilátky. Příklad 1

Pre přípravu hybridnej bunkovej linie sa použije 2.10? buniek myšej 2-amino-6-hydroxy--8-azapurín /8-azaguanín/ rezistentnej myelómovej bunkovej linie, ktoré sa pomocou 1 ml g 50 % hmot. polyetylénglykolu spoja s 1.10 slezinových lymfoidných buniek myši imunizovanej

O 3.10 MSBl lymfoblastoidných buniek. V priebehu 14 dní vyrastú pod selektívnym tlakom kyseliny 4-amino-pteroylglutámovej /aminopterínu/ hybridné buňkové linie, ktoré produkujú monoklonál- ne protilátky rozpoznávejúce povrchové antigény lymfoblastoidnej bunkovej linie označenej skratkou MSBl. 3 259233

Tieto buňky sa potom klónujú tak, že sa zmieša 0,5 % hmot. agaru s 5.106 až 10.106myších slezinových buniek v médiu RPMI 1 640, ktoré obsahuje 100 mg.ml-1 tetrahydrátudusičnanu vápenatého, 2 000 mg.ml-1 D-glukózy, 100 mg.ml-1 heptahydrátu síranu horečnatého, 400 mg.ml ’ chloridu draselného, 1 512 mg.ml ’ hydrogenfosforečnanu sodného, 6 000 mg.ml”'''monohydrátu dihydrogenfosforečnanu sodného, 100 mg.ml-1 kyseliny 2-amino-5-guanidínovalé-rovej /arginínu/, 50 mg.ml ’ kyseliny 2-aminosukcínamovej /asparagínu/, 20 mg.ml-’ kyseliny2-aminojantárove j /kyseliny asparágovej/, 50 mg.ml-1 kyseliny 3*,3'-ditiobis/2-aminopropánovej/,/cystínu/, 20 mg.ml 1 kyseliny 2~aminoglutárovej /kyseliny glutamovej/, 300 mg.ml-'’' kyseliny2-aminoglutarámovej /glutamínu/, 1 mg.ml-1 kyseliny 2-aminoglutaraminyl-2-merkaptopropionyl--aminooctovej /glutationu t j. glutaminyl-cysteinyl-glycínu/, 10 mg.ml-'’· kyseliny amino-octovej /glycínu/, 15 mg.ml-1 kyseliny α-amino-l-imidazol-propiónovej /histidínu/, 50 mg.ml-1kyseliny 2-amino-3-metylvalérovej /izoleucínu/, 50 mg.ml-1 kyseliny 2-amino-4-metylvalérovej/leucínu/, 40 mg.ml 1 kyseliny 2,6-diaminohexánovej /lyzínu/, 15 mg.ml-1 kyseliny 2-amino--4-/metyltio/maslovej /metionínu/, 15 mg.ml ’ kyseliny 2-amino-3~fenylpropiónovej /fenylalaní-nu/, 20 mg.ml ’ kyseliny 2-pyrolidínkarboxylovej /prolinu/, 30 mg.ml-'’' kyseliny 2-amino--3-hydroxypropiónovej /serínu/, 20 mg.ml-1 kyseliny 2-amino-3-hydroxymaslovej /treonínu/, 5 mg.ml 1 kyseliny 2-amino-3-/3-indolyl/propiónove j /tryptofanu/, 20 mg.ml-'’' kyseliny 2-amino--3/4-hydroxyfenyl/-propiónovej /tyrozínu/, 20 mg.ml-1 kyseliny 2-amino-3-metylmaslovej /va-línu/, 0,2 mg.ml 1 kyseliny 5-/2-oxoimidazolidíno/4,5-c/tiol-2-yl/pentánovej /biotínu/, 0,005 mg.ml 1 kobalt«/W-/5,6-dimetylbenzimidazolyl//-kobalt(5-kyanokobamid vitamínu B,-/, -1 0,250 mg.ml D-N-/2,4-dihydroxy-3,3-dimetylbutyryl/-3-2-aminopropionát vápenatý /pantotenát vápenatý/, 3 mg.ml ’ 2-hydroxyetyltrimetylamóniumchlorid /cholínchlorid/, 1 mg.ml-'’' kyselinyN-/2-amino-4-hydroxypteridín-6-ylmetyl/-p-aminobenzoovej /kyseliny listovej/, 35 mg.ml-'’' /1,2,3,5/4,6/cyklohexándexol/ /myoinozitolu/, 1 mg.ml-’' pyridin-3-karboxyamidu /nikotinamidu/,1 mg.ml-’ kyseliny 4-aminobenzoovej /kyseliny p-aminobenzoovej/, 1 mg.ml-’ 3-hydroxy--4,5-bis/hydroxymetyl/-2-metylpyridínchloridu /pyridoxínchloridu/, 0,2 mg.ml-’ 7,8-dimetyl--10~/l"-D-ribytil/izoaloxazínu /riboflavínu/, 1 mg.ml-’ 3-/4-amino-2-metyl-pyrimidyl-5~metyl/- -5-/2-hydroxyetyl/-4-metyltiazolu /tiamínchloridu/, 2 000 mg.ml-’ hydrogenuhličitanu sodného-5 doplnenom s 2 mmol kyseliny 2-aminoglutarámovej /glutamínu/, 5.10 mol 2-merkaptoetanolu, 100 jug.ml-’ 0-K-L-2-deoxy-2-/metylamino/-glukopyranozyl-/l-2/-0-K-L-deoxy-3-C-formyllyxo-furanozy1-/1-4/-1,3-deoxy-l,3-diguanidoscyloinozitsulfátu /streptomycínsulfátu/, 100 jednotiekna mililiter kyseliny 6-/N-fenylacetoamido/-penicilánovej /penicilínu G/, 1 mmol kyselinyN-2-hydroxyetylpiperazín-N"-2-etán sulfonovej /Hepesu/ sa rozpustí v trikrát redestilovanejvodě a doplní trikrát redestilovanou vodou na objem 900 ml roztoku, ktorý sa doplní 100 mlnormálneho inaktivovaného koňského séra. Výsledné pH takto připraveného kultivačného média je 7,2. Po zatuhnutí agaru sa navrstvu 0,5 % hmot. agaru nanesie 100 hybridných buniek v 0,25 % hmot. agare. Po 10 dňochvyrastú kolonie, ktoré sa pomnožia v médiu RPMI 1 640 doplnenom s 2 mmol kyseliny 2-amimo-glutarámovej /glutamínu/, 5.10-^ mol 2-merkapťoetanolu, 100 jug.ml-’ 0-K-L-2-deoxy-2-/metylami-no/ -glukopyranozy 1-/1-2/ -0(X-L-deoxy-3- formy llyxofuranozyl-/ 1-4/-1 , 3-deoxy-l ,4-diguanidoscy-loinozitsulfátu /streptomycínsulfátu/, 100 jednotiek na mililiter kyseliny 6-/N-fenylaceta-mido/-penicilánovej/ /penicilínu G/, 1 mmol kyseliny N-2-hydroxyetylpiperazín-N"-2-etánsulfonovej /Hepesu/ sa rozpustí v trikrát redestilovanej vodě a doplní trikrát redestilovanouvodou na objem 900 ml roztoku, ktorý sa doplní 100 ml normálneho inaktivovaného koňskéhoséra. Výsledné pH takto připraveného kultivačného média je 7,2. V 1 ml kultivačného médiasa nachádza 350 až 700 tisíc hybridómov MSB-NTP-2 produkujúcich 10 až 100 jug monoklonálnejIgGl, kappa, protilátky rozpoznávajucej povrchové antigény lymfoblastoidnej bunkovej linieoznačenéj skratkou MSB1. Příklad 2

