CS209491B2

CS209491B2 - Method of preparation of substituted cis-p-(2-/(3/4-aminobutyl/aminopropyl/carbamoyl)glycosides

Info

Publication number: CS209491B2
Application number: CS797856A
Authority: CS
Inventors: Joseph J Hlavka
Original assignee: American Cyanamid Co
Priority date: 1976-03-18
Filing date: 1979-11-16
Publication date: 1981-12-31
Also published as: US4154925A; CS209490B2

Description

Vynález se týká způsobu přípravy nových antibakteriálně účinných cis-1 p-(2-[ (3-(/4-aminobuty l/aminoopropy 1) karbamoyl ] vinyl} | glykosidů označovaných jako substituované látky cis-BM123yi a cis-BM123yž, které jsou blíže charakterizovány dále.

Účinky těchto, nových antibakteriálních prostředků na specifické mikroorganismy a jejich chemické a fyzikální vlastnosti jsou odlišné od účinku a vlastností až dosud známých popsaných antibakteriálních prostředků.

Nové antibakteriální prostředky připravené podle vynálezu jsou organickými bázemi a. jsou tedy schopny tvořit adiční soli s kyselinami za použití různých organických a anorganických solitvorných reakčních činidel. Adiční soli s kyselinami, vznikající smícháním antibakteriálně účinné volné báze s až třemi ekvivalenty kyseliny, účelně v neutrálním rozpouštědle, lze tedy připravit za použití kyselin, jako kyseliny sírové, fosforečné, chlorovodíkové, bromovodíkové, amidosulfonové, citrónové, maleinové, fumarové, vinné, octové, benzoové, glukonové, askorbové a podobných kyselin. Adiční soli antimikrobiálních činidel podle vynálezu s kyselinami jsou obvykle krystalické pevné látky poměrně rozpustné ve vodě, methanolu· a ethanolu ale poměrně nerozpustné v nepolárních rozpouštědlech, jako v diethyletheru, benzenu, toluenu apod. Pro účely vynálezu jsou antibakteriální volné báze ekvivalentní svým netoxickým adičním solím s kyselinami. V následujícím textu se pod . označením cis-BM123y--átka rozumí směs cis-BM123y₁-látky s cis-BM123y2-látky v jakémkoli poměru . . a pod označením trans-BM123y--átka · se rozumí směs trans-BM123y1-látky a trans-BM1237₂-látky v jakémkoli poměru.

Nové antibakteriální prostředky označené jako· substituované cis-BM123yj- a cis-BM123y₂-látka· se· připravují substitucí (oirganylací) příslušných nesubstituovaných cis- · nebo trans-isomerů, přičemž když se vychází z trans-isomerů provede · se též fotochemická transformace trans-isomerů na cis-isomery a to buď na nesubstituovaných prekursorech nebo ·na ' substituovaných trans-isomerech konečných látek. Fotochemická· transformace přednostně provádí tak, že· se výchozí trans-isomer rozpustí netto disperguje ve vodě a pak se· roztok ozařuje světlem. Koncentrace výchozího· trans-isomeru ve vodě není kritická.

Světlo, použité · při fotolytíckém postupu podle· předloženého vynálezu, nemá s výhodou vlnovou délku nižší než asi 250 nm a přednostně má vlnovou délku· v rozmezí od 250 do 400 nim. Ozařování světlem takové vlnové délky se účelně dosahuje tím, že se reakcei provádí v nádobě vyrobené z takového materiálu jako· je křemen, který odfiltruje v podstatě všechno světlo procházející nádobou, které má vlnovou délku pod 250 nm. Jako zdroje světla se účelně používá vysoíkotloké rtuťové lampy o příkonu asi 450 W.

Teplota, při které se fotolýza provádí, nemá rozhodující význam pro dosažení dobrých výtěžků produktu, ale účelně se pracuje při teplotě v rozmezí 5 až 50 °C, například při asi 25 až 30 °C. Doba potřebná pro podstatnou konverzi substituovaného trans-isomeru na odpovídající substituovaný cis-isomler přirozeně závisí na intenzitě světla ai teplotě a nejlépe se proto stanou vuje v každém jednotlivém případě poku sem. Obvykle však postačuje doba v rozmezí od asi 20 minut do asi 2 hodin:.

Po skončení ozařování se může produkt získat standardními postupy. Tak se například reakční směs může lyofillzovat nebo Odpařit do sucha a zbytek se může rozpustit v minimálními množství rozpouštědla, jako ethanolu nebo methanolu. Výsledný roztok se může zředit diethyletherem nebo acetonem a vzniklý vysrážený produkt se může izolovat filtrací. Další čištění se může provádět standardními metodami, jako krystalizací nebo chromatografií.

Předmětem vynálezu je způsob přípravy substituovaných cis-|p-{2-( (3-(/4-amínobutyl/amlno)propyl Jkarbamoyl J vinyl} | glykosidů, Označovaných jako οϊ8-ΒΜ123τϊ- nebo cis-BM123/₂-sloučeniny, obecného vzorce

kde

R představuje v případě BM123yi-sloučeniny zbytek vzorce

neboi v případě BM123f₂-sloučeniny zbytek vzorce

každý ze symbolů

А а В představuje nezávisle jeden na druhém atolm vodíku nebo skupinu CH₂—Ri a

R_t představuje vodík, alkylskupinu obsahující až 8 atolmů uhlíku, fenylskupinu, benzylskuplnu nebo· alkenylskupimu obsahující 2 až 8 atomů uhlíku, vyznačený tím, že se výchozí amin obecného vzorce , О _r_^~2/-ch-ch-c-nh-( сн₂)у-пн-(сн₂)^-пн₂ nebo kde

R má shora uvedený význam, podrobí alkylaci, arylaci, aralkylaci nebo alkenylaci aldehydem obecného vzorce

R—CHO ..........................................

kde

R_t má shora uvedený význam v přítomnosti redukčního činidla, v rozpouštědle inertním vůči reakčním složkám, přičemž trans-isomer se před nebo po této· reakci podrobí ozařování světlem o vlnové délce 250 až 400 ,uin tak dlouho, dokud se příslušný. trans-isomer v podstatě nepřevede na odpovídající els-isOmer.

Redukční organy lace (alkylace, arylace, aralkylace nebo alkenylace) se může provádět takto:

Příslušná výchozí látka se rozpustí ve vhodném rozpouštědle jako vodě, methanolu, met^y^c^^lh-solvu nebo jejich směsi, přidá se' větší než ekvimolární množství požadovaného aldehydu a pak se přidá natriumikyanoborohydrid v - množství postačujícím pro ' provedení redukce. Hodnota pH

Tabulka I

Použitý aldehyd reakční směsi se během reakce udržuje pomocí zředěné minerální kyseliny na 6,0 až 8,0. Po. 1 až 24 hodinách při teplotě okolí (10 až 35 °C) se reakční směs za vakua odpaří do sucha, zbytek se rozetře s methanolem a odfiltruje. . Filtrát se zředí acetonem a pevný produkt, který se vysráží, se odfiltruje a za vakua vysuší.

