CZ296720B6

CZ296720B6 - Lipofilní analogy N-acetylnormuramoyl-L-alfa-aminobutanoyl-D-izoglutaminu s imunostimulacní aktivitou

Info

Publication number: CZ296720B6
Application number: CZ0130398A
Authority: CZ
Inventors: Ledvina@Miroslav; Jezek@Jan; Hríbalová@Vera; Turánek@Jaroslav
Original assignee: Ústav organické chemie a biochemie AV CR
Priority date: 1998-04-28
Filing date: 1998-04-28
Publication date: 2006-05-17
Also published as: CZ130398A3

Abstract

Lipofilní analog N-acetylnormuramoyl-L-.alfa.-aminobutanoyl-D-izoglutaminu s imunostimulacní aktivitou obecného vzorce I, kde R je lipofilní acylový zbytek o poctu atomu uhlíku C.sub.23.n. az C.sub.70.n., který je lineární nebo vetvený a nebo cyklický nebo polycyklický. Lipofilní analog N-acetylnormuramoyl-L-.alfa.-aminobutanoyl-D-izoglutaminu obecného vzorce I se pripraví tak, ze benzyl-2-acetamido-2-deoxy-4,6-O-izopropyliden-3-O-methoxykarbonylmethyl-.alfa.-D-glukopyranosid vzorce II se po zmýdelnení na benzyl-2-acetamido-2-deoxy-4,6-O-izopropyliden-3-O-karboxymethyl-.alfa.-D-glukopyranosidvzorce III kondenzuje s peptidovou komponentou zavzniku látky IV, nacez se látka IV prevede odstepením izopropylidenové skupiny na benzylester N-(2-O-(benzyl 2-acetamido-2,3-dideoxy-.alfa.-D-glukopyranosid-3-yl)-glykoloyl)-L-.alfa.-aminobutanoyl-D-izoglutaminu vzorce V, který se parciálne acyluje za vzniku 6-O-acylderivátu benzylesteru N-(2-O-(benzyl-2-acetamido-2,3-dideoxy-.alfa.-D-glukopyranosid-3-yl)-glykoloyl)-L-.alfa.-aminobutanoyl-D-izoglutaminu obecného vzorce VI, a z látek V a VI se hydrogenolýzou odstepí benzylové chránicí skupiny zavzniku N-acetyl-normuramoyl-L-.alfa.-aminobutanoyl-D-izoglutaminu obecného vzorce I', kde R je atomvodíku, a jeho 6-O-acylderivátu obecného vzorce I, kde R je lipofilní acylový zbytek o poctu atomu uhlíku C.sub.23.n. az C.sub.70.n., který je lineární nebo vetvený, cyklický nebo polycyklický.

Description

Lipofilní analog N-acetylnormuramoyl-L-a-aminobutanoylD-izoglutaminu s imunostimulační aktivitou obecného vzorce I, kde R je lipofilní acylový zbytek o počtu atomů uhlíku C₂₃až C₇₀, který je lineární nebo větvený a nebo cyklický nebo polycyklický. Lipofilní analog N-acetylnormuramoyl-L-ccaminobutanoyl-D-izoglutaminu obecného vzorce I se připraví tak, že benzyl-2-acetamido-2-deoxy-4,6-O-izopropyliden-3-Omethoxykarbonylmethyl-oc-D-glukopyranosid vzorce II se po zmýdelnění na benzyl-2-acetamido-2-deoxy-4,6-Oizopropyliden-3-O-karboxymethyl-ct-D-glukopyranosid vzorce III kondenzuje s peptidovou komponentou za vzniku látky IV, načež se látka IV převede odštěpením izopropylidenové skupiny na benzylester N-(2-O-(benzyl 2acetamido-2,3-dideoxy-a-D-glukopyranosid-3-yl)-glykoloyl)L-a-aminobutanoyl-D-izoglutaminu vzorce V, který se parciálně acyluje za vzniku 6-O-acylderivátů benzylesteru N(2-O-(benzyl-2-acetamido-2,3-dideoxy-a-D-glukopyranosid3-yl)-glykoloyl)-L-a-aminobutanoyl-D-izoglutaminu obecného vzorce VI, a z látek V a VI se hydrogenolýzou odštěpí benzylové chránící skupiny za vzniku N-acetylnormuramoyl-L-a-aminobutanoyl-D-izoglutaminu obecného vzorce Γ, kde R je atom vodíku, ajeho 6-O-acylderivátů obecného vzorce 1, kde R je lipofilní acylový zbytek o počtu atomů uhlíku C₂₃ až C₇₀, který je lineární nebo větvený, cyklický nebo polycyklický.

