CS221505B2 - Method of making the compounds of the type of n-acetylmuramyle - Google Patents

Description

Vynáleiz se týká způsobu výroby nových sloučenin typu 2- (2-acetamido-2-desoxy-3-O-D-glukopyranosyl Jalkanoylpeptidu, tj. sloučenin, které mají velmi cenné biologické a farmakologické vlastnosti. Vynález se obzvláště týká přípravy takových látek z této skupiny, které mají imunoregulační vlastnosti, jmenovitě vlastnosti nespecifických imunologických adjuvantů, kteréžto sloučeniny jsou schopné zesílit imunoproitektivní účinnost imunogenních látek všeho druhu, přírodních nebo syntetických.

Již dlouhou dobu je věnováno značné úsilí připravit účinné látky mající adjuvantní vlastnosti typu shora uvedeného. Dlouho bylo výzkumné úsilí věnováno přírodním extraktům získávaným z bakterií, obzvláště z mykobakterlí. Ačkoliv mohou být získány produkty vysoce účinné a dosahující vysokého stupně čistoty, rozhodující pokrok byl učiněn zaměřením se na řadu menších molekul, nyní dostupných chemickou synthesou. Jednu z nejrepresentativnějších látek této řady představuje 2-(2-acetamido-2-desoxy-3-O-D-glukopyranosyl) -D-propionyl-L-alanyl-D-isoglutamin, nazývaný také jednodušeji N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutarnin vzorce и, OH / NH-COCH^

H.C- GH-CO-NH-CH-CO □ I ch₃

-NH-CH-CONH_Z (CH^ COOH

Takto bylo možno získat řady sloučenin zbavených dobře známých toxických účinků, vyvolávaných imunostimulanty, jejichž účinnost iako imunologických adjuvantů u některých z nich je velmi silná, když jsou tyto látky podávány hostiteli i v nepřítomnosti jakýchkoliv olejovitých nosičů, jak to bylo dříve nutné, aby se mohly projevit imunologicky adjuvantní vlastnosti přírodních extraktů, zejména získaných z mykobakterií.

Studium sérií těchto sloučenin umožnilo zjistit, že modifikace nebo substituce jistých funkčních seskupení vyskytujících se na různých místech molekuly, například nahrazení prvního, aminokyselinového zbytku peptidového řetězce v N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaiminu může být .provedeno, aniž se ztratí adjuvantní účinnost výchozí látky.

Adjuvantní účinnost může být zachována také v případě nahrazení prionylsku'piny, substituováním polohy 2 glukopyranosylového zbytku jinou skupinou alkanoylového typu v odpovídajícím místě molekuly. Konečně, první aminoacylový zbytek, totiž L-alanylový, může být nahrazen jiným aminoacylovým zbytkem, jako glycylovým nebo přednostně L-serylovým. Stejně tak je možno nahradit jej jiným amlnoacylovým zbytkem, například L-.prolylovým, L-threonylovým nebo L-valylovým.

Naproti tomu jiné části molekuly nemohou být modifikovány rozsáhlejším způsobem, aniž by nedošlo ke ztrátě, alespoň ve velké míře, adjuvantní účinnosti celku molekuly.

Z tohoto hlediska přítomnost skupiny odvozené od kyseliny glutamové v peptidovém řetězci, jakožto druhého aminokyselinového zbytku v peptidovém řetězci, je zřejmě kritická pro zachování adjuvantní účinnosti. Dále pak, obecně platí, že velmi účinné sloučeniny jakožto imunologické adjuvanty jsou takové, u nichž α-karboxylová skupina glutamového' zbytku byla přeměněna na amidovou skupinu, když jsou .používány ve formě emulze voda — v oleji. Důležitost karboxamidové konfigurace a-karboxylové skupiny glutamového zbytku byla zdůrazněna různými autory. V tomto směru je možno se odvolat na pozorování Arletty Adamové a spol. (Biochemical <& Btological Research Communications, svazek 72, č. 1, 1976), kteří například zjistili slabší adjuvantní' účinnost v oleji u dimethylesteru kyseliny N-aoetylmuramyl-L-alanyl-D-glutamové (který má jiné, nanejvýš zajímavé biologické vlastnosti) než u y-methylesteru N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminu.

Podobná pozorování byla učiněna skupinou japonských výzkumných pracovníků, jak je uvedno v publikaci: Shozo Kotani a spol. (Biken Journal, svazek 19, 3—13, 1976).

Sloučeniny popsané ve stavu techniky, mezi nimiž ty, jejichž glutaminový zbytek je a-karboxamidovaný, ntaméně projevují in vivo určitý pyrogenní účinek, zejména když jsou podávány ve zvýšených dávkách. Ze studií uskutečněných v této oblasti různými pracovními skupinami <vy-chází najevo, že existuje nápadná korelace mezi .adjuvantním účinkem¹ vysoce účinných látek a jejich pyrogenitou, za určitých experimentálních podmínek. Shoze Kotani a spol. vyslovily hypothesu, že tato pyrogenita může být přičítána příbuznosti mezi studovanými . sloučeninami a peptídoglykanovými fragmenty, které mohou být získány z grampositivních bakterií (v publikaci zmín&nré již vpředu).

Tito autoři vytvořili hypothesu, že by popřípadě mohl existovat vztah mezi mechanismy zasahujícími na úrovni* imunologických odpově# ssavc^{ů pů}so^bením· antl^genov^é stimulace a mechanismy zasahujícími na úrovni regulace tělesné teploty nebo febrilní odpovědi. · Vyslovili také myšlenku, že určitá místa. N-acetylmuramylpeptidů jsou zúčastněna v těchto mechanismech. Skutečně autoři zjistili mezi¹ sloučeninami, které zkoušen, že nejsilnější adjuvanty b^yly ta^{ké 1} nejvíce pyfogenní a naopak slabší adjuvanty byly také méně pyrogenní.

Toto pravidlo nebylo až dosud .opravdu účinně zpochybněno, i když některé produkty již popsané mají velmi nízkou pyrogenitu v experimentálních dávkách a· podmínkách. Tak je tomu například u diamidu kyseliny N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutamové. Avšak tato· látka, i kdž má therapeutický index zvláště příznivý, je také méně účinná než N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin.

Rozšíření studií v této oblasti, obzvláště tec^hnlky^, vedlo к přípravě novýc^h sloutenin, kteiré jsou .předmětem. vynálezu, a umožnilo dospět k řadě překvapujících závěrů. Skutečně je možno · získat adjuvantní sloučeniny •velmi účinné, mající jen· jednu amidovou· funkci .nahrazující slkupinu y-kanboxylovou v glutamovém zbytku těchto derivátů za podmínek, že a-karboxylová skupina v glutamovém zbytku je tatoéž substhuována určitým· způsobem, jejich adjuvantní účinnost se pak projevuje také dobře ve vodném roztoku, jakož i v emulzi voda v oleji. Tento výsledek je tím více neočekávaný, neboť je dobře známo, že N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutami-n (mající jednu amidovou funkci na y-karboxylové .skupině glutamylu) je jen velmi slabě adjuvantně účinný in vivo, když je podáván ve formě emulze voda v oleji.

Tedy nápadná korelace, která . byla. pozorována mezi- adjuvantním působením a pyrogenním působením u známých sloučenin, je vážně uvedena v pochybnost experimentálními výsledky získanými v .rámci tohoto vynálezu. Jsou to. právě sloučeniny vyrobené podle vynálezu, z nichž některé se vyznačují .takovým stupněm apyrogenity, jakého zatím nebylo dosaženo.

Tato zjtétem platt pro slouteniny připravené podle vynálezu, které tak jako sloučeniny známé ze stavu techniky, jsou sloučeninami ^typu 2-(2-arnino nebo. ac^ylamlno-2-desoxy-i3-0-D-glu kopyranosyl) alkanoylpeptidu. ^V tomto pHpadě jde .o substituci a nahrazení, které byly zmíněny vpředu, nicméně jsou tyto. ^lát^ky charakterⁱzov^án^y současnou přítomností amidové funkce (—CONH2) na skupině y^arboxytové a. esterov^{é f}un^kce na skupině α-karboxylové glutaminového zbytku.

