PL123483B1 - Process for preparing novel compunds of n-acetylmuramylpeptides type - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych zwiazków typu N-acetylomuramylopepty¬ dów, o ogólnym wzorze 1, w którym Ri oznacza grupe hydroksylowa, grupe aminowa, grupe o wzo¬ rze —OZ lub —NHZ, w którym Z oznacza grupe alkilowa, arylowa lub alkiloarylowa o co najwy¬ zej 10 atomach wegla, ewentualnie podstawiona grupami funkcyjnymi, zwlaszcza grupa aminowa, R2 oznacza atom wodoru lub reszte acylowa o 1—6 atomach wegla, ewentualnie podstawiona grupa hy¬ droksylowa, karboksylowa, karbonylowa, aminowa lub metoksylowa, R3 oznacza grupe alkilowa o nie wiecej niz 10 atomach wegla, X oznacza dwuwar- tosciowa reszte aminoacylowa L-alaniny, L-wali- ny, L-seryny lub glicyny o wzorze —NH—CH(W)— CO, w którym W oznacza grupe —CH3, CH2OH, —CH(CH3)2 lub atom wodoru.

Sa to zwiazki typu 2-(2-acetamido-2-dezoksy-3- -0-D-glukopiranozylo)-alkilopeptydów wykazujace cenne wlasciwosci biologiczne i farmakologiczne, zwlaszcza czynnosc immunoregulacyjna przede wszystkim niespecyficznych adjuwantów immuno¬ logicznych, a zwlaszcza czynnosc wzmacniania, aktywnosci immunologicznej wszelkiego rodzaju na¬ turalnych lub syntetycznych czynników immuno¬ logicznych.

Zwiazki te znajduja zastosowanie do sporzadza¬ nia odczynników biologicznych, np. standardowych adjuwantów immunologicznych, zwlaszcza do bada¬ nia ewentualnych wlasciwosci adjuwantowych sub- 10 stancji, przez porównanie z wlasciwosciami adju¬ wantów standardowych, lub stosowanych jako czyn¬ niki przeciwdzialajace pewnym skutkom wprowa¬ dzania substancji immunosupresyjnych.

Od dawna czynione sa próby wytwarzania czyn¬ ników o wyzej podanych wlasciwosciach adjuwan¬ towych. Badaniom poddawano ekstrakty z produk¬ tów pochodzenia naturalnego, takie, jak uzyskiwa¬ ne z bakterii, zwlaszcza z mykobakterii. Choc ze zródel tych udalo sie uzyskac produkty o wyso¬ kiej czynnosci i duzej czystosci, znaczny postep \y omawianej dziedzinie jest zwiazany z wprowa¬ dzeniem produktów o czastkach mniejszych, moz¬ liwych do wytworzenia w drodze syntezy chemicz- 15 nej. Jednym z najbardziej reprezentatywnych zwiazków tego typu jest 2-(2-acetamido-2-dezoksy- -Q-D-glukopiranozylo)-D-propionylo-L-alanylo-D- -izoglutamina zwana prosciej N-acetylo-muramylo- -L-alanylo-D-izoglutamina. 20 Otrzymano szereg zwiazków pozbawionych dzia¬ lania toksycznego przejawianego przez czynniki im- munostylujace, o czynnosci adjuwantu immunolo¬ gicznego, bardzo silnej w przypadku niektórych z nich, równiez w przypadku calkowitej nieobec- 25 nosci czynnika oleistego, którego obecnosc jest ko¬ nieczna dla przejawienia sie czynnosci adjuwantu immunologicznego w przypadku ekstraktów pocho¬ dzenia naturalnego, zwlaszcza otrzymanych z my¬ kobakterii. 30 Badania przeprowadzone na szeregu zwierzetach 123 483123 483 pozwolily stwierdzic, ze modyfikacja lub zamiana pewnych grup funkcyjnych, wystepujacych w róz¬ nych miejscach czasteczki, np. zastapienie pierw¬ szego rodnika aminokwasowego w N-acetylo-mura- mylo-L-alanylo-D-izoglutaminie lancuchem pepty- dowym nie prowadzi do utraty czynnosci adjuwan¬ towej wykazywanej przez zwiazek wyjsciowy.

Czynnosc adjuwantowa moze zostac zachowana równiez w przypadku zamiany rodnika propionylo- wego w polozeniu 2 grupy glukopiranozylowej in¬ nym rodnikiem alkilowym. Równiez pierwszy rod¬ nik aminoacylowy, tj. rodnik L-alanylowy moze byc zasjtapiony irirrynr-rodnikiem aminoacylowym, ta¬ kim jak glicylowy lub korzystnie L-serylowy. Moz¬ na go równiez zastapic innymi rodnikami amino- pcylowymi, takiifmi jak np. L^prolilowy, L-treony- ipwy lub L-walilowy.

Natomiast glebsza modyfikacja innych fragmen¬ tów czasteczki prowadzi do utraty, co najmniej w znacznym stopniu czynnosci adjuwantowej ca¬ lej czastki. Wedlug obecnego stanu wiedzy, obec¬ nosc w lancuchu peptydowym grupy wyprowadzo¬ nej z kwasu glutaminowego jest krytyczna dla za¬ chowania czynnosci adjuwantowej. Zwiazki bardzo czynnymi, znajdujacymi zastosowanie jako adju- wanty immunologiczne sa takie, w których grupa a-karboksylowa rodnika glutaminowego jest przek¬ sztalcona w grupe amidowa. Zwiazki te stosuje sie w postaci emulsji typu woda w oleju. Istotne zna¬ czenie postaci karboksyamidowej, grupy a-karbo- ksylowej rodnika glutaminowego podkreslaja rózni autorzy. Mozna tu przytoczyc np. obserwacje Ar- lette Adam i in. w Biochemical and Biophysical Research Communications, vol. 72, No. 1, (1976), którzy miedzy inymi wykazali, ze czynnosc adju¬ wantowa w oleju estru dwumetylowego kwasu N- acetylo-muramylo-L-alanylo-D-glutaminowego (któ¬ ry to zwiazek jest bardzo interesujacy dla innych wlasciwosci biologicznych) jest mniejsza od wyka¬ zywanej przez ester Y-metylowy N-acetylo-mura- mylo-LiTalanylo-D-izoglutaminy.

Podobne obserwacje poczynila grupa badaczy ja¬ ponskich, o czym donosi np. publikacja Shozo Ko- tani i in. w Biken Journal, vol. 19, -9—13, (1976).

Opisane znane zwiazki miedzy innymi takie, w których rodnik glutaminowy ma postac a-karbo- ksyamidu, dzialaja in vivo pirogennie, zwlaszcza przy podawaniu w duzej dawce. Badania przepro¬ wadzone w tej dziedzinie przez rózne grupy ba¬ daczy nie wykazaly wyraznego zwiazku, w okres¬ lonych warunkach eksperymentalnych, miedzy czynnoscia adjuwantowa najaktywniejszych sub¬ stancji a ich pirogennoscia. Shozo Kotani i in. wysuneli hipoteze, ze pirogennosc moze byc ewen¬ tualnie powodowana pokrewienstwem badanych zwiazków z fragmentami peptydoglikanowyrni, któ¬ re moga byc uzyskane z bakterii gram-dódatnich (wymienionych w publikacji).

Powyzsi autorzy formuluja hipoteze ó mozliwos¬ ci istnienia ewentualnego zwiazku miedzy mecha¬ nizmem interweniujacym na poziomie odpowiedzi immunologicznej ssaków, przejawiajacym sie sty¬ mulacja antygenowa, a mechanizmem interwencyj¬ nym na poziomie regulacji temperatury ciala lub odpowiedzi goraczkowej. Wysuneli oni równiez 10 przypuszczenie, ze pewne fragmenty N-acetylo-mu- ramylo-peptydów uczestnicza w obu mechanizmach.

Autorzy ci stwierdzili, ze sposród badanych przez nich zwiazków te, które mialy najwyzsza czyn- iosc adjuwantowa okazaly sie równiez najbar¬ dziej pirogenne, natomiast zwiazki o najnizszej czynnosci adjuwantowej byly takze najmniej pi¬ rogenne.

Powyzsza regula nie zostala dotychczas podwa¬ zona, pomimo tego, ze pewne z opisanych produk¬ tów przejawiaja bardzo niski poziom pirogennos- ci w dawkach i w warunkach doswiadczenia. Ta¬ kim zwiazkiem jest przykladowo dwuamid kwasu N-acetylo-muramylo-L-alanylo-D-glutaminowego. 15 Zwiazek ten, choc ma szczególnie korzystny in¬ deks terapeutyczny, jest znbcznie mniej czyn¬ ny niz N-acetylo-muramylo-L-alanylo-b-izógluta- mina.

