DK150147B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af forbindelser af muramyldipeptidtypen - Google Patents

Description

150147 ««

Opfindelsen angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte forbindelser af muramyldipeptidtypen med den almene formel CH,R6

l/”°M

H,0iH o eller & r4 Γ / NH' - COOH3 R -CH - CO - X - NH - CH - CO - O - R7

L I

Γ2 CH, I 2

CO - NH

2 hvori R er enten et hydrogenatom eller en alkylgruppe med 1-4 carbonatomer, r4 er en hydroxylgruppe, en Ci_4 -alkoxygruppe eller en Ci_£-alkanoyloxygruppe, r6 er enten -OH eller -NH2, hvori hydrogen kan være erstattet med en al kyl- eller alkanoylgruppe med 1-6 carbcmatomer, der eventuelt kan være substitueret med en carboxylgruppe eller en aminogruppe, X er L-Ala, Gly, L-Ser, L-Ile, L-Leu eller L-Val, og 7 R er en C^_-^Q-alkylgruppe, hvilke forbindelser har biologiske og farmakologiske egenskaber af stor værdi.

150147 2

Forbindelserne har immunregulerende egenskaber, især som ikke-specifikke immunologiske hjælpestoffer, og er blandt andet egnede til at forstærke den immunbeskyttende virkning af im-munoserende stoffer af enhver art, naturlige eller syntetiske.

5

De ifolge opfindelsen fremstillede forbindelser kan anvendes i -farmakologiske præparater, hvis aktive bestanddel består af mindst en af de omhandlede forbindelser i forbindelse med en 10 -farmaceutisk bærer, der er egnet til den administrationsmåde, som er krævet eller anvendelig under hensyn til naturen af den benyttede vaccinationsbestanddel.

Man ved, at betydelige anstrengelserlænge har været anvendt 15 på fremstilling af midler med hjælpestofegenskaber af den ovenfor anførte type. Disse forskningsbestræbelser har længe været baseret på naturekstrakter, såsom de der kan opnås ved at gå. ud fra bakterier, især mycobakterier. Selv om man således har kunnet opnå produkter, der er meget aktive, og som 20 har opnået en høj renhedsgrad, er der foretaget et afgørende fremskridt gennem redegørelsen for klasser af meget små molekyler, som fremover kan opnås ved hjælp af kemisk syntese.

En af de mest repræsentative forbindelser tilhørende disse klasser er 2-(2-acetamido-2-desoxy -3-0-D-glucopyranosyl)-D-25 propio.nyl-L-alanyl-D-isoglutamin, som også mere enkelt betegnes som N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin, med formlen ch2oh

30 Ko / H'0H

HQAl_/ / NH- C0CH3 3 15 01Λ 7 kaldes af de immunstimulerende midler, og hvis immunologiske hjælpestofvirkning, der for nogles vedkommende er meget kraftig, manifesterer sig, når forbindelserne administreres til en vært, endog i fravær af enhver olieagtig bærer, således som 5 det tidligere var nødvendigt for at muliggøre manifestationen af de immunologiske hjælpestofegenskaber hos naturekstrakter, især opnået ved at gå ud fra mycobakterier.

De med disse klasser af forbindelser udførte undersøgelser har gjort det muligt at konstatere, at modifikationen eller substitutionen af visse funktionelle grupper, der forekommer i forskellige dele af molekylet, f.eks. udskiftningen af den første aminosyregruppe i peptidkæden hos N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin, kan foretages uden tab af udgangsfor-15 bindeisens hjælpestofvirkning.

Hjælpestofvirkningen kan således bevares, når propionylgrup-pen, der er substituent i glucopyranosylrestens 2-stilling, skiftes ud med en anden gruppe af alkanoyltypen på det til-20 svarende sted i molekylet. Den første aminoacylrest, dvs.

L-alanyl, kan udskiftes med andre aminoacylrester, såsom glycyl eller fortrinsvis L-seryl. Man kan ligeledes erstatte denne med en anden aminoacylrest, såsom f.eks. L-propyl, L-threonyl eller L-valyl.

25

Andre dele af molekylet kan derimod ikke modificeres på gennemgribende måde, uden at molekylets hjælpestofvirkning samtidig i det mindste i stort omfang går tabt. Tilstedeværelsen i peptidkæden af en gruppe afledt af glutaminsyre er i sin 30 egenskab af den anden aminoacylrest i kæden i denne henseende i øjeblikket afgørende for opretholdelsen af hjælpestofvirkningen. Det er endvidere almindelig anerkendt, at de meget aktive forbindelser betragtet som immunologiske hjælpestoffer er de, i hvilke glutaminsyrerestens a-carboxylgruppe omdannes 35 til en amidgruppe, når de anvendes i form af en vand-i-olie-emulsion. Vigtigheden af carboxamidkonfigurationen i glutaminsyrerestens a-carboxylgruppe er blevet understreget af flere forfattere. I denne henseende kan man eksempelvis henvise til 4 150U7 iagttagelserne foretaget af Arlette Adam og medarbejdere (Biochemical & Biophysical Research Communications, bind 72, nr. 1, 1976), som eksempelvis har påvist den mindre kraftige hjælpestofvirkning i olie af dimethylesteren af N-acetyl-5 muramyl-L-alanyl-D-glutaminsyre (som i øvrigt har andre biologiske egenskaber af større interesse) i forhold til γ-methyl-esteren af N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin.

Lignende iagttagelser er gjort af en japansk forskergruppe, ligesom de også er anført eksempelvis i en artikel af Shozo Kotani og medarbejdere (Biken Journal, bind 19, 9-13, 1976).

De- allerede til den kendte teknik hørende forbindelser, blandt hvilke glutaminsyreresten er α-carboxamideret, kan imidler-15 tid in vivo udvise en vis pyrogen virkning, især når de administreres i høje doser. De undersøgelser, som på dette område er udført af forskellige grupper, har vist, at der eksisterer en tilsyneladende korrelation mellem de mest aktive stoffers hjælpestofsvirkning og deres eventuelle pyroge-20 nicitet under visse forsøgsbetingelser. Shozo Kotani og medarbejdere har fremsat den hypotese, at denne pyrogenicitet eventuelt kan skyldes slægtskabet mellem de undersøgte forbindelser og de peptidoglycanfragmenter, der kan opnås ved at gå ud fra grampositive bakterier (i den ovenfor anførte 25 artikel).

Disse forfattere har formuleret den hypotese, at der kan eksistere en eventuel relation mellem mekanismerne, der indtræder på niveau med pattedyrs immunologiske reaktioner, under 30 indvirkning af en antigen-stimulation, og de mekanismer, der indtræder på niveau med legemets temperaturregulering eller den febrile reaktion. De har også udkastet den ide, at visse centrale punkter i N-acetyl-muramyl-peptiderne er indblandet i de to mekanismer. I virkeligheden har disse forfattere konsta-35 teret, at blandt de forbindelser, som de har afprøvet, er de som hjælpstoffer mest aktive også de mest pyrogene, og at omvendt desom hjælpestoffer mindst aktive også er de mindst pyrogene.