Vynález se obzvláště týká způsobu přípravy nových sloučenin odpovídajících obecnému vzorci I

CH, i *

CH,

CO-NH, , ^г (I) ve „ kterém

Ri značí skupinu hydroxylovou, aminovou nebo aminofenylovou,

R6 značí atom vodíku .nebo sukcinylovou skupinu,

R7 značí přímý nebo rozvětvený alkylový zbytek . až s 10 atomy uhlíku a

X značí aminoacylový zbytek ze skupiny zahrnující L-alanyl, L-valyl, glycyl a seryl.

Podstata výroby sloučenin obecného· vzorce I způsobem· podle vynálezu je v .tom, že se provede kondenzace karboxylové skupiny sacharidové sloučeniny obecného vzorce II

ve kterém

Ri má shora uvedený význam a

Re‘ značí atom vodfcu nebo skupinu pteměntelnou v skupinu sukcinylovou sukcinylací .sloučeniny obecného . vzorce II sukcinylanhydridem, s aminovou funkcí aminoacylové .skupiny X esterového derivátu dipepttou obecněho vzorce ΠΙ

H—X—NH—CH—COORz

CH2 (III),

CH2—CONH2 ve .kterém

X a R7 mají shora uvedené významy, nebo odpovídajícího neesterifikovaného· derivátu ^kyseliny uvedeného ^dipe^ptidu, přičemž uvedena sukcinylace se provádí bud ^před kondenzací, nebo. po ní, má-li být R6 sukcinylovou skupinou v konečném produktu, a a-kairboxylová · funkce glutaminové skupiny získané sloučeniny se popřípadě po kondenzaci kondenzuje-li se uvedený derivát · typu muramylu s uvedeným derivátem dipeptidu, avšak ve formě kyseliny, působením alkoholu obecného vzorce R7O1H, v němž R7 má .shora uvedený význam, anebo esteriíikačním čini-dtem z n^ěho· odvozeným, přičemž reaktivní funkce se popřípadě předem chrání a po· kondenzaci se uvolní a získaná sloučenina se popřípadě sukcinyluje.

Ze sloučenin obecného vzorce I jsou někter^é zvtášlé výhodné. Mže· jsou uveden^y •rozdHné významy proměnlivých ^částí obecného vzorce I odpovídající strukturám, kterým je dávána přednost.

V tomto· vzorci druhá aminoacylová skupina peptidového řetězce vázaná na · zbytek muramylového typu je zbytek D-gluitaminový. První aminoacylová skupina (označená X) může naproti tomu být vybrána z rozmanitých aminoacylových z^bytků zmín^ěných výše.

Skupinou v α-poloze D-glutaminového· zbytku je s výhodou esterová skupina s 1 až ⁴ atomy uhl^íku v uhhkovém řetézci.

Jednou z preferovaných . forem je případ, kdy R7 značí bud —CH5, nebo —C2H5, nebo —C3H7.

Jinou preferovanou formu tvoří sloučeniny, •ve kterých zbytek R7 obsahuje 4 atomy uhlíku.

Glykosidická vazba sacharidové části produktů podle vynálezu se může vyskytovat v anomerních formách a nebo β.

Preferované sloučeniny jsou takové, u kterých substituent Rt je hydroxyl.

Preferované sloučeniny vyrobené podle vynálezu jsou methyl-, ethyl-, propyl-, hexyla decylestery NlacetylmuramyllL-alany·l-D-glutaminu.

Jiné preferované sloučeniny obecného· vzorce I jsou ty, jejichž rozdílné substituenty jsou uvedeny v tabulce:

Ri X R7

OH	L-Ala	CaHs
OH	Gly	CHs
OH	Gly	C4H9
OH	Gly	CeHlS
OH	Gly	C1DH21
OH	L-Ser	CH3
OH	L-Ser	C4H9
OH	L-Ser	C0H13
OH	L-Ser	C10H21
OH	L-Val	GH3
OH	L-Val	C4H9
OH	L-Val	C0H13
OH	L-Val	C10H21
OH	L-Ala	C10H21
C6H4-NH2	L-Ala	CHs
CeH4-NH2	L-Ala	C4H9
C6H4-NH2	L-Ala	C10H21
'C6H4-NH2	L-Ala	CHs
C0H4-NH2	L-Ala	C4H9
C6H4-NH2	L-Ala	C10H21

Podle vynálezu se shora uvedené sloučeniny připraví synthesou. Některé sloučeniny používané při těchto synthesách mohou pocházet z přírodních produktů.

Podle vynálezu synthesa těchto látek zahrnuje v sobě sérii postupných reakcí vedoucí ke spojení fragmentů ^tvořícíc^h základní strukturu konečné sloučeniny, to značí muramovou první a· druhou amino^ky se-linu. Podle · vynálezu jsou také možná rozdílná pořadí synthesy k získání těchto· látek. ^V podstatě se ИЙ pořadím, ve kterém se fragmenty spolu spojují.

^PodLe prvního postupu přípravy podle vynálezu se provede spojeni derivátu kyseliny muramové postupně s derivátem první aminokyseliny, pak druhé aminokyseliny.

Podle druhého· postupu přípravy podle vynálezu se provede spojení dvou aminokyselin a· vytvoří se dipeptldový fragment, který se spojí s derivátem kyseliny muramové nebo jejím, analogem.

U ^dvou predeslýcli z^půso^bů- druh^á aminokyselina, tj. ta, která má strukturu glutaminu, může být esterifikována v poloze a, (která odpovídá zbytku R7 v obecném vzorci I), před prováděním různých spojení, avšak es221505 terifikace může být také provedena bud’ na peptidovém řetězci, nebo až na muramyldipeptidové sloučenině.

Volba pořadí synthesy při způsobech přípravy podle vynálezu uvedených níže je vedena důvody, jako- je snadnost provedení, výtěžek a snaha o získání homogenního produktu, zejména z hlediska stereochemického.

Při přípravě podle vynálezu, derivátem použité kyseliny muramové je kyselina muramová, jejíž funkce schopné reagovat při spojovacích reakcích, s výjimkou karboxylové funkce, jsou buď substituovány, nebo blokovány chránícími skupinami. Stejně tak deriváty aminokyseliny nebo dipeptidový fragment, jsou chráněny během spojování takovým způsobem, že mohou reagovat pouze funkční skupiny zajišťující toto spojení.

Chránění funkčních skupin, aby nereagovaly, se provede obvyklým způsobem.

P'ro chránění karboxylových skupin se s výhodou připraví estery a zejména benzylestery, které mohou být odstraněny hydrogenolysOu, aniž by se zničila, peptidová vazba. Na druhé straně· hydrogenolysa umožňuje současně jiných odstnainění chránících skupin, jako N-karboibenzoxyskupiny.

Chránění amínoskupin se s výhodou provede skupinami alkyl- nebo aryloxykarbonylovými', zejména skupinou benzyloxykarbonylo-vou. Tato skupina se také odstraňuje šetrnou katalytickou hydrogenolysou (v přítomnosti paládia).

Jinou výhodou chránící skupinou je skupina , ,tosylová“ (toluensulfonylová). Tato skupina se zavádí působením chloridu kyseliny p-toluensulfonové na alkalický roztok aminokyseliny, která má být chráněna.

Spojování fragmentů se provádí známou technikou. Je možno použít také techniku smíšených anhydridů. Při této technice se s výhodou¹ připraví anhydrid tím, že se uvede v reakci aminokyselina nebo peptid s chráněnou aminoskupinou, s alkylchlorformiátem (Cl—CO—O—R), například v toluenu v přítomnosti terciárního aminu (zvláště N-methylmorfolinu). Vzniklý smíšený a.nhydrid se snadno kondesuje s aminokyselinou obvyklým způsobem.

Kondensace se stejně dobře uskuteční také přímo, pomocí NjN^dicyklohexylkarbodiimidu.

Jiný způsob kondensace s výhodou používaný, je způsob za použití takzvaných aktivních esterů. Podle této metody se připraví ester karboxylové funkce, která má být napojena,. Ester je s výhodou sukcinimidový ester.

