CS219350B2 - Method of production of substituted benzonitriles - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu výroby substituovaných benzonitrilů obecného vzorce I

Způsob podle vynálezu se provádí tak, Z0 se uvede v reakci substituovaný benzen obecného vzorce

Bz—A, kde

Bz znamená 2-kyano-4-nitrofenyl nebo skupinu (I) kde

X znamená atom kyslíku nebo atom síry, R¹ znamená atom bromu, chloru nebo fluoru, fenoxyskupinu, alkylthioskupinu, alkylsulfinylovou skupinu, alkylsulfonylovou skupinu, alkylaminosulfonylovou skupinu, dialkylaminosulfonylovou skupinu, benzoylovou skupinu, alkoxyskupinu, alkyl, halogenovaný alkyl nebo acetyl, přičemž alkylové a alkoxylové zbytky a alkylové části jiných zbytků obsahují 1 až 3 atomy uhlíku a

R² znamená atom vodíku, atom bromu, chloru nebo fluoru nebo trifluormethylovou skupinu a n znamená celé číslo 1, 2, 3 nebo 4.

kde

R¹, R² a n mají svrchu uvedený význam a A znamená atom halogenu, se sloučeninou obecného vzorce

Bz¹—X—Y, kde

X znamená atom kyslíku nebo síry, ' ^: γ· Znamená . atom vodíku nebo kation, tvořící fenylát a

Bz¹ znamená · druhou ze skupin ve významu ' Bz, při teplotě 60 až 100 °C v inertním organickém rozpouštědle.

Pod pojmem „halogenovaný alkyl” se rozumí, alkyl o 1 až 3 atomech uhlíku, substituovaný s - výhodou 1 až 4 substituenty ze skupiny atom bromu, chloru nebo fluoru, jde 'tedy například o trifluormethyl, 2,2-dichlor-l,l-difluorethyl nebo 1-chlorpropyl, pod pojmem „alkoxyskupina” se rozumí alkoxylový zbytek o- 1' až 3 atomech uhlíku, například methoxyskupina, ethoxyskupina, propoxyskupina a išopropoxyskupina, přičemž ty substituenty, které obsahují alkyl, obsahují ' tento· zbytek rovněž o 1 až 3 atomech uhlíku, například alkylsulfonyl znamená methylsulfonyl, ethylsulfonyl, propylsulfonyl a isopropylsulfonyl, a dialkylamiňosulfonyl znamená například ' dimethylaminosulfonyl, diethylaminosulfonyl, dipropylaminosulfonyl, · · diisopropylámihosulfonyl ' a N,N-methyl-ethylaminosulfonyl.

Výhodnými sloučeninami jsou ty látky, v nichž R¹ znamená atom bromu nebo· chloru, alkylsulfinylovou · - skupinu, alkylsulfonylovou ' skupinu, alkyl, halogenovaný alkyl nebo alkoxyskupinu^ýR²znamená·' atom vodíku, atom· bromu, chloru nebo fluoru · nebo trifluormethyl, X znamená atom kyslíku a n znamená celé číslo 1 nebo 2. Zvláště výhodnými sloučeninami jsou ty látky, v nichž R1 znamená atom bromu nebo chloru nebo halogenovaný alkyl, R2 znamená atom vodíku, atom bromu nebo chloru nebo· trifluormethyl, X znamená atom kyslíku a n znamená celé 'číslo · 1 - nebo - 2.

Sloučeniny- · vyrobené způsobem podle vynálezu budou dále nazývány · „substituované benzonitrily”.

Sloučeniny vyrobené způsobem· · podle vynálezu jsou obvykle krystalické pevné látky s omezenou rozpustností ve vodě, rozpustné v různém stupni v organických rozpouštědlech, · například methylenchloridu, methanolu a ethanolu.

Tyto látky mají protivirový účinek a mohou tedy potlačit replikaci viru při styku s virem a s výhodou s buňkou hostitele. Způsob podle vynálezu vede k výrobě látek, které je možno použít jako protivirových farmaceutických prostředků, které obsahují 0,1 pg nebo méně účinné látky v 1 mililitru nosiče, prostředek však může obsahovat až 99 % hmotnostních účinné látky spolu s nosičem, přijatelným z farmaceutického hlediska.

Reakce probíhá při smísení reakčních složek za přítomnosti zásady, která tvoří fenylát, například hydroxidu alkalického kovu nebo uhličitanu alkalického· kovu, v případě, že Y znamená atom vodíku a za přítomnosti inertního organického rozpouštědla, například dimethylsulfoxidu, methylethylketonu nebo· aoetonitrilu. Reakce probíhá při teplotě 60 až 100 °C, v průběhu 2 až 4 hodin je možno dosáhnout vejmi dobrých výtěžků, v případě, že Bz* ' znamená 2-kyano-4-nitrofenyl, může být zapotřebí použití vyšší teploty nebo delší reakční doby.

Reakční složky je možno mísit v jakémkoli pořadí a v různém poměru, jsou však spotřebovávány v ekvimolárním poměru a je tedy nejvýhodnější je použít v přibližně ekvimolárním množství. V případě, že Y znamená atom vodíku, je také výhodné použít přibližně ekvimolární množství zásady, která tvoří fenylát. Sloučeniny je pak možno izolovat a čistit běžným způsobem.

Substituované benzonitrily · je tedy možno výhodně připravit zejména · · reakcí sloučeniny obecného vzorce II

kde η, X, R1 a R2 mají svrchu uvedený význam, s 2-halogen-5-nitrobenzonitrilem v·· inertním organickém rozpouštědle za přítomnosti zásady, která tvoří fenylát za podmínek, za nichž · může vzniknout požadovaná výsledná látka. Použité alkalické činidlo musí být dostatečně zásadité a má být použito v dostatečné koncentraci, aby bylo možno převést sloučeninu obecného vzorce II na příslušnou sůl pro reakci s 2-halogeh-5-mtrobenzonitrilem.

Sloučeniny obecného · vzorce I je také možno s výhodou získat reakcí substituovaného halogenbenzenu obecného vzorce III

kde

A znamená atom halogenu a n, R1 a R2 mají význam, uvedený v obecném vzorci I, s 2-kyaho-4-nitrofenolem nebo s l-merkapto-2-kyano-4-nitrobenzenem v inertním organickém rozpouštědle za přítomnosti alkalického činidla· za podmínek, za nichž vzniká výsledná látka. Alkalické činidlo má být dostatečně · zásadité · a má mít dostatečnou koncentraci k převedení 2-kyano-4-nitrofenolu nebo l-merkapto-2-kyano--4-nitrobenzenu na sůl pro reakci se sloučeninou obecného vzorce III.

V závislosti na substituentech v obecném

213I-3SW vzorci III -může být -zapotřebí použití vyšší teploty - a 'delší reakční -doby, než při reakci sloučeniny -obecného vzorce II s 3-haiOgen-S-initrohenzonit-riiem -a/nebo může -dojít k tomu, že při reakci vzniká jeS&e větší počet -dalších výsledných látek, takže může být -zapotřebí výsledné produkty -od sebe oddělit v případě, že je požadována jediná sloučenina.

Shora uvedené výsledné látky byly připraveny alespoň jedním z dvou následujících způsobů:

Sloučenina obecného vzorce II se uvede v reakci s 2-halogen-5-mtrobenzonitril-em, obvykle s 2-chloi>5-ni-i?robenzonitrifem. K reakci dojde při styku přibližně í^l^k^imolárních množství reakčních složek v -inertním organickém rozpoustě-dlé, s výhodou 'dimethylsulfoxidu nebo ace-tonitrllu při zahřátí na teplotu ©0 až T0O °C za přítomnosti alkalického činidla, -s výhodou hydroxidu sodného nebo uhličitanu draselného -po dobu dostatečnou ke vzniku výsledného produktu, obvykle 1 až 10 hodin. K izolaci výsledné látky -se použije -běžných způsobů, například ředění vodou -a -filtrace. Č^ištění výsledného produktu je rovněž možno provést běžným způsobem, například překrystalováním z různých rozpouštědel, jako alkanolů, alkylalkanolethéřů, chloroformu, dimethylformamidu, methylethylketonu, isopropylacetátu nebo kyseliny octové.