Z reakčních směsí po redukční organylaci lze· produkty získat rovněž- jinými standardními postupy, jako srážením, koncentrováním, extrakcí rozpouštědly nebo kombinacemi těchto po-tupů. P'o izolaci se mo;hou produkty přečistit jakýmkoli - z běžně známých způsobů čištění. Těmito způsoby jsou překrystalování -z různých rozpouštědel a směsných rozpouštědlových systémů, chromatografické- techniky a pro-tproudé rozdělování, kterých se běžně používá k tomuto účelu.

Aldehydy, kterých lze takto- používat, při uvedené redukční organylaci (způsobem obecně popsaným v příkladu 8), jsou .uvedeny v následující tabulce I. . V této tabulce název derivátu ukazuje zda se jako výchozí látky používá antibiotika trans-BM123y nebo antibiotika cis-BM123y.

Název fenylacetaldehyd etethylhexanal

2.2- dimethylbutanal

2.2- dinieih·ytpropanal

2-meУhyl-2-butenal

2-meΐhyt-2-pentenal formaldehyd acetaldehyd benžaldehyd

2-fenylethyl-trans--BM123y

2-ethylhexyl-cts-BM123y

2.2- dlne.thylbutyl·-trans-BM123y

2.2- dlnethylpгoιp·yl-trans-BM123y

2-nethyl-2-butenyl-cts-BM123y

2-methyl-2-pententlI-tranr-BM123t methyl-tranr-BM123t ethyl-trans-BM123y benzyl-tran--BM123y

Antibiotika označená jako- ВМ123Д₍, ΒΜ123/^₂, tran-s-BM123y₍ a ^ап--ВМ123у₂vznikají kultivací za kontrolovaných podmínek nového kmene neurčeného druhu Nocardia. Tento nový kmen produkující antibiotika byl izolován ze vzorku zahradní půdy odebraného v Oceole ve státě Io-wa, USA a je chován ve sbírce kultur Lederle Laboratories Division, Američan· Cyanamid Company, Pearl River, N. Y. jako kultura číslo BM123. Životaschopná kultura nové ho mikroorganismu byla uložena ve sbírce Culture Collection Laboratory, Northern Utilization Research and Development Division, United States Department of Agricultu-e, Peioria, Illinois a byla zařazena do stálé sbírky. - Je volně dostupná pro veřejnost pod číslem NRRL - 5646. Pod označením BM123/íMátka se rozumí směs v BM123_:;3|-látky a BM123j3-látky v libovolném poměru.

Obecný popis mikroorganismu Nocardia sp. NRRL 5646 založený na pozorovaných rozpoiznávacích znacích je tento. Byly pozorovány vlastnosti organismu v kultuře a fyziologické a morfologické vlastnosti organismu podle metod, které popsal Shirling a Gottlieb, Internát. Journ. of Syst. Bacteriol. 16, 213 až 240 (1966). Chemické složení kultury bylo určováno postupy, které popsali Lechevalier et al., Advan. Appl. Microbiol. 14, 47 až 72 (1971). Podtržený popis barvy a číslo barevného odstínu je použit v souladu s prací Jacobson et al., Color Harmony Manual, 3. vydání (1948), Container Corp. of America, Chicago-, Illinois. Podrobnosti popisu jsou uvedeny v dalších tabulkách II až VI.

Intenzita růstu

Střední na agaru s kvasničným extraktem, agaru s dextrózou a asparaginem, Benedictiově a Bennettově agaru, agaru s bramborelm a dextrózou a Weinstreinově agaru, slabá na Nickeyově a Tresnerově agaru, agaru s rajským protlakem, agaru s ovesnou moukou a pablum-agaru a nepatrný růst na agaru s anorganickými solemi, a škrobem, s Kusterovými ovesnými, vločkami, Czapekovým roztokem a na agaru s rýží.

Vzdušné mycelium

Pokud je přítomno, je vzdušné mycelium bělavé, vzniká jen na agaru s kvasničným extraktem, agaru s dextrózou a asparaginem, na Benettově a Benedictově agaru a na agaru s bramborem a dextrózou.

Rozpustné pigmenty

Nevznikají žádné rozpustné pigmenty.

Reverzní barva

Bezbarvé až nažloutlé odstíny.

Různé fyziologické reakce

Neztekucuje želatinu, dusičnany redukuje na dusitany za 7 dní, na agaru s peptonem a železem netvoří m-elanoidové pigmenty, na mléce s lakmusem nedochází к peptonizaci ani ke tvorbě sraženiny, tolerance vůči chloridu sodnému na agaru s kvasničným extraktem je větší nebo rovná 4 %, ale menší nebo rovná 7 %, optimální teplota růstu 32 °C. Využití zdroje uhlíku podle Pridhamovy a Gottliebovy metody [J. Bacteriol. 56, 107 až 114 (1948)] je následující: dobré využití glycerinu, salicinu, d-trehalózy a dextrózy, střední využití i-inositu a špatné využití až vůbec žádné využití d-fruktózy, maltózy, adonitu, 1-arabinózy, laktózy, d-mahnitu, d-melibiózy, d-raffinózy, 1-rhamnózy, sacharózy a d-xylózy.

Chemické složení

Organismus náleží к organismům s buněčnou stěnou typu IV, tj. obsahuje meso^ -2,6-diaminopimelovou kyselinu a má celobuněčné spektrum cukrů typu A, tj. obsahuje arabinózu a galaktózu. Methylované celobuněčné extrakty vykazují při chromatografii spektrum mastných kyselin podobné spektru, které poskytuje organismus Nocardia asteroides ATCC 3308.

Mikromorfologie

Vzdušné mycelium roste ze substrátového! mycelia ve formě mírně rozvětvených středně dlouhých ohebných prvků, které obvykle koinčí v prodloužených jednoduchých spirálách. Ohebíné prvky jsou nepravidelně uspořádány do krátkých eliptických nebo válcovitých úseků (spory?), které se snadno rozčleůují. Koncové spirálovité části jsou méně nápadně uspořádány do segmentů. Velikost segmentů je obvykle 0,8 až 1,7 /zm x 0,3 až 0,5 μΐη, v průběhu 0,4 μΐη x 1,2 μΐη.

Diagnóza

Morfologické znaky kultury č. BM123 je obtížné sledovat a interpretovat v důsledku chabého vývinu vzdušného· mycelina na většině médií. V důsledku toho je nutno věnovat značnou pozornost při určení rodové příbuznosti organismu chemické analýze. Na základě systému navrženého Lechevalierem a dalšími obsahuje kultura BM123 v celé hmotě buněk kyselinu mesodiaminopimelovoiu a na základě analýzy cukrů je zřejmé, že je přítomna arabinóza a galaktóza. Kultura náleží proto к organismům s typem buněčné stěny IV. Porovnáními diagramu plynové chromatografie kultury č. BM123 s diagramem kultury Nocardia asteroiides ATCC 3308 se zjistí jejich napadá příbuznost. Jiné vlastnosti kultury č. BM123, které jsou v souladu s chováním Nocardia je zlomkovitý vzdušný nárůst na některých médiích a úplná nepřítomnost vzdušného nárůstů na většině médií. Vzhledem к tomu, že není к dispozici vhodné kritérium pro- charakterizaci Nocardia na úrovni druhu, nebyl činěn pokus provést toto stanovení. Kultura BM123 bude tedy považována až do té doby, než bude diagnóza dosažitelná, za neurčený druh Nocardia.