Tyto kondensační reakce jsou vždy prováděny za šetrných podmínek, které chrání před nebezpečím racemisace produktů. Stejně tak se s výhodou pracuje při teplotách místnosti, nebo při teplotách nižších, než je teplota místnosti. Podmínky pH jsou také podle klasického způsobu, blízké neutrálnímu pH.

Volba rozpouštědla je také důležitá. Pro dobrý průběh těchto reakcí se s výhodou používá rozpouštědlo mající polární povahu. Na druhé straně, aby bylo* možno pracovat za podmínek uspokojující koncentrace, se rozpouštědlo volí tak, aby umožňovalo dobrou rozpustnost produktů, které jsou lipofilní. Výhodným rozpouštědlem, které odpovídá požadavkům, je dimethylformamid.

V dalším jsou uvedeny základní popisy vztahující se na různé operace, které je nutno provádět při synthese produktů obecného vzorce I, nejprve sledováním každé etapy odděleně, potom uvedením některých typických reakčních sledů, kterým je dávána přednost.

1. ai) Příprava kyseliny muramové, jejích analogů nebo jejich derivátů

Příprava, těchto látek se může provádět z látek popsaných v dřívějších publikacích. Takové látky, jejichž příprava se neobjevila v literatuře, mohou být získány způsoby pro přípravu odpovídajících derivátů, používanými klasicky v chemii oligosacharidů.

Příprava kyseliny N-acetylmuramové, nebo některého z jejích analogů se může provést způsobem popsaným ve francouzském patentu č. 2 292 486.

Tato synthesa zahrnuje například přípravu sodné soli hydroxylu v poloze 3 a další kcndensaci sodné soli se solí nebo esterem kyseliny 2-chIorpro₍plonové. Použitá halogenkyselina v L-formě může být připravena metodou, kterou popsal Sinay a spol. (J. Biol. Chem. 24'7, 391 /1972/).

Když se použije ester halogenkyseliny, aby bylo možno provést další peptidovou kondensaci, může být karboxylové funkce uvolněna vhodnou hydrolysou.

b) Substituce na sacharidovém zbytku

Když se vyjde z N acetyl-muramového derivátu blokovaného v polohách 1, 4, 6, získaného podle a)

CH^OH

/ NH-COCH^

CHrCH-CO*. .

O je možno připravit různé analogické sloučeniny, ve kterých acetylová skupina -vázaná na dusík v poloze 2 je nahrazena swbstituenty, jejichž povaha je dána obecnou definicí, tj. acylovou skupinou nejvýše s 22 atomy uhlíku. Při této modifikaci je možno pracovat známým způsobem — hydrolysou асе221505 dět -tuto substituci na -dipeptidovém -derivátu. V obou dvou - případech se reakce prová12 tylu silnou basí — například jak popsali

P. H. Gross a R. W. Jeanloz v publikaci citované vpředu.

Získaná sloučenina, ve které aminoskupina je v .poloze 2 glukopyranosidového kruhu, může být znovu podrobena¹ acylaci -za obvyklých podmínek příslušným acetylačním činidlem odpovídajícím· skupině СНз, která má být zavedena. Jako acylačního činidla je možno použít jmenovitě zejména anhydridy nebo chloridy kyselin.

Substituce· v poloze 1 mohou být uskutečněny metodami, '-které již byly dříve -popsány a které jsou obvyklé v chemii cukrů. Během těchto reakcí, polohy, které nemají být substituovány, nebo ty, které mají být později jinak substituovány, se -dočasně blokují chránícími skupinami obvyklými způsoby.

Chrániči skupiny původně přítomné, -v případě že se vychází jak bylo vpředu popsáno z benzyl-Znacetamido-é^-O-benzylidein^-desoxy-D-glukopyraniosidu, se odstraní například působením kyseliny octové (·60 %, jednohodínovým varem- pod zpětným chladičem-) a katalytickou hydrogenací, - kterou popsal Merser a -spol. (Bioch-em-. Biophys. Res. Commun. 466, 1316 /1974/), nebo katalytickou -hydrogenací, kterou například popsal Lefrancier a spol. (Int. J. Peptide- Protein Res. 9, 219 91977/).

Substituce se provádí způsoby obvykle používanými. K získání acylovaných derivátů se pracuje pomocí acylačních činidel, která odpovídají substituentům, které mají být zavedeny (anhydridy, acylchloridy atd.).

Substituce na osidovém -zbytku může -být provedena, před, nebo po připojení peptidového řetězce, nebo jeho fragmentů.

2. Příprava peptidového řetězce

Synthesa peptidového zbytku se provádí klasickými metodami používanými ' - yro' synthesy peptidů. Například je možno použít metod aktivace karboxylů, - jako -je metoda smíšených anhydridů. S výhodou se- peptidová -synthesa provádí pomocí sloučenin typu karbodiimidu, jako je N,N‘-dicyklohexylkarbodiimid nebo ekvivalentní karbodiimidy. Přehled tradičních metod ' peptidových synthes je v práci J. H. Jones, Chem-istry and Industry, 723 (1974). Dále je možno se odvolat na článek ' Lefrancie-ra a spol. (Int. J. Peptide Protein Res. 9, 249 /1977,/).

Substituce- karboxylové funkce D-glutaminnvvho zbytku esterovou funkcí (R7) se s výhodou provádějí ' -na derivátu D-glutamrnu před jeho spojením s derivátem- L-al-aninu. Nicméně je možno taktéž s výhodou -prová dí například technikou, kterou popsal Wang á spol. (J. Org. Chem. 42, 1286 /1977,/).

Sled -synthesy glykopeptldů vzorce I (viz schéma- I -dále)

Výchozím -produktem je derivát obecného vzorce ' (1), kde Ri - značí beozylglykosidový zbytek připravený jak popsali Gross a Jeanloz (J. Org. Chem. 02, '2759 /1967,/). K získání podobných sloučenin vzorce 1, kde Ri jejioá skupina- než benzytová, je možno -použít metodu pro přípravu a- nebo jl-glukosidů popsanou v témže článku, nebo kteroukoliv metodou pro takovou přípravu známou z chemie oligosacharidů.

Deriváty vzorce - (1) mohou být -spojeny s dipeptidovými deriváty obecného vzorce

H—X—D—Glu(N.H2)—O—R7 hydrochlorid.

Různé peptidové deriváty se připravují metodami popsanými Lefrancierem· a spol. (Int. J. Peptide Protein Res. 9, 249: /1977/; 11, 2819 /1978/).

Způsoby spojování používané k získání glykopeptidových derivátů vzorce (5) jsou taktéž popsány v článcích Grosse a Jeanloze (J. Org. Chem 32, 2759 /1-967/) a Ozawy a Jeanloze (J. Org. Chem. 30, 448 /1£t63-/). Nicméně při synthese dipeptidových. derivátů jakož i při synthese- derivátů vzorce (5>) ' může být stejně dobře použita kterákoliv metoda -spojování.

Katalytická hydrogenace sloučenin vzorce - -(5) se provádí klasicky (Lefrancier a spol., 1977, citovaný odkaz J., čímž se dospěje ke- sloučeninám· -vzorce-' (6,).

Při jiné -variantě se -deriváty vzorce (5) podrobí selektivní debenzylaci, kterou popsali Merser a spol. (Biochem. Biophys. Res. Commun. '66, 1316- /19-73/) a ' získají se -deriváty vzorce- (7).

U varianty, ' při které karboxylová - funkce D-glutaminového zbytku je - volná (R7 —OH) u derivátů vzorce- (5), (7) se potom zavede .esterové seskupení (R7) technikou podle Wanga a -spol. - (J. Org. Chem. 42, 12í86 /1977/) a získají se deriváty vzorce (6).

Schéma I

Sled -synthesy sloučenin odpovídajících variantě -obecného ' vzorce, ve kterém Ri značí —OH nebo —NHž

Vynález se týká také způsobu použití sloučenin nodle¹ vynálezu, zejména jako biologicky účinných látek, nebo jako účinných látek ve farmaceuťckých komposicích.

Vynález se týká biologicky účinných látek, například standardů imunologických' adjuvantů, které mohou být tvořeny sloučeninami připravenými podle vynálezu, zejména z hlediska studia případných adjuvantních vlastností studovaných látek ve srovnání se standardními admvantmmi látkami, nebo také naopak jako látek schopných potlačit některé účinky spojené s podáváním imundsupresivních látek.