Rozwój badan w tej dziedzinie techniki, który 20 doprowadzil do wytworzenia nowych zwiazków, sposobem wedlug wynalazku, pozwolil równiez wy¬ ciagnac szereg nieoczekiwanych wniosków. Tak wiec okazalo sie mozliwe uzyskanie zwiazków o bardzo wysokiej czynnosci adjuwantowej, w któ- 25 rych jedynie grupa Y-^arD°ksylowa reszty kwasu glutaminowego ma postac amidowa, pod warun¬ kiem, ze równiez grupa a-karboksylowa- reszty kwasu glutaminowego jest w okreslony sposób pod¬ stawiona. Czynnosc adjuwantowa tych zwiazków 30 przejawia sie zjarówno w roztworze wodnym, jak i w emulsji typu woda w oleju. Ten wynik jest tym bardziej nieoczekiwany, ze jak wiadomo N- acetylo-muramylo-L-alanylo-D-glutamina (z zami- dowana grupa karboksylowa rodnika glutamylowe- 35 go) ma in vivo jedynie bardzo slaba czynnosc adju¬ wantowa, nawet przy podawaniu w postaci emulsji typu woda w oleju.

Pozorna korelacja miedzy czynnoscia adjuwan¬ towa a pirogennoscia nowych zwiazków zostala po- *o waznie podwazona wynikami doswiadczen poczy¬ nionych w zwiazku z wynalazkiem. Przejawia sie to szczególnie w przypadku niektórych sposród zwiazków wytworzonych sposobem wedlug wyna¬ lazku, charakteryzujacych sie dotychczas nie osia- 4* ganym stopniem pirogennosci.

Powyzsze stwierdzenia dotycza produktów wy¬ twarzanych sposobem wedlug wynalazku, które po¬ dobnie jak zwiazki znane, sa zwiazkami typu 2- (2-amino lub acyloamido-2-dezoksy-3-0-D-glukopi- M ranozylo) alkilo-peptydów.

Zwiazki wytworzone sposobem wedlug wyna¬ lazku charakteryzuja sie równoczesna zawartoscia grupy amidowej (—CONH2) usytuowanej w pozy¬ cji y i grupy estrowej usytuowanej w pozycji a » reszty kwasu glutaminowego.

Wedlug wynalazku sposób wytwarzania nowych zwiazków o wzorze ogólnym 1, w którym Ri, R2, R3 i X maja wyzej podane znaczenie, polega na przeprowadzaniu reakcji sprzegania grupy karbofc- •° sylowej zwiazku o wzorze ogólnym 2, w którym Ri i R2 maja wyzej podane znaczenie z grupa aminowa nalezaca do grupy aminoacylowej: H2N- CH(W)-CO- pochodnej o wzorze 3/ w którym W ma wyzej podane znaczenie, R4 ma znaczenie ta»* * kie jak R3' lub oznacza atom wodoru, przy czyms 123 483 6 grupy funkcyjne reaktywnie biorace udzial w reak¬ cji sprzegania zabezpiecza sie a nastepnie po reak¬ cji sprzegania uwalnia sie i ewentualnie gdy R* oznacza atom wodoru otrzymany zwiazek estryfi¬ kuje sie za pomoca alkoholu o wzorze R3OH.

Sposród zwiazków wytwarzanych sposobem wed¬ lug wynalazku o ogólnym wzorze 1, mozna, wy¬ róznic grupe szczególnie korzystnych. Drugim lan¬ cuchem rodnika peptydowego, zwiazanym z rod¬ nikiem typu muramylowego jest reszta kwasu D-glutaminowego. Natomiast pierwsza reszta ami- noacylowa (oznaczona symbolem X) moze byc wyb¬ rana sposród róznych reszt aminoacylowych po¬ wyzej wymienionych.

Korzystne sa te zwiazki o wzorze 1, w których pierwszym ugrupowaniem aminoacylowym jest reszta L-alaniny. Drugi typ korzystnych zwiazków stanowia te, w których pierwszym ugrupowaniem aminoacylowym jest reszta L-seryny. Inna korzy¬ stna grupe stanowia zwiazki, w których wystepu¬ je reszta glicyny. Dalszymi korzystnymi zwiazka¬ mi sa takie, w których ugrupowaniem aminoacy¬ lowym jest reszta L-waliny.

W polozeniu a reszty D-glutaminowej korzystnie znajduje sie grupa estrowa z 1—4 czlonowym lan¬ cuchem weglowym.

R3 korzystnie oznacza rodnik metylowy, etylowy lub propylowy. Korzystne sa równiez zwiazki, w których rodnik R3 zawiera 4 atomy wegla.

Wiazanie glikozydowe produktów wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku moze miec postac odpowiadajaca anomerom a lub B.

Zwiazkami korzystnymi sa te, w których Ri oznacza grupe hydroksylowa a R2 oznacza atom wodoru.

Korzystnymi sposród zwiazków wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku sa zwlaszcza estry takie jak metylowy, etylowy, propylowy, heksy- lowy i decylowy N-acetylo-muramylo-L-alanylo-D- glutaminy, a przede wszystkim ester butylowy N- acetylo-muramylo-L-alanylo-D-glutaminy.

Stosowane w sposobie wedlug wynalazku, zwiaz¬ ki wyjsciowe o wzorze 2 i 3, mozna wytworzyc droga szeregu kolejno po sobie nastepujacych reak¬ cji, prowadzacych do uszeregowania fragmentów stanowiacych podstawowa strukture zwiazku kon¬ cowego, tj. fragmentu muraminowego i zwiazku o wzorze 3. Uzyskiwanie produktów koncowych mozliwe jest w róznych sekwencjach reakcji, róz¬ niacych sie kolejnoscia laczenia poszczególnych fragmentów czasteczki.

Aminokwas o strukturze glutaminy, moze byc zestryfikowany w polozeniu a (polozenie, któremu odpowiada rodnik R3 we wzorze ogólnym) przed wykonaniem sprzezenia, lecz mozliwe jest rów¬ niez przeprowadzenie estryfikacji na lancuchu dwu- peptydowym lub na muramylodwupeptydzie.

Wyboru kolejnosci poszczególnych etapów synte¬ zy w wyzej podanych wariantach dokonuje sie kierujac sie latwoscia wykonania operacji, wy¬ dajnoscia i mozliwoscia uzyskania produktów jed¬ norodnych, zwlaszcza z punktu widzenia stereo- chemii W sposobie wedlug wynalazku kwas muramino- wy stosuje sie w postaci pochodnej, w której wszystkie grupy funkcyjne mogace reagowac w operacjach sprzegania, poza grupa karboksylowa, sa podstawione lub ochronione grupami blokuja¬ cymi. Równiez pochodne aminokwasu lub frag¬ mentu dwupeptydowego sa w trakcie sprzega¬ nia ochronione w taki sposób, ze reagowac moga tylko grupy funkcyjne dajace sprzezenie.

Ochrony grup funkcyjnych, które nie powinny brac udzialu w reakcji, dokonuje sie sposobami tradycyjnymi.

W celu ochrony grup karboksylowych korzystnie tworzy sie ester, zwlaszcza ester benzylowy. Grupa benzylowa moze byc odszczepiona wodorolitycz- nie, w warunkach nie naruszajacych wiazania pe¬ ptydowego. Wodorolitycznie mozna równoczesnie odszczepiac inne grupy ochronne, jak N-karbo- benzoksylowa.

Ochrony grup aminowych korzystnie dokonuje sie za pomoca grup alkiloksy- lub aryloksykarbonylo- wych, zwlaszcza za pomoca grupy benzoksykarbo- nylowej. Równiez te grupe odszczepia sie za po¬ moca katalitycznej wodórolizy, np. w obecnosci palladu.

Inna korzystna grupa blokujaca jest grupa to- sylowa (tolueno-sulfonylowa). Grupe te wprowadza sie dzialajac chlorkiem kwasu p-toluenosulfonowe- go na zasadowy roztwór ochranianego aminokwa¬ su.

Sprzeganie przeprowadza sie sposobami tradycyj¬ nymi. Mozna stosowac sposób zwany technika mie¬ szanego bezwodnika. W sposobie tym tworzy sie bezwodnik dzialajac na aminokwas lub peptyd z ochroniona grupa aminowa chloromrówczanem alkilu (Cl-CO-O-R), np. w toluenie, w obecnosci trzeciorzedowej aminy, zwlaszcza N-metylomorfo- liny. Mieszany bezwodnik latwo kondensuje sie z dalszym aminokwasem.

Równie korzystnie kondensacji przeprowadza sie bezposrednio, za pomoca N,N-dwucykloheksylokar- bodwuimidu.

Inny korzystny sposób kondensacji polega na uzyciu aktywnych estrów. W sposobie tym estry¬ fikuje sie te grupe karboksylowa, która ma byc sprzegnieta. Korzystny jest ester sukcynimidowy.

Powyzsze reakcje kondensacji przeprowadza sie w lagodnych warunkach, w mozliwie najwiekszym stopniu ograniczajacych ryzyko racemizacji. Tak wiec reakcje przeprowadza sie w temperaturze po¬ kojowej lub nizszej, przy pH zblizonym do obo¬ jetnego.

Wazny jest równiez dobór rozpuszczalników. Dla ulatwienia przebiegu reakcji sprzegania korzystnie stosuje sie rozpuszczalnik o charakterze polarnym.