RO

OH

CH₂CO-L-Abu-D-isoGln

Lipofilní analogy N-acetylnormuramoyl-L-a-aminobutanoyl-D-izoglutaminu s ímunostimulační aktivitou

Oblast techniky

Vynález se týká lipofilních derivátů N-acetylnormuramoyl-L-a-aminobutanoyl-D-izoglutaminu s imunostimulační aktivitou, tj. analogů MDP modifikovaných v cukerné a peptidové části molekuly, a způsobu jejich přípravy.

Dosavadní stav techniky

V důsledku negativních změn životního prostředí, narůstajícího významu infekcí poškozujících imunitu (např. AIDS), ale i některých terapeutických postupů, jako je např. rádio- a farmakoterapie nádorových onemocnění, došlo ke značnému nárůstu chorobných stavů charakterizovaných nedostatečnou imunitou. Rovněž ústup od přirozených vakcín a přechod k bezpečnějším semisyntetickým, rekombinantním a syntetickým vakcínám si vyžádal nová a strukturně definovaná adjuvans. Proto je v posledních letech věnována značná pozornost vývoji látek s imunostimulační aktivitou.

Významnými představiteli této skupiny látek jsou muramylové glykopeptidy. Muramyldipeptid (MDP, N-acetyl-muramoyl-L-alanyl-D-izoglutamin; obr. 1) je nejmenší strukturní jednotkou peptidoglykanu bakteriální stěny, která si zachovala imunostimulační aktivitu.

Peptidoglykan n = 10 -100; GMDP n = 1

Obr.1

Tato aktivita spolu s dalšími biologickými účinky vedla k syntéze značného počtu analogů MDP, s cílem zvýšit strukturními změnami specifitu účinku ve zvoleném směru a potlačit nežádoucí vedlejší účinky zejména pyrogenitu. Tento výzkum poskytl několik analogů MDP, které se staly předmětem zájmu farmaceutického průmyslu (viz obr. 2). (Adam A. et al.: Med. Res. Rev., 4, 111 (1984); Leclerc C. et al.: CRC Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 2, 353 (1986); Baschang G.: Tetrahedron 45, 6331 (1989)). Modifikací karboxyterminální oblasti byl získán silně adjuvantní a nepyrogenní analog Murabutid (Bahr G. M. et al.: Int. J. Immunopharmacol. 17, 117 (1995); Riveau G. et al.: in: Immunopharmalogy of Infection Diseases: Vaccine Adjuvant and Modulators of non-Specific Resistance (J. A. Majde, Ed.) str. 213. A.R. Liss, N.Y., 1987; Parant M.A. et al.: in: Microbial Infections: Role of Biological Response Modifíers (H. Friedman and T. Klein, Eds.), 179. Plenům Press, N.Y., 1992). Látka byla vyvinuta v Institut Choay, Paris, Francie, úspěšně prošla fází I a Π klinických zkoušek a je testována zejména na zvyšování nespecifické rezistence k infekcím a jako adjuvans v očkovacích látkách. Zavedení lipofilního zbytku do terminální oblasti peptidového řetězce molekuly MDP vedlo k další k potenciaci mechanismů nespecifické rezistence vůči bakteriálním, virovým a parazitárním infekcím a nádorovému bujení. Z této skupiny látek jsou v nejpokročilejším stadiu vývoje jako potenciální

