CS240463B1

CS240463B1 - Trisodium salt of 4-/n-ethyl-n-phenylamino/-6-/4-methyl-2-sulphobenzene-1-azo-2-/1-hydroxy-3,6-bissulphonate-1-yl/amino/-1,3,5-triazine-2-yl-hydroxyethylcellulose and method of its preparation

Info

Publication number: CS240463B1
Application number: CS843540A
Authority: CS
Inventors: Danica Mislovicova; Peter Biely
Original assignee: Danica Mislovicova; Peter Biely
Priority date: 1984-05-14
Filing date: 1984-05-14
Publication date: 1986-02-13
Also published as: CS354084A1

Description

Vynález sa týká trojsodnej soli 4-(N-etyl-N-fenylamíno)-6-[4-metyl-2-sulfobenzén-l-azo-2-(l-hydroxy-3,6-bissulfonaf t-l-yl) amine] -1,3,5-triazín-2-yl-hydroxyetylcelulózy a sposobu jej přípravy.The present invention relates to the trisodium salt of 4- (N-ethyl-N-phenylamino) -6- [4-methyl-2-sulfobenzene-1-azo-2- (1-hydroxy-3,6-bissulfonaphth-1-yl) amine] -1,3,5-triazin-2-yl-hydroxyethylcellulose and a process for its preparation.

Stanovenie aktivity glukanáz s endo-sposobom ataku polyméjnych substrátov sa v posledných rokocli značné zjednodušuje používáním tzv. chromogénnych substrátov, t, j. polysacharidov s kovalentne.. naviaza-. ným Farbivcm. V případe celuláz (endo-1,4-(3-glukanáz) sa používá niekoíko typov chromogénnych substrátov. Firma Calbiochem vvrába substrát, ktorý představuje vo vodě nerozpustná, čiastočne amorfnú celulózu s kovalentne naviazaným modrým farbivom. E. Kuniak a J. Zemek připravili preparát založený na báze sodnéj soli 2-[3-(l-amíno-2-sulf oantrachinón-4-yl-amíno) f enylsulfonyl] etyl — mikrokryštalickej celulózy upravený vo formě tabletiek (čs. AO 219 575).The determination of the activity of glucanases with endo-attack of polymeric substrates has been considerably simplified in recent years by the use of so-called. chromogenic substrates, i. polysaccharides with covalent .. binds. dym Farbivcm. In the case of cellulases (endo-1,4- (3-glucanases), several types of chromogenic substrates are used. Calbiochem produces a substrate that is a water-insoluble, partially amorphous cellulose with a covalently bound blue dye E. Kuniak and J. Zemek prepared preparation based on sodium salt of 2- [3- (1-amino-2-sulfoanthraquinon-4-ylamino) phenylsulfonyl] ethyl-microcrystalline cellulose formulated as tablets (cf. AO 219 575).

Podobné M. Linko a M. Leisola připravili mikrokryštalikcú celulózu s tým istým naviazaným farbivom ako substrát vhodný predovšetkým pre stanovenie aktivity celuláz, ktoré atakujú krystalické oblasti celulózy [M. Linko, M. Leisola: Anal. Biochem. 70, 592 (1976)]. Dalším chromogénnym substrátom na stanovenie aktivity je vodonerozpustná O-(2,4,6-trinitrofenyl) celulóza, ktorej příprava ale vyžaduje poměrně drahé a toxické chemikálie a samotný substrát sa vyznačuje nestálosťou [J. S. Huang, J. Tang.: Anal. Biochem. 73, 369 (1976}]. Farebný substrát na báze hydroxyetylcelulózy bol připravený sieťovaním hydroxyetylcelulózy epichlórhydrínom a potom reakciou s dvojsodnou solou l-amíno-2-sulfo-4- [ 3- (2-sulf átoetylsulf onylanilíno) ] antrachinónu (čs. AO 192 202).Similarly, M. Linko and M. Leisola prepared microcrystalline cellulose with the same bound dye as a substrate particularly suitable for determining the activity of cellulases attacking crystalline regions of cellulose [M. Linko, M. Leisola: Anal. Biochem. 70, 592 (1976)]. Another chromogenic activity substrate is water-insoluble O- (2,4,6-trinitrophenyl) cellulose, but its preparation requires relatively expensive and toxic chemicals and the substrate itself is unstable [J. Huang, J. Tang. Anal. Biochem. 73, 369 (1976)] A colored hydroxyethylcellulose-based substrate was prepared by cross-linking hydroxyethylcellulose with epichlorohydrin and then reacting with 1-amino-2-sulfo-4- [3- (2-sulfatoethylsulfonylanilino)] anthraquinone disodium salt (US AO). 192 202).