Postupuje sa tak ako v příklade 1 s tým rozdielom, že sa v kultivačnom médiu použije 'nepredtestované běžné telacie fetálne sérum. Do takto připraveného kultivačného prostrediapřenesené buňky po fúzii nie sú schopné rást a produkovat monoklonálne protilátky.

Claims (1)

1. 259233 Myší lymfocytárny hybridem MSB-NTP-2 sa kultivuje pri teplote 37 °C. Stredný generačnýčas je 20 hodin modálny počet ohromozómov je 24 mesiacov po fúzii 75 chromozómov. Produ-kovaná monoklonálna protilátka je myší imunoglobulín rozpoznávájúci povrchové antigénylymfoblastoidnej bunkovej linie označenej skratkou MSB1, .triedy IgGl, kappa. I Monoklonálna protilátka produkovaná myším lymfocytárnym hybridómom MSB-NTP-2-móže bytpoužitá vo veterinárskej praxi pri vyšetřovaní a diferenoiálnej diagnostike nádorových ocho-rení hydiny. PREDMET VYNALEZU Myší lymfocytárny hybridóm MSB-NTP-2, produkujúci monoklonálnu protilátku proti MSB1,lymfoblastoidnej bunkovej linii, podtriedy IgGl, kappa. Severografia, n. p„ MOST Cena 2,40 Kčs