-1 CZ 296720 B6 imunoterapeutika studovaná „muramyltripeptid-fosfatidylethanolamin“ (MTP-PE) a MDP-LysL-l 8 (Romurtid). Obě látky prošly fází I a II klinických zkoušek. MTP-PE je analog speciálně navržený pro jeho in vivo směrování k makrofágům prostřednictvím liposomů. Fosfolipidový charakter lipidické části molekuly je zvlášť vhodný k jejímu zabudování do liposomů konstruovaných z fosfolipidů. Látka je pod označením CGP 19835 A vyvíjena v koncertu Ciba-Geygy, Ltd., Basel, Švýcarsko a hlavními aplikačními směry je terapie a profylaxe nádorových a některých závažných virových onemocnění (Kleinerman E.S. et al.: J. Immunoterapy, 17, 181 (1995); Kleinerman E.S.: J. Clin. Oncology 10, 310 (1992)). Hlavním nežádoucím vedlejším účinkem MTP-PE je jeho poměrně vysoká pyrogenita. (Pro přehled viz: Lopez-Berestein G., Fidler I.J.: Liposomes in the Therapy of Infectious Diseases and Cancer, Alan R. Liss, lne., NY 1989). Látka MDP-Lys-L-18 (Romurtid) je vyvíjena v koncernu Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo, Japonsko. Hlavním směrem její praktické aplikace je stimulace nespecifické rezistence proti bakteriálním a virovým infekcím u pacientů s nádorem podrobených radioterapii nebo chemoterapii (Otani T. et al.: Arzneim. Forsch. Drug Res. 38 (II), 969 (1988); Akasaki M.: ibid., str. 976; Akasaki M. et al.: ibid., str. 978). MDP-Lys-L-18 je méně pyrogenní než MDP a úspěšně prošel fází Π klinických zkoušek (Azuma I.: Int. J. Immunopharmacol. 14, 487 (1992)). Ve vývoji této firmy jsou též analogy nesoucí objemné lipofilní skupiny acylované typy na primární OH skupině sacharidového zbytku 6-O-stearoyl-MDP (L18-MDP) a 6-O-(2-tetradecylhexadekanoyl)-MDP (B30-MDP), navržené jako potenciální adjuvans zejména pro buňkami zprostředkovanou imunitu. B30-MDP je ve srovnání s MDP méně pyrogenní a má vyšší imunostimulační aktivitu (Tsujimoto M. et al.: Vaccine 7, 39 (1989).

NHAc

CHsCHCO-L-Ala-D-GInOtCHásCHj

Murabutid

CHsOOCCísHji , O ČHOOCC₁₅H₃₁

CHjCHCO-L-Aa-D-isoGIn-L-AlaNH-CHzCHjO-P-O-ČHj

OH

MTP-PE

CHjCHCO-l-Ala-D-isoGIn-L-Lys-OH •-COtCHáieCHj

MDP-Lys-L18

CHaCHCO-L-Ala-D-isoGIn

L18-MDP

CHjCHCO-L-Ala-D-isoGIn

B30-MDP

Obr. 2

-2CZ 296720 B6

Podstata vynálezu

Nevýhodou jako imunoterapeutika vyvíjených derivátů MDP s výjimkou Murabutidu je jejich značná pyrogenita. Tuto nevýhodu řeší předmětný vynález, tj. látky konstruované na bází Nacetylnormuramoyl-L-a-aminobutanoyl-D-izoglutaminu, který je ve srovnání s MDP méně pyrogenní a má vyšší adjuvantní aktivitu (Jones G. H. et al.; Ger. Offen. 2718010; Chem. Abstr.: 88, 191481 (1978); Rotta J. et al.: in: Synthetic Immunomodulators and Vaccines Proč. Int. Symp., October 14—18, 1985, Třeboň, Czechoslovakia (M. Zaoral, O. Mikeš, Z. Havlas and Ž. Procházka, Eds) p. 129. Inst. Org. Chem. Biochem., Czechoslov. Acad. Sci., Prague 1986.).

Předmětem vynálezu jsou lipofílní deriváty N-acetylnormuramoyl-L-a-aminobutanoyl-D-izoglutaminu s imunostimulační aktivitou obecného vzorce I

kde Rje lipofílní acylový zbytek o počtu atomů uhlíku C₂3 až C₇₀, který je lineární nebo větvený a nebo cyklický nebo polycyklický, Ac je acetyl, Abu je aminobutanyol. Tyto látky se vyznačují vysokou imunoadjuvantní aktivitou a sníženou, resp. zcela potlačenou pyrogenitou a jsou rovněž vhodné k zabudování do liposomů. Inkorporaci do liposomů se nejen zvyšují imunostimulační účinky, ale současně se i snižují případné toxické efekty.