Vo všetkých vyššie uvedených prípadoch ide o substráty nerozpustné vo vodě, pričom princípom stanovenia aktivity celuláz ich prostredníctvom je spektrofotometrické meranie množstva farbiva uvolněného do roztoku vo formě rozpustných fragmentov polysacharidu s kovalentne naviazaným farbivom. Nevýhodou nerozpustných substrátov sú ťažkosíi s ich dávkováním (tabletováním sa tieto ťažkosti odstránia) akd i heterogenita inkubačných zmesi s enzýmom, keďže nerozpustný substrát nedovoluje bez miešania rovnoměrné vytváranie enzým-substrátového komplexu v celom objeme zmesi. Nerozpustné substráty nie sú tiež vhodné na sledovanie aktivity enzýmov viazaných na nerozpustné struktury, či už nosiče alebo buňkové, organely. Z tohto hladiska je preto výhodnejšie použit další typ chromogénnych substrátov, ktoré sú rozpustné vo vodě a predovšetkým v tlmivých roztokoch, v ktorých sa stanovenie enzýmovej aktivity uskutočňuje. Sú to chromogénne deriváty modifikovanej celulózy, ktorá je vo vodorozpustnej formě.All of the above are water-insoluble substrates, the principle of determining cellulase activity by means of spectrophotometric measurement of the amount of dye released into solution in the form of soluble fragments of a polysaccharide with a covalently bound dye. A disadvantage of insoluble substrates is their difficulty in dosing (tableting eliminates these difficulties) as well as the heterogeneity of the enzyme incubation mixture, since the insoluble substrate does not allow uniform formation of the enzyme-substrate complex without mixing throughout the volume of the mixture. Insoluble substrates are also not suitable for monitoring the activity of enzymes bound to insoluble structures, either carriers or cellular, organelles. Therefore, another type of chromogenic substrates which are soluble in water and in particular in the buffers in which the determination of the enzyme activity is carried out is preferably used in this respect. They are chromogenic derivatives of modified cellulose which is in water-soluble form.

Na tieto účely je vhodná karboxymetylcelulóza alebo hydroxyetylcelulóza. Nevýhodou doteraz připravených chromogénnych substrátov na uvedenej báze je, že karboxymetylcelulóza sa musí upravit čiastočnou enzymatickou depolymerizáciou, aby sa zvýšila jej rozpustnost [Β. V. Mc Cleary: Carbohydr. Res. 86, 97 (1980)] a vodorozpustná hydroxyetylcelulóza po naviazaní dvojsodnej soli l-amíno-2-sulfo-4-[3-(2-sulfátoetylsulfonylanilíno) ] antrachinónu sa stává nerozpustnou v tlmivých roztokoch, v ktorých sa uskutočňuje stanovenie enzýmovej aktivity.Carboxymethylcellulose or hydroxyethylcellulose is suitable for this purpose. A disadvantage of chromogenic substrates prepared hitherto on this basis is that carboxymethylcellulose must be treated by partial enzymatic depolymerization in order to increase its solubility [Β. V. Mc Cleary: Carbohydr. Res. 86, 97 (1980)] and water-soluble hydroxyethylcellulose upon binding of 1-amino-2-sulfo-4- [3- (2-sulfatoethylsulfonylanilino)] anthraquinone disodium salt becomes insoluble in buffers in which the enzyme activity is determined.