Ty sloučeniny, v nichž R1 znamená alkylsulfinylovou nebo alkýisuifonyiovou -skupinu a X znamená atom kyslíku je také možno získat oxidací sloučenin obecného vzorce I, v němž Ri znamená -álkylthiOškupinu a X znamená -atom kyslíku. Oxidace se běžně provádí oxidací -atomu -síry vhodným oxidačním činidlem, například peroxidem vodíku v ledové kyselině octové za podmínek, pří nichž je možno získat požadovanou álky-lsulfinylovou nebo alkylsulfonylovou -skupinu.

Reakční činidla pro svrchu uvedené ' způsoby -výroby sloučenin obecného vzorce I se běžně -dodávají nebo je možno- je snadno připravit známým způsobem 2-chldr^S-hitrobenzonitril se běžně dodává stejně jako většina substituovaných fenolů a substituovaných thiofenolů obecného vzorce IL Substituované fenoly, které mají jako -subštituent dialkylaminosulfonýlovOu skupinu je možno snadno získat způsobem podle publikace Eliel a další, J. Org. Chem., 20, 1657 (1955).

Pod pojmem „inertní organické rozpouštědlo” se rozumí organické rozpouštědlo, které se neúčastní reakce za podmínek reakce, při níž se vyrábí sloučeniny vzorce L Příkladem vhodného inertního organického rozpouštědla může být dimethylsulfoxid, methylethylketon, acetonitril, toiuěn nebo dimethylformamid. Pod pojmem „alkalické činidlo” se rozumí zásada schopná tvořit soli s fenoly, například hydroxid Sodný, hydroxid draselný, uhličitan sodný a draselný, pod pojmem „•hakořen” -se rozumí brom, chlor, -fluor nebo jod.

Vynález bude osvětlen dále příklady provedení.

Příklad 1

2-:(3,5-di^ch^’^c^iř'f(thoxy'J-^-^~h‘^'t^O^,^^^5neonitřll

K roztoku -9-1,3 g (Ό,·56 melu) S-^-ddclhOtfenolu v rOžtoků v 900 -ml díméthylsůiW&idu se přidá 22,4 g (0,56 molu) hydroxidu sodného. Výsledná - suspenze se zahiívá 15 minut na teplotu 60 °C, načež se přidá 100 gramů (0,-55 molli) -2'-čЫor-5mϊtrO’béitZbúltrilu.

Směs se -zahřívá 3 hodiny na ťeptoťú 75 sWpříů Celsia. Pak še reakční směs ochladí a vlije se do· šušpěňzě 200 mi ·2 -N hydroxidu sodného a -1800 ml ledu a vody, čímž se x^ýsiédný -produkt vysřáží. Produkt se pak 'oddělí filt^iíací, dobře se -promyje vodou a vysuší, čímž še získá 163,3 g výsledného produktu o teplotě tání 154 až -155 °C, výtěžek je -90,4 - %. Po- přěkrysrateVáhí z -3-i-mthooýý2-pp’^,opanolu sě získá čištěný -2-^í(3,4Jdichlorf<^inoxy )--5-netťobenžorϊϊtr41 b teplotě tání 155 až 156 °C. Hlavní abšOřpčhí pásy v infračerveném -šVět-le přO 4(-(3(4-41- chlorfenoxy)-5-nttrobenOoíWřil V ihů] MU jšéú při 2250, 1620, 1580, 1520. 1465, 1360, 1270, 1130, 1040 a 895 cm1.

Příklad -2

2-(.2(44dichlořfenéký)

K rožtoku 5,® é (0,030? molM (Mdic-htčřfeno-lu v roztoku ve 150 ml díteetltý-lšůl-řéxau še přidá 1,23 -g (0,0307 íhblú) hýaítexidu sodného. Suspenze -se (ahřéjé Aá teplotu 60 - M 15 teHut a pak f -přidá 5-4'4 gramu (0,0276 mulu) -2-Chlor-5-hitřo'behE'ěnitr-ilu.. Směs sé zahřívá 3 hodiny 15 rAIfiUt. Pak se směš zchladil·, Vlije -sě 'db -vodý h Výhledný produkt se oddělí filťřac-í, dobude promyje vodou a vysuší, -čímž šé ve výtěžku 95,3 % získá 8,1 g Výsledného produktu. Po přékrSstalnváút -2 ethanoiu šě tíffitb způsobem Získá čištěný 2-(2-,4--Псп1оН4ПЬxýp5-nitrrbéezónitril o teplotě táftí 153,5 h-Ž 154,5 °C.

Příklad 3

2- (4-bromf enoxy) -5-nitrobéezrnitril

K roztoku 5,31 g (0,0307 molu) 4-brbffiíenolu v roztoku ve 150 ml dlméthylsulfrxldu te přidá 1,23 g (0,0307 mdlU) fiýUi&xidu sodného. Suspettžé se žahřějě ha 15 Slinut na teplotu 60 - a přidá Šě 5,06 g (O;00(I1 molu) 2-chlor-!--nltrrbfenžbhitřilh. Sihěš šle nahřívá 4 hodiny na teplotu - °e. puk §& reakční směs zchladí a vlíjé §6 ďo. v0flý. Výsledný produkt se (Oddělí - filtraci, d08řé se promyje vodou a pak se vysuší, čímž se získá 8,1 g surového produktu. Tento surový produkt se rozpustí v dichlormethanu a promyje se 10% vodným roztokem hydroxidu sodného, vodou a vysuší se síranem sodným.

Odstraněním rozpouštědla ve vakuu se získá 7,5 g výsledného produktu ve výtěžku 85 %. Po překrystalování z ethanolu se získá čištěný 2-(4-bromfenoxy-5-nitrobenzonitril o teplotě tání 171 až 172 °C.

Příklad 4

2- (4-chlorfenoxy) -5-nitrobenzonitril

К roztoku 3,95 g (0,0307 molu) 4-chlorfenolu v roztoku ve 150 ml dimethylsulfoxidu se přidá 1,23 g (0,0307 molu) hydroxidu sodného. Suspenze se zahřívá 15 minut na teplotu 60 °C, pak se přidá 5,04 g (0,0276 molu) 2-chlor-5-nitrobenzonitrilu a směs se zahřívá 3 hodiny na teplotu 75 °C.

Reakční směs se zchladí a vlije do vody. Výsledný produkt se oddělí filtrací, dobře se promyje vodou a vysuší, čímž se ve výtěžku 92 % získá 7,0 g produktu. Po překrystalování z ethanolu se získá čištěný 2-(4-chlorfenoxy)-5-nitrobenzonitril o teplotě tání 163 až 164 °C.

Příklad 5

2- (4-fenoxyfenoxy) -5-nitrobenzonitril

К roztoku 5,71 g (0,0307 molu) 4-fenoxyfenolu v roztoku ve 150 ml dimethylsulfoxidu se přidá 1,23 g (0,0307 molu) hydroxidu sodného. Suspenze se zahřívá 15 minut na teplotu 75 °C a pak se přidá 5,04 g (0,0276 molu) 2-chlor-5-nitrobenzonitrilu a směs se zahřívá 4 hodiny na teplotu 75 °C. Pak se reakční směs zchladí a vlije do vody. Produkt se oddělí filtrací, dobře se promyje vodou a vysuší. Surový produkt se rozpustí v dichlormethanu a promyje se 10% vodným roztokem hydroxidu sodného, pak vodou, načež se vysuší síranem sodným. Odstraněním rozpouštědla ve vakuu se ve výtěžku 87 % získá 8,0 g výsledného produktu. Po překrystalování z ethanolu se získá čištěný 2-(4-fenoxyfenoxy )-5-nitrobenzonitril o teplotě tání 150 až 151,5 °C.

Příklad 6

2-(4-( methylthio) fenoxy ] -5-nitrobenzonitril

К roztoku 11,55 g (0,0824 molu) 4-methylthiojfenolu v roztoku ve 150 ml dimethylsulfoxidu se přidá 3,3 g (0,0824 molu) hydroxidu sodného. Suspenze se zahřívá na 60 °C a současně se přidává 13,7 g (0,0730 molu) 2-chlor-5-nitrobeňzonitrilu a pak se směs zahřívá 2,5 hodiny na teplotu 75 °C. Směs se zchladí a vlije do 200 ml roztoku

N hydroxidu sodného ve vodě a 500 ml vody. Produkt se oddělí filtrací, dobře se promyje vodou a pak se vysuší, čímž se získá 20,3 g výsledného produktu ve výtěžku 94,6 %. Po překrystalování z methanolu se získá čištěný 2-[4-(methylthi(í)fenoxy]-5-nitrobenzonitril o teplotě tání 124 až 126 stupňů Celsia.