Jednakze dla umozliwienia prowadzenia reakcji w warunkach odpowiedniego stezenia, wybrany rozpuszczalnik winien umozliwiac dobre rozpusz¬ czanie produktów, które sa lipofilowe. Rozpusz¬ czalnikiem korzystnym, odpowiadajacym powyz¬ szym wymaganiom, jest dwumetyloformamid.

Ponizej podano podstawowe wskazówki dotycza¬ ce róznych operacji, które moga byc stosowane w syntezie produktów o wzorze 1. Wpierw omówiono kazdy etap oddzielnie, a nastepnie kilka sekwen¬ cji reakcyjnych korzystnego typu. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 607 123 483 8 a) Wytwarzanie kwasu muraminowego, jego ana¬ logów i pochodnych.

Syntezy tych produktów mozna dokonac wycho¬ dzac ze zwiazków opisanych we wczesniejszych pu¬ blikacjach. Ewentualnie, w przypadku zwiazków, których synteza nie jest opisana, mozna zastoso¬ wac sposoby otrzymywania zwiazków analogicz¬ nych, konwencjonalnie stosowane w chemii oli- gosacharydów.

Kwas N-acetylo-amuraminowy lub jego analogi mozna otrzymywac sposobem opisanym we fran¬ cuskim opisie patentowym nr 2 292 486.

Powyzszy sposób obejmuje np. przeprowadzenia grupy wodorotlenowej w polozeniu 3 w sól so¬ dowa i nastepna kondensacje pochodnej sodowej z sola lub estrem kwasu 2-chloropropionowego.

Stosowany zwiazek chlorowcowy o konfiguracji L mozna otrzymac sposobem opisanym w J. Biol.

Chem., 1972, 247, 391, autor Sinay i in.

Jezeli stosuje sie ester chlorowcokwasu, to dis. nastepnej kondensacji peptydowej grupe karbok¬ sylowa mozna uwolnic hydroliza prowadzona w od¬ powiednich warunkach. b) Podstawienie w rodniku sacharozy.

Wychodzac z pochodnych kwasu N-acetylomura- minowego zablokowanych w polozeniach 1,4 i 6, jak otrzymane w a), mozna otrzymac róznorakie zwiaz¬ ki analogiczne, w których rodnik acetylowy zwia¬ zany z atomem azotu w polozeniu 2 jest zasta¬ piony podstawnikami, jak podane w ogólnej de- finicji* tj. rodnikami acylowymi. W celu dokona¬ nia tej modyfikacji mozna w znany sposób hy¬ drolitycznie odszczepic rodnik acetylowy za pomoca mocnej zasady, np. jak opisano w wyzej podanej publikacji P.H. "Grossa i R.W. Jeanloza.

Otrzymane zwiazki, zawierajace w pierscieniu glukopiranozydowym wolna grupe aminowa, moz¬ na ponownie poddac acylowaniu, w konwencjonal¬ nych warunkach, za pomoca odpowiedniego czynika acetylujacego, wprowadzajacego zadany podstaw¬ nik CH3. Jako czynnik acylujacy mozna stosowac przede wszystkim bezwodniki lub chlorki kwaso¬ we.

Podstawienia w polozeniu 1 mozna dokonac spo¬ sobami uprzednio opisanymi, konwencjonalnymi w chemii cukrów. W trakcie tych reakcji poloze¬ nia, które nie maja byc podstawione lub które maja byc w dalszej kolejnosci podstawione w inny sposób, sa przejsciowo ochraniane grupami bloku^ jacymi w konwencjonalny sposób.

Poczatkowo obecne grupy blokujace, w przypad¬ ku gdy wychodzi sie jak wyzej podano, z benzy- lo-2-acetamido-4,6-0-benzylideno-2-dezoksy-D-glu- kopiranozydu, odszczepia sie np. za pomoca kwasu octowego (60°/*, wrzenie w ciagu godziny pod chlodnica zwrotna) i wodoroliza katalityczna, jak opisano np. w Biochem. Biophys. Res. Commun., 1974, 466, 1316 lub wodoroliza katalityczna, jak opi¬ sano np. w Inst. J. Peptide Protein Res., 1977, 9, 249, autor Lefrancier i in.

Podstawianie przeprowadza sje sposobami kon¬ wencjonalnymi. W celu otrzymania pochodnych acylowych stosuje sie czynnik acylujacy odpo¬ wiadajacy podstawnikowi, który ma byc wprowa¬ dzony (bezwodnik, chlorek acylu itp.).

Podstawienia na rodniku ozydowym mozna do¬ konac przed lub po przylaczeniu lancucha pepty- dowego lub jego fragmentów.

Synteza lancucha peptydowego.

Syntezy rodnika dwupeptydowego sie sposobami konwencjonalnymi w chemii peptydów. Przyklado¬ wo, mozna stosowac sposób z aktywacja grupy karboksylowej, np. metoda bezwodnika mieszanego.

Korzystnie, syntezy peptydu dokonuje sie za po¬ moca zwiazku typu karbodwuimidu, takiego jak N,N'-dwucykloheksylokarbodwuimid lub równowaz¬ ne karbodwuimidy. Przeglad klasycznych sposobów syntezy peptydów przedstawia J.H. Jones, Chemi- stry and Industry, 723, (1974), oraz artykul Le- franciera i in., Int. J. Peptide Protein Res., 1977, 9, 249. ' -.- Podstawienia grupy karboksylowej rodnika D-glu- taminylowego grupa estrowa (R3) korzystnie doko¬ nuje sie na pochodnej D-glutaminy, przed- jej sprzegnieciem z pochodna L-alaniny. Korzystne jest równiez dokonanie tego podstawienia na pochod¬ nej dwupeptydu. W obu przypadkach reakcje prze¬ prowadza sie np. sposobem opisanym przez Wan- ga i in., J. Org. Chem., 42, 1?86 (1977).

Sekwencje syntezy glikopeptydów o wzorze 1.

Produktem wyjsciowym jest pochodna o wzorze 4, w którym Ri oznacza rodnik benzylowy, otrzy¬ mana jak opisuja Gross i Jeanloz, J. Org. Chem., 1967, 32, 2759. Podobny zwiazek, w którym Ri jest grupa inna niz benzylowa, mozna otrzymac sposo¬ bem wytwarzania a lub B-glukozydów, opisanym w tym samym arykule lub innymi sposobami sto¬ sowanymi w chemii oligosacharydów.

Pochodna te mozna sprzegac z chlorowodorkiem dwupeptydu o ogólnym wzorze H-X-D-Glu(NH2)- -O-R3.

Pochodne peptydów otrzymuje sie sposobami opisanymi przez Lefranciera i wspólpracowników, Int. J: Peptide Protein Res., 1977, 9, 249; 1978, 11, 289.

W wyzej cytowanych publikacjach Gross i Je¬ anloz, J. Org. Chem., 1967, 32, 2759 oraz Ózawa i Jeanloz, J. Org. Chem., 1965, 30, 448 opisane sa równiez sposoby sprzegania stosowane dla otrzy¬ mywania pochodnych glikopeptydowych.

Katalityczne uwodornianie zwiazków glikopep¬ tydowych przeprowadza sie konwencjonalnie (Le francier i wspólpracownicy, 1977, cytowane od¬ nosniki).

W jednym z wariantów, pochodne poddaje sie wybiórczemu odbenzylidenowaniu, jak opisuje Ner- ser i inni, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1975, 66, 1316.

W wariancie, w którym funkcja karboksylowa rodnika D-glutaminowego jest wolna (R3=H), gru¬ pe estrowa (R3) wprowadza sie po wykonaniu sprzegania, sposobem opisanym przez Wanga i in.

J. Org. Chem., 42, 1977, 1286.

Zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wyna¬ lazku wykazuja cenne wlasciwosci biologiczne i farmakologiczne. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 609 Wlasciwosci farmakologiczne 1) Toksycznosc Badano toksycznosc produktów wedlug wynalaz¬ ku przy pozajelitowym podawaniu królikom.

Stwierdzono, ze dawki toksyczne sa znacznie wyz¬ szego rzedu od dawek, w jakich produkty przeja¬ wiaja swa czynnosc. Produkty sa dobrze tolerowa¬ ne przez królika w dawce 5 mg/kg wagi zwierze¬ cia lub wiekszej. 2) Pirogennosc.

W trakcie badan na królikach sledzono maksy¬ malne zmiany temperatury w ciagu 3 godzin po podaniu produktu. W dawkach tak wysokich, jak 5 mg/kg i wyzszych produkt nie powodowal zna¬ czacych zmian temperatury. Przecietne podwyzsze¬ nie temperatury powodowane podaniem królikom estru Mur-NAc-L-Ala-D-Gln wynosi dla poszcze¬ gólnych estrów: ester metylowy 5 mg/kg 0,53°C ester butylowy 10 mg/kg 0,30°C ester decylowy 10 mg/kg 0,23°C Mozna wiec stwierdzic, ze w dawkach czynnycn, jak stosowane w nizej opisanych próbach, powyz¬ sze produkty sa calkowicie pirogenne. 3) Charakter adjuwantowy w fazie wodnej.