Uvedené nevýhody v podstatnej miere odstraňuje tento vynález. Podstatou vynálezu je vodorozpustný chromogénny substrát trojsodná sol' á-fN-etyl-Ndenylamínoj-e-já-metyl-2-sulfobenzén-l-azo-2- (l-hydroxy-3,6-bissulf onaf t-l-yl) amíno ] -l,3,5-triazín-2-yl-hydroxyetylcelulózy. Ďalej podstatou vynálezu je sposob přípravy tohto substrátu, ktorý sa vyznačuje tým, že vodorozpustná hydroxyeiylcelulóza reaguje vo vodnom roztoku s obsahom 1 až 3 % hmot. hydroxidu sodného alebo hydroxidu draselného za přítomnosti solí ako octan sodný, síran sodný a chlorid sodný pri teplote 20 až 50 °C počas 1 až 2 h s trojsodnou sofou 2-chlór-4- (N-etyl-N-fenylamíno) -6- [ 4-metyl-2-sulf obenzén-l-azo-2- (l-hydroxy-3,6-bissulf onaf t-l-yl]amíno]-l,3,5-triazínu pri hmotnostných pomeroch hydroxyetylcelulóza : trojsodná soí 2-chlór-4- (N-etyl-N-fenylamíno) -6- [ 4 -metyl-2-sulf obenzén-l-azo-2- (1-hydroxy-3,6-bissulf onaft-l-yl) amíno ] -1,3,5-triazínu:These disadvantages are substantially eliminated by the present invention. SUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides a water-soluble chromogenic substrate trisodium salt of .alpha.-N-ethyl-N-denylamino-ε-methyl-2-sulfobenzene-1-azo-2- (1-hydroxy-3,6-bissulfonaphthyl) amino] -l, 3,5-triazin-2-yl-hydroxyethyl. The invention further relates to a process for the preparation of this substrate, characterized in that the water-soluble hydroxyl cellulose is reacted in an aqueous solution with a content of 1 to 3% by weight. sodium hydroxide or potassium hydroxide in the presence of salts such as sodium acetate, sodium sulfate and sodium chloride at 20 to 50 ° C for 1 to 2 h with the trisodium salt of 2-chloro-4- (N-ethyl-N-phenylamino) -6- [ 4-methyl-2-sulfobenzene-1-azo-2- (1-hydroxy-3,6-bissulfonaphth-1-yl) amino] -1,3,5-triazine at weight ratios of hydroxyethylcellulose: trisodium salt of 2-chloro -4- (N-ethyl-N-phenylamino) -6- [4-methyl-2-sulfobenzen-1-azo-2- (1-hydroxy-3,6-bisulfonaphth-1-yl) amino] - 1,3,5-triazine:

: hydroxid sodný alebo hydroxid draselný = 1 : 0,2 až 0,8 : 0,4 až 1,2; načo sa zafarbená hydroxyetylcelulóza vyzráža 3 objemami roztoku obsahujúceho 1,5 až 2 objemy 96 % obj. etylalkoholu a 1 až 1,5 objemu acetónu a nenaviazané farbivo a farebné nízkomolekulárne frakcie hydroxyetylcelulózy sa odstránia vymýváním s roztokom obsahujúcim 1 objem 0,6 až 1 % hmot. vodného roztoku octanu sodného a 3 objemy roztoku obsahujúceho 1,5 až 2 objemy 96 % obj. etylalkoholu a 1 až 1,5 obpemu acetónu až do bezfarebného filtrátu.: sodium hydroxide or potassium hydroxide = 1: 0.2 to 0.8: 0.4 to 1.2; whereupon the colored hydroxyethylcellulose is precipitated with 3 volumes of a solution containing 1.5 to 2 volumes of 96% by volume. ethyl alcohol and 1 to 1.5 volumes of acetone and unbound dye and colored low molecular weight hydroxyethylcellulose fractions are removed by washing with a solution containing 1 volume of 0.6 to 1% by weight. aqueous sodium acetate solution and 3 volumes of a solution containing 1.5 to 2 volumes of 96 vol. ethyl alcohol and 1 to 1.5 parts of acetone until colorless filtrate.