Denne regel er i virkeligheden indtil i dag reelt ikke blevet 5 ISO-147 sat ud af kraft, selv om visse allerede beskrevne forbindelser udviser et neget svagt pyrogenicitetsniveau i forsøgsdoseme og under forsøgsbetingelserne. Dette er således eksempelvis tilfældet for diamidet af N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-glutamin= 5 syre. Selvcm denne forbindelse har et særligt gunstigt terapeutisk index, er den imidlertid alligevel jninire aktiv end N-acety1-muramy1-L-alanyl-D-isoglutamin.

Udviklingen i undersøgelserne på dette særlige område af 10 teknikken, som har ført til fremstilling af hidtil ukendte forbindelser, hvis fremstilling er genstand for den foreliggende ansøgning, har gjort det muligt at nå frem til et vist antal overraskende konklusioner. Det er i virkeligheden muligt at opnå meget virksomme hjælpestofforbindelser, der bærer en enkelt amidfunk-15 tion som substituent på glutaminsyrerestens y-carboxylsyre= gruppe i derivaterne af den omhandlede art, under den forudsætning, at glutaminsyrerestens α-carboxylsyregruppe ligeledes er substitueret på bestemt måde, idet denne hjælpestofvirkning lige så godt kan manifestere sig i vandig opløsning 20 som i en vand-i-olie-emulsion. Dette resultat er så meget mere uventet, som det er velkendt, at N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-glutamin (som bærer en amidfunktion på carboxylsyregrup-pen i glutamylgruppens γ-stilling) kun har meget svag hjælpestofvirkning in vivo, når den administreres i form af en 25 emulsion af vand i olie.

Ligeledes viser den tilsyneladende korrelation, som er blevet bemærket mellem de kendte forbindelsers hjælpestofvirkning og pyrogene virkning sig fremover alvorligt at være sat ud 30 af kraft af de forsøgsresultater, som er opnået inden for den foreliggende opfindelses rammer.Det er således helt specielt forbindelserne fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse, blandt hvilke visse er karakteriseret ved en hidtil ikke opnået grad af manglende pyrogenicitet.

Disse konstateringer gælder forbindelser fremstillet ifølge opfindelsen, der ligesom de hidtil kendte forbindelser er dannet af en forbindelse af 2- (2-aoetyl-r^do-2-desoxV7?:3bi>?DT.aTu= 35 6 150147 copyranosyl)-alkanoyl-peptidtypén, der eventuelt har substitutioner og udskiftninger, som defineret ved formlen I, idét disse forbindelser ikke desto mindre er karakteriseret ved dén sam-5 tidige tilstedeværelse af en amidfunktion (-C0NH2) på γ-car-boxyisyregruppen og af en esterfunktion på glutaminrestens a-carboxylsyregruppe.

^remaangsmåden i^olge opfindelsen ep e jendommel ig ved, at man pg -inden for peptidkemien sædvanlig måde foretager kobling af det passende beskyttede muraminsyrederi vat med fri a-carboxyl-gruppe med det passende beskyttede dipeptidesterderivat med fri N-te^minal am inogruppe, som forinden er dannet ved kobling af passende beskyttede derivater af den første aminosyre og af 15 D-glutamin og om nødvendigt forestring af glutamin-delen ved dens a-car- boxylgruppe, hvorefter eventuelle beskyttelsesgrupper fjernes.

Nedenfor er angivet de forskellige betydninger af de variable dele af formlen (I) svarende til de foretrukne forbindelser.

20 I formlen (I) er den anden aminoacylgruppe i peptidkaeden, der er knyttet til gruppen af muramyltypen, D-glutamylgruppen. Den første aminoacylgruppe (betegnet med X) kan derimod være valgt blandt de forskellige ovenfor nævnte aminoacyl-25 grupper. Blandt forbindelserne med formlen (I) foretrækkes de, hvori den første aminoacylgruppe er L-alanyl. En anden type foretrukne forbindelser er den, hvori denne aminoacylgruppe er glycylgruppen.

30 Fordelagtige er ligeledes forbindelserne, hvori den første aminoacylgruppe er L-valyl.

En foretrukken udførelsesform fremkommer i det tilfælde, hvor 7 36. R er enten -CH3, -C2H5 eller -CgHy.

En anden foretrukken udførelsesform udgøres af de forbindelser, 7 hvori gruppen R omfatter 4 carbonatomer.

7 150147 I den mest sædvanlige foretrukne udførelsesform, dvs. den, hvori man genfinder muraminsyrestrukturen, er R -CH^. X en anden foretrukken udførelsesform er gruppen R et hydrogenatom.

5 Strukturen er i øvrigt den, som gælder for den homologe, der går under betegnelsen nor-muraminsyre. Endelige er R i en yderligere foretrukken udførelsesform -C2H1J. Til denne udførelsesform svarer den struktur, der angives som homo-mura= minstrukturen.

10

Sacchariddel ens glycosidbinding i forbindelserne fremstillet ifølge opfindelsen kan foreligge i de anomere former α eller β.

ig I den almene formel for forbindelserne fremstillet ifølge op findelsen er glucopyranosidringens substituenter betegnet med R^ og R . De forskellige stillinger har ikke samme muligheder for substitution, idet 6-stillingen er den, i hvilken det største spillerum råder.

20

De foretrukne forbindelser er de, i hvilke en eller flere af substituenterne R4 og R6 uafhængigt af hinanden eller samtidig er hydroxy.

25 Særlig foretrukne forbindelser er de forbindelser, hvori R4 og R6 samtidig er -OH, R er -CH3, X er L-alanyl og R7 er -CH3, -C2H5 eller -C3H7, forbindelser, hvori R4 og R6 samtidig er -OH, R er Η, X er L-alanyl og R7 er -C^Hg, samt forbindelser, hvori R4 og R6 samtidig er -OH, R er -CH3, X er L-alanyl og R7 30 er _c6h13 eller -C10H2i.

4

Fordelagtige forbindelser er ligeledes de, i hvilke R svarer til monoravsyreestere eller eddikesyreestere.

35 De foretrukne forbindelser er de, i hvilke R6 er en am i nfunk tion eller en esterfunktion, hvori acyl- eller alkylgruppen indeholder fra 1 til 6 carbonatomer, især eddikesyreesterne eller monoravsyreesterne.

δ 150147

Foretrukne forbindelser ifølge opfindelsen er methylesterne, ethylesterne, propylesterne, hexylesterne og decylesterne af N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-glutamin. En særlig foretrukken forbindelse er butylesteren af N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-5 .glutamin.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er det benyttede mura-mi nsyrederivat en muram i nsyre, hvis funktioner, der er i stand til at reagere ved koblingsoperationerne, med undtagelse af 10 carboxyl syrefunktionen, er beskyttet ved hjalp af blokeringsgrupper. På samme måde er dipeptiddelen beskyttet under disse koblinger på en sådan måde, at kun de funktionelle grupper, der varetager koblingen, kan reagere.