W serii prób, których wyniki podano ponizej, badano wplyw czynnika aktywnego, wytworzonego sposobem wedlug wynalazku na miano przeciw¬ cial antyalbuminowych, w nastepujacych warun¬ kach.

Grupie 8 myszy rasy Swiss, w wieku 2 miesiace, iniekcja podskórna podawano po 0,5 mg antyge¬ nu — albuminy z osocza bydlecego (BSA), samego lub lacznie z badana substancja, w izotonicznym roztworze solanki. Ta wysoka dawka antygenu, mieszczaca sie w poblizu granicy porazajacej od¬ powiedz immunologiczna, dawala odpowiedz slaba lub zerowa u zwierzat kontrolnych, tj. tych, któ¬ rym podawano sam antygen. Taka dawka stano¬ wi jednakze ostre kryterium dla uwidocznienia czynnosci substancji adjuwantowej. Po uplywie 30 dni myszy otrzymaly, ta sama droga, dawke 0,1 mg tego samego antygenu.

Dla porównania, równoczesnie badano efekt adju¬ wantowy 2-<2-acetamido-2-dezoksy-3-0-D-glukopi- ranozylo)-D-propionylo-D-alanylo-D-izoglutaminy (MDP), zwiazku znanego ze swych wlasciwosci adjuwantowych.

Miano przeciwcial oznacza sie hemaglutynacja pasywna, stosujac krwinki czerwone owcy trak¬ towane formalina i oznaczajac antygen badany sposobem opisanym przez A.A. Hirate i M.W.

Brandissa, J. Immunol., 100, 641—648^ 1968. Próby po pierwszej i po drugiej iniekcji antygenu, dla oznaczenia odpowiedzi pierwotnej i wtórnej.

Wyniki badan przedstawiono w ponizszej tab¬ licy 1. Miano przeciwcial wyraza rozcienczenie se¬ ryjne maksymalne, aglutynujace dana ilosc czer¬ wonych krwinek owcy.

Powyzsze wyniki wykazuja, ze estry metylowy i butylowy, podane w izotonicznej wodnej solan¬ ce, powoduja znaczne podwyzszenie miana prze¬ ciwcial. Efekt jest wyzszy niz w przypadku po¬ dawania MDP, 483 10 Tablica 1 kontrola BSA BSA+ MDP 100 ^ig i BSA+Mur-NAc-L-Ala- D-Glu(NH2)-OCH3 100 \xg BSA+ Mur-NAc-L-Ala- D-Glu(NH2)-OC4H9 100 ^g BSA+ Mur-NAc-L-Ala- D-Glu(NH2)- 100 \ig Miano przeciwcial 1 odpowiedz pierwotna 3 50 100 12 25 odpowiedz wtórna 16+16 300+100 500+500 600+600 200+90 4) Charakter adjuwantowy w obecnosci fazy ole¬ jowej.

W tych próbach sledzi sie zwiekszenie miana przeciwcial specyficznych wobec antygenu, ponie- 25 waz antygen wstrzykuje sie, sam lub z adjuwan- tem wytworzonym sposobem wedlug wynalazku, w postaci emulsji wody w oleju.

Badania prowadzi sie w grupach po 6 samic swinki morskiej rasy Hartley, wagi 350 g. Wpro- 30 wadzenia dokonuje sie iniekcja sródskórna, do poduszki podeszwowej kazdej z tylnych lap. Albu¬ mine bialka jaja (stanowiaca antygen), w ilosci 1 mg, sporzadza sie w postaci emulsji olejowej roztworu w izotonicznej solance, który to uklad 35 stanowi niekompletny adjuwant Freunda (FIA).

Zwiazek wytworzony sposobem wedlug wynalazku podaje sie w ilosci 0,1 mg, w emulsji zawiera¬ jacej FIA.

Jak poprzednio, w celach porównawczych prze¬ to prowadza sie badania z MDP wprowadzonym w miejsce produktu wytworzonego sposobem wedlug wynalazku.

Po uplywie 18 dni po powyzszej immunizacji poszukuje sie ewentualnych reakcji opóznionej nad- 45 wrazliwosci na antygen, wprowadzajac sródskórnie 0,01 mg albuminy jaja w bok zwierzecia i po uply¬ wie 40 godzin obserwuje sie reakcje w miejscu iniekcji. Mierzy sie w milimetrach srednice wy¬ wolanego odczynu. 50 w 21 dni po iniekcji zwierzeta wykrwiawia sie. W otrzymanym osoczu oznacza sie zawartosc przeciwcial specyficznych wobec albuminy jaja, przez wytracenie kompleksu przeciwcialo-antygen w strefie równowagi. W produkcie wytraconym 55 metoda Folina oznacza sie ilosc azotu bialkowego.

W tablicy przedstawiono srednie zawartosci prze¬ ciwcial. Wartosci te wyrazaja, w mikrogramach, ilosc azotu wytracona przez antygen, na mililitr osocza. w Wyniki badan przedstawiono w ponizszej tablicy 2.

Powyzsze wyniki wskazuja, ze estry metylowy i butylowy, wprowadzone w emulsji olejowej, w bardzo znaczny sposób zwiekszaja miano przeciw- « cial tworzacych w odpowiedzi na iniekcje antygen123 483 11 12 Tablica2 Tablica 3 Sklad emulsji zawiera¬ jacej antygen FIA FIA+ MDP (100 ^g) FIA + Mur-NAc-L-Ala- D-Glu(NH2)-OCH3 (100 |ig) FIA+ Mur-NAc-L-Ala- D-Glu(NH2)-OC4H9 Przeciwciala w osoczu (ag/ml) 800 5000 6000 2000 Próba skór¬ na (srednica w mm) 0 15 17 8 i wywoluja reakcje opóznionej nadwrazliwosci wo¬ bec tego samego antygenu, przy czym obie te reak¬ cje sa co najmniej równe obserwowanym w przy¬ padku MDP. 5) Czynnosc przeciwzakazna wobec Klebsiella.

Sposób przeprowadzania próby jest opisany w Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, 64, 2089, autor Chedid L. i in.

Powyzszy sposób pozwala wykazac przeciwza- kazny charakter produktów. Wykazano, ze lawka 1 do 2.104 mikroorganizmów Klebsiella pneumo- niae wprowadzona domiesniowo myszom powoduje progresywny zgon znacznej czesci lub wszystkich zwierzat w ciagu tygodnia po inokulacji. Po osmiu dniach smiertelnosc zwierzat jest calkowita.

Badano przezywalnosc grupy myszy inokulowa- nych w wyzej podanych warunkach i potraktowa¬ nych produktami otrzymanymi sposobem wedlug wynalazku.

Powyzszym badaniom poddano myszy hybrydy (C57BD6 x AKR/FI wyhodowane w Instytucie Pa¬ steura ze szczepów pochodzacych z hodowli C.N.

R.S. w Orleanie.

Infekcji dokonano szczepem Klebsiella pneumo- niae typu torebkowatego 2, biotyp d, 16 godzinna hodowla w pozywce dla pneumokoków (nr 53515, Instytut Pasteura). Dawka zakazajaca jest 2.104 mi¬ kroorganizmów Klebsiella, dawke te wprowadzano droga domiesniowa.

Wprowadzenia badanego produktu dokonano dro¬ ga dozylna, w apirogennym roztworze fizjologicz¬ nym (0,2 ml). Injekcji dokonano 24 godziny przed inokulacja.

W warunkach powyzszych prób, estry butylowy i decylowy Mur-NAc-L-Ala-D-Glu wykazuja czyn¬ nosc przeciwzakazna, wyrazajaca sie wyzsza pro- centowoscia zwierzat przezywajacych niz w grupie kontrolnej. 6) Brak oddzialywania na mechanizmy koagula¬ cji.

Z ostatnio przeprowadzonych badan wiadomo, ze zwiazki o wlasciwosciach adjuwantowych jak LPS, moga miec dzialania uboczne. Tak wiec stwierdzo¬ no, ze podawanie LPS królikowi ma tendencje do skracania czasu koagulacji. Przyczyny tego zja¬ wiska nie sa dokladnie znane, niemniej wydaje sie uzyteczne ^oznaczanie wplywu produktów wy¬ twarzanych sposobem wedlug wynalazku na koagu¬ lacje w tych samych warunkach, Produkt Kontrola Mur-NAc-L Ala-D-Glu (NH2)- OC4H9 Liczba myszy JO 24 J24 Przezywajace ,J3 29 92 J5 12,5 75 J10 12,5 75 */o' ochrony J — dzien Do badan tych stosuje sie test opisany przez Lernera i in. w Thrombosis Research, vol. 11, str. 253—261, 1977 „Endotoxin induced disseminated in- travascular clotting, evidence that it is mediated by neutrophile production of tissue factor". (Powo¬ dowana endotoksynami rozsiana koagulacja we¬ wnatrznaczyniowa: dowody, ze posredniczy w niej produkcja neutrofili przez czynnik komórkowy).