Výhodou navrhovaného nového substrátu a spůsobu jeho přípravy je, že sa získá jednoduchým sposobom farebný substrát rozpustný v tlmivých roztokoch, v ktorých sa uskutočňuje stanovenie enzýmovej aktivity. Ďalšou výhodou je, že tento substrát je zrážaný a vymývaný za přítomnosti octanu sodného, t. j. za podmienok zhodných s podmienkami zrážania enzymaticky nerozštiepených farebných makromolekúl pri stanovení aktivity endo-l,4-/3-glukanáz. Výhodou je tiež to, že základné suroviny sú dostupné.The advantage of the proposed new substrate and the process for its preparation is that a colored substrate soluble in buffers in which the enzyme activity is determined is obtained in a simple manner. Another advantage is that this substrate is precipitated and eluted in the presence of sodium acetate, i. j. under conditions consistent with the precipitation conditions of the enzymatically undigested colored macromolecules when determining the activity of endo-1,4- / 3-glucanases. It is also an advantage that the basic raw materials are available.

Příklad 1 g hydroxyetylcelulózy sa rozpustí v 30 mililitroch dest. vody, potom sa přidá 0,3 gramov trojsodnej soli 2-chlór-4r(N-etyl-N-f enylamíno) -6- [ 4-metyl-2-sulf obenzén-1-azo-2-(l-hydroxy-3,6-bissulf onaft-l-yl) amíno]-1,3,5-triazínu (Ostazinová červeň bril. H—3B) rozpustenej v 5 ml dest. vody. Po dókladnom premiešaní sa přidá 5 ml 6 % hmot. vodného roztoku chloridu sodného· a 10 ml 15 % hmot. vodného rozteku hydrou xidu draselného. Mieša sa 2 h pri teplote 20 ^CC. Po zneutralizovaní reakčnej zmesi 3 mol. 1^_1 kyselinou chlorovodíkovou na pH 7 sa zafarbený produkt vyzráža s roztokom 93 ml 96 °/o obj. etylalkoholu a 93 ml acetónu.Example 1 g of hydroxyethylcellulose is dissolved in 30 ml of dest. water, then 0.3 grams of trisodium salt of 2-chloro-4R (N-ethyl-N-phenylamino) -6- [4-methyl-2-sulphobenzene-1-azo-2- (1-hydroxy-3, 6-bissulfonaphth-1-yl) amino] -1,3,5-triazine (Ostazin brilliant H-3B) dissolved in 5 mL of dist. water. After thorough mixing, 5 ml of 6 wt. % aqueous sodium chloride solution and 10 ml of 15 wt. aqueous solution of potassium hydride. Stir for 2 h at 20 ^° C. After neutralizing the reaction mixture, 3 mol. 1 ^_1 hydrochloric acid to pH 7, the colored product is precipitated with 93 ml solution of 96 ° / o by volume. ethanol and 93 ml acetone.

Vzniknutá zrazenina sa filtruje na nuči a premýva roztokom obsahujúcim 1 dřel 0,6 pere. hmot. vodného roztoku octanu sodného, 1,5 dielu 96 % obj. etylalkoholu a 1,5 dielu acetónu do bezfarebného filtrátu. Potom sa zrazenina premyje roztokom 96 % obj. etylalkoholu a vody 3 : 1. Ešte vlhká zrazenina sa rozpustí v 50 ml vody a lyofilizuje. Získá sa 1 g farebnej hydroxyetylcelulózy s obsahom 2,5 % hmot. trojsodnej soli 4-(N-etyl-N-fenylamíno )-6-[4-metyl-2-sulf obenzén-l-azo-2- (l-hydroxy-3,6-bissulf onaf t-l-yl) amíno]-1,3,5-triazín-2-yl. Příklad 2.The resulting precipitate is filtered on suction and washed with a solution containing 1 pulp of 0.6 pens. wt. aqueous sodium acetate solution, 1.5 parts of 96 vol. ethanol and 1.5 parts of acetone to a colorless filtrate. The precipitate is then washed with a 96% v / v solution. of ethanol and water 3: 1. The still wet precipitate is dissolved in 50 ml of water and lyophilized. 1 g of colored hydroxyethylcellulose with a content of 2.5% by weight is obtained. 4- (N-ethyl-N-phenylamino) -6- [4-methyl-2-sulfobenzen-1-azo-2- (1-hydroxy-3,6-bisulfonaphthyl) amino] trisodium salt - 1,3,5-triazin-2-yl. Example 2.