ω o

(N 00 £

Б 'G ri

Sl ó CL s o К Ф

G £ ri _w G H

I «g ri φ 3 pí

Φ U G 3 s

h

CL s

CL с/э с/э >

CO 'Ctí ri >□ >S a 3 g

C/3 •1“^ s

Š g

o 'Φ '£ ri >Φ 'G ri

N

Φ Φ 3

Φ >N ©

'ti £ ri s Λ

N Φ o > Φ ri >ri G CL3 £ Q ri £ O CL

CD co .2

Ф Ф

I

X(U § я o ri £ O

Φ

I 8 >ri O >

>ф _ 44 CL G ctí

Ž ri

C/3

I

N

Φ Φ 3

Φ ω

ri > O CL 'G ri Ф

Ф

N

Ф r—<

+3 ^Š r—< >N §

J a

§ ?

> G £

ф >ф > с/з o ω •ř^ Φ či ti O Ά ri 'G Ě> §

Λ Φ ri o C/3 к 'G > ri G 3 N Φ 3 'G χυ

I ri >N φ

'G СО £

Η ω

G 3 ϋ ti O СЛ C/3 ·/—n ri φ

či o co •I—» Ф ri 'G £ I •s

Ф >N

G 'G > ri G 3

N Φ 3 s

o >N

G ri § ~ .21 cn Ч--У .mi “ Ф ti

Φ ti

Charakteristické vlastnosti kultury kmene Nocardia sp. NRRL 5646 o 3 ~G .2 φ o £ 'Φ £ £ N >

CL ω 'Φ £

G >Φ .2 ί-4

Φ ω

I с

>φ У > £ ω ri či e

•<4 £

a 'Φ ri >C/3 ri

N £ 'Φ ri >5/3 > 'Φ £ G >Φ 3 'Φ ri ri

G a φ ri '1

G >ω «яЧ г—Ч φ ω

S 'φ £ £,£ 8 g .2 φ

ω 'Φ >ф £ с/э 'Φ a >с/з ri

N £ 'Φ £ G >Φ 3 '03 ri ri ctí cl Φ ri φ ri ϋ •r4 r-4

Φ ω £ ! ⁸ΐ'φ !

’ 3 £Ό Ύ N 1 >

s ri Έ5 o’ k

I φ CJ ^φ>CC3 ti 3

N >

I >φ a

•rH ·—'

Φ _ Q £

Š

Φ ri ri φ ri £ Φ )ri 44 СЛ 'cd xa G ω

s

Φ >?4 +-» (Λ

Φ >Í4 44

C/5 >p-i ri φ >ri л <G —I ω

cř ri cizí Cli a H 3 'Φ s

Φ

X

G ΰ X Φ 'c?

>CJ i £ 3 ω

ri G bO <C (4 G £ °ri ri Φ ri ω Φ ri H

G £ °ri £ Φ Д! O •rH Д

G φ ri ад

G

CL c§ (Л ri

Φ Q

8' '0) \Q3 ti >ccn ti Ό

Ň >

ti >ω

Ό

N >

'Φ >φ > W

О' 'Ф ti >03 ti Ό

N >

í г—4 w tí

8 *гЧ «яЧ

Έ) φ ω ω £ £ а o ri >ω ri з N >

'Φ >§5 ³

N £ '£ s 3

T5 Ctí Ф ČL>ri ri φ

Ó g ri a

£' Φ

C CL

G N O ω

G ..

ад ад S < < 3 a φ 3 G S ri CL

Ě '£ ω

G ri

C/3 ri Ctí <

'£ ω φ ё ω

Ρ ti bO ti s ti S S ^M ω ,χλ

G &8 У

G ri с/э ri

G

S' ω •rH s ад ti ti G C/3

Й ад < g я o 3 ri o a ri o ri

C/3 g o ri G ад ctí > € •F4 3 % φ 'П а*³

S> х ад - _ < 3 CQ bO Q

G >

oti

Φ

PQ

G 3 >o O £

N Ό in 44 X a ri g

CL

R

10

Tabulka III

Mlkromorrologie kmene Nocardia sp. NRRL5646

Médium Vzdušné mycelium a/nebo struktury typu spor agar s kvas- Vzdušné mycelium roste · ze ničhým substrátové-ho · mycelia ve' farextraktem mé mírně rozvětvených středně dlouhých ohebných prvků, které obvykle končí v prodloužených jednoduchých spirálách. Ohebné prvky jsou ' nepravidelně ' uspořádány dokrátkých úseků (spory?), které se snadno rozčleňují. Koncové spirálové části jsou méně nápadně uspořádány do segmentů. Velikost segmentů je obvykle 0,8 až 1,7 μΐη x x 0,3 ' až 0,5 · jtm, v průměru 0,4 ^m. x 1,2 μτη.

Tabulka IV

Různé· fyziologické reakce kmene Nocardia sp. NRRL 5646

Médium Inkubační Intenzita růstu Fyziologická reakce doba

želatina	7 dní
želatina	14 dní
bujón s organickými dusič-	7 dní
nany
bujón s organickými	14 · dní
dusičnany
agar· s peptonem a železem	24 až 48 hodin
mléko s· lakmusem	7 dní
kvasničný extrakt se (4, 7,	7· dní
10 a 11 ·% o chloridu soddéhe

Tabulka V

Využití zdroje· uhlíku kmenem- No-cařdia sp. NRRL 5646

Iniklu-báce·: 10 dnů Teplota 32 °C

Zdroj uhlíku využití*) adonit0

1-arabinóza0 glycerin3 d-fruktůza1 i-inosit·2 laktóza0 d-mannit0 salicin2 d-miallbióza0 d-raffinóza0 rhamnóza0 maltóza- 1 sacharóza 0 d-trehalóza· 3 d-xylůza· 0 déxtróza· 3 negativní kontrolní pokus 0 nízká nedochází ke ztekucování dobrá nedochází ke ztekucování dob-rá dusičnany se redukují na¹ dusitany dobrá dusičnany se redukují na· dusitany dobrá neredukují se melaninové pigmenty dobrá nedochází k peptonizaci nebo tvorbě sraženiny střední tolerance vůči chloridu sodnému 5 4 °/o ale § . 7 %

*) 3 dobré využití střední využití slabé využití žádné využití

Tabulka VI

Chemické složení kmene Nocardia sp. NRRL 5646

Typ buněčné· stěny Hlavní složky

Typ IV mesoi-DAP, arabinózá, galaktóza

Produkce ΒΜ123-3 a trans-BM123 není omezena na tento konkrétní organismus nebo na organismy, které plně odpovídají shora uvedeným charakteristikám růstu a vzhledu pod mikroskopem. . Uvedené charakteristické vlastnosti jsou · uvedeny pouze pro ilustraci. Ve skutečnosti se může použít rnutant získaný z tohoto organismu různými prostředky, jako vystavením rentgenovému záření, UV-zárení,· dusíkatému yperitu, aktinofágům apod. Životaschopná kultura takové typické mútanty je uložena v Culture Collection Laboratory, Northern

Utilization Research and Development Division, United States Department of Agriculture, Peorie, Illinois, a bya zařazena do stálé sbírky pod číslem NRRL 8050. Ačkoli vlastntofsti kultury tohoto organismu, fyziologické a miorfologické vlastnosti kmene NRRL 8050 jsou v podstatě stejné, jako u kmene NRRL 5646, produkuje při aerobním kvašéní kmen NRRL 8050 zvýšené množství látky BM123. Kmen NRRL 8050 se liší od mateřského kmene NRRL 5646 rovněž těmito vlastnostmi:

a) redukce dusičnanů na dusitany je pomalejší,

b) na Bennettově agaru a na agaru s kvasničným extraktem poskytuje myceliální pigment světle hnědého narůžovělého· odstínu (rosewood tan).