Calosc pobranej krwi dzieli sie na dwie czesci, z których jedna odwirowuje sie, dla uzyskania oso¬ cza bez plytek (PDP). 1 ml krwi niewirowanej inkubuje sie w plasti¬ kowej probówce 100 \ig badanego produktu.

Sporzadza sie równiez probówki zawierajace po 0,1 ml PDP, do których dodaje sie co godzine, od godziny 0 do 5, po 1 ml mieszaniny inkubacyj- nej, a nastepnie nawapnia sie 0,1 ml 0,025 M chlorku wapnia.

Notuje sie czasy koagulacji i wyznacza czyn¬ nosc prokoagulacyjna w funkcji skrócenia czasu koagulacji, w odniesieniu do kontroli, czyli wody fizjologicznej. Wyniki porównuje sie z uzyskiwa¬ nymi za pomoca standardu o wysokiej czynnosci prokoagulacyjnej, LPS.

Wyniki badan przedstawiono w ponizszej tab¬ licy. Czas koagulacji podano w sekundach.

Stwierdzono, ze estry butylowy, metylowy, N-ac- -Mur-L-Ala-D-Glutaminy w przeciwienstwie do LPS, nie przyspieszaja koagulacji.

Tablica 4 Inkuba¬ cja godzin 0 2 . 3 4 " 5 Woda 131 129 122 119 113 LPS 129 118 98 88 77 Ester metylo¬ wy 125 118 109 110 104 Ester butylowy 129 1 120 122 114 108 Zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalaz¬ ku moga byc stosowane do odczynników biologicz¬ nych np. standardowych adjuwantów immunolo¬ gicznych, w celu badania ewentualnych wlasciwos¬ ci adjuwantowych substancji, przez porównanie z adjuwantami standardowymi lub przeciwdziala¬ nia pewnym efektom zwiazanym z podawaniem. substancji immunosupresyjnych, 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 80123 483 13 14 Dokladniej, do wytwarzania leków zawieraja¬ cych jako skladnik czynny co najmniej jeden ze zwiazków otrzymanych sposobem wedlug wyna¬ lazku, sluzacym do regulowania odpowiedzi im¬ munologicznej pacjenta.

Powyzsze leki stosuje sie przede wszystkim w celu wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej czynnika immunogennego. Takim czynnikiem im- monugennym moze byc substancja pochodzenia na¬ turalnego lub syntetyczna, wymagajaca stosowa¬ nia czynnika stymulujacego.

Koniecznosc stosowania czynnika stymulujacego moze byc spowodowana z natury slabym dziala¬ niem czynnika immunogennego, tym, ze choc sil¬ nie dzialajacy, musi byc stosowany w bardzo ma¬ lych dawkach lub oslabieniem jego charakteru immunogennego, np. w wyniku modyfikacji lub oczyszczania. Ogólnie, zwiazki immunoregulacyjne wedlug wynalazku znajduja zastosowanie we wszy¬ stkich tych przypadkach, gdzie czynnik immuno- genny nie pozwala uzyskac odpowiedzi odpowied¬ nio silnej.

Ujmujac sprawe jeszcze scislej, omawiane zwiaz¬ ki stosuje sie dla wzmocnienia efektu immunogen¬ nego skladników czynnych szczepionek podawanych czlowiekowi lub zwierzeciu, zwlaszcza w przypad¬ ku, gdy skladniki czynne szczepionek naleza do wyzej wymienionych kategorii czynników immuno- gennych. W konsekwencji, wynalazek znajduje za¬ stosowanie do wytwarzania srodków farmaceutycz¬ nych, których skladnik czynny stanowi co naj¬ mniej jeden z tych zwiazków, lacznie z nosnikiem farmaceutycznym dostosowanym do sposobu po¬ dawania lub natury skladnika szczepionki.

Zwiazki wytworzone sposobem wedlug wynalaz¬ ku umozliwiaja stosowanie szczepionek o takich skladnikach, które maja silne wlasciwosci immuno- genne, lecz których stosowanie w normalnych daw¬ kach jest trudne z powodu bardzo wysokiej tok¬ sycznosci lub niepozadanych efektów ubocznych.

Stwierdzono, ze czynniki adjuwantowe otrzyma¬ ne sposobem wedlug wynalazku sa zdolne kompen¬ sowac utrate efektu immunogennego spowodowa¬ na rozcienczeniem lub zmniejszeniem dawki, zwlaszcza w celu zmniejszenia toksycznosci lub w odpowiednim stosunku, efektów ubocznych, nie wplywaja niekorzystnie na te zjawiska.

Ten sam efekt stwierdza sie w przypadku czyn¬ ników szczepionek o duzej czynnosci, lecz o zmniej¬ szonym charakterze immunogennym, zwlaszcza wskutek wysokiego stopnia oczyszczenia lub dla obnizenia toksycznosci niepozadanych efektów u- bocznych. Dotyczy to zwlaszcza szczepionek zawie¬ rajacych anatoksyny bakteryjne lub wirusowe lub bardziej ogólnie, szczepionek zawierajacych sklad¬ niki pochodzace od bakterii lub wirusów, prze¬ ciwko którym szczepionka ma chronic.

Ogólnie, wynalazek znajduje zastosowanie w przypadku wszelkich antygenów poddanych prze¬ mianom chemicznym lub fizycznym, prowadzacym do eliminacji lub modyfikacji tych czesci antyge¬ nu, które' sa odpowiedzialne za efekty wtórne, przy zachowaniu czesci odpowiedzialnych za wlas¬ ciwosci immunogenne. Do tego typu slabych im- munogenów naleza np. czynniki zlozone z „pod- jednostek" pochodzacych od wirusa grypy, zawie¬ rajace jedynie hemaglutaniny i neuraminidazy, a nie zawierajace nukleoprotein i innych skladni¬ ków nukleotydowych wirusa, z którego pochodza. 5 Powyzsze dotyczy równiez pewnych antytoksyn, np. blonicy lub tezca, które moga skladac sie z substancji rozpuszczalnych, jak otrzymywane przez dzialanie w podwyzszonej temperaturze for¬ malina na toksyny bakteryjne, pochodzace od od¬ powiednich bakterii.

Zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalaz¬ ku, zwlaszcza te, w których podstawnik R3 ma 4 lub wiecej atomów wegla, stosuje sie równiez do wytwarzania preparatów przeznaczonych do leczenia chorób zakaznych. Nalezy zwrócic uwa¬ ge, ze w tym zastosowaniu produkty otrzymane spo¬ sobem wedlug wynalazku wyraznie odrózniaja sie od zwykle stosowanych antybiotyków. W prze¬ ciwienstwie do antybiotyków, nie dzialaja bakte¬ riobójczo lub bakteriostatycznie in vitro. Przeciw¬ nie, in vitro moga aktywowac wyodrebnione mak- rofagi, a ich czynnosc in viivo przejawia sie jak przedstawiono w przykladach badan farmakologicz¬ nych.

Ponadto, przeciwnie niz to ma miejsce w przy¬ padku antybiotyków, czynnosc nie ogranicza sie do okreslonych gatunków mikroorganizmów. Wy¬ jasnia sie to faktem, ze ich czynnosc nie jest ukierunkowana, lecz rozwija sie za posrednictwem mechanizmów obrony immunologicznej niespecy¬ ficznej. Podawanie srodków wedlug wynalazku sty¬ muluje i wzmacnia te mechanizmy. Ta róznica czynnosci w stosunku do czynnosci antybiotyków czyni omawiane produkty tym bardziej interesuja¬ cymi, gdyz umozliwia stosowanie ich przeciwko mikroorganizmom chorobotwórczym opornym na antybiotyki.

Sposób dzialania produktów zbliza je do zwiaz¬ ków przeciwzakaznych znanych, takich jak BCG lub lipopolisacharydy. Mozna je z powodzeniem stosowac do leczenia chorób zakaznych, bez ogra¬ niczen powodowanych toksycznoscia, która ograni¬ cza lub wrecz uniemozliwia stosowanie LPS lub BCG.

Produkty wytworzone sposobem wedlug wyna¬ lazku moga byc stosowane zwlaszcza do niewybiór- czego zwalczania chorób powodowanych przez takie mikroorganizmy jak Klebsiella, Pseudomonas, Sta- phylococcus itp.