15 Beskyttelsen af de funktionelle grupper, som ikke må reagere, foretages på traditionel måde.

Beskyttelsen af aminogruppeme foretages fordelagtigt ved hjælp af alkylgrupper eller af aryloxycarbonylgrupper, især 20 ved hjælp af benzyloxycarbonylgruppen. Denne gruppe fjernes også ved hjælp af katalytisk foretaget hydrogenering (i nærværelse af palladium).

En anden fordelagtig blokeringsgruppe er tosylgruppen (to= 25 luen-sulfonyl). Denne gruppe indføres ved hjælp af indvirkning af p-toluensulfonsyrechlorid på en alkalisk opløsning af aminosyren,der skal beskyttes.

Koblingerne udføres i overensstemmelse med sædvanlig teknik.

30 Man kan således gå frem ved hjælp af de blandede anhydriders teknik. Ved denne teknik danner man fordelagtigt anhydridet ved at lade aminosyren eller peptidet, hvis aminogruppe er beskyttet, reagere med et alkylchlorformiat, f.eks. i toluen i nærværelse af en tertiær amin (især N-methyl-morpholin).

35 Det dannede blandede anhydrid kondenseres let med den yderligere aminosyre.

Kondensationen foretages ligeledes fordelagtigt direkte ved hjælp af N,N'-dicyklohexylcarbodiimid.

9 150147

En anden fordelagtigt benyttet kondensationsniåde er den, som gør brug af de aktiverede esteres metode. Ved denne metode danner man carboxylsyrefunktionens ester, som derpå kan kob les. En fordelagtig ester er succinimidesteren.

Disse kondensationsreaktioner udføres altid under milde arbejdsbetingelser samt sådanne betingelser, der så vidt muligt undgår risikoen for racemisering af forbindelserne. Man arbejder således fortrinsvis ved omgivelsernes temperatur eller ved lavere temperaturer end omgivelsernes temperatur. pH-vær-dierne ligger ligeledes på sædvanlig måde i nærheden af neutralitet.

15

Valget af opløsningsmidler er ligedes vigtigt. Med henblik på et godt forløb af koblingsreaktionerne benytter man fortrinsvis et opløsningsmiddel, der har polær karakter. Por at kunne arbejde under tilfredsstillende koncentrationsbetingelser 20 skal det valgte opløsningsmiddel i øvrigt muliggøre en god solubilisering af forbindelser, som er lipophile. Et foretrukket opløsningsmiddel, der opfylder disse krav, er dime= thylf omamid.

2g I det efterfølgende gives de vigtigste oplysninger vedørende forskellige arbejdstrin, som kan udføres til syntetisering af forbindelserne med formlen I, for det første gående ud på hvert trin separat, derefter under angivelse af nogle foretrukne typer reaktionssekvenser.

30

Substitution i D-g1utaminylrestens carboxylfunktion med en estergruppe (R?) foretages fordelagtigt i et derivat af D- glutamin før dets kobling med et derivat af L-alanin. Man kan imidlertid ligeså fordelagtigt udføre denne substitution i et 35 dipeptidderivat. I de to tilfælde lader reaktionen sig eksempelvis udføre i overensstemmelse med den teknik, der er beskrevet af Wang et al. (J . Org.Chem., 42 (1977), 1286).

ίο 150147

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser kan anvendes som reagens eller som aktiv forbindelse i farmaceutiske præparater.

Forbindelserne kan således anvendes som midler, der er i stand 5 til at modvirke visse virkninger, der er knyttet til administra tionen af immunundertrykkende stoffer.

Endvidere kan forbindelserne anvendes til fremstilling af lægemidler, der benyttes til at regulere den immunologiske reaktion hos personer, hvortil de administreres.

10 Disse lægemidler er især anvendelige, når man tilstræber en styrkelse af den immunologiske reaktion på ethvert immunogent stof. Sådanne immunogene stoffer kan være naturlige eller syntetiske, og de nødvendiggør anvendelse af et middel, som stimulerer det immunologiske system, uanset om det immunogene 15 stof er svagt af naturen eller kraftigt og kan benyttes i meget små doser, eller om den immunogene karakter er blevet formindsket, f.eks. under modifikationer eller forudgående rensninger. Generelt kan anvendelsen af disse immunregulerende forbindelser benyttes hver gang, det immunogene stof ikke til-20 lader fremkaldelse af en tilstrækkelig reaktion.

De omhandlede forbindelser anvendes især også til forstærkning af. den immunogene virkning af aktive bestanddele i vacciner, som administreres til en vært, et dyr eller et menneske, især i det tilfælde, hvo»' disse vacci nebestanddele tilhører de 25 overfor anførte kategorier af immunogene stoffer.

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser kan bringes til at indgå i farmaceutiske præparater sammen med en farmaceutisk bærer,der er egnet til den krævede administrationsmåde, eller som er anvendelig under hensyn til 30 naturen af den benyttede vaccinebestanddel .

11 150147

De omhandlede forbindelser kan anvendes i kombination med vaccinationsstoffer, hvis immunogene karakter er kraftig, men som er vanskelige at anvende på normal tid som følge af en meget høj toksicitet eller sekundære uønskede virkninger. Det har 5 vist sig, at hjælpestofferne ifølge opfindelsen er i stand til effektivt at kompensere for tabet af den immunogene virkning, som normalt resulterer af en fortynding eller en formindskelse af de brugbare doser, især med henblik på formindskelse af to-xiciteten eller de ovennævnte sekundære virkninger i et tils-10 varende forhold, og uden ugunstig virkning på disse sidstnævnte fænomener.

Man konstaterer de samme virkninger i tilfælde af kraftige vaccinationsstoffer, hvis immunogene karakter man har formind-15 sket, især ved hjælp af vidtgående rensninger i det omfang, som dette nødvendiggøres til tilsvarende formindskelse af deres toxiske eller sekundære skadelige virkninger. Dette er navnlig tilfældet for vaccinationsbestanddele, som består af bakterielle eller virale anatoxiner, . eller generelt vaccina-20 tionsbestanddele, der alene består af en del af de indlednings vis i bakterierne eller viruset indeholdte bestanddele, overfor hvilke en beskyttelse er ønsket.

Generelt anvendes forbindelserne fremstillet ifølge opfindel-25 sen mod ethvert antigen, som har undergået kemiske eller fysiske transformationer, med henblik på eliminering eller modificering af de dele af antigenet, som er ansvarlige for dets sekundære skadelige virkninger, idet de dele bevares, som lig-, ger til grund for dets immunogene egenskaber. Det er til denne 30 type svage immunogener eksempelvis bestanddelen dannet af "underenhederne" afledt af influenzavirus henregnes, og heraf hæmmes kun hæmagglutininerne og neuramini dåserne med undtagelse af nucleoproteiner og andre nuc1eotid-bestanddele fra virus, hvoraf de er afledt. Dette gælder også visse anatoxiner, 35 såsom eksempelvis fra difteritis eller fra stivkrampe, hvilke man ved kan være dannet af opløselige stoffer, såsom sådanne opnået ved hjælp af samtidig indvirkning af formaldehyd og af varme på bakterietoxiner afledt af tilsvarende bakterier.