Nové antibakteriálně účinné látky podle vynálezu jsou obecně pevné krystalické látky s poměrně nízkou rozpustností v nepolárních rozpouštědlech, jato v diethyletheru a n-hexanu, ale se značnou rozpustností v rozpouštědlech, jako je voda a nižší alkanoly. Antibiotika trans-BM123y₁ a trans-BM123/₂ jsou strukturními isomery a lze je znázornit následujícími strukturními vzorci:

I

trans-BM123n

О

trans-BM123/2

Redukční organylace trans-BM123/-látky, tríuis-BM123yi-látky, trans-BM123y₂-látky, cis-BM123y-látky, cis-BM123y1-látky nebo cis-BM123yrlátky aldehydy probíhá nasperinadinovém postranním· řetězci za vzniku mono-, di- a tri-substituovaných derivátů vzorců

O

C H~QÍC -NH- chj^nh^ch^-nh-ch^ o

„ / 4- ^hcH's^wh-^íchAU_ch__Ri

o

ct

o

Cf-toCH-C-NHy^CH^^R1 ^(CiV3l^ÍCrí2^\cH_rR ^СНГ kde

R a R| mají shora uvedený význam.

Užitečnost cis-isornerU shora uvedeným způsobem substituovaných dor^:toto П’. «η -BM123 je demonstrována na jejích s-m o niosti potlačovat systemické letháhU' infekce u myší. Tyto ' nové látky vykazují in vivo. vysoký antibakteriální účinek u myší proti Escherichia coli US 3 s i 1 . oři po <ltá^^^.í jedné subkutánní dávky skupinám myší o hmotnosti asi 20 g (Carwor i: i . 1mrnr CF-—1 . j. Infikace se provádí intrapentcon'toné lethál·· ní dávkou těchto bakterii pětibodmové TSP krevní kultury zředěné tryplikázuvým bujónem se sójou TSP na koncentraci 10' у

Postup fermentace upravený pro· produtkci především látky BM1.23 a

Kultivace Nocardia sp. NRR l F05S s:: rnůže provádět na velkém no čtu. kapala : ob kultivačních mód s í. Média oč . i::: ::S o:o s sodukci antibiotik obsahují s. s i mi i o vatotoý zdroj uhlíku, jako škrob, cmer. melasu, glycerín atd., astanllovatelný zdroj dusíku, jako je bílkovina, hydrolyzovaná bílkovina, polypeptidy, aminokyseliny, kukuřičný extrakt, atd., anorganické .aníonty a kati. ony. jako je draslík, hořčík, vápník, amomum, sulfát, uhličitan, fosforečná o, chlorid. a^Ld. Stopové prvky, jako bor, molybden, měď atd. se dodávají ve formo nečistot spolu s ostatními složkami média. Provzdušňování v nádržích a lahvích se provádí tak. že se do kvasného prostředí nebo na jeho povrch vhání sterilní vzduch.. Míchání v nádržích se provádí pomocí mechanického rotačního. míchadla. Podle potřeby se může přidávat ' protípěnový prostředek jako Hodag (R) FD 82. .

Příprava inokula pro· BM1.233 a trans-BM123

Primární inokulum Nocardia sp. NRRL 8050 v třepací baňce se připraví inokulací 100 ml sterilního: kapalného' média v 500 ml baňkách pomocí steru nebo· promývacíbo louhu obsahujícího spory, získaného . ze šikmého agaru kultury. Obvykle se používá tohoto média:

bakto-trypton 5g kvasničný extrakt 5g extrakt z hovězího masa 3g glukózz ' .10 g voda do 1000 ml

Banky se inkubují při teplotě 25 až 29 stupňů Celsia, přednostně 28 °C a intenzívně se promíchávají 30 až 48 hodin . na rotační třepačce. Pak se inokula převedou do sterilních tub pro. uchovávání kultur se šroubovým uzávěrem a skladují se při teplotě pod —18 °C. Této- zásoby . vegetativního, i nok ala se používá místo. steru ze šikmého agaru pro inokulací dalších třepacích baněk určených pro přípravu tohoto inokula prvního stupně,

Takto získaného· inokula prvního stupně se používá pro inokulaci 12 litrů dávek stejného média ve 20!Ьго^;^^^(зЬ skleněných fermentačních nádobách.

Médium s inokulem se provzdušňuje. sterilním· vzduchem a v růstu se pokračuje až 48 hodin.

litrů dávek inokula druhého· stupně se používá pro očkování · nádržových fermentačních nádob obsahujících . 300 litrů následujícího sterilního· kapalného média.

masový extrakt 115g síran amonný 3g střední fosforečnan draselný 3g uhličitan vápenatý 1g síran horečnatý (heptahydrát)1,5 g glukóza 10g voda do 1000 ml

Glukóza se sterilizuje odděleně. Uvedeným způsobem se získá třetí a konečné stadium· inokula. Kultivace se provádí tak, že se půdou v nádobě prohání sterilní vzduch rychlostí 0,4 až 0,8 litrů na litr půdy za minutu a fermentační směs se míchá rotačním míchadlem pracujícím· při 150 až 300 ot./min. Teplota . se udržuje na 25 až 29 °C, obvykle na 28 °C. Kultivace se provádí po> dobu 48 až 72 hodin a pak se inokula použije pro· očkování nádržové fermentační nádoby o· obsahu 3000 litrů.

Fermentace v nádržích pro výrobu látky BM123í/3 · a látky trans-BM123y

Jako živné půdy se pro výrobu BM123/L

-látky a transBM 123y--átky přednostně používá následujícího média
masový extrakt	30 g
síran· aimonný	6g
střední fosforečnan draselný	6g
uhličitan vápenatý	2g
síran horečnatý heptahydrát	3g
glukóza	20 g
voda do	1000 ml
Glukóza· se sterilizuje odděleně.

Každá nádrž se inokuluje 5 až 10 % inokula třetíto stupně získaného · shora uvedeným způsobem. Fermentační směs· se udržuje· při teplotě 25 až 28 °C, obvykle 26 °C. Směs se provzdušňuje sterilním vzduchem rychlostí 0,3 až 0,5 litrů sterilního vzduchu na litr směsi za minutu a míchá se rotačním míchadlem, · pracujícím při 70 až 100 ot./min. Fermentace se provádí po dobu 65 · až 90· hodin a pak se výsledný produkt zpracuje.

