CS240463B1 - Trojsodná sol' 4-(N-etyl-N-f0nylamíno)-8-(4-meíyll-2-sulíobenzén-l- -azo-2-(l-hydroxy-3,6-bÍ8Sulfonaft-l-yl)antíno ]-1,3,5-triazín- -2-ylhydroxyetylcelulózy a sposob jej přípravy - Google Patents

Description

ČESKOSLOVENSKA SOCIALISTICKÁ REPUBLIKA (19) POPIS VYNÁLEZU K AUTORSKÉMU OSVEDÉENIU 240463 (11) (Bl) (22) Přihlášené 14 05 84(21) (PV 3540-84) (51) Int. Cl.4 C 12 N 9/42 s (40) Zverejnené 16 07 85 ÚŘAD PRO VYNÁLEZY A OBJEVY (45) Vydané 15 08 87 (75)

Autor vynálezu MISLOVIČOyÁ DANÍCA ing. CSc.; BIELY PETER RNDr. CSc.,BRATISLAVA 154) Trojsodná sol' 4-(N-etyl-N-f0nyIamíno)-8-(4-meíyll-2-sulfobenzén-l--azo-2-(l-hydroxy-3,6-bÍ8Sulfonaf t-l-yl) antíno ]-1,3,5-triazín--2-ylhydroxyetylceIulózy a sposob jej přípravy 1 2 ‘

Vynález sa týká trojsodnej soli 4-(N-etyl--N-fenylamíno)-6-[4-metyl-2-sulfobenzén-l--azo-2-(l-hydroxy-3,6-bissulfonaf t-l-yl) ami-ne] -1,3,5-triazín-2-yl-hydroxyetylcelulózya spósobu jej přípravy.

Stanovenie aktivity glukanáz s endo-spQ-sobom ataku polyméjnych substrátov sa vposledných rokocli značné zjednodušuje po-užíváním tzv. chromogénnych substrátov,t, j. polysacharidov s kovalentne.. naviaza-.ným Farbivcm. V případe celuláz (endo-1,4--(3-glukanáz) sa používá niekolko typovchromogénnych substrátov. Firma Calbio-chem vvrába substrát, ktorý představuje vovodě nerozpustná, čiastočne amorfnú ce-lulózu s kovalentne naviazaným modrýmfarbivom. E. Kuniak a J. Zemek připravili pre-parát založený na báze sodnéj soli 2-(3-(1--amíno-2-sulf oantrachinón-4-yl-amíno) f enyl-sulfonyl] etyl — mikrokryštalickej celulózyupravený vo formě tabletiek (čs. AÓ219 575).

Podobné M. Linko a M. Leisola připravilimikrokryštalikcú celulózu s tým istým na-viazaným farbivom ako substrát vhodnýpredovšetkým pre stanovenie aktivity celu-láz, ktoré atakujú krystalické oblasti celu-lózy [M. Linko, M. Leisola: Anal. Biochem.70, 592 (1976)]. Dalším chromogénnym sub-strátom na stanovenie aktivity je vodone- rozpustná O-(2,4,6-trinitrofenyl) celulóza, kto-rej příprava ale vyžaduje poměrně drahéa toxické chemikálie a samotný substrátsa vyznačuje nestálosťou [J. S. Huang, J.Tang.: Anal. Biochem. 73, 369 (1976)]. Fa-rebný substrát na báze hydroxyetylceluló-zy bol připravený sieťovaním hydroxyetyl-celulózy epichlórhydrínom a potom reak-ciou s dvojsodnou soldu l-amíno-2-sulfo-4-- [ 3- (2-sulf átoetylsulf onylanilíno j ] antrachi-nónu (čs. AO 192 202).

Vo všetkých vyššie uvedených prípadochide o substráty nerozpustné vo vodě, pri-Čom princípom stanovenia aktivity celulázich prosiredníctvom je spektrofotometric-ké meranie množstva farbiva uvolněného doroztoku vo formě rozpustných fragmentovpolysacharidu s kovalentne naviazaným far-bivom. Nevýhodou nerozpustných substrá-tov sú ťažkosti s ich dávkováním (tableto-váním sa tieto ťažkosti odstránia) akd iheterogenita inkubačných zmesí s enzýmom,keďže nerozpustný substrát nedovoluje bezmiešania rovnoměrné vytváranie enzým-sub-strátového komplexu v celom objeme zme-si. Nerozpustné substráty nie sú tiež vhod-né na sledovanie aktivity enzýmov viaza-ných na nerozpustné struktury, či už no-siče alebo buňkové, organely. Z tohto hl'a-diska je preto výhodnejšie použit další typ 240463 240463 chromogénnych substrátov, ktoré sú roz-pustné vo vodě a predovšetkým v tlmivýchroztokoch, v ktorých sa stanovenie enzýmo-vej aktivity uskutočňuje. Sú to chromogén-ne deriváty modifikovanej celulózy, ktoráje vo vodorozpustnej formě.