Syntéza látek obecného vzorce I vychází z dobře dostupného benzyl - 2-acetamido-2-deoxy4,6-0-izopropyliden-3-0-methoxykarbonylmethyl-a-D-glukopyranosidu vzorce Π.

kde Ac je acetyl, Abu je aminobutanyol, Bzl je benzyl.

Methylester vzorce II se převede na benzyl - 2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-izopropyliden-3-0karboxymethyl-a-D-glukopyranosid vzorce III působením báze ve směsi vody a s vodou mísitelného organického rozpouštědla, s výhodou působením hydroxidu sodného ve směsi voda methanol.

-3CZ 296720 B6 kde Ac je acetyl, Abu je aminobutanyol, Bzl je benzyl.

Kondenzací látky III s benzylesterem L-a-aminobutanoyl-D-izoglutaminu promotovanou s výhodou Ν,Ν'-dicyklohexylkarbodiimidem a 1-hydroxybenztriazolem se připraví benzylester N(2-O-(benzyl-2-acetamido-2,3-dideoxy-4,6-O-izopropyliden-a-D-glukopyranosid-3-yl)glykoloyl)-L-a-aminobutanoyl-D-izoglutaminu vzorce IV,

(iv)_z

CH₂-CO-L-Abu-D-isoGln(OBzl) kde Ac je acetyl, Abu je aminobutanyol, Bzl je benzyl. Acetalová chránicí skupina látky IV se odstraní kyselou hydrolýzou, s výhodou působením směsi kyselina octová - voda za zvýšené teploty, za vzniku benzylesteru N-(2-O-benzyl 2-acetamido-2,3-dideoxy-a-D-glukopyranosid-3-yl)-glykoloyl)-L-a-aminobutanoyl-D-izoglutaminu vzorce V,

H₂CO-L-Abu-D-isoGln(OBzl) kde Ac je acetyl, Abu je aminobutanyol, Bzl je benzyl. Parciální acylací látky V se získají 6-0acylderiváty benzylesteru N-(2-(O-(benzyl 2-acetamido-2,3-dideoxy-a-D-glukopyranosid3-yl)-glykoloyl)-L-a-aminobutanoyl-D-izoglutaminu vzorce VI,

kde R je lipofilní acylový zbytek o počtu atomů uhlíku 23 až 70, který může být lineární, větvený, cyklický nebo polycyklický, např. palmitoyl, stearoyl, 2-tetradecyldexadekanoyl, adamantylkarbonyl atd. Ac. je acetyl, Abu je aminobutanyol, Bzl je benzyl. Objemný acylový zbytek je primární OH(6) skupinu látky vzorce V se s výhodou zavede její reakcí s karboxylovou kyselinou (např. kyselinou stearovou nebo 2-tetradecylhexadekanovou) v přítomnosti hydrochloridu N-(3dimethylaminopropyl)-N'-ethylkarbodiimidu (WSC) a 4-dimethylaminopyridinu (DMAP) v N,N-dimethylformamidu.

Hydrogenolytickým odštěpením benzylových chránících skupin z látky vzorce V a látek obecného vzorce VI, s výhodou za použití palladiového katalyzátoru na uhlí v kyselině octové, se při

-4CZ 296720 B6 praví N-acetyl-normuramoyl-L-a-aminobutanoyl-D-izoglutaminu obecného vzorce Γ, kde R je atom vodíku, a jeho 6-O-acylderiváty obecného vzorce I, kde R je acyl, např. stearoyl nebo 2tetradecylhexadekanoyl.

Příklady provedení

Dále je předmětem vynálezu doložen příklady provedení, aniž se tím jakkoli omezuje.