12 150147

De ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser og især de, 7 hvori R indeholder 4 carbonatomer eller flere, anvendes også til fremstilling af forbindelser, som er bestemt til behandling af infektionssygdomme. Ved denne anvendelse skal det be-5 mærkes, at forbindelserne fremstillet ifølge opfindelsen tydeligt adskiller sig fra de sædvanligvis benyttede antibiotika. De her omhandlede forbindelser har i modsætning til antibiotika ikke baktericid eller bakteristatisk virkning in vitro. De kan derimod aktivere de macrofage isolater in vitro, og deres virk-10 ning in vivo manifesterer sig som det vil ses i de farmakologiske forsøgseksempler. Virkningen er endvidere i modsætning til virkningen af antibiotika ikke begrænset til bestemte mikroorganisme-stammer. Dette forklares af det forhold, at deres virkning ikke er direkte, men udvikler sig ved hjælp 15 af ikke-specifikke immunologiske forsvarsmekanismer hos værten, hvilke mekanismer deres administration stimulerer og forstærker. Denne virkningsforskel i forhold til antibiotika gør forbindelserne yderligere interessante, da de kan anvendes overfor patogene kim, som er blevet resistente over-20 for antibiotika.

De omhandlede forbindelsers virkemåde kan sidestilles med virkemåden af kendte antiinfektionsforbindelser, såsom BCG eller lipopolysacchariderne, og kan som sådanne anvendes 25 med held til behandling af infektioner uden at frembyde de ulemper, især med hensyn til toxicitet, der begrænser eller forbyder anvendelsen af LPS eller BCG.

De ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser kan især 30 anvendes til uspecifik bekæmpelse af sygdomme forårsaget af mikroorganismer, såsom Klebsiella, Pseudomonas, Staphy-lococus etc.

De ovenfor eksempelsvis anførte anvendelser skal ikke ude-35 lukke andre anvendelser, hvor man gør brug af de immunregu-lerende egenskaber hos forbindelserne fremstillet ifølge opfindelsen. Man kan også til eksempel nævne deres styrkende virkning på den specifikke immuniseringsgrad hos værtsorganismen i henseende til parasitære antigener, genopret- 150 U7 13 teisen af værtsorganismens immunkompetence, når den har et niveau under det normale, især når den er blevet forringet af antigener eller endog snyltedyr·,, eller under virkningen _ af en kemoterapi, en radioterapi eller enhver anden behand-

O

ling, der har en immunundertrykkende virkning. Disse farmaceutiske præparater er generelt anvendelige til behandling eller forhindring af infektionssygdomme af bakteriel eller parasitær oprindelse eller til inhibering af svulst-lidelser.

De ifølge opfindelsen fremstillede hjælpestoffer kan administreres til en vært - et dyr eller et menneske - på enhver passende måde med henblik på opnåelse af den ønskede virkning.

Administrationerne af den immunregulerende bestanddel, især 15 et hjælpestof, og af det immunogene middel, især af vaccinationsantigenet, kan foregå samtidig eller separat, og i det sidstnævnte tilfælde eventuelt tidsforskudt, eventuelt endvidere ad samme eller forskellige administrations veje (f.eks. ad henholdsvis parenteral og oral vej eller omvendt).

b U

Til fremstilling af de forskellige omhandlede farmaceutiske præparater kan forbindelserne fremstillet ifølge opfindelsen kombineres med andre aktive stoffer. Især kombineres forbindelserne 2g med formlen I fordelagtigt med immunogene stoffer, som de påvirker, f.eks. immunogene stoffer, der anvendes i meget små doser, eller svage immunogene stoffer’.

Fordelagtige farmaceutiske præparater dannes af injicerbare opløsninger eller suspensioner eller liposome-former, der in-

oO

deholder en effektiv dosis af mindst en forbindelse fremstillet ifølge opfindelsen. Fortrinsvis dannes disse opløsninger eller suspensioner eller liposome former i en isotonisk steriliseret vandig fase, fortrinsvis saltvand eller tilsat glucose.

35 Sådanne suspensioner eller opløsninger eller liposome former er især de, som er egnet til at blive administreret ved hjælp af intradermale, intramuskulære eller subkutane injektioner eller også ved hjælp af skarifikationer.

14 150147

Andre farmaceutiske præparater er endvidere sådanne, som kan administreres ad andre veje, især ad oral vej eller rectal 5 vej, eller som kan administreres i form af aerosoler, der er bestemt til at komme i kontakt med slimhinder, især med øjets slimhinder, næsens slimhinder, lungernes slimhinder ellélf då vaginale slimhinder.

10 I disse farmaceutiske præparater foreligger mindst en af for bindelserne fremstillet ifølge opfindelsen i kombination med farmaceutisk acceptable excipienser, som er faste stoffer eller væsker, og som er beregnet til at danne de orale, oku-lare eller nasale former, eller sammen med excipienser, der 15 er beregnet til at danne rectale administrationsformer, eller sammen med gelatinøse excipienser til vaginal administration. Disse præparater kan også være flydende, isotoniske præparater, som indeholder mindst en af forbindelserne, og som er beregnet til administration til slimhinderne, især i øjet eller næsen. Præparaterne kan også være præparater dannet af en farmaceutisk acceptahel fordråbet gas af typen "drivmiddel", hvori de omhandlede forbindelser er opløst eller holdes i suspension, og hvis ekspansion fremkalder spredning af en aerosol.

25 Til styrkelse af værtsorganismens immunologiske forsvar er effektive doser af forbindelserne fremstillet ifølge opfindelsen i en af de ovenfor anførte administrationsformer fordelagtigt af størrelsesordenen 10 til lOOOyg pr. kg legemsvægt, f.eks. 50yg, når administrationen foretages ad parenteral 30 vej, eller en dosis på 200 til 20.000 yg pr. kg legemsvægt, f.eks. 1000 yg, til andre administrationsformer, såsom f.eks. administration ad oral vej.

Andre karakteristika ved opfindelsen fremgår af fremstillings-35 eksempler samt af forsøg, der godtgør egenskaberne af de fremstillede produkter. '

De benyttede forkortelser i resten af beskrivelsen har følgende betydninger: 15 150147

Ala : alanin

Gin : glutamin 5 Mur-NAc : N-acetyl-muraminsyre BOC : t-butyloxycarbonyl OMe : methylester OBu : butylester OSu : succinimidester 10 Bzl : benzyl

Bzi : benzyliden Z : benzyloxycarbonyl

Eksempel 1.

15

Syntese af methylesteren af N^acetyl«imuranyl'^I>alanyl-l>glutamin.

Methylesteren af t-butylo^caibonyl-D-glutamin; BOC-D-Gln-OMe (1).