Zastosowania wyzej podane nie wykluczaja in¬ nych, polegajacych na wykorzystaniu czynnosci immunoregulacyjnej zwiazków wytworzonych spo¬ sobem wedlug wynalazku. Mozna równiez tytulem przykladu przytoczyc ich czynnosci wzmacniania na poziomie immunizacji specyficznej zywiciela wo¬ bec antygenów pasozytniczych, odtwarzanie odpor¬ nosci zywiciela, gdy jest ona na poziomie nizszym od normalnego, a zwlaszcza wówczas, gdy zostala zniszczona samymi antygenami lub pasozytami lub pod wplywem chemoterapii, radioterapii lub pod wplywem innego leczenia dzialajacego immuno- supresyjnie* Adjuwanty wytworzone sposobem wedlug wy¬ nalazku moga byc podawane zywicielowi — zwie¬ rzeciu lub czlowiekowi «« wszelkimi sposobami od- 15 20 25 30 35 40 45 50 55 CO15 123 483 16 powiednimi dla uzyskania zadanego efektu. Po¬ danie czynnika immunoregulacyjnego, tj. adjuwan- tu i czynnika immunogennego, tj. szczepionki anty¬ genowej, moze byc dokonywane równoczesnie lub oddzielnie, w tym ostatnim przypadku w pewnym odstepie czasu, tymi samymi lub róznymi droga¬ mi (np. odpowiednio droga pozajelitowa lub do¬ ustna lub odwrotnie).

W celu wytworzenia róznorakich kompozycji far¬ maceutycznych, zwiazki wedlug wynalazku moga byc laczone z innymi substancjami aktywnymi.

Korzystne jest zwlaszcza laczenie zwiazków o wzo¬ rze 1 z czynnikami immunogennymi np. z czyn¬ nikami immunogennymi stosowanymi w bardzo malych dawkach lub ze slabymi czynnikami im¬ munogennymi.

Korzystne kompozycje farmaceutyczne maja po¬ stac roztworów lub zawiesin lub postac liposomo- wa do injekcji, zawierajacych skuteczna dawke co najmniej jednego produktu wytworzonego sposo¬ bem wedlug wynalazku. Korzystnie, sa to roztwo¬ ry lub zawiesiny lub postaci liposomowe w steryl¬ nej, izotonicznej fazie wodnej, zwlaszcza w solan¬ ce lub glukozie. Takie zawiesiny lub roztwory lub postaci liposomowe moga byc wprowadzone injek- cja sródskórna, domiesniowa lub podskórna lub przez skaryfikacje.

Do kinych kompozycji farmaceutycznych wytwa¬ rzanych ze zwiazków wytwarzanych sposobem wed¬ lug wynalazku naleza kompozycje wprowadzane innymi drogami, jak doustna lub doodbytnicza lub w postaci aerozolu kontaktujacego z blona sluzo¬ wa, zwlaszcza oczu, nosa, pluc lub pochwy.

W powyzszych kompozycjach farmaceutycznych, co najmniej jeden ze zwiazków wytworzonych spo¬ sobem wedlug wynalazku jest zlaczony z dopusz- 10 15 20 25 czalnymi nosnikami farmaceutycznymi, stalymi lub cieklymi, dostosowanymi do podawania doustne¬ go, doocznego lub donosowego, z nosnikami odpo¬ wiednimi do podawania doodbytniczo lub z nosnika¬ mi zelatynowymi, dostosowanymi do wprowadza¬ nia dopochwowego.

Odpowiednie sa równiez kompozycje ciekle izo¬ toniczne, zawierajace co najmniej jeden z produk¬ tów wedlug wynalazku, dostosowane do wprowa¬ dzania przez blone sluzowa, zwlaszcza oczu lub nosa. Inna postacia sa kompozycje w skroplonym, farmaceutycznie dopuszczalnym gazie typu „pro- pellentu", w którym produkty wedlug wynalazku sa rozpuszczone lub utrzymywane w zawiesinie.

Rozprezenie gazu powoduje ich dyspersje w po¬ staci aerozolu. v Dla wzmocnienia obrony immunologicznej zywi¬ ciela, produkty wytworzone sposobem wedlug wy¬ nalazku, w jednej z wyzej podanych postaci daw¬ kowania, stosuje sie w ilosci rzedu 10—1000, np. 50 \ig na kilogram wagi ciala przy podawaniu pozajelitowym lub 200 do 20 000, np. 1000 .jig przy innym sposobie podawania, np. doustnie.

W nizej podanej tablicy V wymieniono korzystne zwiazki o wzorze 1 oraz ich wlasciwosci fizykoche¬ miczne.

W nizej podanej tablicy VII zilustrowano wy¬ niki badan biologicznych zwiazków wymienionych w tablicy V [tj. zwiazków oznaczonych literami od (a) do (k)] przeprowadzonych na królikach i uzyskane przy dawkach wymienionych w sasied¬ niej kolumnie, w warunkach opisanych uprzednio na stronie 14.

Aktywnosc przeciwzakazna mierzono w warun¬ kach opisanych uprzednio na stronach 18—19.

Tablica V Zwiazek 1 a 1 b c ¦¦ d ¦ e .":¦" f > g L fc i j k Ri H H H H H H H H H H H R2 H H H H H H H H H H H X L-Ala L-Ala L-Ala L-Ala L-Ala L-Ala L-Ala L-Ala L-Ala L-Val L-Ser, R3 CHa n-C4H» n-CioHji n-CsH7 n-C6Hi3 i-C4H5 C2H5 n-CsHu sukcyny 1 n^G4H» n-C4H9 Wlasciwosci fizykochemiczne 1 ?Md*0 +30° +32J30 +29,5° + 36,7° + 34° 36,5° +33,1° +47,6° +39,4° 'Md25 +34,3 +34,8 Rf" 0,6 0,3 0,38 0,34 0,34 0,2 Rf™ 0,3 0,35 0,67 Analiza elementar- ¦ na Wyniki zestawiono w nizej podanej tablicy 1 Objasnienia: **CCM I — Chromatografia cienkowarstwowa na zelu krzemionkowym w ukladzie: n-butanol/kwas octowy/woda jak: 4:1:5 obj. faza górna) ***CCM II — Chromatografia cienkowarstwowa na zelu krzemionkowym w ukladzie; octan etylu/pirydyna/kwas octowy/woda jak: ff:2:0, 6:1 (obj.)123 483 17 18 Wyniki analizy elementarnej zwiazków z tablicy I Zwiazek a b 1 c d e f . • , , ¦ t g h ; i dla wzoru C2oH34N40ii-l,25 H20 0i5H«N4Oii-l/3 H20 C29H52N4O1i-0,5 H20 C25H44N4Oii-0,5 H20 C25H44N4O11 • 1 H20 CzaH^NiOn-l CH^COOH, 0,75 HaO CwHMN4Qn-l,25 H20 :¦-...

C»HaN40ual,25 H,0 C27H44N4Oi4-0,75 H20 Obliczono Otrzymano Obliczono Otrzymano Obliczono Otrzymano Obliczono Otrzymano Obliczono Otrzymano Obliczono Otrzymano Obliczono Otrzymano Obliczono Otrzymano Obliczono Otrzymano % C 45,40 45,46 48,24 48,26 54,1 64,3 51,3 51,3 50,5 50,4 48,10 48,2 46,4 46,4 49,4 49,3 48,97 48,8 % H 6,95 6,76 7,50 7,08 8,3 8,3 7,6 7,7 7,8 7,6 7,34 7,0 7,5 7,1 7,6 7,7 6,92 6,5 % N 10,59 10,56 9,78 9,74 8,6 8,7 9,5 9,6 9,4 9,5 8,98 9,0 10,2 10,3 9,3 9,6 8,46. 8,4 % O 28,8 28,0 31,5 31,4 32,3 32,4 36,8 36,0 33,4 33,5 t.t 180°C 157—158° Tablica VII Wlasciwosci biologiczne a-estrów wymienionych w tablicy Ester '(b) (c) (d) (e) (f) (g) (h) (i) (j) (k) Test pirogen- nosci A (°C) . —0,23 —0,07 <—0,13 —0,07 —0,03 —0,03 —0,23 —0,23 daw¬ ka mg/kg 10 10 10 10 10 10 10 10 1 1 Aktywnoj adjuwantu woda + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + NT olej .± + + + + ± + — NT NT NT NT + + NT 3C prze¬ ciw za¬ kaz¬ na (100 v) 63% T— — 25% ,29% 37% —< 1 37% 1 8% i 12% — Objasnienia: + + + + — oznacza aktywnosc znakomita + + + — oznacza aktywnosc bardzo dobra ++ — oznacza aktywnosc dobra 4- — oznacza aktywnosc dobra NT — oznacza: nie testowano A — oznacza wzrost temperatury w °C 100y=0,0001 mg Z tablicy VII widoczne jest, ze dwie pierwsze substancje nie powoduja zadnego wzrostu tempe¬ ratury nawet przy podaniu w dawkach tak wy¬ sokich jak 10 mg/kg. Inne zwiazki wywoluja za¬ ledwie bardzo slabe odczyny goraczkowe przy wskazanych dawkach, które w kazdym z podanych przypadków sa bardzo wysokie w porównaniu z dawkami rzedu 100 y, W- 0,0001 mg stosowanymi 30 35 BOC OMe 40 OSU Bzl Bzi Zx do oceny aktywnosci biologicznej tych samych substancji.

Indeks terapeutyczny badanych substancji jest wiec bardzo korzystny dla wszystkich badanych zwiazków.

Inne cechy charakterystyczne wynalazku sa przedstawione w nizej podanych przykladach wy¬ twarzania zwiazków.