Příklad 1

K míchanému roztoku methylesteru Π (4,235 g; 10 mmol) v methanolu (60 ml) se přidá 0,5 M NaOH (40 ml; 20 mmol). Po 4 h se směs zneutralizuje přidáním Dowexu 50 v pyridinové formě Ionex se infiltruje, promyje 50% vodným methanolem (3x50 ml) a filtrát se vakuově zahustí. Zbytek se opakovaně vakuově zahustí sbenzenem (3x100 ml) a lyofilizuje se z benzenu. Výtěžek 4,05 g (99 %) benzyl 2-acetamido-3-0-karboxymethyl-2-deoxy-4,6-0-izopropyliden-a-Dglukopyranosidu ΠΙ, který je při chromatografii na tenké vrstvě na silikagelu v soustavách ethyl acetát-toluen (2:1) a n-butanol-kyselina octová-voda (4:1:1) chromatografícky jednotný (a)o +90° (c 0,6°; chloroform). Pro látku ΙΠ (C₂₀H₂₇NO₈) vypočteno: relativní molekulová hmotnost 409,4; monoizotopická hmotnost 409.1. FABMS: m/z 410,1 (M + H)⁺, 432,1 (M + Na)⁺. Pro C₂₀H₂₇NO₈ (409,4) vypočteno: 58,67 %, C, 6,64 %, H, 3,42 % N; nalezeno: 58,75 % C, 6,50 % H, 3,57 % N.

Příklad 2

Roztok benzyl esteru terc-butyloxykarbonyl-L-a-ammobutanoyl-D-izoglutaminu (4,22 g; 10,0 mmol) ve směsi dichlormethan-kyselina trifluoroctová (1:1; 40 ml) se ponechá reagovat při pokojové teplotě 30 min Potom se směs vakuově zahustí, sirupovitý zbytek se rozetře s diethyletherem (3x50 ml) a nerozpustný zbytek se odpaří s dichlormethanem (2x50 ml) a závěrečné se vysuší při vakuu 1,32 P po dobu 2 h za teploty místnosti. Získaný sirup se rozpustí vDMF (20 ml) a vzniklý roztok trifluoracetátu benzyl esteru L-a-aminobutanoyl-D-izoglutaminu se ihned použije ke kondenzaci s kyselinou ΙΠ.

K míchanému roztoku kyseliny ΠΙ (4,094 g; 10 mmol) a monohydrátu 1-hydroxybenzotriazolu (1,531 g); 10 mmol) ve směsi N,N-dimethylformamidu (10 ml) a dichlormethanu (40ml) se při 0 °C přidá shora uvedený roztok trifluoracetátu benzyl esteru L-a-aminobutanoyl-D-izoglutaminu a diizopropylethylamin (1,88 ml; 11 mmol) a směs se míchá 1 h při 0 °C a přes noc při teplotě místnosti (pH musí být 7 až 8). Potom se přidá ethylacetát (500 ml) a přes noc vyrážená Ν,Ν-dicyklohexylmočovina se odfiltruje. Filtrát se ochladí v ledové lázni a extrahuje se nasyceným roztokem hydrogen uhličitanu sodného (3x100 ml) a 5% roztokem chloridu sodného (3x100 ml), vysuší se bezvodým síranem hořečnatým, který se pak odfiltruje při +3 °C přes noc. Získaný krystalický produkt (6,46 g) se rekrystaluje ze směsi ethylacetátu a petroletheru. Výtěžek 4,71 g (66%) benzyl esteru N-(2-O-(benzyl 2 acetamido-2,3-dideoxy-4,6-O-izopropylidena-D-glukopyranosid-3-yl)-glykoloyl)-L-a-aminobutanoyl-D-izoglutaminu IV. Látka je homogenní při chromatografii na tenké vrstvě silikagelu v systémech chloroform-methanol (10:1) a n-butanol-kyselina octová-voda (4:1:1) T.t. 136-137 °C, (a)_D +63 (c 0,6; chloroform). Pro látku IV (C36H4₈N4O]0 vypočteno: relativní molekulová hmotnost 712,8; monoizotopická hmotnost 712,3. FABMS: m/z 713,6 (M + H)⁺. Aminokyselinová analýza: Glu 1,03, Abu 1,04, kyselina normuramová 0,96. Pro C3₆H₄₈N₄0n (712,8) vypočteno: 60,66% C, 6,78% H, 7,86% N; nalezeno: 60,49 % C, 6,88 % H, 7,65 % N.