Následující specifické příklady slouží k bližšímu objasnění vynálezu, v . žádném· směru však nevymezují rozsah vynálezu.

Produkt „Hodag FD—82” používaný jako · pomocná látka je podle · udání výrobce silikonové protipěnové činidlo. Výrobek „Agar · pablum”, rovněž používaný v příkladech je vysokokapacitní katexová a anexová pryskyřice, popřípadě napuštěná v papíru.

Příklad 1

Příprava inokula pro· produkci ΒΜ123$ a trans-BM123

Podle následujícího receptu se připraví typické médium pro kultivaci inokula prvního· a druhého stupně lakto-trypton 5g kvasničný extrakt 5g extrakt z hovězího· masa 5g glukóza 10g voda do 1000 ml

Dvě 500 ml baňky, z nichž každá obsahuje 100 ml shora uvedeného sterilního prostředí se inokulují vždy 5 ml zmrazeného vegetativního inokula Nocardia sp. NRRL 8050. Baňky se umístí na rotační třepačku a intenzívně se míchají 48 hodin při 28 °G. Výsledné inokulum v baňce se převede do 231itrové skleněné fermentační nádoby obsahující 12 litrů shora uvedeného sterilního· média. Směs se provzdušňuje sterilním· vzduchem a růst se provádí po· dobu asi 48 hodin a pak se obsahu nádoby použije pro· inokulaci 4541iirové fermentuční nádrže obsahující 300 litrů následujícího* sterilního kapalného média masový extrakt 115g síran· amonný 3g střední fosforečnan draselný 3g uhličitan vápenatý 1g síran horečnatý (heptahydrát)1,5 g glukóza 10g voda do· 1000ml

Do· média pro· přípravu inokula třetího . stupně se vhání sterilní vzduch rychlostí 0,4 litru vzduchu na litr směsi za minutu. Míchání se provádí rotačním· míchadlem pracujícím při 240 ot./min. Směs se udržuje při 28 °C a pak se jí použije po· přídavku Hodag · (R) FD 82 pro inookulaci 300 litrů živné půdy.

Příklad 2

Fermentace za použití Nocardia sp. NRRL 8050 a média favorizujícího produkci BM123 a trans-BM123y

Fermentační · médium se připraví podle

následujícího receptu
masový extrakt	30g
síran amonný	6g
střední fosforečnan draselný	6g
uhličitan vápenatý	2g
síran horečnatý heptahydrát	3g
glukóza	20g
voda do*	1000 ml
Glukóza se sterilizuje odděleně.

Fermentační médium · se sterilizuje při

120 °C párou o tlaku 138 kPa po dobu 60 minut. Hodnota pH média po* sterilizaci je

6,9: 3000 litrů sterilního média ve 4000 litrové fermentační nádrži se inokuluje 300 litry inokula popsaného v příkladě 1 afér209491 mentace se provádí za použití protipěno·vého činidla Hodag (R) FD 82. Vzduch se dodává rychlostí 0,35 litru sterilního· vzduchu na litr směsi za minutu. Směs se míchá rotačním míchadlem pracujícím při 70 až 72 ot./min. Po 67 hodinách fermentace se fermentační směs zpracuje.

Příklad 3

Izolace BM123.jMlítky a transBM123y-4átky

Hodnota pH 3000 litrů fermentační směsi získané způsobem popsaným v příkladě 2 o pH 4,3 se nastaví na pil 7,0 pomocí hydroxidu sodného a pak se směs přefiltruje za použití 5% křemollny, jako pomocného¹ filtračního· prostředku. Filtrační koláč se promyje asi 100 litry vody a . pak se zlikviduje. Směs filtrátu a prcmývacího louhu se čerpá zdola nahoru třemi paralelními nerezovými kolonami o- rozměrech 210 x 1220 mm, z nichž každá obsahuje .'i 5 litrů ionexu CM Sephadex (R) C—25 v sodíkové formě (zesilovaný dextran-epichlorhydrinový katex v gelové formě. Sloupce katexu se po adsorbci promyjí celkem asi 390 litry vody a pak se eluují 200 litry 1% vodného· roztoku chloridu sodného a pak 560 litry 5% vodného roztoku chloridu sodného. Eluát tvořený 5% vodným roztokem· chloridu sodného· se vyčeří filtrací přes křemelinu a vyčeřený filtrát se nechá projít skleněnou kolonou · o rozměrech 229 x · 1524 mm obsahující 25 litru granulovaného produktu Darco· (R) C—-69 [o zrnění 20 až 40 mesh), což je granulované aktivní uhlí. Sloupec se promyje 12 litry vody a pak se vyvíjí 120 litrů 15% vodného methanolu a pak 340 litry 50% vodného methanolu a nakonec 120 litry 50% vodného acetonu. Eluát tvořený 15% vodným· methanolem se za vakua /koncentruje na asi 7 litrů vodné fáze a pH vodné fáze se ze 4,5 nastaví na 6,0 pomocí io-nexu Amberlite (Rj IR—45 v hyroxylové formě (slabě zásaditá anexová pryskyřice polystyren-polyaminového· typu.]. Pryskyřice se odfiltruje a filtrát se zkoncentruje za vakua na asi 1 litr a pak se lyofilizuje, čímž se získá 38 g látky sestávající především z látky BM123 spolu s malým množstvím látky trans-BM123y (převážně trans-BM12%₂’ -látky). Eluát tvořený 50% vodným methanolem se z hodnoty 4,65 zalkalizuje icnexovolu pryskyřicí Amberlite IR—45 v hydroxylové formě na hodnotu 6,0. Pryskyřice se odfiltruje a filtrát se za vakua zkoncentruje na asi. 6,3 litru a tento koncentrát ee lyofilizuje. Získá se 213 g laiky sestávající převážně z látky trans · BMi.23y· Eluát tvořený 50% vodnými aceton · m se · hto.noty 4,0 zalkalizuje pomocí mnsmevo pryskyřice Amberlite (Rj IR—45 v hydroxyicvém cyklu na hodnotu 6,0. Pryskyřice se odfiltruje a filtrát se za vakua zkoncentruje na asi 1,5 litru. Koncentrát se pak lyo23 filizuje, čímž se získá 56 g nečisté látky trans-BM123·

Příklad 4

Další čištění trans-BM123y-látky

Suspenze CM Sephadexu (Rj C—25 v amonném cyklu (N14%) ve 2% vodném roztoku chloridu amonného se nalije do skleněné kolony o průměru 2,6 cm, až je sloupec pryskyřice v koloně asi 62 cm vysoký. Přebytek 2% vodného rozteku chloridu a- . me.nného se odpustí. Vzorek trans-BM123y-látky o hmotnosti 5 g, vyrobený způsobem popsaným v příkladě · 3 se rozpustí ' v asi 10 ml 2% vodného chloridu amonného¹ a roztek se nanese na sloupec. Sloupec · se eluuje vodným chloridem amonným· o koncentrací jednak 2 a jednak 4 % [vždy 6 litrů), přičemž · se používá koncentračního gradientu. Každých 15 minut se automaticky odebírají 75 ml frakce. Antibiotikum trans-BM123y se lokalizuje v jednotlivých frakcích kontrolou eluátu vytékajícího z kokony pomocí ultrafíalcv/ého světla a biomlitografií · pomocí navlhčených papírových kotoučů na velkých figurových deskách inokulovaných kmenem Klebslella pneumoniae

AD. Většina látky trans~BM123y se lokalizuje mezi frakcemi 71 až 167 včetně.