Příklad 7

2-(4-( methy lsulfinyl) f enoxy ] -5-nitrobenzonitril

К suspenzi 10,0 g (0,0350 molu) 2-[4-(methylthio )f enoxy ]-5-nitrobenzonitrilu ve 100 mililitrech ledové kyseliny octové se přidá roztok 4,0 g vodného 30% peroxidu vodíku (0,0350 molu) v roztoku ve 20 ml ledové kyseliny octové v průběhu 5 minut. Reakční směs se míchá při teplotě místnosti 16 hodin a pak se zahřeje na 3 hodiny na teplotu 50 °C. Pak se reakční směs vlije do vody a výsledný produkt se oddělí filtrací, dobře se promyje vodou a vysuší se, čímž se ve výtěžku 92,8 % získá 9,8 g výsledného produktu. Po překrystalování z ethanolu se tímto způsobem získá čištěný 2-[4-(methylsulfinyl) fenoxy] -5-nitrobenzonitril o teplotě tání 159 až 160 °C.

Příklad 8

2-(4-( methylsulf onyl) fenoxy ] -5-nitr obenzonitril

К suspenzi 10,0 g (0,0350 molu) 2-[4- (methylthio)fenoxy ] -5-nitrobenzonitrilu v 75 ml ledové kyseliny octové zahřáté na 60 stupňů Celsia se přidá 15,85 g 30% vodného peroxidu vodíku (0,140 molu) v průběhu 5 minut. Dalších 25 ml ledové kyseliny octové se přidá po skončeném přidávání peroxidu vodíku a pak se směs zahřeje na 3 hodiny na teplotu 75 °C.

Pak se reakční směs zchladí a vlije do vody. Produkt se oddělí filtrací, promyje se vodou a vysuší, čímž se ve výtěžku 98,2 % získá 10,9 g výsledného produktu o teplotě tání 205 až 206,5 °C. Po překrystalování z methanolu se získá čištěný 2-[4-(methylsulfony!) fenoxy]-5-nitrobenzonitril o teplotě tání 206 až 207 °C.

Příklad 9

N,N-dimethyl-4- (2-kyan-4-nitrofenoxy) benzensulfonamid

К roztoku 6,37 g (0,0317 molu) N,N-dimethyl-4-hydroxybenzehsulfonamidu ve 150 ml dimethylsulfoxidu se přidá 1,27 g (0,0317 molu) hydroxidu sodného. Směs se zahřeje na 60 °C a přidá se 5,26 g (0,0288 molu) 2-chlor-5-nitrobenzonitrilu a směs se pak zahřívá 2,5 hodiny na teplotu 75 °C. Reakční směs se zchladí a vlije do 400 ml 2 N vodného roztoku hydroxidu sodného a 300 ml vody. Produkt ' se oddělí filtrací, důkladně se promyje vodou a vysuší, čímž se ve výtěžku 88 % získá 8,8 g výsledného produktu. Po překrystalování ze směsi ethanolu a dimethylformamidu se získá čištěný N,N-dimethyl-4- ( 2-kyaii-4-nitrofenoxy) benzensulfonamid o teplotě tání 221,5 až 223 °C.

Příklad 10

N,N-diethyl-4- (2-kyan-4-nitrofenoxy )benzensulfonamid

K · roztoku 6,73 g (0,0294 molu) N . N-diethyl-4-hydroxybenzensulfonamidu ve 150· ml dimethylsulfoxidu se přidá 1,18 g (0,0294 molu) hydroxidu sodného. Směs se zahřeje na teplotu 60 °C a přidá se 4,88 g . (0,0267 molu) 2-chlor-5-nitrobenzomtrilu a směs se zahřeje na 3 hodiny na teplotu 75 °C. Reakční směs se zchladí a vlije do 400 ml 2 N vodného roztoku hydroxidu sodného a 300 mililitrů vody.

Produkt se oddělí filtrací, důkladně se promyje vodou a vysuší, čímž se ve výtěžku 88 % získá 8,8 g výsledného produktu. Po překrystalování z ethanolu se získá čištěný N,N-diethyl-4-(2-kyan-4-nitrofenoxý')'benzensulfonamid o teplotě tání 163 až 164 stupňů Celsia.

Příklad 11

2- (4-benzoylf enoxy) -5-nitrobenzonitril

K roztoku 11,4 g (0,0575 molu) 4-hydroxybenzofenonu v roztoku ve 150 ml dimethylsulfoxidu se přidá 2,3 g(0,0575 molu) hydroxidu sodného. Směs se zahřeje na 60 stupňů Celsia a přidá se 10,0 g (0,0548 molu ) 2-chlor-5-nitrobenzonitrilu a směs se zahřeje na 3 hodiny na teplotu 75 °C. Pak se reakční směs zchladí a vlije do roztoku 100 ml 2 N hydroxidu sodného ve vodě a 700 mililitrů vody. Produkt se oddělí filtrací, důkladně se promyje vodou a vysuší, čímž se ve výtěžku 89,6 % získá 17,75 g výsledného· produktu. Po překrystalování ze směsi ethanolu a dimethylformamidu a po druhém překrystalování z chloroformu se tímto způsobem získá čištěný 2-(4-benzoylfenoxy)-5-nitrobenzonitril o teplotě tání 179,5 až 180,5 °C.

Příklad 12

2-[ (4-chlorfenyl )thio)-5-nitrobenzonitril

K roztoku 15,2 g (0,105 molu) 4-chlorthiofenolu v roztoku ve 150 ml dimethylsulfoxidu se přidá 4,2 g (0,105 molu) hydroxidu sodného. Směs se zahřeje na teplotu 60 °C a přidá se 18,3 g (0,100 molu) 2-chlor-5-nitrobenzonitrilu, načež se směs zahřívá 2,5 hodiny na teplotu 60 °C. Pak se směs zchladí a vlije se do, 100· ml 2 N vodného roztoku hydroxidu sodného a 600 ml vody. Výsledný produkt se oddělí filtrací, důkladně se promyje vodou a vysuší, čímž se ve výtěžku 99 % získá 28,8 g produktu. Po překrystalování z ethanolu se tímto způsobem získá čištěný 2-[ (4-chlorfenyl)thio]-5-nitrobenzonitril o teplotě tání 162 až 164,5 °C.

Příklad 13

2- (3-methoxyf enoxy) -5-mtrobenzonitril

Do baňky s · jedním hrdlem o obsahu 250 mililitrů, opatřené magnetickým míchadlem a zpětným chladičem se vloží 9,13 g (0,050 molu) 2-chlor-5-nitrobenzonitrilu, 6,39 g (0,0515 molu) 3-methoxyfenolu, ' 7,10 g (0,0515 molu) bezvodého uhličitanu draselného a 75 ml acetonitrilu. Směs se zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem a na této teplotě se udržuje 3 hodiny. Pak se reakční směs zchladí na teplotu místnosti a zředí se 150 ml vody. Produkt se oddělí jako pevná látka. Tato pevná látka se oddělí filtrací, důkladně se promyje vodou a vysuší se na vzduchu. Pevná látka, vysušená na vzduchu se nechá překrystalovat z přibližně 200 ml absolutního ethanolu, čímž se ve výtěžku 53 % získá 7,15 g čištěného 2-(3-methoxyfenoxy) -5^-hi:robenzo^^trilu o teplotě tání 102 až 103,5 °C.

Příklad 14

2- [ (4-trifluormethyl) fenoxy ] -5-nitrobenzonitril

Do baňky s jedním hrdlem o obsahu 250 mililitrů, opatřené magnetickým míchadlem a zpětným chladičem, opatřeným zařízením pro probublávání dusíku se vloží 9,13 g (0,050 molu) 2-chlor-5-nitrobenzonitrtlu, 8,35 gramu (0,0515 molu) 4- (trifluormethyl) fenolu, 7,10 g (0,0515 molu) bezvodého’ uhličitanu draselného a 75 ml acetonitrilu. Směs se zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem a na této teplotě se udržuje 3 hodiny. Pak se reakční směs zchladí na teplotu místnosti a zředí se 150 ml vody. Výsledný produkt se vyloučí jako pevná látka. Tato pevná látka se oddělí filtrací, důkladně se promyje vodou a vysuší se na vzduchu. Pevná látka vysušená na vzduchu se nechá překrystalovat ze 350 ml absolutního ethanolu, čímž se ve výtěžku 80 % získá 12,35 g čištěného 2-[ (4-trifluormethyl)fenoxy^S-mtiObenzonítrilu o teplotě tání 154 až 155,5 °C.