Na tieto účely je vhodná karboxymetylce-lulóza alebo hydroxyetylcelulóza. Nevýho-dou doteraz připravených chromogénnychsubstrátov na uvedenej báze je, že karbo-xymetylcelulóza sa musí upravit čiastočnouenzymatickou depolymerizáciou, aby sa zvý-šila jej rozpustnost [B. V. Mc Cleary: Car-bohydr. Res. 86, 97 (1980)] a vodorozpust-ná hydroxyetylcelulóza po naviazaní dvoj-sodnej soli l-amíno-2-sulfo-4-[3-(2-sulfáto-etylsulfonylanilíno) ] antrachinónu sa stávánerozpustnou v tlmivých roztokoch, v kto-rých sa uskutočňuje stanovenie enzýmo-vej aktivity.

Uvedené nevýhody v poidstatnej miere od-straňuje tento vynález. Podstatou vynálezuje vodorozpustný chromogénny substrát troj-sodná sol' 4-(N-etyl-N-fenylamíno )-6-[4-me-tyl-2-sulfobenzén-l-azo-2- (l-hydroxy-3,6--bissulf onaft-l-yl) amíno ] -l,3,5-triazín-2-yl--hydroxyetylcelulózy. Ďalej podstatou vyná-lezu je spósob přípravy tohto substrátu,ktorý sa vyznačuje tým, že vodorozpustnáhydroxyetylcelulóza reaguje vo vodnom roz-toku s obsahom 1 až 3 % hmot. hydroxidusodného alebo hydroxidu draselného za pří-tomnosti solí ako octan sodný, síran sodnýa chlorid sodný pri teplote 20 až 50 °C po-čas 1 až 2 h s trojsodnou sofou 2-chlór-4-- (N-etyl-N-fenylamíno) -6- [ 4-metyl-2-sulf o-benzén-l-azo-2- (l-hydroxy-3,6-bissulf onaf t--l-yl]amíno]-l,3,5-triazínu pri hrnotnostnýchpomeroch hydroxyetylcelulóza : trojsodnásol 2-chlór-4- (N-etyl-N-fenylamíno j -6- [ 4--metyl-2-sulf obenzén-l-azo-2- (1-hydroxy--3,6-bissulf onaft-l-yl) amíno ] -1,3,5-triazínu: : hydroxid sodný alebo hydroxid drasel-ný = 1 : 0,2 až 0,8 : 0,4 až 1,2; načo sa za-farbená hydroxyetylcelulóza vyzráža 3 ob-jemami roztoku obsahujúceho 1,5 až 2 ob-jemy 96 % obj. etylalkoholu a 1 až 1,5 ob-jemu acetonu a nenaviazané farbivo a fa-rebné nízkomolekulárne frakcie hydroxye-tylcelulózy sa odstránia vymýváním s roz-tokom obsahujúcim 1 objem 0,6 až 1 %hmot. vodného roztoku octanu sodného a 3objemy roztoku obsahujúceho 1,5 až 2 ob-jemy 96 % obj. etylalkoholu a 1 až 1,5 ob-pemu acetonu až do bezfarebného filtrá-tu. Výhodou navrhovaného nového substrátua spůsobu jeho přípravy je, že sa získá jed-noduchým sposobom farebný substrát roz-pustný v tlmivých roztokoch, v ktorých sauskutočňuje stanovenie enzýmovej aktivity.Ďalšou výhodou je, že tento substrát je zrá-žaný a vymývaný za přítomnosti octanu sod-ného, t. j. za podmienok zhodných s pod-mienkami zrážania enzymaticky nerozštie-pených farebných makromolekúl pri stano- vení aktivity endo-l,4-/3-glukanáz. Výhodouje tiež to, že základné suroviny sú dostup-né. Příklad 1 1 g hydroxyetylcelulózy sa rozpustí v 30mililitroch dest. vody, potom sa přidá 0,3gramov trojsodnej soli 2-chlór-4r(N-etyl-N--f enylamíno) -6- [ 4-metyl-2-sulf obenzén-1--azo-2-(l-hydroxy-3,6-bissulf onaft-l-yl) amí-no]-1,3,5-triazínu (Ostazinová červeň bril.H—3B) rozpustenej v 5 ml dest. vody. Podůkladnom premiešaní sa přidá 5 ml 6 %hmot. vodného roztoku chloridu sodného· a10 ml 15 % hmot. vodného roztoku hydro-xidu draselného. Mieša sa 2 h pri teplote20 CC. Po zneutralizovaní reakčnej zmesi 3mol. 1_1 kyselinou chlorovodíkovou na pH7 sa zafarbený produkt vyzráža s roztokom93 ml 96 °/o obj. etylalkoholu a 93 ml ace-tonu.