20 1,5 g (6,1 mmol) t-butyloxycarbonyl-D-glutamin (BOC-D-Gln), der er fremstillet ved fremgangsmåden beskrevet af Schnabel (Liebigs Ann. Chem. (1967) 702, 188-196), opløses i 60 ml absolut methanol. Ved 0°C tilsætter man dråbevis en etheropløsning af dia-zomethan indtil vedvarende gul farve. Reaktionsblandingen hol-25 des under omrøring ved 0°C i 10 min og derefter ved sædvanlig temperatur i samme tid. Reaktionsforløbet kontrolleres ved hjælp af kromatografi på tynde silicagellag i opløsningsmiddelsystemerne n-butanol-eddikesyre-vand (4:1:5 øvre fase), n-butanol-pyridin-eddikesyre-vand (30:20:6:24) og chloroform-30 methanol (5:1). Overskuddet af diazomethan fjernes ved tilsætning af iseddikesyre, og reaktionsblandingen inddampes til tørhed. Resten optages i et minimum af ethylacetat og udfældes med petroleumsether. Dets smeltepunkt er 86-90°C og dets drej-25 o ningsevne [a]D = +24,7 (methanol).

35

Man opnår 1,417 g BOC-D-Gln-OMe, dvs. et udbytte på 89,7%.

Grunds tof analysen af denne forbindelse er for c;qH20N2O5 (260,29) 16 150147

C Η N

beregnet: 50,76 7,75 10,76 5 fundet : 50,62 7,75 10,82 b) hydrochlorid af methylesteren af D-glutamin, D-Gln-QMe, HCl, (2) 1,4 g (5,4 mmol) af (1) behandles med 15 ml af en IN opløsning 10 af saltsyre i iseddikesyre. Efter 30 min ved sædvanlig tempe ratur inddampes reaktionsblandingen til tørhed, og den opnåede olie tørres under vakuum i nærværelse af KOH.

c) methylester af t-butyloxycarbonyl-L-alanyl-D-glutamin; BOC- 15 L-Ala-D-Gln-OMe (3) .

1,86 g (6,5 mmol) af succinimidesteren af t-butyloxycarbonyl-alanin (BOC-Ala-OSu), der er fremstillet ifølge Anderson et al. (J. Am. Chem. Soc. (1964) 86, 1839-1842), sættes til en 20 opløsning af 1,2 g (5,4 mmol) af (2) og 0,6 ml (5,4 mmol) N- methylmorpholin i 25 ml dimethylformamid. Efter en nat ved omgivelsernes temperatur inddampes reaktionsblandingen til tørhed og kromatograferes på en silicasøjle (27 x 3 cm), der forinden, er ækvilibreret i systemet chloroform-isopropanol-eddike= 25 syre (100:0,5:0,2), ved eluering med systemet chloroform-iso= propanol-eddikesyre (100:5:2). Fraktionerne indeholdende forbindelsen forenes og inddampes til tørhed. Ved hjælp af krystallisation i blandingen isopropanol-isopropylether opnår man 1,035 g af ( 3) . Dens smeltepunkt er 115-116°C, og dens drej-25 o 30 ningsevne er [a]D = -9 (methanol).

Grundstofanalysen af denne forbindelse er for C14H25N3°6 (331,37)

C Η N

35 beregnet 50,74 7,60 12,68 fundet 50,79 7,40 12,42 d) hydrochlorid af methylesteren af L-alanyl-D-glutamin; L-Ala-D-Gln-OMe, HCl (4) .

17 150147 332 g (1 mmol) af ( 3) behandles med 3 ml af en IN opløsning af saltsyre i iseddikesyre. Efter 30 min ved sædvanlig tempe-5 ratur inddampes reaktionsblandingen til tørhed, og den opnåede olie tørres under vakuum i nærværelse af KOH.

e) Kobling af peptidderivatet (4) med det beskyttede derivat af muramylresten (l-a-Bzl-4,6-Bzi) -Mur-NAc-L-Ala-D-Gln-OMe (5-') .

10 471.5 mg (1 mmol) af (l-a-Bzl-4,6-Bzi)-Mur-NAc, der er fremstillet ifølge Osawa og Jeanloz (J. Org. Chem. (1965) 30, 488), opløses i 5 ml dimethylformamid indeholdende 0,11 ml (1 mmol) N-methyl-morpholin. Til denne opløsning, der er· kølet 15 til -15°C, sættes 0,13 mml (1 mmol) isobutylchlorformiat. Efter 3 til 5 min bliver en opløsning, der er kølet til -15°C, af 268 mg (1 mmol) af (4) og 0,11 ml (1 mmol) N-methylmorpho= lin i 5 ml dimethylformamid sat til den ovennævnte opløsning. Efter en nat ved -15°C tilsætter man 1 ml af en 2,5 M opløsning 20 af kaliumbicarbonat. Efter 30 min ved 0°C udfældes forbindelsen ved tilsætning af vand til reaktionsblandingen, hvorpå der filtreres, vaskes med en opløsning af kaliumbiearbonat på filteret og tørres under vakuum i nærværelse af P2®5’ ^an opnår 620 mg (90,5%) af forbindelsen (5). Dens smeltepunkt er 215-220°C, og dens drejningsevne er [ct]^ = +92,6°(dimethylfor= mamid) .

f) Methylesteren af N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-glutamin?

Mur-NAc-L-Ala-D-Gln-OMe ( 6,1.

30 587.6 mg (0,86 mmol) af (5), der er opløst i 35 ml iseddikesyre, hydrogeneres i 60 timer i nærværelse af 450 mg 5% palladium på carbon. Efter frafiltrering af katalysatoren fjernes eddikesyren under vakuum. Forbindelsen optages i en 0,1M eddike-35 syreopløsning, påføres på en søjle (10 x 1 cm) af ionbytterhar-piks, der i handlen går under betegnelsen "Amberlite AG 50 W-X 2", og elueres med den samme eddikesyreopløsning. Efter lyofiliserlng af eluatet indeholdende forbindelsen efterføl- 18 150147 ges den samme procedure af en kromatografering af forbindelsen på harpiksen "Amberlite AG 1 X-2". Man opnår til slut 290 5 mg lyofiliseret produkt.

Denne forbindelse kromatograferes på en silicasøjle, som forinden er ækvilibreret i blandingen N-butanol-eddikesyre-vand (65:10:25). Den samme blanding anvendes til eluering af for-10 bindeisen. Fraktionerne indeholdende den rene forbindelse for enes rekstraheres med vand, og den opnåede vandige fase lyo-filiseres. Man opnår 234,4 mg af forbindelsen. Dens smeltepunkt er 108-112°C, og dens drejningsevne er [a]^ = +34,3° (iseddikesyre).

15

Forbindelsens grundstofanalyse er som følger for C20H34N4°n ” 1,25 H20 (529,02)

C Η N

beregnet: 45,40 6,95 10,59 20 fundet : 45,46 6,76 10,56

Eksempel 2.

Syntese af n-butylesteren af N-aætyl-niurairy 1-L-alanyl-D-glutamin.

25 a) Z-Ala-D-Gln (1).

2,4 g (16,4 mmol) D-glutamin solubiliseres i varm tilstand i 35 ml vand. Ved omgivelsernes temperatur tilsætter man 2,3 30 ml (16,4 mmol) triethylamin og 4,62 g (14,4 mmol) Z-L-Ala- OSu opløst i 70 ml vandfri tetrahydrofuran (THF). Reaktionen forløber ved 4°C i 48 timer. Man tilsætter 0,5 ml (3,85 mmol) dimethylaminopropylamin.