Vynález se také ještě týká přípravy farmaceutických přípravků, jejichž účinnou složkou je nejméně jedna ze sloučenin připravených podle «vynálezu, kterážto léčiva jsou použitelná ia.ko regulátory imunitní reakce subíektu, kterému byla podána.

Tato léčiva isou jmenovitě aplikovatelná, když žádáno zesílení imunitní odpovědi u všech imunogenních agens. Tato imúnogenní agens mohou bvt přírodní nebo syntetická a vyžadují použití látek stimulujících imunitní systém ať je imunogenní agens slabé povahy, nebo silné a může být použito jen ve velmi slabých dávkách, nebo když imunogenní charakter byl zeslaben, například vlivem přecházejících modifikací nebo čistění. Obecně, použití imunoregulačních sloučenin podle vynálezu je užitečné vždy, když imunogenní agens nedovoluje vyvolat dostačující odpověď.

Sloučeniny podle vynálezu se používají zvláště ke zvýšení imunogenního· účinku aktivních principů vakem podaných hostiteli, zvířeti nebo člověku, zvláště v případě, kdy tyto vakcinační principy náležejí do kategorií imunogenních agens zmíněných výše. Následkem toho se vynálezu týká stejně tak přípravy farmaceutických nříoravků, jejíchž účinnou složku tvoří neúnéně jedna z těchto sloučenin, ve spoienf s farmaceutickým· nosičem vhodným pro: požadovaný způsob podávání, nebo používaný z hlediska povahy použitého vakemačního principu.

Vynález se obzvláště aplikuje u takových vakcinačních agens. která man silný imunogendí charakter, ale která se těžko používají v normální době z důvodu příliš vysoké toxicity nebo nežádoucích vedlejších účrnků. Bvlo potvrzeno, že adiuvantní látky podle vynálezu jsou schopné účinně kompensovat ztrátu imunogenního účinku, která obvvkle nastává následkem zředění nebo zmenšení používaných dávek, jmenovitě za účelem snížení tolxicity nebo vedlejších účinků shora jmenovaných, v odpovídající míře a to bez nepříznivého ovlivnění ieuch účinků.

Stemé účinky bvly zjištěny v případě silných vakcinačních agens. jejichž imunogenní charakter byl snížen, zejména nutným čištěním, kde to bylo nezbvtné к odpovídajícímu snížení jench toxických nebo vedlejších účinků. Tak tomu je zvláště u vakcinačních principů tvořených bakteriálními nebo virovými anatoxidy, nebo obecně u vakcinačních principů .tvořených částí složek původně obsažených v bakteriích nebo· virech, proti nimž ie hledána ochrana.

Obecně, vynález se aplikuje u všech antigenů, které byly podrobeny chemickým· nebo fyzikálním transformacím, iejichž cílem byla eliminace nebo· modifikace částí antigenů, které způsobuií jejich nežádoucí vedlejší účinky, za současného zachování čás221505 tí, které jsou nositeli imunogenních vlastností. Tak na slabé imunogeny, například principy pozůstávající ze subjednotek viru chřipky a které v sobě nepozdržují hemagluitininy a neuraminidasy s výjimkou nukleoproteinů a ostatních nukleotldíckých součástí viru, z něhož jsou odvozeny^ Toto se aplikuje stejně také na určité anatoxiny, například záškrtu nebo tetanu, které jak známo mohou být tvořeny látkami rozpustnými, které se získávají současným působením formaldehydu a tepla, na bakteriální toxiny získané z odpovídajících bakterií.

Sloučeniny připravené podle vynálezu, zejména takové sloučeniny vzorce I, kde R7 obsahuje 4 atomy uhlíku nebo více, jsou také používány pro přípravu komposic určených к léčení infekčních onemocnění. Při této aplikaci je třeba poznamenat, že produkty podle vynálezu se jasně odlišují od antibiotik obvykle používaných. Tyto produkty, oproti antibiotikům, nemají baktericidní nebo bakteríostatické účinky in vitro. Naproti tomu mohou aktivovat magrofágy isolované in vitro a jejich působení in vivo se· projevuje jak bude patrno z příkladů farmakologických zkoušek. Ještě oproti antibiotikům, jejich působení není omezeno na určité druhy mikroorganismů. To se vysvětluje skutečností, že jejich působení není přímé, ale uskutečňuje se prostřednictvím nespecifické imunitní obrany hostitele, mechanismy, jež jejich podáváním stimuluje a rozvíjí. Tyto rozdíly v působení ve srovnání s antibiotiky činí tyto produkty tím zajímavější, že mohou být použity proti pathogenním zárodkům, které se staly resistentními vůči antibiotikům.

Způsob působení těchto látek se blíží protiinfekčním sloučeninám známým jako B'CG nebo lipopolysacharidy a jako tyto mohou být použity s úspěchem při léčení infekcí, aniž by se přitom vyskytovaly nesnáze, zejména toxicita, která omezuje nebo¹ vylučuje p oužití LPS nebo В CG.

Produkty připravené podle vynálezu mohou být použity obzvláště při potírání nespecifickým způsobem nemocí vyvolaných mikroorganismy, jako Klebsiella, Pseudomonas, Staphylococcus atd.. ·

Aplikace uváděné vpředu jako příklady nevylučují jiné aplikace využívající imuinoregulační vlastnosti sloučenin připravených podle vynálezu. Je možno ještě uvést jako příklad jejich zesilující účinek na úrovni specifické imunisace hostitele s ohledem к parasitárním antigenům, obnovení imunokompetence, když tato má nižší úroveň než normálně, jmenovitě když bylá poškozena antigeny nebo parasity samotnými, nebo vlivem chemoitherapie, radiotherapie, nebo jakýmkoliv jiným léčením· působícím imunosupresivně.

Farmaceutické komposice podle vynálezu, připravené obvyklým způsobem jsou vhodné к léčení nebo к prevenci nakažlivých onemocnění bakteriálního nebo parasitárního původu, nebo к potlačování nádorových onemocnění.

Adjuvanty připravené podle vynálezu mohou být podávány hostiteli — zvířeti nebo člověku — jakýmkoliv způsobem vhodným к dosažení žádaného účinku. Podávání ímunoregulačního principu, zejména adjuvantu, a imunogenního· agens, zejména vakcinačního antigenu, může být provedeno současně nebo odděleně, v posledně jmenovaném případě, popřípadě časově posunuté, popřípadě ještě podávány stejnými aplikačními cestami nebo rozdílnými (například parenterálně a· orálně, nebo naopak j.

Pro přípravu různých farmaceutických přípravků mohou být sloučeniny podle vynálezu sdružovány s jinými účinnými substancemi. Zejména sloučeniny vzorce I jsou s výhodou sdružovány s imunogenními látkami, ať jde například o imunogenní látky používané ve velmi malých dávkách, nebo o slabě imunogenní látky.

Výhodné farmaceutické přípravky představují injikovatelné roztoky nebo suspense, nebo liposomní formu, obsahující dostatečně účinnou dávku nejméně jednoho produktu připraveného podle vynálezu. S výhodou tyto roztoky nebo suspense, nebo liposomní forma, se připravují ve sterilní vodné isotonické fázi, s výhodou s chloridem sodným nebo glukosou.

Z těchto roztoků, suspensí nebo liposomních forem jsou to obzvláště takové, které jsou způsobilé к podávání iinitradermáltními, intramuskulárnímii nebo subkutánními· injekcemi, nebo skarifikacemi·.

Jiné farmaceutické přípravky připravené podle vynálezu jsou takové, které se dají podávat jinými cestami, jmenovitě orálně nebo rektálně, nebo také ve formě aerosolů určených к .tomu, aby přicházely do styku se sliznicemi, zejména sliznicemi očními, nosními, plicními nebo vaginálními.