-5CZ 296720 B6

Příklad 3

Plně chráněný derivát VI (6,36 g; 8,92 mmol) se zahřívá za míchání v 50% vodné kyselině octové (140 ml) na 60 °C po dobu 2 h. Rozpouštědla se vakuově odpaří a zbytek se vakuově kodestiluje s toluenem (3x100 ml). Přidá se diethyl ether a petrolether a směs se ponechá přes noc v lednici. Získaná pevná látka se chromatografuje na koloně silikagelu Cl8 v systému vodamethanol(lineámí gradient 50-80 % za 60 min) Výtěžek 4,8 g (80 %) benzyl esteru N-(2-O(benzyl 2-acetamido-2,3-dideoxy-a-D-glukopyranosid-3-yl)-glykoloyl)-L-a-aminobutanoyl-D-izoglutaminu V, který se krystaluje ze směsi methanolu, diethyletheru a petroletheru. Výtěžek 4,25 g (71%) látky V, t.t. 208 °C, (a)_D +63° (c 0,2; methanol). Pro látku V (C33H44N4O11) vypočteno: relativní molekulová hmotnost 672,7; monoizotopická hmotnost 672,3. FABMS: m/z 673,4 (M + H)⁺, 695,3 (M+Na)⁺. Pro (672,7) vypočteno: 58,91 % C,

6,59 % H, 8,32 % N; nalezeno: 58,66 % C, 6,48 % H, 8,40 % N.

Příklad 4

K míchanému roztoku látky V (1,345 g; 2 mmol) v suchém N,N-dimethylformamidu (80 ml) se přidá kyselina stearová (740 mg; 2,6 mmol), WSC (728 mg; 3,8 mmol) a DMAP (489 mg; 4 mmol). Po 6 h míchání při teplotě místnosti se přidá další várka WSC (728 mg; 3,8 mmol) a DMAP (489 mg; 4 mmol) a míchání pokračuje přes noc (14 h). Průběh reakce se sleduje tenkovrstvou chromatografií v soustavě chloroform-methanol (10:1). K reakční směsi se přidá methanol (5 ml) a směs se míchá 30 min za teploty místnosti a potom se rozpouštědla vakuově oddestilují. Zbytek se rozpustí v chloroformu (200 ml) a roztok se extrahuje dvakrát roztokem KH₂PO₄, jehož pH bylo předem upraveno na pH 3 kyselinou sírovou (6 g KH₂PO₄ a 2 ml kyseliny sírové ve 40 ml vody) a dvakrát 5% roztokem chloridu sodného (60 ml), vysuší se bezvodým síranem hořečnatým, který se pak odfiltruje. Filtrát se vakuově zahustí. Získaná látka chromatografuje na koloně silikagelu C18 v systému voda-methanol (lineární gradient 90-100 % za 60 min). Výtěžek 900 mg (40 %) benzyl esteru N-(2-O-(benzyl-2-acetamido-2,3-dideoxy-ct-D-glukopyranosid-3-yl)-glykoloyl)-L-a-aminobutanoyl-D-izoglutaminu VI (kde R je oktadekanoyl); (a)_D(c 0,4; chloroform). Pro látku VI (C51H78N4O12) vypočteno: relativní molekulová hmotnost 939,2; monoizotopická hmotnost 938,6. FABMS: m/z 939,3 (M + H)⁺, 961,3 (M+Na)⁺. Pro C_5IH7₈N₄0i₂(939,2) vypočteno: 65,22 % C, 8,37 % H, 5,96 % N; nalezeno: 65,41 % C, 8,23 % H, 6,13 % N.

Příklad 5

K míchanému roztoku látky V (1,345 g; 2 mmol) v suchém N,N-dimethylformamidu (80 ml) se přidá kyselina 2-tetradecylhexadekanová (1,177 g; 2,6 mmol), WSC (728 mg; 3,8 mmol) a DMAP (489 mg; 4 mmol). Po 6 h míchání při pokojové teplotě se přidá další várka WSC (728 mg; 3,8 mmol) a DMAP (489; 4 mmol) a míchání pokračuje při téže teplotě dalších 6 h. Průběh reakce se sleduje tenkovrstvou chromatografií v soustavě chloroform-methanol (10:1). Po ochlazení na laboratorní teplotu se k reakční směsi přidá methanol (5 ml) a směs se míchá 30 min za teploty místnosti a potom se rozpouštědla vakuově oddestilují. Zbytek se rozpustí v chloroformu (200 ml) a roztok se extrahuje stejně jako ve výše uvedeném příkladu, vysuší se bezvodým síranem hořečnatým, který se pak odfiltruje. Filtrát se vakuově zahustí. Získaná látka se chromatografuje na koloně silikagelu Cl8 v systému voda-methanol (lineární gradient 95100 % za 60 min). Výtěžek 1,20 g (54 %) benzyl esteru N-(2-O-(benzyl 2-acetamido-2,3-dideoxy-6-O-(2-tetradecylhexadekanoyl)-a-D-glukopyranosid-3-yl)-glykoloyl)-L-a-aminobutanoyl-D-izoglutaminu VI (kde R je 2-tetradecylhexadekanoyl); (a)_D +30° (c 0,6; chloroform). Pro látku VI, kde R je 2-tetradecylhexadekanoyl) (C₆₃Hi₀₂N₄Oi₂) vypočteno: relativní molekulová hmotnost 1107,5; monoizotopická hmotnost 1106,7. FABMS: m/z 1107,7 (M + H)⁺, 1130,3 (M+Na)⁺. Pro C₆₃Hi₀₂N₄Oi₂ vypočteno: 68,32 % C, 9,28 % H, 5,05 % N; nalezeno: 68,52 %, C, 9,13 % H, 5,15% N.