Příklad 15

2-(4-acetylfenoxy)-5-nitrobenzonitril

Do baňky s jedním hrdlem o obsahu 250 mililitrů, opatřené magnetickým míchadlem

12 a . zpětným chladičem se zařízením k probublávání dusíku se vloží 9,13 g (0,05 molu) 2 -chlor-5-nitrobenzonitrilu, 7,01 g (0,0515 molu) 4-hydroxyacetofenonu, 7,10 g (0,0515 molu) bezvodého uhličitanu draselného a 75 ml acetonitrilu. Směs se zahřeje na teplotu varu pod zpětným chladičem a na této teplotě . se udržuje 3 hodiny. Pak se reakční ' směs zchladí na teplotu místnosti a zředí se 150 ml vody. Výsledný produkt se vyloučí jako pevná látka. Tato pevná látka se oddělí filtrací, důkladně se promyje vodou a vysuší se na vzduchu. Pevná látka vysušená na vzduchu se nechá dvakrát překrystalovat ze 300 ml absolutního ethanolu, čímž se ve výtěžku 35 % získá 4,95 g čištěného 2- (4-acetylf enoxy) -5-nitrobenzonitrilu o teplotě tání 135 až 136,5 °C.

Příklad 16

2- (4-chlor-2-methylfenoxy) -5-nitrobenzonitril

Do baňky o obsahu 250 ml, opatřené jedním hrdlem s magnetickým míchadlem a zpětným chladičem se zařízením k probublávání dusíku se - vloží 9,73 g (0,0533 molu) 2-chlor-5-rntrobenzonitrilu, 7,83 g (0,0539 molu) -4-chlor-2-methylfenolu, 7,56 g (0,0549 molu) bezvodého uhličitanu draselného a 75 ml aeetonitrilu. Směs se zahřeje na teplotu varu pod zpětným chladičem a na této teplotě se udržuje 3 hodiny. Pak se reakční směs zchladí na teplotu místnosti a zředí se 150 - ml vody. Výsledný produkt se vyloučí jako- pevná látka. Ta-to pevná látka se oddělí filtrací, důkladně se promyje vodou .a. vysuší na vzduchu. Pevná látka vysušená . na vzduchu se nechá překrystalovat ze . -400 ml absolutního ethanolu s malým množstvím . acetonu, čímž se ve výtěžku 62 proč, získá 9,60 g čištěného 2-(4-chlor-2-methylfenoxy)-5-nitrobenzonitrilu o teplotě -tání 144,5 až 145,5 °C.

Příkla d 17

2- (3,4,5-trichlorf enoxy) -5-nitrohenzonitril

Do baňky s jedním hrdlem o objemu 250 mililitrů, opatřené magnetickým míchadlem a zpětným chladičem se zařízením k probublávání dusíku se vloží 8,68 g (0,0475 molu) 2-сЫог-5·-nitrobenzonitrilu, 9,67 g (0,0489 molu) 3,4,5-trichloгfenolu, 6,75 g (0,0489 molu) bezvodého uhličitanu draselného a 75 ml aeetonitrilu. Směs se zahřeje na teplotu varu pod zpětným chladičem a na této teplotě se udržuje 3 hodiny. Pak se reakční směs zchladí na teplotu místnosti a zředí se 150 ml vody. Výsledný produkt se vyloučí jako pevná látka. Tato pevná látka se oddělí filtrací, důkladně se promyje vodou a vysuší se na vzduchu. Pevná látka, vysušená na vzduchu se nechá překrystalovat ze směsi 200 ml absolutního ethanolu a 100 mililitrů acetonu, čímž se ve výtěžku 71 % získá 11,62 g čištěného 2-(3,4,5-trichlorfet noxy)-5-nitrobenzonitrilu ve formě malých bílých krystalů o teplotě tání 162 až 164 stupňů Celsia.

Příklad 18

2-(2,3,5,6-ttCrafluorfcnoxy )-5-nitrobenzonitril

Do baňky s jedním hrdlem o -objemu 250 mililitrů, opatřené magnetickým míchadlem a zpětným chladičem se zařízením k probublávání dusíku se vloží 9,13 g (0,050 molu') 2-chlor-5-nitrobenzonitrilu, 8,55 g (0,0515 molu) 2,3,5,6-teΐrafluorfcnolu, 7,10 gramu (0,0515 - molu) bezvodého uhličitanu draselného a 75 ml aeetonitrilu. Směs se zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem a na této teplotě se udržuje- 3 hodiny. Pak se reakční směs zchladí na teplotu místnosti a zředí se 150 ml deionizované vody. Produkt se vyloučí jako- pevná látka.

Tato pevná látka se oddělí filtrací, důkladně se promyje vodou a vysuší se na vzduchu. Pevná látka vysušená na vzduchu se nechá překrystalovat ze 300 ml absolutního ethanolu, čímž se ve -výtěžku 73 % získá 11,36 g čištěného 2-(2,3,5,6--tetafluorfenoxy )-5-nitrobenzonitrilu o teplotě tání 152,5 až 154,5 °C.

Příklad 19

2- (2,3,4,5,6-pentaf luorfenoxy) -5·-nitrobenzonitril

Do baňky -s jedním hrdlem o objemu 250 mililitrů, opatřené magnetickým míchadlem a zařízením k probublávání dusíku se vloží 9,59 g - (0,0525 molu) 2-chlor-5-nitrobenzot nitrilu, 9,96 g (0,0541 molu) 2,3,4,5,6-рспtafluorfenolu, 7,56 g (0,0541 molu) bezvodého uhličitanu draselného a 75 ml acetonitrilu. Směs se zahřívá na teplotu varu pod zpětným chladičem <a na této teplotě se udržuje 3 hodiny. Pak se reakční směs zchladí na teplotu místnosti a zředí se 150 mililitry deionizované -vody. Produkt se vyloučí jako krystalická pevná látka. Tato pevná látka se oddělí filtrací, důkladně se promyje vodou a vysuší se na vzduchu. Pevná látka - vysušená na vzduchu se nechá překrystalovat ze 200 ml absolutního ethanolu, čímž se -ve výtěžku 75 % získá 9,91 g čištěného 2-(2,3,4,5,6-ppntaf luorfenoxy)t5t tnitrobcnzonitrilu o teplotě tání 127,5 až 129 °C.

Příklad 2 0

Způsobem podle předchozích příkladů se při použití příslušných výchozích látek získá jako výsledná látka 2-[ (3,4-dichlorfenyl)thioj-^5-nitrobenzoniitril o teplotě tání 137 až 139 °C.

Příklad 21

Způsobem podle předchozích příkladů se při použití příslušných výchozích látek získá jako výsledná látka 2-(4-fluorfenoxy)-5nitrobenzonitril o teplotě tání 132,5 až 133,5 stupňů Celsia.

Příklad 22

Způsobem podle předchozích příkladů se při použití příslušných výchozích látek získá jako výsledná látka 2-(2,3-dichlorfenoxy )-5-nitrObenzonitril o teplotě tání 146 až 147 °C.

Příklad 23

Způsobem podle předchozích příkladů se při použití příslušných výchozích látek získá jako výsledná látka 2-(2,5-dichlorfenoxy)-5-nitrobenzonitril o teplotě tání 167 až 168,5 °C.

Příklad 2 4

Způsobem, podle předchozích příkladů se při použití příslušných výchozích látek získá jako výsledná látka 2-(2,6-dichlorfenoxy)-5-nitrobenzonitril o teplotě tání 157 až 159 °C.

Příklad 25

Způsobem podle předchozích příkladů se při použití příslušných výchozích látek získá jako výsledná látka 2-(3,5-dichlorfenoxy j-5-nitrobenzonitril o teplotě tání 196 až 198 °C.

Příklad 26

Způsobem podle předchozích příkladů se při použití příslušných výchozích látek získá jako výsledná látka 2-[ (2-trifluormethylj fenoxyJ-5-nitrobenzonitril o teplotě tání 113 až 115 °C.

Příklad 27

Způsobem podle předchozích příkladů se při použití příslušných výchozích látek získá jako výsledná látka 2-[ (3-trifluormethylJfenoxyp5-niirobenzonitril o teplotě tání 85,5 až 86,5 °C.