V těchto farmaceutických přípravcích je obsažena jedna nebo více sloučenin podlé vynálezu ve spojení s pomocnými látkami farmaceuticky vhodnými, pevnými nebo kapalnými, vhodnými svou konstitucí pro formu aplikace orální, okulární nebo nasální, nebo s pomocnými látkami vhodnými pro formu rektální, nebo .také pomocné látky gelovité pro podávání vaginální. Jsou to také kapalné isotonické přípravky obsahující nejméně jeden z produktů podle vynálezu, uzpůsobené к aplikaci na sliznioe, zejména oční nebo nosní. Konečně jsou to přípravky obsahující farmaceuticky vhodné zkapalněné plyny, .typu „propelentu“, ve kterých jsou produkty podle vynálezu rozpuštěny nebo obsaženy v suspensí, jejichž uvolněním se vytvoří disperse nebo aerosol.

К posílení imunitní obrany hostitele, jsou dostatečně účinné dávky produktů připravených podle vynálezu, v některé ze shora zmíněných aplikačních forem, výhodně řádu 10 až 1000 /íg pří podávání parenterální cestou, .nebo dávka 200 až 20 000 /zg/kg tělesné hmotnosti, například 1000 .g pro jiné způsoby podávání, například pro cestu orální.

Jiné charakteristiky vynálezu budou patrné d^ále z popisu přípravy sloučenin podte vynálezu a také z popisu testů vyplynou vlastnosti připravený^ .produktů

V dalším popisu používané zkratky mají tyto· významy:

Ala: alenin Gin: /lutamin Mur-NAc: kyselina N-acetyl-muramová BOC: terč.butyloxykar bony 1

OME: methylester OBu: butylester OSu: sukcinimidový ester Bzl: benzyl

Bzi: benzyliden

Z: bmzyloxykarbonyl

P ř í k 1 a d 1

Synthesa methylesteru N-aeetyl-muramyl-L-alanyl-D-gluitaminu (I) a j terobutyhoKykarbonylderlvát methylesteru-D-glutaminu BOC-D-Gln-OMe (1)

1,5 g g^l6,1 mmol) terc.buityloxykarbonyl-D-^/lutamⁱnu (ВОС-О-СШ^ připraveného zp^ůsobem, který popsal Schnabel (Liebigs Ann. Chem. 702, 138—196 /1967,/) se rozpustí v 00 ml absolutního methanolu. Při 0°C se po kapkách přidá roztok diazomethanu v etheru· až do trvalého žlutého zbarvení. Reakční směs se udržuje za. míchání 10 minut při 0°'С a potom stejnou dobu při teplotě místnosti. Postup· reakce se ověří chromato/rafií na tenké vrstvě siUka/elu v systému rozpouštědel n-butanol — kyselina octová — — voda (4:1:5·, v^yšší ^fáze), n-butanol — — pyridin — kyselina octová — voda (30: :20:6:24) a chloroform· — methanol (5: : 1 ]. Přebytek · diazomethanu se odstraní přidáním ledové ^kyseliin^y octov^é a reakčrn směs· -se· zkonceintruje do sucha. Zbytek se vyjme· do minimálního· množství · ethylacrtátu a srazí se petroletherem; Teplota tání 86 až IC!°C, otá^čivost [a]_D ²⁵=+²^4^^,7° (methanol). Získá se 1,417 g B(OC-D-Gln-OMe (89,7 procenta).

Pro C11H20N2O5 (260,29) vypočteno:

50^,76 % C, 7,7'5 % H, 10^;,7'6 · % N, nalezeno:

•50,62 % · C, 7^,75 % ^H 10^/82 % N.

b) Hydrochlorid methylesteru D- ’ -gluitaminhydrochloridu D-Gln-OMe (11)

Na 1,4 g . (5,4 mmol) I se působí 15 ml roztoku 1 N kyseliny chlorovodíkové v ledové kyselině octové. Po 30 minutách při tep^lot^ě místnosti se reakM směs zkoncentruje do sucha a získaný olej se vysu^ší ve vakuu v přítomností KOH.

c) · Methyl-ester terc.butyloxykarbonyl-L-alia ny l-D-gluitaminu BOC-L-ALa-D-Gln-OMe (111) ^{1,86 g} (^6,5 mmolj sutoinimidového esteru trrc.buιiyloxykarbo^ιnylalanmu (BOC-Ala-OSu), připraveného podle Anderson a ·a spol. (J. Am. Chem. Soc. 86, 18’39—1842 ^/1964/) se* ^přid^{á k} roztoku ^{1,2 g} (^5,4 mmol) 11 a Ο16 ml (5,4 mmol) N-metíhylmorfolinu ve· 25 ml dimethylformamidu. Po stání přes noc při teplotě místnosti se reakční směs zkoncentruje do sucha a. chromato/rafuje se na koloně (27 X 3 cm) kysličníku křemimtého', ^př^edem promy.tého systémem chloroform — rsopropylalkohol — kyselina octová (100 : 0,55 0,2) ' a eluuje se systémem chloroform· — isopropylalkohol — kyselina octová (Ю0: 5· : 2).

Frakce obsahující produkt se spojí a odpaří do sucha. Krystalisací ze směsi ísopropylalkohol — isopropylether se získá . 1,035 gramu (111) o teplotě tání 115· až 116 + a· otómvosti [a]_D ²⁵ = — ⁹° (methanol).

Pro C14H25N3O6 (381,37) vypočteno:

50,74 · % O, 7,6Cl% H, 12,68% N, nalezeno:

50^,79 % C, 7,40 % ^H 12^,42 % N.

d) methylesteru L-alanyl-D-glutaminu, L-Ala-D-Glu-OMe . HC1 (1V)

Ke 332 mg (1 mmol) 111 se · přidají 3: ml 1 N roztoku kyseliny chlorovodíkové v ledové kyselině octové. Po· 30· minutách při teplotě místnosti se reakční směs odpaří do sucha a zbylý olej se suší ve vakuu v přítomnosti KOH.

e) Spojení peptidového derivátu 1V s derivátem chráněného muramylového· ' zbytku (l-a-Bzl-4..6-Bzi) -Mur-Nac-L-Ala-D-Gln-OMe (V)

471,5 mg (1 mmol] l-a-Bzl-4,6-Bzi)-Mur-NAc připraveného podle Osawy a Jeanloze (J. ^Or^g. Chem. ^{30, 488} /l·⁹⁶⁵/) se roz^pust^í v 5 ml ďmethylformamídu obsahujícího 0,11 mililitru [1 mmol) NlmethylmOrfoliιnu. K tomulo roztoku ochlazenému nia —15 + se pi^l^dá 0ДЗ· ml (¹ mmol) chtormraveráanu isobutyhiatého. Po 3 až 5 minutách se k tomu přidá roztok 268 mg (1 mmol) 1V a 0,11 ml (1 mmol) N-methylmorfolinu v 5· ml dimefoylformamldu ochlazený una· —15'°C. · Po

20 stání pres při —15 °C se · přidá 1 ml 2,5

M roztoku hydrogenkarbonátu draselného. Po· 30 minutách stání při ·0 °C se· produkt vysráží přidáním vody k reakční směsi, zfiltruje se, promyje na filtru molárním· roztokem' hydrogenuhličitanu draselného · a suší se ve vakuu nad P2O5. Získá se 620 mg (90,5· procenta·) produktu V, o teplotě tání 2,15 až ²2O°C a otáčivosti [a]_D ²⁵ = + 9^2,6° (^methyl· formamid).

f) Methylester N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-gluta-minu Mur-NAc-L-Alai-E^-GLn-OMe · (VI)

667,6 m^g (0,66 mmol) V rozpuštěno' v 35 mililitrech ledové kyseliny octové se hydrogenuje ⁶⁰ hodin na 4Й0¹ m^g 6'% ^paladia na uhlí. Po odfiltrování katalyzátoru se kyselina octová odstraní ve vakuu. Produkt se vyjme do 0',1 M roztoku kyseliny octové, nalije na sloupec (10· X 1 cm) iontoměničové pryskyřice (obchodní název „Amberlite AG 60¹ W—X 2“) a. ehiuje se roztokem 0,1 ^M kyseliny octové. Po lyofilisaci eluátu obsahujícího produkt se produkt stejným způsobem chromatografuje na pryskyřici „Amberhte· ^AG 1 · X—²“. Nakonec se zís^ka 290 m^g lyofiiizovaného produktu.