35 Efter 1 time ved sædvanlig temperatur fortyndes reaktionsblan dingen med 65 ml vand, og den syrnes derpå til pH 2,2-3 med 4 N HC1 ved 0°C. THF-mængden fjernes under vakuum.

Forbindelsen udfældes. Efter en nat ved 4°C frafiltreres den 150U7 19 og vaskes med et minimum af isvand. Den krystalliseres fra lunken ethanol.

5

Man opnår 2,87 g af forbindelsen, dvs. et udbytte på 62%. Dens

2 Q

smeltepunkt er 179-182°C, og dens drejningsevne er [o]D = -13,3° (methanol).

10 Dens grundstofanalyse er: for C16H21N3°6 (351'37)

C Η N

beregnet: 54,69 6,02 11,96 fundet : 54,18 5,8 11,77 15 b) Z-Ala-D-Gln-O-n-Bu (2) 350 mg (1 mmol) af (1) , der er opløst i 15 ml THF og 5 ml vand, omdannes til cæsiumsaltet ved tilsætning af en 20% vandig opløsning af Cs9C0, (1 mmol). Efter inddampning til tørhed 20 £3 og derefter tørring ved inddampning sammen med dimethylforma= mid flere gange samt tørring under vakuum (dessikator med opløser man den tørre rest i 30 ml dimethylformamid, og man tilsætter 0,12 ml (1,1 mmol) 1-brom-n-butan.

25

Efter 20 timer kontrollerer man ved hjælp af tyndtlagsr.kroma-tografi på silicagel i systemet acetat-pyridin-eddikesyre-vand (6:2:0,6:1), at reaktionen er afsluttet. Hvis ikke tilsætter man påny 0,06 ml (0,55 mmol) 1-brom-n-butan, og man lader på ny reagere i 20 timer. Reaktionsblandingen inddampes 3 0 derefter til et minimum, og forbindelsen udfældes med vand.

Man opnår 332 mg af forbindelsen, dvs. et udbytte på 81,5%.

Dens smeltepunkt er 148-150°C.

35

Dens grunds tof analyse er: for (407,47)

C Η N

beregnet: 58,95 7,17 10,31 fundet: 58,91 7,12 10,26 150U7 20 C) L-Ala-D-Gln-O-n-Bu (3) 5 330 mg (0,8 mmol) af (2), som er opløst 1 30 ml iseddikesyre, hydrogeneres i 4 timer i narværelse af 330 mg Pd (5%) på carbon og 1 ml (1 mmol) IN HC1. Man kontrollerer ved hjælp af tyndtlags-kromatografi på silicagel i systemet ethylacetat-10 pyridin-eddikesyre-vand (6:2:0,6:1), at hydrogeneringen er afsluttet, hvorefter man frafiltrerer katalysatoren og af-damper opløsningsmidlet. Den tilbageværende olie tørres omhyggeligt i vakuum (dessikator med P2O5) og benyttes som sådan til det efterfølgende trin.

15

Man opnår 254 mg af forbindelsen, dvs. et udbytte på 100%.

d) Mur-NAc(l-bzl-4,6-0-Bzi)-L-Ala-D-Gln-0Bu ( 4) 20 Fremstillingen af dette derivat foretages på klasssisk måde ved hjælp af de blandede anhydriders metode.

Ved at gå ud fra 0,9 mmol af Mur-NAc-(l-bzl-4,6-O-Bzi) og 0,8 mmol af (3) opnår man et udbytte på 81,2%. Forbindelsens _ Λ Λ 25 smeltepunkt er 220-235°C, og dens drejningsevne er [a]^ = +82,6° (dimethylformamid) .

Grundstofanalysen af forbindelsen er: for ^37^50^4^1 (726,84)

C Η N

30 beregnet: 61,14 6,93 7,71 fundet: 61,77 7,03 7,03 e) Mur-NAc-L-Ala-D-Gln-O-n-Bu (5) 35 472 mg (0,6 mmol) af (4), der er opløst i 30 ml iseddike syre, hydrogeneres i 40 timer i nærværelse af 470 mg Pd (5%) på carbon. Efter kromatografisk kontrol på silicagel-plade i systemet CHCl-j-MeOH (50-15) frafiltreres katalysatoren, og filtratet inddampes.

21 150147

Den olieagtige rest optages i CHCl^-MeOH (50:15) og kromato-5 graferes på en søjle med silica 60 (33 g) med CHCl^-MeOH

(50:15). Fraktionerne indeholdende forbindelsen inddampes til tørhed. Resten optages i vand, hvorpå den lyophiliseres efter ultrafiltrering.

10 Man opnår 157 mg af forbindelsen, dvs. et udbytte på 48%. Dens drejningsevne er [α]β° = +34,8° (eddikesyre).

Grundstofanalysen af forbindelsen er: for c23H4oN4°il/ 1/3 H20

C H N

15 beregnet: 48,24 7,50 9,78 fundet: 48,26 7,08 9,74

Eksempel 3 .·

Syntese af n-decylesteren af N-acety 1-murgnyl-L-alanyl-D-glutamin.

u U

a) Denne forbindelse fremstilles ifølge den metode, som ovenfor er beskrevet for n-butylesteren af N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-glutamin.

25 Den under disse betingelser opnåede forbindelse har en drej ningsevne [a]^ = +30° (iseddikesyre) .

Dens grundstofanalyse er: for c29H52N40ix " 0fl5 CHCl3 (650,64)

C Η N

30 beregnet: .53,81 8,08 8,16 fundet: 53,97 8,06 8,47

Eksempel 4.

35 Syntese af n-propylesteren af N^acetyl-murarnyl-L-alanyl- D-glutamin.

150U7 22

Forbindelsen fremstilles i overensstemmelse med den metode, der er beskrevet for n-butylesteren af N-acetyl-muramyl-L-ala-nyl-D-glutamin.

Den opnåede forbindelses drejningsevne er [a]^ =+32,3° (iseddikesyre).

10

Grundstofanalysen er: for C22H38N4°11' 0,6 CHCl3, 1CH3C00H (664,65)

C Η N

beregnet: 44,4 6,4 8,4 15 fundet: 44,5 6,3 8,4

Eksempel 5.

Syntese af N-hexylesteren af N-acetyl-muramyl-L-alanyl-20 D-glutamin.

Forbindelsen fremstilles ifølge den metode, der er beskrevet for n-butylesteren af N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-glu= tamin.

25

Den opnåede forbindelses drejningsevne er [a]^0 = +29 /5° (iseddikesyre).

Grundstofanalysen er: for C25H44N4°n' °'3 CHC13 (612,47) 3 0

C Η N

beregnet: 49,6 7,3 9,1 fundet: 49,4 7,4 9,1

Farmakologiske egenskaber.