Příklad 28

Způsobem podle předchozích příkladů se při použití příslušných výchozích látek získá jako výsledná látka 2-[3,!^-^l^is(trifluo.rmethyl)fenoxy]-5-nitrobenzonitril o teplotě tání 138 až 140 °C.

Příklad 29

Způsobem podle předchozích příkladů se při použití příslušných výchozích látek , získá jako výsledná látka 2-(2,3,4-trichlorfenoxy)-5-nitrobenzonitril o teplotě tání 203 až 204,5 °C.

Příklad 30

Způsobem podle předchozích příkladů se při použití příslušných výchozích látek získá jako výsledná látka , 2- (2,3,5--richlorfenoxyj-5-nitrobenzonitril o teplotě tání 160 až 162 °C.

Příklad 31

Způsobem podle předchozích příkladů se při použití příslušných výchozích látek získá jako výsledná látka 2-(2,3,6-trichlorfenoxy)-5-nitrobenzonitril o teplotě tání 141 až 143 °C.

Fyzikální vlastnosti sloučenin vyrobených způsobem podle předchozích příkladů budou uvedeny dále v tabulce 1.

Sloučeni- vypočítáno nalezeno na z pří- X R¹ (R²)_n Teplota tání °C % C % H % N % C % H % N

O ÍČi 3-C1 155 až 156 50,51 1^96 9J36 50/3 1,99 9,17

О 4-C1 2-C1 153,5 až 154,5 50,51 1,96 9,06 50,7 1,97 9,20

O 4-Br H 171 až 172 48,93 2,21 8,78 48,9 2,21 9,05

О)	V		Os	со см со	со	со см см	СП
см~	V		v	00 т-^СМ^	CD	ιτγ ад гН	со~
о	00	сп	σ>	00 см г-н	оо	сп о σΓ	О)

см	О	гЧ	со
κγ	ад	ад~	со
см	оо	оо	со

со		ад	UD~
со	оо	оо	Líd
ю	со	LÍD	LÍD

n m ю cm οο^ιτγ co co v

ад	см	см	оо	сп
ио	U0		со	со~
со	см	оо	см	со

сп со со	о	LÍD CD UD	со
см	т-Ч		сл	СО	γ-Ч V·	со
UD	ю	UD	со	LÍD	со ад	со

o CM o

со	СП	г»	о О СП	v
VI		см	ад~ гч^ т-ч^	гЧ~
ад	σΓ	σΓ	ад см γ-Τ	ад
		гЧ гЧ

V ld со см со см со 'LÍD СО

СО со

NOT co <o со cd со cn co σ> стГ

Ь* со т-Н СО СО СП гч~ ιτγ lo см_л со со ’ф со см со см

UD со

UD	ь-	со	см	СМ Ьч СП	со	о см ад	СО
ад	со		со^	ад оосо	СМ_ UD~	ад
со	ад	оо	но	см 1-Г V	О) со	со см v	со
UD	со	LÍD	UD	UD UD UD	LÍD СО UD	со

V	UD^	со	о	. co t>s CM V*
со	Г-Г	см	CD	CD	CM	CD
гЧ	UD	т-Ч	гЧ	CM	т-Ч
	гЧ			>N	>N	>N
>IS3	>N	>N	>N	Ctí
cd	«d	Ctí	cd	cd
cd			UD
со		v<	CD	co		co
со	о	CM	LCD	o	r4	CD
т-Ч	UD	тЧ	гЧ	CM	CM	т-Ч
	гЧ				CM

Ψ НН М НН НН ψ НН нн нн Мн Мн Мн Мн Мн

UD~ со со г-Н >N ctí со

ООО О О СЛ О

00 CD O	т-Ч	CM CO V	LO
r4	гЧ	г—1 т-Ч т-Ч	гЧ

Z о

tfNDoOTNCXNooNDDOoa ώ, w o, , N σ_ o ho cd r—~ , ld, г—, cm, co, cn oo o* oo oo o cn cd cd σΓ cn cn t>? oo oo oo г— o Й ω N Φ г—<

Ctí P

Ή θLWOODtLlObttWCWmNDin CO CO LO CM, O °°~ r~ rd O, CD, LD~ LO, í>^ OD Is, O© T-Γ rd ^γ— ν' om cf Od cm O] Cd cm r— w rd r-T

O

χι cm μ ω ιη h co, oo lo , co, od, оф cd, co, m, m oo 10 o o oo o oT o o o Ό m of ’φ in m LÍD LODW CmOLOLOLO ICL Ш

O o

O

DD

ts

CD

CM

fLD

CO

00

O

O

CD

cd

ID

xc

lD

Ю

O,

r—,

CD,

Мф

oo

oo,

O,

(D,

O,

OD

O,

o,

хф

г-j,

г-Ч

г—,

cn

oo

oo

°0

OD

o

cd

CD

CD

CD

od

oD

I>

oo

oo

oo

r—1

O P

>» >

XŤ г—I

CO*

Γ- CD -d CM, r— r—I <M<D) DOOCDCO CD, ©0 , CD, O, CD CD O т—I CM i—I r— r— r— r—

CD CD CD !>. >> t> cm

CM rd r—I г— г—

M ID r— CD r— Ν· rd η t-— t— XD LD CQ LD XD cm^f ° lo iD, ID, in ld ID' СО Τφ oo HO o O^- oo o o <o O <o X^ X^ t> 1L° ID urWDWtCiDOLnLIOLnWXW

XD xM

ID

O

O

P 'CO 4-J ctí +O

Oi Φ A

UD

in

m

CD CM

CD

oo

ID,

OD

OD г—

ID

Хф

o

XD,

CM

oo

x*

CD

LO

|

CO

oo

Ml

DO

XD

cn

a

a

co

X1

r—

r—

г—

r—

r—

r—1

CD

г—

r—1

°0

г—

O

rH

T“)

>N

>N

>N

>N cd

>N

>N

>N

γΠ

>N

»M Ctí

>N

>N

>N

CM

>N

>ÍM

td

cd

Oí

Ctí

od

Ctí

>N

Ctí

cd

cd

Ctí

>N

<d

cd

'XD,

t>

Ctí

OD OD г—

cd

ID,

CM

LD,

ID

CD

t> CD t—I

t>-

CO

XD,

OO

00 CD CM

O

T~<

Xí A

CD r—

cm ID

bCM r—

CO

cm 0°

Mi r—

LO r—

r— r—1

in CO

A

CO r-i

Mi r—(

<N i—I

O

I CM

O «

LD

CO ~CJ ~Ю ’ “Woo to o

CD o

I

ID ω o I I

0D LD

CM

Гы ω ω o

K KO M LQ CD

LD oo 00 CO” ^QQ Й

M , 1 ^{CM 0M}t“Ct^(OCC0Oo^’'_c±(JMI0M οοοοωοοοοοοοοοοο

OD t> ОСЛО HCJ (CDHLCO SO (COr—I r— —dr—CmNNNC NNNNNNDCD

Sloučeniny vyrobené způsobem podle vynálezu mají protivirovou účinnost a jsou zvláště účinné proti picornavirům, tj. malým virům typu ribonukleové kyseliny. Do této skupiny virů patří viry Coxsackie, Rhinoviry a celá řada virů, způsobujících choroby rostlin. ' Sloučeniny vyrobené způsobem podle vynálezu mají nízkou toxicitu pro savce, nízkou fytotoxicitu a mají malé nebo žádné vedlejší účinky při podávání savcům v dávkách, v nichž jsou účinné proti virům. Sloučeniny se poněkud liší ve své protivirové účinnosti a ve svém protivirovém spektru i toxicitě a vedlejších účincích, jak bude dále uvedeno.

Protivirová účinnost sloučenin vyrobených způsobem podle vynálezu byla prokázána při použití 'těchto metod:

Jednovrstevná kultura HeLa buněk v miskách o průměru 16 mm se ošetří 1 ml tkáňového živného prostředí (Eaglesovou prostředí s přídavkem fetálního. telecího séra) s obsahem sloučeniny vyrobené způsobem podle vynálezu v příslušné koncentraci nebo· pro' kontrolu bez obsahu této sloučeniny. Prostředí pro pěstování tkáňových kultur jsou podrobně popsána v běžných publikacích, například v Kuchler ‘s Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, Dowden, Hutchinson a Ross, lne., Stroddsberg, Pa. (1977).