W opisie stosowano nastepujace skróty: Ala — alanina Gin — glutamina Mur-NAc — kwas N-acetylo-muraminowy — t-butoksykarbonyl — ester metylowy — ester sukcynimidowy — rodnik benzylowy — rodnik benzylidenowy -r- grupa benzoksykarbonylowa Przyklad I. Synteza estru metylowego N-ace- 45 tylo-muramylo-L-alariylo-I>glutamiriy. a) t-butoksykarbonylowa pochodna estru mety¬ lowego D-glutaminy BOC-D-Gln-OMe (I). 1,5 g (6,1 mola) t-butoksykarbonylo-D-glutaminy (BOC-D-Gln), sporzadzonej sposobem opisanym 50 przez Schnabela, Liebiegs Ann. Chem. (1967), 702, 188^196 rozpuszcza sie w 60 ml absolutnego meta¬ nolu. W temperaturze d°C wkrapla sie eterowy roztwór dwuazometanu, az do utrzymujacego sie zabarwienia zóltego. Mieszanine reakcyjna miesza 55 sie w ciagu 10 minut w 0°C, a nastepnie w cia¬ gu 10 minut w temperaturze pokojowej. Postep reakcji sledzi sie chromatografia cienkowarstwo¬ wa na zelu krzemionkowym w ukladzie n-butanol- kwas octowy-woda (4:1:5) faza górna), n-butanol- 80 pirydyna-kwas octowy-woda (30:20:6:24) i chloro- form-metanol (5:1). Nadmiar dwuazometanu rozkla¬ da sie dodaniem lodowatego kwasu octowego, po czym odparowuje sie mieszanine reakcyjna do su¬ cha. Pozostalosc rozpuszcza sie w jak najmniej- 65 szej objetosci octanu etylu i wytraca eterem naf-123 483 id 20 towym. Produkt ma temperature topnienia 86-^90° C i skrecalnosc [ Otrzymuje sie 1,417 g BOC-D^Gln-OMe, co od¬ powiada wydajnosci 89,7%.

Analiza elementarna: C11H20N2O5 (260, 29) obliczono: C 50,76%, H 7,75% N 10,76% otrzymano: C 50,62%, H 7,75%, N 10,82.% b) Chlorowodorek estru metylowego D-glutaminy, D-Gln-OMe HC1 (II). 1,4 g (5,4 moli) zwiazku (I) zadaje sie 15 ml 1 N roztworu HC1 w lodowatym kwasie octowym. Po 30 minutach utrzymywania w temperaturze poko¬ jowej mieszanine reakcyjna odparowuje sie, a po¬ zostaly olej suszy pod zmniejszonym cisnieniem nad KOH. c Ester metylowy t-butoksykarbonylo-L-alanylo- D-glutaminy BOC-L-Ala-D-Gln-OMe (III). 1,86 g (6,5 mmolii) estru sukcynimidowego t-buto- ksykarbonylo-alaniny (BOC-Ala-OSu), sporzadzone¬ go wedlug Andersona i wspólpracowników, J. Am.

Chem. Soc. (1964) 86, 1839—1842, dodaje sie do roztworu 1,2 g (5,4 mmoli) zwiazku (II) i 0,6 ml (5,4 mmolij N-metylomorfiny w 25 ml dwumety- loformamidu. Mieszanine utrzymuje sie w ciagu nocy w temperaturze pokojowej, po czym odparo- wAije^tfo sucha i poddaje chromatografii na ko¬ lumnie (27X3 cm) z zelem krzemionkowym, wstep¬ nie zrównowazonej ukladem chloroform-izopropa- nol-kwas octowy (100:0,5:0,2), eluujac ukladem chlo- roform-izopropanol-kwas octowy (100:5:2). Frakcje zawierajace produkt laczy sie i odparowuje do sucha. Prze%71crystalizacje z mieszaniny izopropa- nol-eter izopropylowy otrzymuje sie 1,035 g (III) 0 temperaturze topnienia 115—116°C i skrecalnosci [a]D25 = —9° (w metanolu).

Analiza elementarna: C14H25N3O6 (331, 37) obliczono: C 50,74%, H 7,60%, N 12,68%; otrzymano: C 50,79%, H 7,40% N 12,42%. d) Chlorowodorek estru metylowego L-alanylo-D- glutaminy L-Ala-D-Gln-OMe-HCl. 332 mg (1 mmol) zwiazku (III) zadaje sie 3 ml 1 N roztworu Hd W lodowatym kwasie octowym.

Po 30 minutach utrzymywania w temperaturze po¬ kojowej mieszanine reakcyjna odparowuje sie do sucha, a pozostaly olej dosusza sie pod zmniej¬ szonym cisnieniem, w obecnosci KOH. e) Sprzeganie pochodnej peptydowej (IV) z ochro¬ niona pochodna rodnika rriuramylowego (1-a-Bzl- 4,6-Bzi/Mur-NAc, zwiazku otrzymanego wedlug Ózawy i Jeanloza, J. Org. Chem. (1965), 30, 488 rozpuszcza sie w 5 ml dwumetyloformamidu za¬ wierajacyCh 0,11 ml (1 mmol) N-metylomorfoliny.

Do powyzszego roztworu, oziebionego do —15°C, dodaje sie 0,1 & ml (1 mmol) chloromrówczanu izo- butylu. Po uplywie 3 do 5 minut dodaje sie ozie¬ bionego do —15°C roztworu 268? mg (1 mmol) zwiazku (IV) i 0,11 ml (1 mmol) N-metylomorfo- liny w 5 ml dwumetyloformamidu; Mieszanine utrzymuje sie w ciagu nocy w temperaturze —15°C, po czym dodaje sie 1 ml 2,5 M roztworu wodo¬ roweglanu potasu. Po 30 minutach w 0°C wy¬ traca sie produkt dodaniem do mieszaniny reakcyj¬ nej wody, odsacza go, przemywa ria saczku 1 M roztworem wodoroweglanu sodu i suszy pod zmniejszonym cisnieniem w obecnosci P2O5. Otrzy- 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 65 muje sie 620 mg (90,5%), produktu (V) o tempera¬ turze topnienia 215—220°C i skrecalnosci [cJd25 = +92,6° (w dwumetyloformamidzie). f) Ester metylowy N-acetylo-muramylo-L-alany- lo-D-glutaminy Mur-NAc-L-Ala-D-Gln-OMe (VI). 587,6 ml (0,86 mola) zwiazku (V) rozpuszczonego w 35 ml lodowatego kwasu octowego uwodornia sie w ciagu 60 godzin w obecnosci 450 mg 5% palladu na weglu. Po odsaczeniu katalizatora, pod zmniejszonym cisnieniem odpedza sie kwas octo¬ wy. Produkt rozpuszcza sie w 0,1 M kwasie octo¬ wym, nanosi na kolumne (10X1 cm) z zywica jo¬ nitowa Amberlite AG 50 W—X 2 i eluuje roztwo¬ rem kwasu octowego o tym samym stezeniu. Po liofilizacji eluatu zawierajacego produkt, w taki sam sposób przeprowadza sie chromatografie na zywicy Amberlite AG 1 3t—2. Ostatecznie otrzy¬ muje sie 29ff mg produktu liofilizowanego. :> Powyzszy produkt poddaje sie chromatografii na kolumnie z zelem krzemionkowym, wstepnie zrów¬ nowazonej mieszanina n-butanol-kwas octowy-wo- da (65:10:25). Te sama mieszanina stosuje sie do elucji produktu. Frakcje zawierajace produkt la¬ czy sie, ekstrahuje woda, a otrzymana faze wod¬ na poddaje liofilizacji. Otrzymuje sie 234,4 mg produktu o temperaturze topnienia 108—112°C i skrecalnosci Md85 = +34,3° (w lodowatym kwa¬ sie octowym).

Analiza elementarna: C2oH34N4Ou 1,25 HaO (529,02) obliczono: C 45,40%, H 6,95%, N 10,59%; otrzymano: C 45,46%, H 6,76%, N 10,56%.

Przyklad II. Synteza estru n-butylowego N- acetylomuramylo-L-alanylo-D-glutaminy. a) Z-Ala-D-Gln (I). 2,4 g (16,4 mM) D-glutaminy rozpuszcza sie na goraco w 35 ml wody. W temperaturze pokojowej dodaje sie 2,3 ml (16,4 mM) trójetyloaminy i 4,62 g (14,4 mM) Z-L-Ala-OSu w roztworze w 70 ml bezwodnego czterowodorofuranu (THF). Reakcje prowadzi sie w 4°C w ciagu 48 godzin, po czym dodaje sie 0,5 ml (3,85 mM) dwumetyloaminopro- pyloaminy.

Po godzinie utrzymywania w temperaturze po¬ kojowej mieszanine reakcyjna rozciencza sie 65 ml wody i w 0°C za pomoca 4 N HC1 zakwasza do pH 2,2—3, po czym pod zmniejszonym cisnieniem odpedza sie THF.

Po utrzymywaniu w ciagu nocy w temperaturze 4°C odsacza sie wytracony produkt i przemywa mala objetoscia wody oziebionej lodem, a nastep¬ nie przekrystalizowuje z goracego etanolu.