-6CZ 296720 B6

Příklad 6

Látka VI (R je oktadekanoyl) (380 mg; 0,4 mmol) v kyselině octové (50 ml) se hydrogenolyzuje za přítomnosti 10% Pd/C katalyzátoru (400 mg) při laboratorní teplotě 16 h. Na konci hydrogenolýzy se aparatura evakuuje a propláchne argonem. Katalyzátor se odfiltruje, promyje kyselinou octovou (3x30 ml) a filtrát se lyofilizuje. Lyofilizovaný produkt se chromatografuje na koloně Silikagelu C18 v systému methanol-voda (9:1). Homogenní fragment se vakuově zahustí a zbytek se lyofilizuje z kyseliny octové. Výtěžek 200 mg (66 %) 6-O-oktadekanoyl-N-acetylnormuramoyl-L-a-aminobutanoyl-D-izoglutaminu I (kde R je oktadekanoyl); (a)_D +17° (c 0,1; kyselina octová). Pro látku I (C37H66N4O12) vypočteno: relativní molekulová hmotnost 759,0; monoizotopická hmotnost 758,5. FABMS: m/z 759,4 (M+H)⁺, 781,4 (M+Na)⁺. Pro C₃₇H₆₆N₄Oi₂(759,0) vypočteno: 58,55 % C, 8,76 % H, 7,38 % N; nalezeno: 58,67 % C, 8,61 % H, 7,20 % N.

Příklad 7

Látka VI (kde R je 2-tetradecylhexadekanoyl) (1,2 g; 1,084 mmol) v kyselině octové (50 ml) se hydrogenolyzuje za přítomnosti 10% Pd/C katalyzátoru (400 mg) při laboratorní teplotě 16 h azpracuje se analogicky jako v příkladě 6. Lyofilizovaný produkt se chromatografuje na koloně silikagelu C18 v systému methanol-voda (9:1). Homogenní frakce se vakuově zahustí a zbytek se lyofilizuje z kyseliny octové. Výtěžek 698 mg (69 %) 6-O-(2-tetradecylhexadekanoyl)N-acetylnormuramoyl-L-a-aminobutanoyl-D-izoglutaminu I (kde R je 2-tetradecylhexadekanoyl); (a)_D+13° (c 0,1; kyselina octová). Pro látku I (C₄₉H₉₀N₄Oi₂) vypočteno: relativní molekulová hmotnost 927,3; monoizotopická hmotnost 926,5. FABMS: m/z 927,9 (M+H)⁺, 949,9 (M+Na)⁺. Pro C₄₉H₉oN₄Oi₂ vypočteno: 63,46 % C, 9,78 % H, 6,04 % N; nalezeno: 63,68 % C, 9,96 % H, 5,81 %N.

Příklad 8

Biologická aktivita látek obecného vzorce Γ (kde R je atom vodíku) a vzorec I, (kde R je oktadekanoyl nebo 2- tetradecylhexadekanoyl) byla testována standardními tedy pro imunoadjuvantní účinek a pyrogenitu. Jako referenční látky byly použity MDP a jeho analog N-acetylnormuramoyl-L-a-aminobutanoyl-D-izoglutaminu obecného vzorce Γ (kde R je atom vodíku).