Po' tomto ošetření byl do' tkáňových kultur přidán rhinovirus v množství 0,05 ml, typ 1A (RV—1A) nebo typ 2 (RV—2) nebo virus Coxsackie A21 (Cox A₂i) v odpovídajícím množství živného prostředí. Některé sloučeniny byly rovněž zkoumány na svůj účinek proti rhinoviru typ 5 [RV—5), typ 8 (RV—8) nebo typ 64 (RV—64). Kontrolní tkáně byly pěstovány bez přidání viru. Tkáňové kultury byly zkoumány na cytotoxicitu a účinek viru na buňky (CPE) po 48 až 72 hodinách od přidání viru.

Kromě toho byly některé ze sloučenin zkoumány na zvířatech způsobem, při němž se účinná látka podává jednorázově:

Myší samci o' hmotnosti 10 až 12 gramů byli infikováni intraperitoneálně 0,2 mililitru ' letální dávky, . tj. takovým množstvím viru, které stačí k uhynutí 80 až 100 proč, infikovaných zvířat v průběhu 10 dnů . v případě použití Cox A_2:t ve fyziologickém roztoku s fosforečnanovým pufrem s obsahem 1 % telecího séra, inaktivovaného teplem. Po' 3 hodinách bylo- myším perorálně podáno 0,2 ml účinné 'látky v suspenzi v 0,5 % hydroxypropylmethylcelulázy (Methocel) nebo 0,2 ml suspenze v 0,5 °/o téhož derivátu methylcelulózy bez obsahu účinné látky. .*%_·

Účinná látka byla podávána v koncentraci 30 mg/ml, tj. 600 mg/kg. Myši byly sledovány denně po' dobu 7 až 10 dnů a byl zaznamenáván počet uhynulých zvířat. K vyhodnocení statisticky významného rozdílu mezi kontrolními a ošetřenými skupinami bylo' použito modifikovaného Mantel-Haenzelova testu X².

Při provádění tohoto testu při hodnotě vyšší než 3,84 je výsledek statisticky významný při pravděpodobnosti 95 %.

Některé z účinných látek byly rovněž zkoumány při kontinuálním podávání zvířatům. Virus Coxsackie A21 pěstovaný na HeLa buňkách byl podáván v koncentraci, která způsobí uhynutí 80 až 100 % zvířat: bylo použito myší o hmotnosti 10 až 11 g, myši byly pozorovány 10 dnů po intraperito·neální infekci 0,2 ml roztoku s obsahem viru. Pak byly myši ošetřovány účinnými látkami, které byly podávány v běžném krmivu pro hlodavce v koncentraci 0,06 % hmotnostních, s podáváním bylo započato' 1 den před intraperitoneálním podáním roztoku s obsahem viru. Následujících 10 dnů bylo zaznamenáváno uhynutí kontrolních zvířat i zvířat ošetřených účinnými látkami. Tyto výsledky byly vyhodnoceny testem X². Hodnoty vyšší než 3,84 prokazují účinnost zkoumané látky při pravděpodobnosti 95 %.

Výsledky získané svrchu uvedeným způsobem jsou shrnuty dále v tabulce 2.

Tabulka 2

Sloučenina z příkladu Č.	Cytotoxicrta* (^g/ml)	RV—IA	Testy na tkáňových kulturách** RV—2 Cox A21 RV—5	RV—8	RV—64
1	>100	0,5	0,25	0,25	0,5	0,25	0,156
2	>100	0,625	0,625	1,25	2,5	2,5
3	>100	1,25	1,25	2,5
4	>100	<0,625	<0,625	0,625	<0,3	< 6
5	>100	NA	50	<6,25
6	100	NA	<6,25	<6,25
7	50	NA	6,25	<6,25
8	>100	NA	12,5	<6,25
9	>100	NA	NA	<6,25
10	>100	+50	NA	<6,25
11	>100	NA	+100	12,5
12	25	+3,125	íl,6	1,6
13	> 50	6,25	<3,125	<3,125	6,25	3,125	12,5
14	> 50	3,125	0,3125	0,625	2,5	0,3125	0,625
15	> 50	6,25	3,125	<3,125	6,25	3,125	6,25
16	> 50	12,5	3,125	12,5	6,25	3,125	NA
17	10	2,5	1,25	1,25
18	12,5	3,125	<3,125	3,125	1,25	1,25	0,3125
19	12,5	6,25	<3,125	6,25	1,25	1,25	0,3125
20	10	NA	2,5	+2,5
21	10	0,625	0,625	0,625	1,25	0,625	0,625
22	> 50	<3,125	<3,125	<3,125			<3,125
23	> 50	3,125	<3,125	6,25	ž6,25	<6,25	3,125
24	> 50	3,125	<3,125	12,5	3,125	<3,125	3,125
25	> 50	6,25	3,125	NA	6,25	3,125	25
26	> 20	NA	1,25	10
27	12,5	2,5	0,625	1,25	0,625	1,25	0,625
28	> 20	NA	2,5	10
29	> 20	+10	1,25	+5
30	> 20	2,5	2,5	NA
31	> 20	2,5	1,25	5	3,125	<3,125	3,125

Tabulka 2 — pokračování

Pokus na zvířatech

Sloučenina z příkladu č.	Jednotlivá perorální dávka	Kontinuální perorální dávka
dávka (mg/kg)	X2	dávka* ** (°/o)	X2
1	600	5,36	0,06	23,62
2	600	3,659	0,06	1,38
3	600	2,139	0,06	5,81
4	600	0,252	0,06	10,61
5	600	0,719	0,06	0,26
6	600	0,609	0,06	6,91
7	600	18,94	0,06	18,82
8	600	0,095	0,06	10,45
9			0,06	9,03
10			0,06	2,84
11	600	0,64
12	600	4,805	0,06	0,215
21			0,06	10,513

* Údaje o cytotoxicitě znamenají koncentrací účinné látky v ,ug/ml, která je toxická pro buňku.

** Nejnižší koncentrace účinné látky v pg/ml nutná ke snížení cytopatického účinku na 50 %.

*** Hmotnostní % účinné látky v krmivu pokusných zvířat.

„NA“ znamená, že sloučenina nebyla účinná proti uvedenému viru při použitém typu pokusu.

V případě, že v tabulce není uveden žádný údaj, znamená to, že v tomto· případě nebyl uvedený pokus proveden.

Údaje v tabulce 2 ukazují, že sloučeniny vyrobené způsobem podle vynálezu jsou účinné proti různým virům.

Údaje, které se týkají tkáňových kultur ukazují, že všechny zkoumané látky byly účinné proti alespoň jednomu ze tří zkoumaných virů (RV—1A, RV—2 neboCoxA₂i). Mimoto některé zkoumané látky byly účinné proti virům RV—5, RV—8 nebo· RV—64.

Kromě toho některé ze sloučenin jsou účinné proti virovým infekcím myší, jak bylo možno prokázat s pravděpodobností 95 proč, při testu X², při němž bylo dosaženo· hodnot vyšších než 3,84.

Zvláštní význam má sloučenina z příkladu 1, tj. 2-(3,4-dichlorf enoxy )-5-nitrobenzonitril, který má protivirovou účinnost při jednorázovém perorálním podání i při kontinuálním perorálním podávání. Sloučenina, kterou je možno podávat perorálně, a která si i v tomto případě uchová svou protivirovou účinnost je velmi výhodná, protože je možno ji snadno včlenit do plniva, jak bylo prokázáno v pokuse s kontinuálním perorálním podáváním u myší nebo je možno ji podávat v lékové formě, která obsahuje účinnou látku spolu s nosičem, přijatelným z farmaceutického hlediska 2-(3,4-dichlorfenoxy)-5-nitrobenzonitril má protivirový účinek proti celé řadě virů ve tkáňových kulturách, jak bylo prokázáno tímto způsobem:

Roztek 2- (3,4-dichlorfenoxy) -5-nitrobenzonitriki byl připraven rozpuštěním 5 mg této látky v 0,1 ml dimethylsulfoxidu s následnou inkubací při teplotě 56 °C na alespoň 15 minut. Roztok byl přidán k 0,9 ml udržovacího prostředí o· teplotě 56 °C. Šlo o prostředí, které obsahovalo· 49 %’ Eaglesova prostředí, 49 % prostředí 199, 2 % totálního telecího· séra a antibiotika. Výsledný 1 ml byl přidán k 9 ml udržovacího prostředí o teplotě 56 °C. Z tohoto· roztoku byly připraveny výsledné koncentrace s obsahem 100, 50, 25 nebo 12,5 ředěním udržovacím prostředím.