35 23 150147

Foretrukne ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser er følgende: ethylesteren af N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-glutamin, [ot] D = +34° :(iséddikesyré), 5 pentylesteren af N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-glutamin, [α]β - +36,5° ' (iseddikesyre), n-butylesteren af N-acetyl-muramyl-L-valyl-D-glutamin, [a]p = +21,0° (iseddikesyre), n-butylesteren af N-acetyl-muramyl-L-seryl-D-glutamin, 10 [α]β = +39,4° (iseddikesyre), n-butylesteren af N-acetyl-[6-O-succinyl-muramyl]-L-alanyl-D-glutamin, [a]D = +30,0° (iseddikesyre), n-butylesteren af N-acetyl-[6-0-e-amino-copropyl-muramyl]-L-alanyl-D-glutamin, [alD = +32,8° (iseddikesyre).

15 1) Toxicitet.

Man har undersøgt toksiciteten af forbindelserne fremstillet ifølge opfindelsen ved hjælp af parenteral administration, især til kaniner. Man har konstateret,at de toksiske doser er af en størrelsesorden, som er langthøjere end den dosismængde, hvori 20 forbindelserne udøver deres virkning. Forbindelserne tåles således af kaniner i doser, der er lig med eller større end 5 mg/kg af dyrets legemsvægt.

• 2) Pyrogenicitet.

Under forsøgene med kaninerne har man fulgt de maximale tem-25 peraturvariationer i løbet af 3 timer efter administraionen.

For doser, der er så høje som 5 mg/kg eller mere af forbindelsen, konstaterer man ingen signifikant temperaturvariation.

Den gennemsnitlige temperaturforøgelse ved administrationen til kaninerne er således for forskellige estere af Mur-NAc-30 L-Ala-D-Gln: 24 150147

5 MDP 1 mg/kg 0,77°C

Methylester 5 mg/kg 0,53°C

Butylester 10 mg/kg 0,30°C

Decylester 10 mg/kg 0,23°C

Propylester 10 mg/kg 0,10°C

10 Hexylester 10 mg/kg 0,13°C

Man må således antage, at i sådanne aktive doser som de, der forekommer i de nedenfor anførte forsøg, er denne forbindelse fuldstændig apyrogen.

15 3) Hjælpestofkarakter i vandig fase.

I en serie forsøg, hvis resultater er anført i det følgende, har man undersøgt indflydelsen af forbindelser €remstillet i-

O Q

følge opfindelsen på styrken af anti-albumin antistoffer under følgende betingelser.

Grupper på 8 svejtsermus i en alder på 2 måneder indgives ved hjælp af subcutan injektion 0,5 mg af antigenet dannet 25 ved hjælp af albumin fra okseserum (BSA) med eller uden forsøgsforbindelsen i en isotonisk saltopløsning. Denne forøgede antigendosis medfører, fordi den ligger på grænsen af den dosis, som er lammende overfor den immunologiske reaktion, en svag eller ingen reaktion på antigenet alene hos forsøgs-30 dyrene. Den danner imidlertid et strengt kriterium for påvisning af virkningen af et hjælpestof. 30 dage senere indgives musene ad samme administrations vej et supplement indeholdende 0,1 mg af det sammen antigen.

λ r

Med henblik på sammenligning har man samtidigt undersøgt hjælpestofvirkningen af 2-(2-acetamido-2-deoxy-3-0-D-gluco= pyranosyl]-D-propionyl-L-alanyl-D-isoglutamin (MDP), der er kendt for sine hjælpestofegenskaber.

25 150147

Antistofstyrken bestemmes ved hjælp af passiv hemagglutination under anvendelse af fåreblodlegemer, som er behandlet med formalin, og antigenets genvinding undersøgt i overensstemmelse med metoden .beskrevet af a.A. Hirata og M.W- Brandiss (J.

S-' Immunol., 100, 641-648, 1968). Man foretager de respektive prøveudtagninger efter den første indsprøjtning af antigenet og efter indsprøjtningen af supplementet til bestemmelse af de primære og sekundære reaktioner.

lu Resultaterne af disse forsøg fremgår af den efterfølgende tabel. Antistofstyrkerne udtrykker den maximale serumfortynding, der agglutinerer en given mængde fåreblodlegemer.

Tabel 1 15 Antistof-styrke primær sekundær reaktion reaktion

Kontroldyr BSA <3 16 ± 16 BSA + MDP, 100 yg 50 300 + 100 20 BSA + Mur-NAc-L-Ala-D-Glu(NH-)- 0CH3 100 yg 100 500 ± 150 BSA + Mur-NAc-L-Ala-D-Glu(NH_)- OC4H9 lOO^yg 12 600 ± 200 BSA + Mur-NAc-L-Ala-D-Glu(NH„) 100 yg 25 200 ± 90 25 (sammenligningsforbindelse)

Disse resultater viser, at methyl- og butylesterne, når de administreres i vandig isotonisk saltopløsning, fremkalder en betydelig forøgelse af styrken af dannede antistoffer. Virkningen 30 viser sig endog at være større end den, som man iagttager hos forsøgsdyr, der er behandlet med MDP. Det ses således, at én overordentlig kraftig immunreaktion opnåedes efter en anden indsprøjtning af den ifølge opfindelsen fremstillede forbindelse.

4) Hjælpestofkarakter i nærværelse af en olieagtig fase.

35

Ved disse forsøg tilstræber man at forøge den specifikke antistof styrke af et givet antigen, når dette med eller uden hjælpestofforbindelsen fremstillet ifølge opfindelsen indsprøjtes indeholdt i 26 150147 en emulsion af vand i olie.

Forsøgene foretages med grupper på 6 Hartley-hunmarsvin med en vægt på 350 g. Administrationen foretages ved hjælp af 5 intradermal ^injektion i hver bagpotes ballepude. Ovalbumin (indeholdende antigenet) i en mængde på 1 mg fremstilles i 0/1 ml af en emulsion af isotonisk saltvandsopløsning i en olieagtig fase dannet af Freund's ufuldstændige hjælpestof (FIA) . Forbindelsen fremstillet ifølge opfindelsen administreres i en 10 mængde på 0,1 mg, der er sat til emulsionen indeholdende FIA.

Som ovenfor anført foretager man til sammenligning et forsøg med MDP i stedet for forbindelsen fremstillet ifølge opfindelsen.

18 dage efter denne immunisering undersøger man eventuelle 15 hypersensibilitets^reaktioner, der er forsinket med antigenet, ved ad intradermal vej at indsprøjte 0,01 mg ovalbumin i >· siden på dyrene, og man iagttager 48 timer senere reaktionen på injektionsstedet. Man måler diameteren i mm af den således fremkaldte reaktion. Diameteren af reaktionen sammenlignes 20 med diameteren af den ved hjælp af hjælpestoffet fremkaldte reaktion. Jo større diameteren af reaktionen er,jo mere aktiv er forbindelsen under forsøgsbetingelserne. Som nævnt blev også dette forsøg foretaget med en vand-i-olie-emulsion.

25 21 dage efter indsprøjtningen dræbes dyrene. I det udvundne serum måler man indholdet af specifikke ovalbumin-antistoffer ved udfældning af antistof- antigenkomplekset i ækvivalensområdet. Den mængde proteinnitrogen, der er indeholdt i præci-pitatet, bedømmes i overensstemmelse med metoden ifølge Folin.

