CS254162B1 - Sposob přípravy rozpustného cbromolytickéha substrátu na stanovenie (3(l-*3) glukanázy - Google Patents

Description

254162 3 4

Vynález sa týká sposobu přípravy rozpust-ného chromoíytického substrátu na stano-venie /3(1-3) glukanázy, EC 3.2.1.6. K osvědčeným a velmi efektívnym spéso-bom stanovenia pólysacharid-hydrolázovýchenzymových aktivit patria sposoby fotokolo-rimetrické. Spočívajú v tom, že enzým sanechá reagovat s nerozpustným chromoly-tickým substrátem, pričom účinkom enzý-mu sa tento stává rozpustným a zafarbujereakčný roztok. Intenzita zafarbenia rozto-ku je potom úměrná aktivitě meraného en-zýmu [J. Kennedyc Advances in carbohydra-te chemistry and biochemistry 29, 350 (1974)]. Známe sú sposoby i s použitím vo-dorozpustných chromolytických substrátov,u kterých sa rozpustný enzymatický neata-kovaný podiel chromoíytického polysacha-ridu vyzráža organickým rozpúšťadlom ahydrolyzovaný podiel ostává rozpustný atým aj zafarbuje reakčný roztok úměrněaktivitě přítomného enzýmu [K. K. Mákinen,I. K. Paunio: Anal. Biochem. 39, 202 (1971)].V súčasnej době nemožno jednoznačné do-poručovat nerozpustné alebo rozpustné chro-molytické polysacharidové substráty, preto-že oba majú svoje výhody i nevýhody. Zá-leží na konkrétných podmienkach analýzy,ktorému typu substrátu dáme přednost. Pří-prava mnohých vodorozpustných polysacha-ridových chromolytických substrátov jepredmetom Čs. AO 237 101 a US patentu4 321 364. Nezahrňuje však menej známe po-lysacharidy, akým je /3(1-3) glukán, izolo-vaný z buněčných stien pekárenských kva-siniek (Saccharomyces cerevisiae), ktorýsavyznačuje velmi nízkou reaktivitou pri ná-sledných alkylačných modifikačných reak-ciách, ktorými sa tento nerozpustný poly-sacharid prevádza na rozpustný.

Podstata vynálezu spočívá v tom, že v pr-vom stupni sa /3(1-3) glukán alkylu je ety-lénoxidom alebo /3-chloretyl sulfonátom sod-ným alebo kyselinou monochlóroctovou v·alkalickom prostředí na stupeň substitúcie0,35 až 0,8 a v druhom stupni sa na alkyl--polysacharid naviaže farbivo; dvojsodnásol' kyseliny 8-amíno-5-[3-(sulfoetylsulfo-nyl )anilíno ] 6-antrachinón-sulf onove j (Re-mazol briliant blue R) v množstve 6 až 10percent hmot. na hmotnost polysacharidupri teplote 15 až 25 °C a koncentrácii hydro-xidu sodného 1,0 až 3,0 % hmot. po dobu 2až 4 hodin a vyfarbený polysacharid sa zroztoku izoluje známým spdsobom. Připravený chromolytický /3(1-3) glukánje vo vodě dobré rozpustný a je vhodnýmsubstrátem pre meranie β (to3) glukanázovejenzýmovej aktivity, EC 3.2.1.6. Hydroxyetyl--derivát je vhodnější pre vlazanie farbiva,nakolko neblokuje hydroxylové skupiny po-lysacharidu. Karboxymetyl a sulfoetyl deri-váty /3(1-3) glukánu sa horšie vyfarbujú,ale je jednoduchšia ich příprava oproti hyd-roxyetylderivátu. Výhodou nového postupu přípravy vodo- rozpustného chromoíytického gelu /3(1-3)glukánu je, že umožňuje připravit z tohtomálo reaktívneho polysacharidu dostatečnécitlivý vodorozpustný enzýmový substrátvhodný pre fotokolorimetrické stanovenie/3(1-3) glukanázovej aktivity, EC 3.2.1.6, čímsa rozšiřuje paleta vodorozpustných poly-sacharid-hydrolázových enzýmových sub-strátov. Přikladl K 200 g vzduchosuchého práškového/3(1—3] glukánu izolovaného z buněčnýchstien pekárskych kvasiniek (Saccharomycescerevisiae) sa alkalizuje, s 200 ml 20 °/o hmot·vodného roztoku hydroxidu sodného a ne-chá sa aktivovat po dobu 1 hodiny pri tep-lote 20 °C. Potom sa alkalyzovaný glukán vreaktore, z ktorého sa odsaje vzduch alky-luje postupné přidáváním 35 g etylénoxidupri teplote 45 °C sa nechá reagovat ešte 2hodiny po přidaní posledného podielu ety-lénoxidu. Po ukončení reakcie sa produktrozpustí v 3 litroch vody, ochladí sa na tep-lotu 20 °C a postupné sa za miešania přidá-vá 25 g farbiva (Remazol briliant blue R).Reakčná zmes sa nechá reagovat celkove 2hodiny od pridania posledného podielu far-biva. Po naviazaní farbiva na polysacharid sareakčný roztok zneutralizuje kyselinou oc-tovou. Potom s neutrálny roztok naleje dopřebytku alkoholu za miešania, čím sa chro-molytický /3(1-3) glukán vyzráža, odfiltrujesa na filtri a premýva metanolom, až premý-vací roztok je bezfarebný. Hotový produktobsahuje 8 až 10 % hmot. viazaného farbi-va, je dobré rozpustný vo vodě a je tedavhodným vodorozpustným substrátem nastanovenie /3(1-3) glukanázovej enzýmovejaktivity. Příklad 2 200 g vzduchosuchého práškového /3(1—3)glukánu izolovaného z buněčných stien pe-kárskych kvasiniek sa alkyluje v suspenzii2 litrov izopropanolu a 200 ml vodného roz-toku hydroxidu sodného o koncentrácii 20percent hmot. Reakčná zmes sa postupnévyhrieva na teplotu 55 °C, kedy sa v priebe-hu 30 minut po častiach přidává 70 g pev-ného /3-chlóretylsulfonátu sodného. Reakč-ná zmes sa pri teplote 55 °C za miešaniaudržuje 3 hodiny, potom sa pevný sulfoetyl--glukán odfiltruje, premyje 96 % hmot. eta-nolom, dobré odsaje a pevný produkt sarozpúšťa v 3 litroch vody, upraví sa kon-centrácia hydroxidu sodného na hodnotu 3percenta hmot. a vyfarbí sa farbivom (Re-mazol briliant bleu R) pri teplote 25 °C podobu 4 hodin. Hotový produkt je dobré roz-pustný vo vodě a je vhodným substrátem nastanovenie /3(1-3) glukanázovej enzýmovejaktivity. Obsahuje 6 % hmot. viazaného far-biva.