Pyrogenita byla testována na králících testem předepsaným ve farmakologii léčiv. Použity byly dávky 40,200, a 100 nM na králíka. V testované sekvenci MDP a jeho analogů pyrogenita klesá v pořadí MDP, N-acetylnormuramoyl-L-a-aminobutanoyl-D-izoglutaminu obecného vzorce Γ (kde R je atom vodíku), jeho 6-O-oktadekanoyl derivát obecného vzorce I, (kde R je oktadekanoyl) a jeho 6-O-(2-tetradecylhexadekanoyl) derivát obecného vzorce I (kde Rje 2-tetradecylhexadekanoyl), derivát obecného vzorce I, (kde Rje 2-tetradecylhexadekanoyl) je apyrogenní dokonce při nejvyšší testované dávce.

Adjuvantní aktivita byla testována pomocí indukce experimentální alergické encefalomyelitidy na morčatech. V tomto testu rostla adjuvantní aktivita v pořadí MDP, jeho 6-O-oktadekanoyl derivát obecného vzorce I, (kde R je oktadekanoyl), N-acetylnormuramoyl-L-a-aminobutanoyl-D-izoglutaminu obecného vzorce Γ (kde Rje atom vodíku) a 6-O-(2-tetradecylhexadekanoyl) derivát obecného vzorce I (kde Rje 2-tetradecylhexadekanoyl).

Průmyslová využitelnost

Látky podle vynálezu lze použít v základním výzkumu, ve farmaceutickém průmyslu a v humánním i veterinárním lékařství.

Claims

1. Lipofilní analog N-acetylnormuramoyl-L-a-aminobutanoyl-D-izoglutaminu s imunostimulační aktivitou obecného vzorce I, kde R je lipofilní acylový zbytek o počtu atomů uhlíku C₂₃ až C₇₀, který je lineární nebo větvený a nebo cyklický nebo polycyklický, Ac je acetyl, Abu je aminobutanyol.

2. Způsob přípravy lipofilního analogu N-acetylnormuramoyl-L-a-aminobutanoyl-D-izoglutaminu obecného vzorce I, (O, kde R je lipofilní acylový zbytek o počtu atomů uhlíku C₂₃ až C₇₀, který je lineární nebo větvený a nebo cyklický nebo polycyklický, Ac je acetyl, Abu je aminobutanyol, vyznačující se tím, že jako výchozí látka se použije benzyl-2-acetamido-2-deoxy-4,6-O-izopropyliden-3O-methoxykarbonylmethyl-a-D-glukopyranosid vzorce Π, kde Ac je acetyl, Bzl je benzyl, který se po zmýdelnění a benzyl-2-acetamido-2-deoxy-4,6-Oizopropyliden-3-O-karboxymethyl-a-D-glukopyranosid vzorce III

-8CZ 296720 B6 kde Ac je acetyl, Bzl je benzyl, kondenzuje s peptidovou komponentou za vzniku látky IV, (lvy

CH₂-CO-L-Abu-D-isoGln(OBzl) kde Ac je acetyl, Abuje aminobutanyol, Bzl je benzyl, načež se látka IV převede odštěpením izopropylidenové skupiny na benzylester N-(2-O-(benzyl 2-acetamido-2,3-dideoxy-a-D-glukopyranosid-3-yl)-glykoloyl)-L-a-aminobutanoyl-D-izoglutaminu vzorce V, kde Ac je acetyl, Abuje aminobutanyol, Bzl je benzyl, který se parciálně acyluje za vzniku 6-0acylderivátů benzylesteru N-(2-(O-(benzyl 2-acetamido-2,3-dideoxy-cc-D-glukopyranosid3-yl)-glykoloyl)-L-a-aminobutanoyl-D-izoglutaminu obecného vzorce VI, (vi)_z kde Ac je acetyl, Abu je aminobutanyol, Bzl je benzyl, a z látek vzorce V a VI se hydrogenolýzou odštěpí benzylové chránící skupiny za vzniku N-acetyl-normuramoyl-L-a-aminobutanoylD-izoglutaminu obecného vzorce Γ, kde R je atom vodíku a jeho 6-O-acylderivátů obecného vzorce I, kde R je lipofilní acylový zbytek o počtu atomů uhlíku C₂₃ až C₇₀, který je lineární nebo větvený, cyklický nebo polycyklický.