Tento produkt se chroimatografuje na koloně silikagelu předem ekvillbrovaného směsí · n-buitanol — kyselina octová — voda (615 : : 10: 25). Stejná směs se použije k e-lucí produktu. Frakce obsahující produkt se spojí, extrahují se vodou, získaná vodná fáze se lyofilizuje·. Získá se 234,4 mg produktu, který má teplotu tání 108· až 112 ^aC, a rotaci [a]_D25 — + 34)3° (ledová kyselina octová).

Pro C20H54N4O11 . 1,25 H20 vypočteno:

45,40 % C, 6,95 % H, 10'59· % 4 nalezeno:

45,46 % C, 6/76 % H, 10,56 % N.

Příklad 2'

Synthesa n-butylesteru N-acetylmu·ramyl-L-alanyl-D-glutaminu

a) Z-Ala-D-Gln (I)

2,4 g (16,4 mmol) D-glulaminu se rozpustí za studená ve 35 ml vody. Při teplotě místnosti se přidají 2,3 · ml (16,4 mmol) triethylamiinu ia 4,62 g (14,4 mmol) Z-L-Ala-OSU rozpuštěné v 70 ml bezvodého tetrahydrofuranu (THF). Reakce se provádí 46· hodin při ^{4 Přidá} se ^0,5 ш¹ (^3-85 mmol) ^methyl· aminopropylaminu. Po 1 hodině stání při teplotě místnosti se reakční směs zředí 65 mililitry vody, potom se při 0°C okyselí 4 N kyselinou chlorovodíkovou na pH 2,2 až 3. Tetrahydrofuran se odstraní ve vakuu.

Produkt se vyloučí. Po stání přes noc při 4°C se zfillruje, promyje minimálním množstvím ledové vody. Krystaluje se z ethanolu rozpuštěním· za horka· a vychlazením. Získá se ^2,6'^{7 g} produktu, tj. výtěžek ⁶² %. 'teplota tání 179 až 162 °C a otám vosí [celD²⁰ = = —1.3!', 3° (methanol).

P'ro C16H21N5O6 (351,37) vypočteno:

54,69 % O^, 6_r02 % H, 11,96 % N, nalezeno:

54Д6 % C, 5,6 % H, 11^,77 % · N.

b) Z-Ala-D-Gln-O-n-Bu (II) .

³⁵⁰ m^g (1 mmol) I rozpuštéré v I⁵ ml ^THF a ⁵ m¹ vody se přidáním vodného ²⁰% roztoku CS2O1O3 (1 mmol) převede na cestovou s^ůl. ^Po zahu&ění do sucha a ^pa^k sukním několikerým odpařením · s· dimethylformamidem a· sušení ve vakuu nad P2O5 se zbytek rozpustí ve 30 ml dimethylformamldu, přidá se 0,12 ml (1,1 mmol) 1-brom-n-butanu.

Po 20 hodinách se chromatografií na tenké vrstvě ·sillka·gniu v systému ethylacetát — — pyridin — kyselina octová — voda (6 : :2 :4-,6:1) ověří, že reakce je skončena. Jestliže není, tedy se znovu přidá 0,06 ml (0,55 mmol) 1-brom-n-butanu· a· ponechá se znovu reagovat 20 hodin. Reakční směs se pak zahustí na minimum a produkt se vysráží vodou. Získá se 332 mg produktu, tj. ^61,5 %. teplota ^tání ¹⁴⁶ a^ž 1^{50 a}C.

Pro C20H2BN3O6 (407,47) vypočteno:

58,,5-% C, 7,17% ^H 10,3'1% N, nalezeno:

56^,91 % C, 7^,12 % 10,26 % N.

c) L-Ala-D-Gln-O-n-Bu (III)

330 mg (0,6 mmol) II rozpuštěného· .ve 30 ^^^lil^^^^i^^ch ledové kyseliny octové se hydrrgenu · e 4 hodiny v přítomnosti 330 mg Pd (⁵%) na uhh a 1 ш¹ (1 mmol) 1 N kyseliny chlorovodíkové. Chromatografií η,-a tenké vrstvě siiikagniu v systému ethylacetát — — pyridin — kyselina octová — voda (6^2: : · 0,6 : 1) se ověří, že hydrogeιěacn je skončena, pak se odfUtruje katalyzátor a rozpouštělo se zahustí. Z^bylý olej se pečUv^ě suší ve vakuu (exsíkátor s P2O5) a jako takový se pou^žije v daféím stupni. ^Získ^á se 254 míhgram-ů p:rodukι^tu^, tj. výtěžek 100 %.

d) Mur-NAc- (l-Bzl-4,6-O-Bzi) -L-Ala-D-Gln-OBu (IV)

Příprava· tohoto derivátu se· provede kla221505 sickou metodou pomocí smíšených anhydridů.

Když se vyjde z 0,9 mmol Mur-NAc- (1-Bz.l-4,6-Ó-Bzi] a 0 8 mmol III, získá se produkt ve výtě^žku ^81,2 %. Teplota tárn produktu je 220’ a^ž 236 '°'C a -otáčivost [ajD²⁰ = +B2,6° (dimethylf ormamid ).

Pro C37H50N4O11 (726,84] vypočteno:

61,14 % C, 6,93 % H, 7,71 % N, nalezeno:

61,77% C, 7,03% H, 7,03% N.

o) Mur-NAc-L-AIa-D-Ghi-O-n-Bu (V]

472 mg (Об mmol] ^IV -rozpuštěného ve ³⁰ m-iliiitrech iedové kyseliny -octové se hydrogenuje 4 hodiny v .přítomnosti 470* mg Pd (5·%] na u^hií. ^po kontrole ctaomatojgraíií na tenké vrstvě silikagelu v systému CHCE — ^Me^OH ('5°: ¹⁵] se kata^iyzátor odfiltruje a fiit^r^át .se zahustí. Olejovitý zbytek se · vyjme do· 'směsi CHCE — MeOH (50: 15] a chromatografuje -se na. sloupci kyseliny křemičité 60 (33 g] . pomocí CHCE — MeOH (56:15··]. Frakce obsahující .produkt se zahustí -do sucha, zbytek se vyjme do. vody a potom se po ultrafiltraci iyo-filisuje. Získá se ¹⁵⁷ m^g produktu^, tj. výt^ěžek 48^% otáčivosí OÍd²⁰ = + 34,8° (kyselina. octový.

^prO GžHddNáOll . ^{1/3 H}2° vypočteno:

43,24% <C, 7,50·% H, 9,78% . N, nalezeno:

48,26 % C, 7,08% H, 9,74% N.

Příkiad .3

Synthesa n-decyiesteru N-acetyimuramyi-L-aianyhD-glutc^n^inu.

a] Tento produkt ^byi připraven vpředu popsanou metodou pro synthesu butyl-esteru N-acetyiniuramyi-L-alany--D-glutaminu. ^Získaný produkt m^á otárnvost [ι]_ο ²⁰=+'3⁰° (iedová kyselina octová].

Pro C20H52N4O11.0,15 CHCE (050,64], vypočteno:

5^3,81 % C, 8^,08 % H, 8 ,<61 % N, naiezeno:

5^3,97 % C 8,(06% . H, 8,47% N.

b] Stejný produkt byi synthetisován v jiném siedu.

492,5 mg (1 mmol·] Mur-NAc-L-Aia-D-Gln rozptótěného v ¹⁵ m^{i T}HF a ⁵ mⁱ vod^{y b}ylo převedeno· na cestovou s^ůi přidáním. vodného ²⁰% roztoku CS2^CO3 (¹ mmol]. ^po* zahuštění do sucha a potom sušením .několikerým oddesti .ováním dimethyiformamidu a v e*xsikátoru se zbytek rozpustí . ve 30 mi dimethyiforrnamidu, .přidá se 0,13 ml (1,1 mmol] 1-brom-n-dekainu. Po 20 hodinách se reakční směs odpaří do sucha. Po chromaitografii na sloupci kyseliny křemičité ve směsi chloroform — methanol 50: 15 .se produkt získá srážením v methanoi — etheru. Produkt má otáčivost [ajD²⁰ = +29° (ledová ^kyselma octová ].