Vzniknutá zrazenina sa filtruje na nučia premýva roztokom obsahujúcim 1 dřel 0,6pere. hmot. vodného roztoku octanu sod-ného, 1,5 dielu 96 % obj. etylalkoholu a1,5 dielu acetonu do bezfarebného filtrá-tu. Potom sa zrazenina premyje roztokom96 % obj. etylalkoholu a vody 3 : 1. Estevlhká zrazenina sa rozpustí v 50 ml vody alyofilizuje. Získá sa 1 g farebnej hydroxy-etylcelulózy s obsahom 2,5 % hmot. troj-sodnej soli 4-(N-etyl-N-fenylamíno )-6-[4-me-tyl-2-sulf c-benzén-l-azo-2- (l-hydroxy-3,6-bis-sulf onaf t-l-yl) amíno]-1,3,5-triazín-2-yl.Příklad 2. 10 g hydroxyetylcelulózy sa rozpustí v 200mililitroch dest. vody.pri teplote 40 °C. Po-tom sa přidá 8 g trojsodnej soli 2-chlór--4- (N-etyl-N-fenylamíno) -6- [ 4-metyl-2-sul-f obenzén-l-azo-2- (l-hydroxy-3,6-bissulfo-naf t-l-yl)amíno]-1,3,5-triazínu rozpustenejv 50 ml dest. vody a ďalej 50 ml 6 % hmot.vhodného roztoku octanu sodného a nako-niec 100 ml 4 % hmot. vodného* roztokuhydroxidu sodného. Mieša sa 1 h pri tep-lote 40 °C. Reakčná zmes sa zneutralizuje s3 mol. I-1 kyselinou octovou , na pH 7 a vy-zráža za intenzívneho miešania s 860 ml96 % obj. etylalkoholu a 430 ml acetonu.

Zrazenina sa přefiltruje na nuči a pre-mýva roztokom obsahujúcim 1 diel 1 %hmot. vodného roztoku octanu sodného, 2diely 98 % obj. etylalkoholu a 1 diel aceto-nu do bezfarebného filtrátu. Potom sa zra-zenina premýva roztokom 96 % obj. etyl-alkoholu a vody 3:1a ešte vlhká sa roz-pustí v 400 ml vody a lyofilizuje. Získá sa10 g farebnej hydroxyetylcelulózy s obsa-hom 13 % hmot. trojsodnej soli (4-N-etyl--N-fenylamíno) -6- [ 4-metyl-2-sulf obenzén-1--azo-2-(l-hydroxy-3,6-bissulf onaft-l-yl) amí-no] -1,3,5-triazín-2-yl-.

Claims (2)