g hydroxyetylcelulózy sa rozpustí v 200 mililitroch dest. vody.pri teplote 40 °C. Potom sa přidá 8 g trojsodnej soli 2-chlór-4- (N-etyl-N-fenylamíno) -6- [ 4-metyl-2-sulf obenzén-l-azo-2- (l-hydroxy-3,6-bissulf onaf t-l-yl)amíno]-1,3,5-triazínu rozpustenej v 50 ml dest. vody a ďalej 50 ml 6 % hmot. vhodného roztoku octanu sodného a nakoniec 100 ml 4 % hmot. vodného· roztoku hydroxidu sodného. Mieša sa 1 h pri teplote 40 °C. Reakčná zmes sa zneutralizuje s 3 mol. I^-1 kyselinou octovou , na pH 7 a vyzráža za intenzívneho miešania s 860 ml 96 % obj. etylalkoholu a 430 ml acetónu.g of hydroxyethylcellulose is dissolved in 200 ml of dest. water at 40 ° C. 8 g of 2-chloro-4- (N-ethyl-N-phenylamino) -6- [4-methyl-2-sulfobenzen-1-azo-2- (1-hydroxy-3,6- bissulfonaphthyl) amino] -1,3,5-triazine dissolved in 50 mL dist. water and 50 ml of 6 wt. % of a suitable sodium acetate solution and finally 100 ml of 4 wt. aqueous sodium hydroxide solution. Stir 1 hour at 40 ° C. The reaction mixture was neutralized with 3 mol. 1 ^-1 with acetic acid, to pH 7 and precipitated with vigorous stirring with 860 ml of 96 vol. ethanol and 430 ml acetone.

Zrazenina sa přefiltruje na nuči a premýva roztokom obsahujúcim 1 diel 1 % hmot. vodného roztoku octanu sodného, 2 diely 98 % obj. etylalkoholu a 1 diel acetónu do bezfarebného filtrátu. Potom sa zrazenina premýva roztokom 96 % obj. etylalkoholu a vody 3:1a ešte vlhká sa rozpustí v 400 ml vody a lyofilizuje. Získá sa 10 g farebnej hydroxyetylcelulózy s obsahom 13 % hmot. trojsodnej soli (4-N-etyl-N-fenylamíno) -6- [ 4-metyl-2-sulf obenzén-1-azo-2-(l-hydroxy-3,6-bissulf onaft-l-yl) amíno] -1,3,5-triazín-2-yl-.The precipitate is filtered on suction and washed with a solution containing 1 part of 1 wt. aqueous sodium acetate solution, 2 parts of 98 vol. of ethyl alcohol and 1 part of acetone into a colorless filtrate. The precipitate is then washed with a 96% v / v solution. of ethanol and water 3: 1 and still wet is dissolved in 400 ml of water and lyophilized. 10 g of colored hydroxyethylcellulose are obtained with a content of 13% by weight. (4-N-ethyl-N-phenylamino) -6- [4-methyl-2-sulfobenzen-1-azo-2- (1-hydroxy-3,6-bisulfonaphth-1-yl) amino] trisodium salt] -1,3,5-triazin-2-yl.