Zkumavky s obsahem tkáňové kultury (WI—33 embryonální buňky lidské plicní tkáně] byly doplněny 1 ml prostředí s obsahem účinné látky v určité koncentraci a prostředí se naočkuje 3 až 300 TCID50, tj. 3 až 300násobek dávky, která je zapotřebí k infekci 50 % zkoumaných tkáňových kultur, Každá, zkouška byla provedena třikrát. Současně byla provedena i titrace viru. Tkáňové kultury byly doplněny v případě potřeby po 3 až 4 dnech čerstvým živným prostředím až do posledního provedení titrace viru.

Tkáňové kultury byly denně sledovány na vznik cytopatiokého účinku. Test byl hodnocen jako úplný v případě, že kontrolní tkáně s obsahem viru byly poškozeny na 75 nebo více %. V tomto případě bylo pro vedeno srovnání s % buněk, které bylo poškozeno ve zkumavkách, které obsahovaly virus i účinnou látku. Rozdíly zjištěné v tomto případě byly hodnoceny při poškození 75 % nebo vyšším +, při poškození 74 až 50 % jako + a při poškozením nižším než 50 % jako —.

Ve svrchu uvedených pokusech zabraňovala zkoumaná látka, tj. 2-(3,4-dichlorfenoxy)-5-niírobenzonitril v koncentraci 25 μ// /ml rozmnožování 20 . různých rhinovirů, to znamená, že byla hodnocena jako· + proti 20 různým rhinovirům při pokusech, které byly provedeny následujícím způsobem. K pokusu byly použity viry typ 4, typ 6, typ 8, typ 10, typ 13, typ 17, typ 19, typ 21, typ 29, typ 39, typ 56, typ 58, typ 59, typ 60, typ 64, typ 68, typ 74, typ 75, typ 81 a kromě toho Hanksův virus, jehož typ nebyl určen.

V dalších tkáňových kulturách, a to v pokusech provedených obdobným způsobem bylo prokázáno, že 2-(3,4-dichlorfenoxy)-5-nitrobenzonitrií inhibuje rozmnožování enterovirů Coxsackie B2 a B₄, avšak v použitých koncentracích není účinný proti následujícím virům: Virus chřipky A, WSN, PR 8, virus parainfluenza 1, NDV (Newcastleská horečka), netypovaný adenovirus, virus oparu typ 1 a nepřesně identifikovaný virus feline calmi.

Svrchu uvedené výsledky ukazují, že 2- (3,4-dichlorfenoxy)-5-nitrobenzonitril je zvláště účinný proti Picornavirům, tj. malým virům typu ribonukleové kyseliny, jako jsou například viry CoKsackie a rhinoviry. Je rovněž zřejmé, že tato látka má · proti uvedeným virům široké spektrum účinnosti.

Při použití standardních pokusů na tkáňových kulturách i na zvířatech bylo tedy prokázáno, že 2-(3,4-dichloff enoxy )-5-nitrobenzototril má výrazně vyšší účinnost než srovnávací sloučeniny 5-(3,4-dichlorfenoxy)-2-nitrobenzonitril. Při pokusu na tkáňových kulturách bylo zapotřebí vyšších koncentrací srovnávací sloučeniny k vyvolání 50% snížení cytopatického účinku v případě virů RV—1A, RV—2 a Cox A21. Mimoto nebyla srovnávací sloučenina účinná proti virům RV—5, RV—8 a RV—64 v použité koncentraci. Tato látka také neměla žádný protivirový účinek při kontinuálním perorálním podávání.

Další výhodou 2- (3,4-dichlorf enoxy )-5-nit+obenzonitrilu je nízká toxicita. Při pokusu na krysách bylo prokázáno, že akutní perorální toxicita je 5 g/kg, při intraperitoneálním podávání je vyšší než 2 g/kg. U psů byla zjištěna perorální toxicita vyšší než 2 g/kg.

Vzhledem k řadě výhod, například široké spektrum protivirové účinnosti při nízké koncentraci, nízká toxicita a protivirová účinnost při perorálním podávání, je možno potvrdit, že 2-(3,4-diohlorfenoxy)-5-nitrobenzonitril je nejvýhodnější sloučeninou vyrobenou způsobem podle vynálezu.

Sloučeniny vyrobené způsobem podle vynálezu je možno použít tak, že se virus nebo hostitelský organismus uvede ve styk s jednou nebo větším počtem těchto látek, které mohou způsobit inhibici viru. Účinek spočívá pravděpodobně v tom, že dochází k přímé inhibici viru v buňce hostitele, nejde tedy pravděpodobně o· přímý chemický nebo fyzikální účinek mimo buňku. Při použití sloučenin obecného vzorce I mimo živý organismus je nutno zajistit, aby se při styku viru s hostitelskou buňkou dosáhlo vždy účinného množství sloučeniny vyrobené způsobem podle vynálezu. Nejvýhodnější však je uvést účinnou látku do styku přímo s buňkou hostitele. Je možno použít jednotlivou látku nebo . větší počet těchto látek ve směsi. Je možno· dosáhnout přímého styku, například přidáním sloučeniny do tkáňové kultury k zabránění infekce picornavirem.

Je také možno podat vyšším organismům účinnou látku v účinné dávce. Účinnou látku je možno podat parenterálně, například intraperitoneálně, podkožně nebo nitrožilně, dále perorálně, což je pro· kontinuální podávání nejvýhodnější. V těchto· případech se rovněž podává účinná látka jedné nebo většího počtu sloučenin. Volba sloučeniny pro toto použití se řídí různými vlivy, například toxicitou, mutagenním účinkem, protivirovým účinkem, způsobem podávání, stálostí, možností kombinace s různým typem nosiče a podobně.

Přesné množství sloučenin vyrobených způsobem podle vynálezu závisí na různých faktorech, například na použité sloučenině, způsobu aplikace, velikosti, věku a druhu živočicha, na cestě podání a častosti podání. Pokud jde o virus, který má být inhibován, jde také o· to, zda je sloučenina podávána preventivně, nebo zda je podávána zvířeti, které již infekcí trpí. Může být podáno· až 600 mg/kg/den účinné látky, avšak alespoň 0,1 mg/kg/den, s výhodou 0,1 až 60 mg/kg/den.

Ve zvláštních případech je možno množství účinné látky předem zjistit, například vlivem, který je možno vyvolat při použití různého množství této látky. K tomuto účelu je možno· použít běžných pokusů, které se používají při virových infekcích.

Sloučeniny vyrobené způsobem podle vynálezu se s výhodou podávají ve formě farmaceutických přípravků, které obsahují účinnou látku ve směsi s nosičem, přijatelným z farmaceutického hlediska, tj. inertním vzhledem k účinné látce, nosič také nesmí vyvolávat škodlivé vedlejší účinky nebo být toxický za podmínek používání. Jak již bylo uvedeno sloučeniny vyrobené způsobem podle vynálezu mají při použití v tkáňových kulturách dobrý protivirový účinek v nízké koncentraci. Například koncentrace 0,156 ;íg/ml 2- (3,4-dichIorfenoxy ] -5-nitrobenzonitrilu způsobí 50% snížení cytopatického efektu v případu viru RV—64,

Farmaceutický přípravek může obsahovat 0,1 ,;zg nebo méně účinné látky v 1 ml nosiče, až 99 % hmotnostních účinné látky spolu s nosičem, přijatelným z farmaceutického· hlediska. Tyto přípravky s výhodou obsahují 0,1 až 6,0 ^g/ml.

Farmaceutický přípravek může .mít pevnou formu, jde například o tablety, kapsle, granuláty, krmné směsi, doplňková krmivá, koncentráty, prášky, granule a podobně. Může rovněž jít o kapalné formy, například sterilní injekční roztoky nebo suspenze, suspenze nebo roztoky pro perorální· podání · a podobně. Nosiče přijatelné z farmaceutického hlediska jsou také dispergační činidla, činidla napomáhající vzniku suspenze, pojivá, kluzné · látky, vonné látky a barviva.

Typický farmaceutický přípravek bude obsahovat 0,1 ,ug účinné látky v 1 ml nosiče nebo jiné množství, například 0,0025, 0,05, 0,25, 0,5, 1,0, 10, 25 nebo 50 % hmotnostních účinné látky spolu s nosičem, přijatelným z farmaceutického hlediska.