Otrzymuje sie 2,87 g produktu, co odpowiada wydajnosci 62%. Produkt topnieje w 179—182°C i ma skrecalnosc [a]D20 = —13,3° (w metanolu).

Analiza elementarna: C16H21N3O6 (351,37) obliczono: C 54,69%, H 6,02%, N 11,90%; otrzymano: C 54,18%, H 5,8%, N 11,77%. b) Z-Ala-D-Gln-O-n-Bu (II). 350 mg (1 mM) zwiazku ml THF i 5 ml H20 przeprowadza sie w sól ce- zowa, przez dodanie 20% wodnego roztworu C02CO3 (1 mM). Mieszanine odparowuje sie do sucha, su¬ szy przez kilkakrotne odparowanie z dwumetylo- formamidem i pod zmniejszonym cisnieniem nad P2O5, a pozostalosc rozpuszcza sie w 30 ml dwume-123483 21 22 tyloformamidu i dodaje 0,12 ml (1,1 mM) 1-bromo- n-butanu.

Po uplywie 20 godzin chromatografia cienkowar¬ stwowa na zelu krzemionkowym w ukladzie octan etylu-pirydyna-kwas octowy-woda (6:2:0,6:1) spraw¬ dza sie, czy reakcja zostala zakonczona. Jezeli nie, to ponownie dodaje sie 0,06 ml (0,55 mM) 1-bromo- -n-butanu i pozostawia do przereagowania w ciagu nastepnych 20 godzin. Z kolei mieszanine reakcyj¬ na odparowuje sie do minimalnej objetosci i wo¬ da wytraca produkt.

Otrzymuje sie 332 mg produktu, co odpowiada wydajnosci 81,5%. Temperatura topnienia 148— 150°C.

Analiza elementarna: C20H29N3O6 (407,47) obliczono: C 58,95%, H 7,17%, N 10,31; otrzymano: C 58,91%, H 7,12%, N 10,26%. , c) J>Ala-D-Gln-0-nrBu (III). 350 mg (0,8 mM) zwiazku (II) rozpuszcza sie w 30 ml lodowatego kwasu octowego i w ciagu 4 godzin uwodornia w obecnosci 350 mg 5% Pd na weglu i 1 ml (1 mM 1 N HC1. Po zakonczeniu uwodorniania, sprawdzonym chromatografia cien¬ kowarstwowa na zelu krzemionkowym w ukladzie octan etylu-pirydyna-kwas octowy-woda (6:2:0:1) odsacza sie katalizator, a z przesaczu odpedza roz¬ puszczalnik. Pozostaly olej starannie suszy sie pod zmniejszonym cisnieniem, nad P2O5 i w tym stanie przerabia w nastepnym etapie.

Otrzymuje sie 254 mg produktu, co odpowiada wydajnosci 100%. d) Mur-NAc/l-bzl-4,6-0-Bzi/-L-Ala-D-Gln-OBu : (IV).

Zwiazek otrzymuje sie sposobem konwencjonal¬ nym, poprzez bezwodnik mieszany.

Z 0,9 mM Mur-NAc/l-bzl-4,6-0-Bzi/ i 0,8 mM (III) uzyskuje sie wydajnosc 81,2%. Temperatura topnienia produktu wynosi 220—235°C, a skrecal- nosc [«]d20 = +82,6°C (w dwumetyloformamidzie).

Analiza elementarna: C37H50N4O11 (726,84) obliczono: C 61,14%, H 6,93%, N 7,71%; otrzymano: C 61,77%, H 7,03%, N 7,03%. e) Mur-NAc-L-Ala-D-Gln-O-n-Bu (V). 472 mg (0,6 mM) zwiazku (IV) rozpuszcza sie w 30 ml lodowatego kwasu octowego i w ciagu 40 godzin uwodornia w obecnosci 470 mg 5% Pd na weglu. Po kontroli chromatograficznej na plytce z zelem krzemionkowym, w ukladzie CHCI3—MeOH, (50—15) odsacza sie katalizator, a przesacz odpa¬ rowuje.

Oleista pozostalosc rozpuszcza sie w CHCL3— MeOH (50:15) i poddaje chromatografii na kolum¬ nie z zelem krzemionkowym 60 (33 g)r ^luujac mieszanina CHC13—MeOH (50:15). Frakcje zawie¬ rajace produkt odparowuje sie do sucha, a pozo¬ stalosc rozpuszcza w wodzie i po ultrawirowaniu poddaje liofilizacji.

Otrzymuje sie 157 mg produktu, co odpowiada wydajnosci 48%. Skrecalnosc [a]D20 = +34,8° (w kwasie octowym).

Analiza elementarna: C25H40N4O11 1/3 H20 obliczono: C 48,24%, H 7,50%, N 9,78%; otrzymano: C 48,26%, H 7,08%, N 9,74%.

Przyklad III. Synteza estru decylowego N- -acetylo-muramylo-L-alanylo-D-glutaminy. a) Produkt otrzymuje sie sposobem wyzej - opa¬ sanym dla estru n-butylowego N-acetylo-muramy- lo-L-alanylo-D-glutaminy.

Produkt otrzymany w tych warunkach ma skre- 5 calnosc [a]D20 = +30° (w lodowatym kwasie octo¬ wym).

Analiza elementarna: C29H52N4Oii-0,15 CHCI3 (650,64) obliczono: C 53,81%, H 8,08%, N 8,61%; 10: otrzymano: C 53,97%, H 8,06%, N 8,47% b) Ten sam produkt zsyntetyzowano w innej sekwencju 492,5 mg (1 mM) Mur-NAc-L-Ala-D-Gln rozpusz¬ czono w 15 ml THF i 5 ml H20 i dodaniem 20% 15 wodnego roztworu Cs2C03 (1 mM) przeksztalcona w sól cezowa. Po zatezeniu do sucha i wysuszeniu przez kilkakrotne odparowanie z dwumetyloforma- midem i nad srodkiem suszacym, pozostalosc roz¬ puszczono w 30 ml dwumetyloformamidu, a do 20 roztworu dodano 0,13 ml (1, 1 mM) 1-bromo-n- -dekanu. Po uplywie 20 godzin mieszanine reak¬ cyjna odparowano do sucha. Po chromatografii na kolumnie z zelem krzemionkowym, mieszanina chloroform-metanol (50:15), produkt otrzymano 25 przez wytracenie eterem z metanolu.

Skrecalnosc [a]D20 = +29° (w lodowatym kwasie octowym).

Analiza elementarna: C29H52N4Oii-0,25 CHCI3 (661,9) 30, obliczono: C 53,081%, H 7,96%, N 8,47%; otrzymano: C 53,2%, H 8,0%, N 8,50%.

Przyklad IV. Synteza estru n^propylowego N- -acetylo-muramylo-L-alanylo-D-glutaminyk Produkt otrzymuje sie sposobem opisanym dla 35 estru n-butylowego N-acetylo-muramylo-L-alanylo- -D-glutaminy.

Skrecalnosc otrzymanego produktu [ +32,3° (w lodowatym kwasie octowym).

Analiza elementarna dla 40 C22H38N40ii 0,6 CHC13-1 CH3COOH (664,65) obliczono: G 44,4%, H 6,4%, N 8,4%; otrzymano: C 44,5%, H 6,3%, N 8,4%.

Przyklad V, Synteza estru n-heksylowego ,N- -acetylo-muramylo-L-alanylo-D-glutaminy. 49 Produkt otrzymuje sie sposobem opisanym dla estru n-butylowego N-acetylo-muramylo-L-alanylo- -D-glutaminy.

Skrecalnosc otrzymanego produktu [o]D20 = +29,5° (w lodowatym kwasie octowym). 50 Analiza elementarna: CajH^On 0,3 CHC13 (612,47) r obliczono: C 49,6%, H 7,3%, N 9,1%; otrzymano: C 49,4%, H 7,4%, N 9,1%.

Przyklad VI. Synteza estru n-butylowego 6? 55 -O-sukcynylo-N-acetylo-muramylo-L-alanylo-D- -glutaminy. a) Synteza estru n-butylowego a-benzylu-N-ace- tylo-muramylo-L-alanylo-D-glutaminy. 3,634 g estru n-butylowego a-benzylo-4,6-0-ben- 60 zylideno-N-acetylo-muramylo-L-alanylo-D-gluta- miny (5 mmoli) zawiesza sie w 250 ml kwasu octo¬ wego 60%, po czym rozpuszcza calkowicie przez ogrzewanie we wrzacej lazni wodnej. Po przesa¬ czeniu od resztkowych ilosci substancji stalych, •5 mieszanine reakcyjna odparowuje sie do suchosci.123 483 CH£H-CQ-X-NH-CH-CQ-0-R3 CH, i CH2 CO-NH2 Wzór1 CHjORa CH3CH-COOH Wzór 2 H H^i -C-CO-NH-CH-COOR4 W CHo-CONHz Wzór 3 OCH* H,Ri NH-COCH3 yizor 4