Pro C29H52N4O11.0,25 CHCE (661,9] vypočeeno: .

53,08 % C, 7,9(6% H, 8,47% N naiezeno:

53^,2 % C, 8,0' % H 850* % N.

P ř í k 1 a d 4

Synthesa n-propyiesteru N-acetyimu ramyl-L-a 1 anyi-D-giutaminu

Produkt byi připraven způsobem popsaným pro butylesčer N-acetylmuramyi-L-aianybD-glutaminu a má otáčwost kb²⁰ = = + 32,3° (iedová kyselina octová].

Pro C22H38N4O11.0,0 CHCE 1 CHsCOOH (664,6'5] vypočteno:

44,4·'% C, 6,4% H 8,4% N naiezeno:

44.5 . % C, 6,3% H, 8,4 . % N.

P říkia d 5

Synthesa n-hexyiesteru N-acetyimuramyi-L-aianyl-D-gluitaminu

Produkt připravený metodou popsanou pro. n-butyiester N-acetylmuramyi-L-aianyi-^D-^giuitaminu má otáčivost [ι]^°=+2Ι95° (iedová kyselina octová].

Pro. C2H44N4O11.0,3 CHCE (612,47] v^ypočteno:

49^.6 % 'C 7,3 % H, 9^,1 %. N, naiezeno:

49^,4 % C 7^,4 % ^H 9^,1 % N.

P ř íkiade

Farmakoiogické vlastnosti

1. To-xicita

Toxicita iátek .podie vynáiezu byia stude23 vána parenterálním podáváním u králíků. Bylo - zjištěno·, že. toxické dávky jsou vysokého* ^řádu -vzhtedem ^{k -} d^áv^kám ve ^kterýc^h produkty jeví účinnost. Stejně tak jsou produkty dobře sn^ásen^y v - dávkác^h 5 mg/^kg hmotnosti zvířete a vyšších.

•ny změny - teplot . po dobu tří hodin po· podání. U dávek ⁵ m^g/^kg nebo v^yššíc^h nebyty zjistany signiftkantní změny teploty. Stejně ta^k pr^ům^ěrn^é zvýšení tepoty po- aplikací králíkům různých esterů Mur-NAc-L-Ala-D-Glin jsou:

2. Pyrrgenita

Během pokusů na králících byly -sledovámethylester butylester decylester ⁵ mg/^kg mg/kg mg/kg •0,53 °C

0,30 °C

0,23 °C

Lze tedy látky podle vynálezu považovat v účinných - dávkách použitých v níže -uvedených testech za zcela apyrogenní.

3. Adjuvantní charakter ve vodné fázi

V sérii- pokusů, jejichž výsledky jsou- uvedeny níže, byl studován vliv účinného principu podle vynálezu na obsah antilátek antialbuminových za -následujících podmínek:

Skupinám po -8 myších Swiss ve· stáří 2 měsíce bylo injikováno subkutánně O;5 mg antigenu pozůstávajícího· z hovězího serumalbuminu ^- (BSA) ^-se ^- zkoušenou tetkou nebo bez ní, ve- fyziologickém roztoku [vodný isotonický roztok chloridu sodného). Tato zvýšená dávka- antigenu, protože je na hranici paralysující dávky vzhledem k imunitní’ odpovědi, vyvolává slabou nebo -nulovou odpověď vzhledem· k antigenu u kontrol, přesto tvoří -přísné kritérium pro důkaz účinnosti· adjuvantní látky. Po -třiceti dnech -se- myším stejným způsobem podává opět 0,1 mg stejného antigenu.

Pro -srovnání byl současně studován, adjuvantní účinek 2-(2-acetamido-2-deoxy-3-0-D-glukoipyranosyl) -D-proplcinyl-L-alanyl-D-isoglutaminu (MDP), o kterém je známo, že má adjuvantní účinky.

Množství protilátek bylo stanovováno p^ausivní hemaglutinací za použití ovčích červenýc^h krvinek zpracovaných formaldehydem a pokrytých -antigeny, podle metody kterou popsali A. A. Hirata -a M. W. Brandiss (J. Immunol., TCO, 641—648 /196//). Provede se odebírání vzorku před, popřípadě po první injekci antigenu a po' opakované injekci -pro stanovení primární a sekundární -odpovědi.

Výsledky těchto pokusů jsou- uvedeny dále v tabulce 1. Množství antilátek vyjadřuje maximální sérové zředění -aglutinující dané množství ovčích krvinek.

Tabulka 1

Obsah antilátek ^yrim^ární Sekundární odpověď odpověď

Kontrola BSA <3

BSA +M-DP 100' μξ50

BSA + Mur-NAc-L-Ala-D-GLu(N«2)-OCHs 100 (ug100

BSA + Mur-NAc-L-Alia-D-Glu(NH2)-OC4H9 100 - μξ12

BSA + Mur-NAc-L-.Ala-D-G1'u'(NH2) 100 μξ25

16+16

300+100

500+150

600+2'00

200+10

Tyto výsledky ukazují, že methyl- a. butylester, podaný ve fyziologickém roztoku, vyvolává význačné zvýšení hladin vytvořených antilátek. Účinek Je dokonce vyšší než jaký lze pozorovat po podání MDP.

4. Adjuvantní charakter v přítomnosti olejové fáze

V těchto pokusech bylo sledováno zvýšení hladiny specifických antilátek к danému antigenu. když tento je injikován společně nebo bez ad uvantní sloučeniny padle vynálezu, v emulsi voda v oději.

Pokusy byly provedeny na skupinách po· 6 mo čatech Hartley, samicích o· hmotnosti 35'0' g. Podávání bylo· provedeno intradenmální injekcí do chodidla každé zadní packy.

Ovalbumin (tvořící antigen] sa připraví po 1 mg v 0i,l ml emulse ve fyziologickém roztoku, v olejové fázi tvořené neúplným Freundovým adjuvantem (FIA). Sloučen na podle vynálezu se aplikuje po 0,1 mg přidaná к emulsi obsahující FIA.

Jako* předešle, pro srovnání byl proveden jeden pokus s MDP namísto sloučeniny podle vynálezu.

Osmnáct dnů po této imunisaci bylo pátráno po· případných reakcích zpožděné b.ypersensibillty na antigen intradermálním indikováním. 0,0'1 mg ovalbuminu, na boku zvířat a po· 48 hodinách byla pozorována reakce v místě vpichu injekce. Byl měřen průměr v m ilimetrech vyvolané reakce.

Dvacetjed-en den po injekci byla zvířata usmrcena. V séru byl měřen obsah spec^!fických antilátek cvaíbuminu srážením komplexu antilátky — antigen v zóně ekvivalence. Množství' bílkovinného dusíku obsaženého' ve sraženině se hodnotí Folino-vcu metodou. Střední hodnoty obsahu antilátek jsou uvedny v tabulce 2. Tyto hodnoty vyjadřují v množství dusíku (v mikrograimech), sraženého cnrgenu, v mililitru séra.

Tabulka 2

Složení emulse obsahující antigen	Sérové protilátky (^g/ml)	Kožní test (průměr v mm)
FIA	800	0
FIA + MDP (1Q0I <ug]	5000	15
FIA 4-Mur-NAc-L-Ala-D-G1u(NH2)-O'CH3 [10O (Ug)	6000	17
FIA 4-Mur-NAc-L-ALa-D- -G1U(NH2)-O'C4H9	2000'	8

Tyto výsledky ukazují, že methyl- a butylester podaný v olejové emulsi, umožňují velmi značný vzrůst hladiny antilátek, vytvořených jako odpověď na injekci antigenu a indukují reakci retardované hypersensibility vůči témuž antigenu a obě tyto reakce jsou přinejmenším stejně silné jako ty, které se pozorují u MPD.

5. Antiinfekční účinnost vůči Klebsiella

Protokol o pokusech je popsán v článku Chedid L. a spol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74, 20'83 (1977).