Claims (2)

1. 254162 5 6 Příklad 3 200 g vzduchosuchého práškovéhoglukánu izolovaného z buněčných stien pe-kárskych kvasiniek sa. suspenduje v 2 lit-roch 96 % hmot. etanolu, do ktorého sapredtým přidalo 100 ml vodného roztokuhydroxidu sodného o koncentrácii 600 g.. I-1. Reakčná zmes sa mieša 1 hodinu přiteplote 20 °C, potom sa přidá 100 g kyseli-ny chlóroctovej a vyhřeje sa na teplotu 55stupňov Celsia počas 30 až 45 minút a přitejto teplote sa reakčná zmes udržuje cel-kom 3 hodiny. Potom sa pevný produkt kar- boxymetyl-glukán odfiltruje, dobré odsajeetanol a pevný produkt sa rozpustí v 2 lit-roch vody, upraví sa koncentrácia hydroxi-du sodného, na hodnotu 3 % hmot. a vyfarbísa barvivom (Remazol briliant blue R) akov příklade
2. 2. Hotový produkt je dobré roz-pustný vo vodě, a je vhodným substrátom nastanovenie /3(1—3) glukanázovej enzýmovejaktivity. Vynález má použitie v analytike enzýmov,biotechnologii a všade kde třeba pohotovomerať /3(1—3) glukanázovú enzýmovú akti-vitu. ťREDMET Sposob přípravy rozpustného chromoly-tického substrátu na stanovenie β (l->3 j glu-Kanázy, EC 3.2.1.6 modifikáciou β (l->3) glu-kánu vyznačený tým, že v prvom stupni sa/3(1—3) glukán alkyluje etylénoxidom ale-bo j3-chloretylsulfonátom alebo kyselinoumonochlóroctovou v alkalickom prostředína stupeň substitúcie 0,35 až 0,8 a v dru-hom stupni sa na alkyl-polysacharid navia- že farbivo, dvojsodná sol' kyseliny 8-amí-no-5- [ 3- (sulfoetylsulf onyl janilíno ] 6-antra-chinon-sulfonovej v množstve 6 až 10 %hmot. na hmotnost polysacharidu pri teplote15 až 25 °C a koncentrácii hydroxidu sodné-ho 1,0 až 3,0 % hmot, po dobu 2 až 4 hodina vyfarbený polysacharid sa z roztoku izo-luje.