130 ml granulovaného produktu Darco (R) G-—-60 o zrnění 20 až 40 mesh · se suspenduje ve vodě, suspenze se převede· do skleněné koleny, nechá se usadit a přebytek vody so nechá odtéci. Frakce 84 až ' 96 včetně, ze shora uvedené chromatografie na CM Sephadexu, se spojí a. nechají projít sloupcem· granulovaného· uhlí. Sloupec s- absorbovanou látkou se promyje 600 ml vody a vyvíjení se provádí 1 litrem·· 50% vodného acetonu. Eluáty, z nichž oba obsahují trans-BM123y-Iátku, se zkoncentrují za vakua na vodné fázo a koncentráty se lyofilízují. Získá se celkem 886 mg trans-BM123y4átky ve formě hydrochloridu. Mikrounalytický vzorek se získá · ták, že se tato látka podrobí shora uvedenému čištění ještě jednou.

Antibiotikum trans-DMlPSy nemá určitý bod tání, ale postupný rozklad začíná v blízkosti 200 °C. Mikroánalýzou vzorku ekvilibrovaného 24 hodin při 22,2 °C v atmosféře o relativní vlhkosti 23 % se· zjistí toto* složení: C: 39,44, H: 6,10, N: 16,19 %, Cl [iontový] 11,54 %, ztráta sušením 8,19 proč. Ve vodě poskytuje trans-BM123y-látka v U. V. absorpčním spektru maximum při 286 nm a E 0 = 250.

Poloha tohoto maxima se nemění s hodnotou pH. Trans-BM123y--á.tka má úhel optické otáčivosti [α]τ?⁵° = · 1-71° (c = 0,97 ve vodě) a vykazuje clrn·akíeristikké absorbce v infra' ·rvané ·.>>' ?í?íí spektra při následujících· v i n a'яоск: 77O, 830· 870, 930,

980, 1035. 1105, 1175 · 1'25 _; 1 300, 1340, 1370,

2G9491

1460, 1510, 1555, 1605, 1660, 1740, 2950 а 3350 cm¹.

Příklad 5

Izolace trans-BM123y_rlátky

Suspenze CM Sephadexu (R) G—25 v sodíkové formě (Na⁴') ve 2% vodném roztoku chloridu sodného se nalije do skleněné kolony 0' průměru 2,6 cm, až je sloupec pryskyřice v koloně 70 cm vysoký. Přebytek 2% vodného roztoku chloridu sodného se odpustí. Vzorek trans-BM123/.|-látky a malého množství trans-BM123y₂-látky a jiných nečistot o hmotnosti 4,11 g, vyrobený způsobem popsaným v příkladě 3 se rozpustí v asi 10 ml 2% vodného roztoku chloridu sodného· a nanese na sloupec. Sloupec se ehru.je vodným chloridem sodným o koncentraci jednak 2 a jednak 4 % (vždy 4 litry), přičemž se používá koncentračního- gradientu. Každých 15 minut se automaticky odebírají 75 ml frakce. Antibiotikum trans-BM123y se lokalizuje v jednotlivých frakcích kontrolou eluátu vytékajícího- z kolony pomocí ultrafialového světla a bioautografií pomocí navlhčených papírových kotoučů na velkých agarových deskách inokulovaných kmenem Klebsíella pneumoniae AD. Většina látky trans-BM123y se lokalizuje mezi frakcemi 64 až 90 včet- a. ně. První frakce (64 až 80) obsahují směs JU trans-BM123/j a trans-BM123y₂-látky zatímco pozdější frakce (81 až 90) obsahují v podstatě čistou trans-BM123y_rlátku.

100 ml granulovaného produktu Darco (R) G—60 o zrnění 20 až 40 mesh se suspenduje ve vodě, suspenze se převede do skleněné kolony, nechá se usadit a přebytek vody se nechá odtéci. Frakce 81 až 90 včetně, ze shora uvedené chromatografie na CM Sephadexu, se spojí, a nechají projít sloupcem granulovaného uhlí. Sloupec s absorbovanou látkou se promyje 500 ml vody a vyvíjí 500 ml 10% vodného- methanolu a pak 1 litrem 50% vodného methanolu. Hodnota pH eluátu v 50% vodném methanoilu, který obsahuje většinu trans-BM123yi-látky se upraví z 5,9 na 6 pomocí ionexové pryskyřice Amberlite (R) IR—45 v hydroxylovérn cyklu. Pryskyřice se odfiltruje a filtrát se za vakua zkoncentruje na vodnou fází, která se Iyofiiizuje. Získá se 294 mg bílé amorfní tran.s-BM123/i-látky ve formě hydrochloridu.

Antibiotikum trans-BM123y_L nemá ostrou teplotu tání, ale postupný rozklad začíná v blízkosti 200 °C. Mikroanalýzcu vzorku ekvilibrovaného v atmosféře o určité vlhkosti se zjistí toto, složení: C: 37.84 %, H: 5,73 %, N: 15,58 %, Cl (iontový): 10,01 %, ztráta sušením 10,45 %. V methanolu poskytuje trans-RM123/i-látka U. V. absorpční inaxiniíum. při 286 nm s Ε I ₍225.

Poloha maxima se nemění v hodnotu pH.

Trans-BM123y₁-látka má úhel optické otá22 čivosti +55° (c = 0,803, ve vodě) a vykazuje charakteristickou absorbci v infračervené oblasti spektra při následujících vlnočtech: 770, 830, 870, 930, 980, 1045, 1080, 1110, 1125, 1175, 1225, 1305, 1345, 1380, 1465, 1515, 1560, 1605, 1660, 1730, 2950 a 3350 cm-¹.

Příklad G

Izolace trans-BM123y₂-látky

25gramový vzorek obsahující především • tTans-BM123/₂- a BM123./3-látku připravený způsobem popsaným v příkladě 3, se rozpustí v asi 120 ml 2% vodného chloridu sodného a nanese na sloupec obsahující 1800 ml CM Sephadexu (R) C—25 v sodíkové formě ve 2% vodném chloridu sodném. Sloupec se eluuje gradientem mezi 20 litry 2!% a 20 litry 4% vodného chloridu sodného'. Prvních 12 litrů eluátu se jímá do; velké láhve a pak zlikviduje. Pak se každých 40 minut automaticky zachytí frakce asi o objemu 800 ml. Antibiotikum trans-ВМ123/ se lokalizuje sledováním frakcí eluátu v ultrafialovém světle. Většina trans-BM123/-látky se lokalizuje mezi frakcemi 7 až 18 včetně. Počáteční frakce (7 až 15) obsahují v podstatě čistou trans-BM123y₂-látku a pozdější frakce (16 až 18) obsahují směs trans-BM123y₁ a trans-BM123/_rlátky.