240463 Příklad 3 Postupuje sa ako v příklade 2 s tým roz-dielom, že sa použije miesto octanu sodné-ho 5 % hmot. vodný roztok síranu sodnéhoa 6,5 g trojsodnej soli 2-chlór-4-(N-etyl-N--f enylamíno) -6- [ 4-metyl-2-sulf obenzén-1--azo-2- (1-hydr o-xy-3,6-bissulf onaf t-l-yl j amí-no]-1,3,5-triazínu. Reakcia prebieha pri tep-lotě 50 °C po dobu 1 h. Získá sa 10 g fa-rebnej hydroxyetylcelulózy s obsahom 20pere. hmot. trojsodnej soli 4-(N-etyl-N-f e-nylamíno j -6- [ 4-metyl-2-sulf obenzén-l-azo--2- (l-hydroxy-3,6-bissulf onaf t-l-yl) amíno ] --l,3,5-triazín-2-yl-. Příklad 4 60 g hydroxyetylcelulózy sa rozpustí v1 200 ml dest. vody počas 24 h. Potom sapřidá postupné 24 g trojsodnej soli 2-chl-ór--4- (N-etyl-N-f enylamíno) -6- [ 4-metyl-2-sul-f abenzén-l-azo-2- {l-hydroixy-3,6-bissulf o-naft-l-yl jamíno]-l,3,5-triazínu rozpustenejv 300 ml dest. vody, potom 50 ml 30 % hmot.vodného roztok u octanu sodného a nako-niec 600 ml 4 % hmot. vodného roztokuhydroxidu sodného. Teplota sa zvýši na 50stupňov Celsia a reakčná zmes sa mieša pritejto teplote 1 h. Po ukončení sa zneutrali- zuje s 5 mol. I"1 kyselinou ocíc-vou na pIT7 a zráža s 4 600 ml 96 % obj. etylalkoho-lu a 2 300 ml acetonu. Vyzrážaná zafarbe-ná hydroxyetylcelulóza sa premýva rozto-kom obsahujúcim 1 diel 0,6 % hmot. roz-toku octanu sodného, 2 diely 96 % obj. e-tylalkoho-lu a 1 diel acetonu do slabéhosfarbenia filtrátu. Zrazenina sa ešte vo vlh-kom stave rozpustí v 1 500 ml 0,6 % hmot.vodného roztoku octanu sodného a prezrá-ža zmesou rozpúšfadiel obsahujúco-u 3 000mililitro-v 96 % obj. etylalkoholu a 1 500 mlacetonu. Zrazenina sa přefiltruje cez nuča premýva roztokom obsahujúcim 1 diel0,6 % hmot. vodného roztoku octanu sod-ného, 2 diely 96 % obj. etylalkoholu a 1diel acetonu do- bezfarebného filtrátu a na-koniec s roztokom 96 % obj. etylalkoholu avody 3 : 1. Vlhká zrazenina sa rozpustí v1 500 ml vody a lyo-filizuje. Získá sa 55 g fa-rebnej hydroxyetylcelulózy s obsahom 15pere. hmot. trojsodnej soli 4-(N-etyl-N-f e-ny laminoj-6- [ 4-metyl-2-sulf obenzén-l-azo--2-(l-hydroxy-3,6-bissul.f onaf t-l-yl jamíno-j--l,3,5-triazín-2-yl-. Vynález má použitie v biochemii pře de-tekciu a kvantitativné stano-venie aktivityendo-l,4-/3-glukanáz ako zlo-žiek celulázo-vých enzýmových systémov. PREDMET

1. Trojsodná sol’ 4-{N-etyl-N-fenylamíno )--6- [ 4-metyl-2-sulf obenzén-l-azo!-2- {1-hyd-roxy-3,6-bissu] fonaf t-l-yl j amíno]-1,3,5-tria-zín-2-yl-hydroxyetyIcelulózy.

2. Spósob přípravy zlúčeniny pod!'a bo-du 1 vyznačujúci sa tým, že vodorozpustnáhydrozyetylcelulóza reaguje vo voduom roz-toku s obsahom 1 až 3 % hmot. hydroxidusodného- alebo hydroxidu draselného za pří-tomnosti solí ako octan sodný, síran sod-ný a chlorid sodný pri teplote 20 °C až 50stupňov Celsia počas 1 až 2 h s trojsodnousoldu 2-chlór-4- (N-etyl-N-f enylamíno )-6- [ 4--metyl-2-sulf obenzén-l-azo-2- (l-hydroxy--3,6-bissulfonaft-l-yl)amíno]-l,3,5-triazínu VYNALEZU pri hmotnostných pomeroch hydroxyetylce-lulóza : trojsodná sol' 2-chlór-4-(N-etyl-N--fenylamínoj-6-[4-metyl-2-sulf obenzén-l-azo-2- (l-hydroxy-3,6-bissulf onaft-lyl) amí ·no]-1,3,5-triazínu : hydroxid sodný alebohydroxid draselný = 1 : 0,2 až 0,8 : 0,4 až1,2; načo sa zafarbená hydroxyetylcelulózavyzráža zmesou ro-zpúšťadiel obsahujúcou1,5 až 2 objemy 96 % obj. etylalkoholu a1 až 1,5 objemu acetonu a zrazenina sapremýva ro-ztokom obsahujúcim 1 objem0,6 až 1 °/o hmot. vodného roztoku octanusodného, 1,5 až 2 objemy 96 % obj. etyl-alkoholu a 1 až 1,5 objemu acetonu až dobezfarebného filtrátu.