30 Middelværdierne af antistof indholdene. _ er anført i tabellen med resultater. Disse værdier udtrykker mængden i mikrogram af nitrogen, der kan udfældes ved hjælp af antigenet pr. ml serum.

35 Resultaterne af disse forsøg er angivet i den efterfølgende tabel 2.

27 150147

Tabel 2

Sammensætning af emulsionen Serum antistof Hudførsøg indeholdende antigenet (μζί/ml) (diamer i mm) PIA 800 0 FIA + MDP (100 yg) 5.000 15 FIA + Mur-NAc-L-Ala-D-Glu(NH„)- OCH3 (100 Pg) 6.000 17 FIA + Mur-NAc-L-Ala-D-Glu(NH9)- OC4H9 2 2.000 8 10

Disse resultater viser, at methyl- og butyl.estrene, der administreres i en olieagtig emulsion, muliggør meget betydelig forøgelse af styrken af antistoffer dannet som reaktion på antigenindsprøjtningen, og at de fremkalder en hypersensibilitets-reaktion, som er forsinket i forhold til antigenreaktionen, li, hvilke to reaktioner er i det mindste lig med de reaktioner, som man iagttager med MDP. Resultaterne er mindre gode end de i tabel 1 viste.

5) Antiinfektionsvirkning over for Klebsiella.

20

Forsøgsprotokollen er beskrevet i en artikel af Chedid L. og medarbejdere i Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, 74: 2089.

Man har således på foreløbig måde fastlagt en forsøgsmåde, 25 der gør det muligt at godtgøre forbindelsernes antiinfektions-karakter. Man har vist, at en dosis på 1 til 2 x 104 Klebsiella pneumoniae, der er indsprøjtet intramuskulært i mus, medfører gradvis dødelig bortgang af en betydelig del om ikke af samtlige dyr i løbet af den uge, som følger efter smitningen. Ef-30 ter 8 dage er dyrenes overlevelse endeligt afgjort.

Man har fulgt overlevelsen af grupper af mus, der er smittet under de ovenfor anførte betingelser og behandlet ved hjælp af forbindelserne ifølge opfindelsen.

35 Til disse forsøg har man benyttet krydsningsformer for mus (C57B1/6 x AKR)Fl opdrættet på Institut Pasteur ved at gå ud fra stammer hidrørende fra opdrætning på C.N.R.S. (Centre National de la Recherche Scientifique) i Orleans.

: 28 150147

Infektionen med Klebsiella pneumoniae, der er stammer af kapseltypen 2, biotype d, foretages ved at gå ud :fra en 16 timer gammel kultur i et medium for pneumokokker (nr. 53 515, Institut Pasteur). Infektionsdosen er 2 x 10^ Klebsiella.

5 Den administreres ad intramuskulær vej.

Administrationen af forsøgsforbindelsen foretages ad intravenøs vej i 0,2 ml fysiologisk apyrogen vandig opløsning, idet kontroldyrene kun indgives den vandige opløsning. Dette lu foretages 24 timer før podningen.

Ved disse forsøgsbetingelser viser butylesteren af Mur-NAc-L-Ala-D-Glu en antiinfektionsvirkning, som viser sig ved en større procentdel overlevende end procentdelen i kon-15 trolgruppen.

Tabel 3 Antal mus Overlevelses% % beskyttelse

Forbindelse Dag: 0 3 5 10 20

Kontroldyr 24 29 12,5 12,5

Mur-NAc-L-Ala-D-Glu(NH0)- OC4H9 1 24 92 75 75 63 2jj 6) Fravær af påvirkning over for koagulationsmekanismerne.

Man ved på grundlag af tidligere undersøgelser, at forbindelser, der har hjælpestofegenskaber, såsom lipopolysaccharid-forbindelserne, kan have sekundære virkninger. Man har såle-30 des konstateret hos kaniner, at administrationen af lipopoly-saccharider har tendens til at forkorte koagulationstiden. Årsagerne til dette fænomen er ikke fuldstændig kendte. Ikke desto mindre har det forekommet nyttigt at bestemme virkningen af forbindelserne fremstillet ifølge opfindelsen på koa-^5 gulationen under de samme betingelser.

Til disse forsøg anvender man prøven beskrevet af Lerner og medarbejdere i Thrombosis Research, bind 11, side 253-261, 1977, 29 150147 "Endotoxin induced disseminated intravascular clotting: evidence that it is mediated by neutrophile production of tissue factor".

Man deler helblodet, som er blevet udtaget,i 2 dele, hvoraf 5 den ene centrifugeres til opnåelse af plasma uden blodplader (PDP).

1 ml helblod inkuberes i et plastrør i nærværelse af 100 yg af forsøgsforbindelsen.

Man fremstiller endvidere rør indeholdende 0,1 ml PDP,.hvor-10 til man hver time fra 0 til 5 timer sætter 0,1 ml af inkubationsblandingen, hvorpå man kalkbehandler med 0,1 ml 0,025 M

calciumchlorid.

Man iagttager koagulationstiden, og derfra trækker man pro-koagulationsvirkningen som funktion af forkortelsen af koagu-15 lationstiden i forhold til sammenligningsvæsken, som er fysiologisk vand. Man sammenligner resultatet med resultatet af en meget prckoagulerende referencestandard, EPS, lipopolysaccharidet.

Resultaterne af disse forsøg fremgår af den følgende tabel. Koagulationstiderne er anført i sekunder. Man konstaterer, 20 at butylesteren og methylesteren af Mur-NAc-L-Ala-D-Glu i modsætning til LPS ikke accelererer koagulationen.

Tabel 4

Koagulationstid i minutter,

Inkubation Methyl- Butyl- timer Vand LPS ester ester 25 0 131 129 125 129 2 129 118 118 120 3 · 122 98 109 122 4 119 88 110 114 5 113 77 104 108

Claims (2)

150U7 3Q 5 Patentkrav.

1. Analogifremgangsmåde til fremstilling af forbindelser af muramyldipeptidtypen med den almene formel I 10 CH0R6 i j? / Η,ΟΗ α eller & ff / NH - COCH3 R -CH - CO - X - NH - CH - CO - O - R7 (I) ?0 L I Γ2 Γ2 CO - NH 2 25 . hvori R er enten et hydrogenatom eller en alkylgruppe med 1-4 carbon- atønér, 4 30. er en hydroxylgruppe, en C^_^-alkoxygruppe eller en C^_^- alkanoyloxygruppe, g R er enten -OH eller -N^, hvori hydrogen kan være erstattet- med en alkyl- eller ialkancylgruppe med 1-6 carbonatomer, __ der eventuelt er substitueret med en carboxylgruppe eller o 5 en aminogruppe, X er L-Ala, Gly, L-Ser, L-Ile, L-Leu eller L-Val, og 7 R er en alkylgruppe, kendetegnet ved, at man på inden for peptidkemien sædvanlig måde foretager kobling af det passende beskyttede muraminsyrederivat med fri a-carboxylgruppe med det