600 ml granulovaného produktu Darco (R) G—60 o zrnění 20 až 40 mesh se suspenduje ve vodě, suspenze se převede do skleněné kolony, nechá se usadit a přebytek vody se nechá odtéci. Frakce 7 až 15 včetně, ze shora uvedené chromatografie na CM Sephadexu se spojí, a nechají pro-jít sloupcem granulovaného uhlí. Sloupec s absorbovanou látkou se promyje 3 litry vody a vyvíjí se 3 litry 10% vodného methanolu a 6 litry 50% vodného methanolu. Hodnota pH 10% vodně-methanolického eluátu se upraví z 5,8 na 6,0 pomocí ionexové pryskyřice Amberlite (R) IR—45 v hydroxylové formě. Pryskyřice se odfiltruje a filtrát se za vakua zkoncentruje na vodnou fázi, která se Iyofiiizuje. Získá se 595 mg bílé amorfní trans-BM123y₂-látky ve formě hydrochloridu. Hodnota pH 50'% vodně-methanoJického eluátu se nastaví z pH 4,6 na pH 6,1 pomocí ionexové pryskyřice Amberlite (R) IR—45 v hydroxylové formě. Pryskyřice se odfiltruje a filtrát se za vakua zkoncentruje na vodnou fázi, která se Iyofiiizuje. Získá se 3,645 g poněkud méně čisté bílé amorfní trans-BM123y₂-látky ve formě hydrochloridu.

Antibiotikum trans-BM123y₂ nemá ostrou teplotu tání, ale postupný rozklad začíná v blízkosti teploty 200 °C. Mikroanalýza vzorku ekvilibrovaného 24 hodin při 22,2 stupních Celsia v atmosféře o 60% relativní vlhkosti poskytuie tyto- výsledky: C:

36,14 %, H: 5,67 %, Ň: 15,1 %, Cl (ion.to209491

24 vý) 11,11 %, ztráta sušením 10,87 %. V miethanolu poskytuje trans-BM123/₂-látka U. V. Absorpční maximum při 286 nim s Ε ί * = 220.

Poloha tohoto maxima se nemění s pH. TranS’BM123x₂-látka má úhel optické otáčivosti 4-60° (c — 0,51 ve vodě) a vykazuje charakteristické absorpce v infračervené oblasti spektra při následujících vlnočtech: 770, 830, 870, 950, 980, 1035, 1110, 1175, 1225, 1285, 1345, 1380, 1470, 1515, 1560, 1605, 1660, 1755, 2950 a 3350 cm’¹.

Příklad 7

Papírová rozdělovači chromatografie a chromatografie v tenké vrstvě látek ΒΜ123β a trans-BM123/

Antibiotika BM123 lze rozlišit papírovou chromatografií. К tomuto účelu se na proužky papíru Whatman č. 1 nanesou skvrny vodného nebo miethanolického· roztoku látek a ekvilibrují se 1 až 2 hodiny v přítomnosti jak horní, tak dolní fáze. Proužky se vyvíjejí přes noc spodní (organickou] fází získanou smícháním 90 °/o fenol : im-kresol : kyselina octová : pyridin : voda (objemově 100 : 25 : 4 : 4 : 75]. Pa vyvíjení se proužky vyjmou z chromatografieké komory, 1 až 2 hodiny se suší na vzduchu, promyjí se etherem·, aby se odstranil zbylý fenol a bioautografují na velkých agarových deskách naočkovaných Klebsiella pneurrioniae kmenem AD. Reprezentativní hodnoty Rf jsou uvedeny v následující tabulce VIII:

Tabulka VIII

Složka Rf trans-BM123/-láťka 0,85

BM123í/3-látka 0,50, 0,70 β složka se za použití tohoto systému chová jako směs 2 antibiotik. BM123>/3-látka se skládá z hlavního antibiotika (Rf = = 0,50) označeného ВМ123Д a z v menší míře zastoupeného· antibiotika (Rf = 0,70] oiznačenéhoí ΒΜ123β₂.

BM123-antibiotíka lze rovněž rozlišit chromatografií v tenké vrstvě. К tomuto účelu se nanesou na desky předem povlečené celulózy F (R) (o tloušťce 0,10 mm), tj. celulóza ve formě tenkých vrstev, skvrny vodného· roztoku látky, která má být chroimatografována (asi 20 až 40 na skvrnu). Desky se vyvíjejí přes noc rozpouštědlem získaným smícháním. 1-butanolu, vody, pyridinu a kyseliny octové (objemově 15 : 12 : 10 : 1). Po vyvíjení se desky odstraní z chromatografické komory a nechají na vzduchu během; asi 1 hodiny uschnout. Antibiotika se detegují za použití buď standardního ninhydrinového, nebo Sekaguchíbo reakčního činidla ve formě spraye. Reprezentativní Rf hodnoty jsou uvedeny v tabulce IX:

T a b u 1 к а I X

Složka Rf

BM123/-látka 0,17,0,23

BM123jS-látka 0,08 0,14

Jak BM123|/S, tak trans-BM123/-látka se za použití tohoto systému chová jako směs dvou složek. BM123/Máťka se skládá z hlavní složky (Rf = 0,08) označená jako BM123ft-složka a z vedlejší složky (Rf — = 0,14) označené jako BM123/3'2. Méně polární složka trans-BM123/-látky (Rf — 0,23) je označována jako trans-BM123/₁-látka a polárnější složka (Rf = 0,17) jako trans-BM123/₂-láťka.

Příklad 8

Obecný postup redukční alkylace antibiotika trans-BM123/ nebo antibiotika cis-ВМ123/

К míchanému roztoku 100 mg antibiotika trans-BM123y nebo· antibiotika cis-BM123y ve 20 mil methanolu se přidá 5 mil· (nebo 5 g) vhodného aldehydu a 100 mg natriunlkyanoborhydridu. Hodnota pH výsledného roztoku se udržuje na 7,0 pomocí miethanolického chlorovodíku po dobu 3 až 24 hodin. Postup reakce se sleduje chromatografií v tenké vrstvě podle mizení výchozího antibiotika. Pak se reakční směs přefiltruje a filtrát se odpaří do sucha. Zbytek se trituruje s 3 ml methanolu a směs se přefiltruje. Filtrát se zředí 50 ml acetonu a sraženina, která vznikne se odfiltruje a vysuší. Methanol, jako rozpouštědlo se může nahradit 20 ml vody, pokud je výchozí aldehyd rozpustný ve vodě.

Příklad 9

Příprava methyl-trans-BM123/-látky

К roztoku 1,0 g trans-BM123/-látky a 2,5 ml 37% vodného formaldehydového· roztoku v 50 ml vody se po částech přidá 400 mg natriumkyanborhydridu. Během přidávání se pH reakční směsi udržuje 1N kyselinou chlorovodíkovou na 7,0. Reakční směs se míchá dalších 10 minut při teplotě místnosti a pak se za vakua odpaří do sucha. Zbytek se rozetře s 20 ml methanolu, přefiltruje a filtrát se zředí 250 hil acetonu. Produkt, který sé vysráží se odfiltruje a vysuší. Získá se 667 mg produktu.