Příklad 3Example 3

Postupuje sa ako v příklade 2 s tým rozdielom, že sa použije miesto octanu sodného 5 % hmot. vodný roztok síranu sodného a 6,5 g trojsodnej soli 2-chlór-4-(N-etyl-N-f enylamíno) -6- [ 4-metyl-2-sulf obenzén-1-azo-2- (l-hydroxy-3,6-bissulf onaf t-l-yl) amíno]-1,3,5-triazínu. Reakcia prebieha pri teplote 50 °C po dobu 1 h. Získá sa 10 g farebnej hydroxyetylcelúlózy s obsahom 20 pere. hmot. trojsodnej soli 4-(N-etyl-N-f enylamíno) -6- [ 4-metyl-2-sulf obenzén-l-azo-2- (l-hydroxy-3,6-bissulf onaf t-l-yl) amíno ] -l,3,5-triazín-2-yl-.The procedure is as in Example 2 except that 5% by weight of sodium acetate is used instead of sodium acetate. aqueous sodium sulfate solution and 6.5 g of 2-chloro-4- (N-ethyl-N-phenylamino) -6- [4-methyl-2-sulfobenzene-1-azo-2- (1-hydroxy-3) trisodium salt 6-bissulfonaphth-1-ylamino] -1,3,5-triazine. The reaction is run at 50 ° C for 1 h. 10 g of colored hydroxyethylcellulose containing 20 pens are obtained. wt. Trisodium salt of 4- (N-ethyl-N-phenylamino) -6- [4-methyl-2-sulfobenzene-1-azo-2- (1-hydroxy-3,6-bisulfonaphthyl) amino] -1 , 3,5-triazin-2-yl.

Příklad 4 g hydroxyetylcelúlózy sa rozpustí v 1 200 ml dest. vody počas 24 h. Potom sa přidá postupné 24 g trojsodnej soli 2-chlór-4- (N-etyl-N-f enylamíno) -6- [ 4-metyl-2-sulf abenzén-l-azo-2- {l-hydroixy-3,6-bissulf onaft-l-yl)amíno]-1,3,5-triazínu rozpustenej v 300 ml dest. vody, potom 50 ml 30 % hmot. vodného roztok u octanu sodného a nakoniec 600 ml 4 % hmot. vodného roztoku hydroxidu sodného. Teplota sa zvýši na 50 stupňov Celsia a reakčná zmes sa mieša pri tejto teplote 1 h. Po ukončení sa zneutralizuje s 5 mol.1¹ kyselinou octovou na pH 7 a zráža s 4 600 ml 96 % obj. etylalkoholu a 2 300 ml acetonu. Vyzrážaná zafarbená hydroxyetylcelulóza sa premýva roztokom obsahujúcim 1 diel 0,6 % hmot. roztoku octanu sodnéhd, 2 diely 96 % obj. etylalkoholu a 1 diel acetonu do· slabého sfarbenia filtrátu. Zrazenina sa ešte vo vlhkom stave rozpustí v 1 500 ml 0,6 % hmot. vodného roztoku octanu sodného a prezráža zmesou rozpúšťadiel obsahujúcou 3 000 mililitrov 96 % obj. etylalkoholu a 1 500 ml acetonu. Zrazenina sa přefiltruje cez nuč a premýva roztokom obsahujúcim 1 diel 0,6 % hmot. vodného roztoku octanu sodného, 2 diely 96 % obj. etylalkoholu a 1 diel acetonu do· bezfarebného filtrátu a nakoniec s roztokom 96 % obj. etylalkoholu a vody 3 : 1. Vlhká zrazenina sa rozpustí v 1 500 ml vody a lyofilizuje. Získá sa 55 g farebnej hydroxyetylcelúlózy s obsahom 15 pere. hmot. trojsodnej soli 4-(N-etyl-N-f eny lamino)-6- [ 4-metyl-2-sulf obenzén-l-azo-2-(l-hydroxy-3,6-bissul.f onaf t-l-yl )amíno]-l,3,5-triazín-2-yl-.EXAMPLE 4 g of hydroxyethylcellulose are dissolved in 1200 ml of dist. water for 24 h. Subsequently, 24 g of 2-chloro-4- (N-ethyl-N-phenylamino) -6- [4-methyl-2-sulfabenzene-1-azo-2- (1-hydroxyl-3,6-) -benzoate] was added in succession. bissulfonaphth-1-yl) amino] -1,3,5-triazine dissolved in 300 mL dist. water, then 50 ml of 30 wt. % aqueous solution in sodium acetate and finally 600 ml of 4 wt. aqueous sodium hydroxide solution. The temperature was raised to 50 degrees Celsius and the reaction mixture was stirred at this temperature for 1 h. After completion, it is neutralized with 5 mol / ^{l of} acetic acid to pH 7 and precipitated with 4600 ml of 96% by volume. ethanol and 2300 ml acetone. The precipitated colored hydroxyethylcellulose is washed with a solution containing 1 part of 0.6 wt. sodium acetate solution, 2 parts 96% v / v ethanol and 1 part acetone until the filtrate is slightly colored. The precipitate is still dissolved in 1500 ml of 0.6 wt. aqueous sodium acetate solution and precipitated with a solvent mixture containing 3000 ml of 96 vol. ethyl alcohol and 1500 ml acetone. The precipitate is filtered through suction and washed with a solution containing 1 part of 0.6 wt. aqueous sodium acetate solution, 2 parts of 96 vol. ethyl alcohol and 1 part acetone to a colorless filtrate and finally with a 96% v / v solution. of ethanol and water 3: 1. The wet precipitate is dissolved in 1500 ml of water and lyophilized. 55 g of colored hydroxyethylcellulose containing 15 pens are obtained. wt. Trisodium salt of 4- (N-ethyl-N-phenylamino) -6- [4-methyl-2-sulfobenzene-1-azo-2- (1-hydroxy-3,6-bissulfonaphthyl) amino ] -l, 3,5-triazin-2-yl.