Předběžným způsobem byla také zavedena experimentální metoda dovolující zjistit antiinfekční povahu produktů. Bylo zjištěno, že jedna dávka 1 až 2:. 1O⁴ Klebsiella pneumoniae, injikovaná intramusku-lárně myším, způsobuje postupné uhynutí velké části, ne-li všech, zvířat v týdnu následujícím po inokulaci. Po· osmi dnech je známo definitivní přežití zvířat.

Bylo sledováno přežití u skupin myší inokulovaných za shora uvedených podmínek a ošetřených produkty podle vynálezu. Pro· tyto pokuisy bylo· použito hybridních myší (C57B1/6 X AKRJFl vypěstovaných v Pasteurově Institutu z kmenů pocházejících z chovu C.N.R.S. v Orleansu.

Infekce KTebsiellou pneumoniae, kmen kapsulárního typu 2, biotyp d, byla provedena pomocí 16 h kultury v prostředí pro pneumokoky (č. '53515, Institut Pasteur). Infekční dávka byla 2. 1O⁴ Klebsiella a byla podána Intraimuskulárně.

Podání testované látky bylo provedeno! intraveinosně ve 0,2 ml apyrogennfho fyz ologického roztoku a kontrolní zvířata dostala samotný fyziolcgcký roztok. Podání by'o provedeno 24 h před i noku lácí.

Za těchto pokusných podmínek b ni у 1 ester Mur-NAc-L-Ala-D-Glu prokázal antiinfekční účinnost, která se projevuje ve zvýšených procentech přežití oproti kontrolní skupině:

Produkt	Tabulka 3 Počet myší JO	J3	Přežití %	% Ochrana
J5	J10
Kontrola	24	29	12,5	12,5
Mur-NAc-L-Ala-D-
-G1u(NH2)-OC4H9	24	92	7'5	75	63

6. Absence vlivu na mechanismus koagulace'

Na základě recen-tních studií se tvrdí, že sloučeniny, které mají adjuvantní vlastnosti, jako LPS, mohou mít vedlejší účinky. Bylo také u králíků zjištěno, že po podání LPS se projevuje tendence ke zkrácení koagul-ační doby. Důvody pro tento jev .nejsou dokonale známé, nicméně bylo považováno za užitečné stanovit vliv produktů podle vynálezu na koagulaci za stejných podmínek.

Pro .tyto pokusy bylo použito testů, které popsal Lerneir a spol. v Thrombosis Research, sv. 11, str. 253—261 (1977), „E-ndotoxin induced disseminated intravascular clotting: evidence that it is mediated by neuitrophrle produiction of tissue factor“.

Odebraný vzorek kompletní krve byl rozdělen na, dvě části, z nichž jedna, byla centrifugována, aby se získala plasma zbavená destiček (PDP).

ml kompletní krve byl vnesen do plastikové zkumavky a inkubován v přítomnosti 1010· ^ug zkoumané látky.

Vedle toho, byly připraveny zkumavky obsahu ící 0,1 ml plasmy zbavené destiček, ke kterým se přidával vždy po hodině v čase 0 až 5 hodin 0,1 ml inkubované směsi, pak se rekalcifikovalo přídavkem 0,1 ml chloridu vápenatého 0,025 M.

Byly zaznamenány koagulační časy a z to>ho odvozována prokoaguilační aktivita jako funkce zkrácení koagulačních časů, ve srovnání s kontrolou, fyziologickým roztokem. Výsledky byly srovnány s referenčním standardem -vysoce prokoiagulačním, tj. LPS.

Výsledky těchto pokusů jsou uvedeny dále v tabulce 4. Ko-agulační časy jsou vyjádřeny v sekundách.

Bylo zjištěno, že butylester a methylester Muir-NAc-L-Ala-D-Glu, na rozdíl od LPS, neurychlují koagulaci.

Tabulka 4

Inkubace h	Voda	LPS	Methylester	Butylester
0	131	129	125	129
2	139	118	118	120
3	122	98	109	122
4	119	88	110	114
5	113	77	104	108

předmět vynale zu

Claims (7)

1. Způsob výroby sloučenin typu N-acetylmuramylu obecného vzorce I

CfyOR*

H_tRi<* ^neb0

-COCH_b

GH^CH-CO-X-NH-CH-CO-ORj

CH,

I *· ch_z

СО-ЫН₃ (I) ve kterém

Ri značí skupinu hydroxylovou, aminovou nebo- am-inof enylovou,

R6 značí atom vodíku nebo sukcinylovou skupinu,

R7 značí přímý nebo rozvětvený alkylový zbytek až s 10 atomy uhlíku a

X značí aminoacylový zbytek ze skupiny zahrnující L-alanyl, L-valyl, g-lycyl -a seryl, vyznačující se tím,, že se provede kondenzace karboxylové skupiny sacharidové sloučen ny obecného vzorce II ve kterém

Ri má shora uvedený význam a.

R6^ť značí atom vodíku nebo skupinu přeměnitelnou v skupinu sukcinylovou sukcinylací sloučeniny obecného vzorce II sukcinylanhydridem, s aminovou funkcí am-ino•acylové skupiny X esterového derivátu dipeptidu obecného- vzorce III

Η—X—ΝΉ—>CH—COOR7

I

CH2

CH12—CONH2 (Ш), ve kterém

X a R7 mají shora uvedené -významy, nebo odpovídajícího* neesterifikovaného* derivátu kyseliny uvedeného dipeptidu, přičemž uvedená sukcinylace se pro-vádí' buď před kondenzací, nebo· po- ní, má-li být Re sukcmyl!o>vou skupinou v konečném produktu, a a-karboxylooá fu-nkce glutaminové skupiny získané sloučeniny se popřípadě po kondenzaci esterifikuje, kondenzuje-li se uvedený derivát typu muraimylu s uvedeným derivátem dipeptidu, avšak ve formě kyseliny, působením alkoholu obecného¹ -vzorce

R7OH, v němž

R7 má shora uvedený význam, anebo esterifikačním činidlem z něho odvozeným, přičemž reaktivní funkce s-e popřípadě předem chrání a po kondenzaci se uvolní a získaná sloučenina se popřípadě sukcinyluje.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tm, že se provede kondenzace karboxylové skupiny sloučeniny obecného* vzorce II, ve kterém má Ri shora uvedený význam, s aminovou funkcí esteru dipeptidu obecného- vzorce III, ve kterém X značí zbytek L-alanytový a R? m*á shora u-vedený význam, nebo odpovídající ne-esterifikcvané kyseliny uvedeného dipep-tidu.

3. Způsob podle bodu 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se provede kondenzace karboxylové skupiny sloučeniny obecného vzorce II, ve kterém má Ri shora uvedený význam, s aminovou funkcí esteru dipeptidu obecného- vzorce III, ve kterém- má X shora uvedený význam a R7 značí zbytek —СНз, —C2H5 nebo —C3H7, nebo odpovídající neesterifikované kyseliny uvedeného dipeptidu.

4. Způsob podle bodu 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se provede kondenzace karboxylové skupiny sloučeniny obecného* vzorce II, ve kterém má Ri shora uvedený význam, s aminovou funkcí esteru dipeptidu obecného vzorce III, ve kterém má X shora uvedený význam a R7 značí butylový zbytek, nebo odpovídající neesterifikované kyseliny uvedeného dipeptidu.

5. Způsob podle bodu 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se provede kondenzace karboxylové skupiny sloučeniny obecného vzorce II, ve kterém má Ri shora uvedený -význam, s aminovou funkcí esteru dipeptidu obecného vzorce III, ve kterém má X shora uvedený význam a R7 značí skupinu — C&H13 nebo —CioHai, nebo odpovídající neesterifikované kyseliny uvedeného dipeptidu.

-

6. Způsob podle kteréhokoliv z bodů 1 až 5, vyznačující se tím, že se provede kondenzace karboxylové skupiny sloučeniny obecného vzorce II, ve kterém má Ri shora uvedený význam, s aminovou funkcí esteru dipeptidu obecného vzorce III, ve kterém má X shora uvedený význam a Ri značí hydroxylovou skupinu, nebo odpovídající neesterifikované kyseliny uvedeného dipeptidu.

7. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se provede kondenzace karboxylové skupiny kyseliny N-acetylmuramové s aminovou funkcí alanylové skupiny derivátu L-alanyl-D-glutamin-a-butylesteru.