Ve výhodných přípravcích pro toto použití se účinná látka použije v mikronizované formě v přípravku v pevném stavu nebo spolu s nosičem, dispergovatelným ve vodě, jako je například povrchově aktivní dispergační činidlo, nebo· může mít přípravek formu kapalné vodné suspenze nebo· roztoku s obsahem činidla, které napomáhá vzniku suspenze, jako je například methylcelulóza, hydroxypropylmethylcelulóza, karboxymethylcelulóza nebo rozpouštědlo přijatelné z farmaceutického hlediska, například ethanol.

Dále budou uvedeny příklady vodných suspenzí, tablet a kapslí s obsahem sloučenin vyrobených způsobem podle vynálezu.

A) К 50 ml deoonizované vody se postupně přidávají a mísí tyto složky:

1,0 g mikrokrystalické celulózy (Avicel RC 591),

0,15 g karboxymethylcelulózy, (CMC 7HF), 0,05 g kondenzátu polyoxypropylenpolyoxyethylenu (Pluronic polyol F68).

0,1 g sorbitanu draselného jako konzervačního činidla,

60,0 g sacharózy ve 25 až 30 ml deionizované vody a

2,0 g 2-(3,4-dichlorfenoxy)-5-nitrobenzonitrilu, s výhodou v mikronizované formě, aby nedošlo ke vzniku vzduchových bublin.

Objem se upraví na 100 ml delonizovanou vodou a vzniklá suspenze se nechá projít koloidním mlýnem nebo homogernzátorem. Výsledná suspenze je vhodná pro perorální podání a obsahuje 100 mg/5 ml, tj. 200 mg/ /10 ml.

V případě potřeby je možno použít činidel, která napomáhají vzniku suspenze, dále chuťových látek, barviv, konzervačních látek a podobně. Koncentrace účinné látky v těchto suspenzích se pohybuje v rozmezí až 10 °/o (% hmotnostní/objemové).

B) Obdobným způsobem je možno smísit g mikronízovaného 2-(3,4-dichlorfenoxy)-5-nitrobenzonitrilu, 0,3 g karagenanu vápenatého (SeaSpen PF), 0,5 g karboxymethylcelulózy (CMC 7HF), 30 g sacharózy, 0,1 g povrchově aktivního činidla (Pluronic polyol F68) a 0,01 g laurylsíranu sodného s dostatečným množstvím deionizované vody к úpravě suspenze na konečný objem 100 ml.

C) Obdobným způsobem je možno smísit 2g mikronízovaného 2-( 3,4-dichlorfenoxy )^ -5-nitrobenzonitrilu, 2 g mikrokrystalické celulózy, 0,1 g povrchově aktivního činidla [Pluronic polyol F68), 0,01 g laurylsíranu sodného, 0,1 g methylesteru .kyseliny 4-hydroxybenzoové (methylparaben) a 0,01 g propylesteru kyseliny 4-hydroxybenzoové (propylparaben) s dostatečným množstvím deionizované vody na výsledný objem suspenze 100 ml.

D) Smísí se 7 g mikronízovaného 2-(3,4-dichlorfenoxy)-5-nitro'benzonitrilu, 228 g mikrokrystalické celullózy, 5,5 g kukuřičného škrobu a 7,5 g methylcelulózy (Methocel A15). Vyrobí se vlhký granulát přidáním deionizované vody. Tento granulát se protlačí sítem a .pak se usuší. Po dalším protlačení >ítem se к suchému granulátu přidá 2,0 g itearanu hořečnatého, směs se důkladně promísí a lisuje na tablety o hmotnosti 200 miligramů.

E) Smísí se 5 g mikronizovaného 2-(3,4-dichlorfenoxy)-5-nitrobenzonitrilu, 230 g modifikovaného škrobu (StáRx 1500), 2,5 g stearanu hořečnatého a 12,5 g kukuřičného šrobu, načež se směs lisuje do tablet o hmotnosti 250 mg.

F) Rozpustí se 5 g 2-(3,4-dichlorfenoxy)-5-nltrobenzonitrilu ve 100 ml polyethylěnglykólu 400 a vzniklý roztok se plní do kapslí z měkké želatiny v množství 250 mg do 1 kapsle.

G) Smísí se 5 g mikronizovaného· 2-(3,4-dichlor.fenoxy) -5-nitrobenzonitrilu, 210 g mikrokrystalické célulózy, 25 g laktózy a 10 gramů kukuřičného škrobu a směs se plní do kapslí z tvrdé želatiny v množství 250 miligramů na 1 kapsli.

Tablety a kapsle obvykle obsahují 250 mg účinné látky, mohly by však obsahovat i 50 nebo 100 mg této látky, tyto tablety nebo kapsle je možno· snadno připravit změnou koncentrace.

Farmaceutický přípravek má s výhodou formu upravenou pro perorální podání a obsahuje účinné množství uvedené sloučeniny, které nesmí být toxické pro organismus, jemuž se sloučenina podává. S výhodou jde o pevnou lékovou formu, obsahující ve vodě dispergovatelný nosíc a účinnou látku.

Lékové formy pro perorální podání, jako tablety, kapsle, suspenze a podobně, obsahují obvykle 1 mg nebo méně nebo 5, 10, 25, 50, 100, 250 nebo 300 mg v jednotlivé dávce.

Claims (8)

1. PŘEDMĚT VYNALEZU

   1. Způsob výroby substituovaných benzonitrilů obecného vzorce I kde

   X znamená atom kyslíku nebo atom síry,

   R¹ znamená atom bromu, chloru nebo fluoru, fenoxyskupinu, alkylthloskupinu, alkylsulfinylovou skupinu, alkylsulfonylovou >kupinu, aLkylaminosulfonylovou skupinu, diilkylaminosulfonylovou skupinu, benzoylovou skupinu, alkoxyskupinu, alkyl, halogenovaný alkyl nebo acetyl, přičemž alkylové a alkoxylové zbytky a alkylové části jiných zbytků obsahují 1 až 3 atomy uhlíku, a

   R² znamená atom vodíku, atom bromu, chloru nebo fluoru nebo trifluormethylovou skupinu .a n znamená celé číslo 1, 2, 3, nebo 4, vy značující se tím, že se uvede v reakci substituovaný benzen obecného vzorce

   Bz-A, kde

   Bz znamená 2-kyano-4-nitrofenyl nebo skupinu kde

   R¹, R² a n mají svrchu uvedený význam a A znamená atom halogenu, se sloučeninou obecného vzorce

   Bz¹—X—Y, kde

   X znamená atom kyslíku nebo síry,

   Y znamená atom vodíku nebo kation, tvořící fenylát a

   Bz¹ znamená druhou ze skupin ve význa219350 mu Bz, při teplotě 60 až 100 °C v inertním organickém rozpouštědle.
2. 2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se reakční složky použijí v ekvimolárním poměru.
3. 3. Způsob podle bodů 1 a 2, vyznačující se tím, že se uvede v reakci sloučenina obecného vzorce kde

   R¹, R², X a n mají význam uvedený v bodu 1, s 2-halogen-5-nitrobenzonitrilem v inertním organickém rozpouštědle za přítomnosti alkalického činidla.
4. 4. Způsob podle bodů 1 a 2, vyznačující se tím, že se uvede v reakci sloučenina obecného vzorce (III) kde

   R¹, R², A a n mají význam uvedený v bodu 1, s 2-kyano-4-nitrofenolem nebo s 1-merkapto-2-kyano-4-nitrobenzenem v inertním organickém rozpouštědle za přítomnosti alkalického činidla.
5. 5. Způsob podle bodů 1 a 2, vyznačující se tím, že se uvede v reakci 3,4-dichlorfenol s 2-chlor-5-nitrobenzonitrilem.
6. 6. Způsob podle bodů 1 a 2, vyznačující se tím, že se uvede v reakci 4-(trifluormethyljfenol s 2-chlor-5-nitrobenzonitrilem.
7. 7. Způsob podle bodů 1 a 2, vyznačující se tím, že se uvede v reakci 2,3-dichlorfenol s 2-chlor-5-nitrobenzonitrilem.
8. 8. Způsob podle bodů 1 a 2, vyznačující se tím, že se uvede v reakci 3-(trifluormethyl)fenol s 2-chlor-5-nitrobenzonitrilem.