Vynález má použitie v biochemii pře detekciu a kvantitativné stanovenie aktivity endo-l,4-/3-glukanáz ako zložiek celulázových enzýmových systémov.The invention has utility in biochemistry for the detection and quantitative determination of endo-1,4- / 3-glucanase activity as components of cellulase enzyme systems.

Claims

SUBJECT

1. Tri-sodium so! 4- (N-ethyl-N-phenylamino) -6- [4-methyl-2-sulfohenzen-1-azol-2- (1-hydroxy-3,6-bisulfonaphth-1-yl) amino] -1, 3,5-triazin-2-yl-hydroxyetyicelulózy.

2. A process for the preparation of a compound according to claim 1, wherein the water-soluble diethylcellulose is reacted in an aqueous solution containing from 1 to 3% by weight. sodium hydroxide or potassium hydroxide in the presence of salts such as sodium acetate, sodium sulfate and sodium chloride at 20 ° C to 50 degrees Celsius for 1 to 2 h with trisodium salt of 2-chloro-4- (N-ethyl-N-phenylamino) -6 - [4-Methyl-2-sulfobenzene-1-azo-2- (1-hydroxy-3,6-bissulfonaphth-1-yl) amino] -1,3,5-triazine

OF INVENTION at weight ratios of hydroxyethylcellulose: trisodium salt of 2-chloro-4- (N-ethyl-N-phenylamino) -6- [4-methyl-2-sulfobenzene-lazo-2- (1-hydroxy-3,6-bissulfulfate)] onaphthyl) amino] -1,3,5-triazine: sodium hydroxide or potassium hydroxide = 1: 0.2 to 0.8: 0.4 to 1.2; whereupon colored hydroxyethylcellulose is precipitated with a solvent mixture containing 1.5 to 2 volumes of 96% by volume. ethanol and 1 to 1.5 volumes of acetone, and the precipitate is washed with a solution containing 1 volume of 0.6 to 1% w / w. defective sodium acetate solution, 1,5 to 2 volumes of 96% vol. ethyl alcohol and 1 to 1.5 volumes of acetone up to a colorless filtrate.