Příklad 10

Příprava j3-fenylethyl-trans-BM123/-látky

К roztoku 200 mg trans-BM123/-látky v ²⁹ ml Vody a 25 ml acetonitrilu se přidá roztok 2 ml fenylacetaldehydu ve 4 ml ethanolu. Ke směsi se přidá 103 mg natriumkyanborhydridu. Reakční směs se míchá 30 minut při teplotě místnosti a během této doby se pH směsi udržuje na 7,0 přidáváními 0,2 N kyseliny chlorovodíkové. Reakční směs se přefiltruje a filtrát se za vakua odpaří do sucha. Zbytek se rozetře se 2 ml methanolu a přefiltruje. Filtrát se zředí 100 ml acetonu a produkt, který se oddělí, se odfiltruje a vysuší. Výtěžek je 180 mg.

Příklad 11

Směs 50 mg trans-BM123/₁-látky, 5 g acetaldehydu a 60 mg natriumkyanborhydridu v 35 ml methanolu se míchá 40 minut při teplotě místhosti. Hodnota pH roztoku se udržuje na 7 přikapáváním methanolického chlorovodíku. Směs se o-dpaří do sucha za vakua. Zbytek se rozetře s 5 ml methanolu a výsledný roztok se zředí 50 ml acetonu. Výtěžek je 49 mg produktu.

Postupuje se shora uvedeným způsobem, ale místo acetaldehydu se použije jako výchozích látek karbonylových sloučenin uvedených v následující tabulce. Získají se odpovídající alkylované produkty.

Příprava ethyl-trans-BM123/₁-látky

Výchozí látka formaldehyd ⁺) propionaldehyd n-butyraldehyd isobutyraldehyd

Produkt methyl-trans-BM123y₁-látka n-propyl-trans-BM123yi-látka n-butyl-trans-BM123y₁-látka isobutyl-trans-BM123y_rlátka + ) Jako 37% vodný roztok, tj. jako rozpo uštědla se místo methanolu použije vody.

Příklad 12

Příprava ethyl-trans-BM123/₂-látky

Směs 41 mg trans-BM123/₂-láťky, 5 g acetaldehydu a 50 mg natriumkyanborhydridu v 35 ml methanolu se míchá při teplotě místnosti po dobu 40 minut. Hodnota pH roztoku se přikapáváním nasyceného methanolického' roztoku chlorovodíku udržuje na 7. Směs se přefiltruje a za vakua odpaří do sucha. Zbytek se rozetře s 5 ml methanolu a výsledný roztok se zředí 50 ml acetonu. Získá se 46 mg produktu.

Postupuje se shora uvedeným způsobem, ale místo! acetaldehydu se použije jako výchozích látek karbonylových sloučenin uvedených v následující tabulce. Získávají se odpovídající alkylované produkty.

Výchozí látka

Produkt formaldehyd ⁺) propioinaldehyd n-butyraldehyd isobutyraldehyd meťhyl-trans~BM123/₂-látka n-propyl-trans-BM123y₂-látka n-butyl-trans-BM123y₂-látka isobutyl-trans-BM123y₂-látka ⁴ ) Jako 37% vodný roztok, tj. jako rozpouštědla se místo methanolu použije vody.

Příklad 13

Příprava ethyl-cis-BM123y-látky

Roztok 200 mg ethyl-trans-BM123y-látky ve 200 ml vody se fotolyzuje světlem Hanovia v tříhrdlé baňce s kulatým dnem opatřené vodním pláštěm po dobu jedné hodiny. Během této doby se maximum ultrafialové absorpce reakčního roztoku přesune z vlnové délky 290 μΐη na 275 μΐη. Produkt se z reakční směsi získá lyofilizací. Výtěžek je 160 mg.

Tato fotolytická reakce se nejlépe sleduje tak, že se odebírají v různou dobu z reakční směsi alikvótní vzorky a měří se jejich ultrafialová absorpce. Reakce je skončena' poté, co se maximum absorpce přesune z 290 um na 275 ^m.

Postupuje se shora uvedeným způsobem, ale místoi ethyl-trans-BM123/-látky se použije alkylovaných derivátů uvedených v příkladech 11 a 12. Získá se látka methyl-CÍS-BM123/!, ethyl-cis-BM123/₁, n-propylCÍS-BM123/!, n-butyl-cis-BM123/_1} isobutyl-cis-BM123y₁, methyl-cis-BM123/₂, ethyl-CÍS-BM123/2, n;-propyl-cis-BM123y₂, butyl-cis-BM123/2 a lsobutyl-cis-BM123/2.

Příklad 14

Příprava cis-BM123/-látky

Roztok 200 mg trans-BM123y-látky ve 200 ml vody se fotolyzuje světlem Hanovia v tříhrdlé baňce s kulatým dnem opatřené vodním pláštěm po dobu 1/2 hodiny. Během této* doby se maximum ultrafialové absorbce reakčního roztoku přesune z vlnové délky 290 <umj na 275 μΐη.

Tato fotolytická reakce se nejlépe sleduje tak, že se odebírají v různou dobu z reakční směsi alikvótní vzorky a měří se jejich ultrafialová absorpce. Reakce je skončená poté, co se maximum absorpce přesune z. 290 μΐηί na 275 ^m. Produkt se z reakční směsi získá lyofilizací.

Shora uvedený postup se opakuje s tím rozdílem, že se roztok fotolyzuje 1,5 hodiny. Lyofilizací se získá 170 mg látky cis-ВМ123/.

Claims

Způsob přípravy substituovaných cis-|p-{2- [ (3-(/4-aminobutyl/amino)propy 1)karbamoyl]vinyl}| glykosidů, označovaných jako

VYNALEZU cis-BM123yi- nebo cis-B.M123y₂-sloučeniny obecného vzorce kde

R představuje v případě BMlŽS^-sloučeniny zbytek vzorce nebo v případě BM123y₂-sloučeniny zbytekvzorce každý ze symbolů

A a B představuje nezávisle jeden na druhém atom vodíku nebo· skupinu CH₂—RR a

R_t představuje vodík, alkylskupinu obsahující až 8 atomů uhlíku, fenylskupinu, benzylskupinu nebo alkenylskupinu obsahující 2 až 8 atomů uhlíku, vyznačený tím, že se výchozí amin obecného, vzorce nebo cis l.« ,

C H-CH - C~NH- (C Ha (C NH?

kde

R má shora uvedený význam, podrobí alkylaci, arylaci, aralkylaci nebo alkenylaci aldehydem·· obecného· vzorce

Rx—CHO kde

Rx má shora, uvedený význam, v přítomnosti redukčního činidla, v rozpouštědle inertním vůči reakčním složkám;, přičemž trans-isomer se před nebo po této reakci podrobí ozařování světlem o' vlnové délce 250 až 400 μηι tak dlouho, dokud se příslušný trans-išomer v podstatě nepřevede na odpovídající cis-isomer.