CS209490B2 - Method of preparation of substituted cis-(p-2/(3/4-aminobutyl/amino)propyl carbamoyl/vinyl glycosides - Google Patents

Description

(54) Způsob přípravy substituovaných cis|p{2-[ (3 - (/4-aminobutyl/amino)propyl) karbamoyl ] vinyl) | glykosidů

Vynález se týká způsobu přípravy nových antibakteriálně účinných cis-p?{2-[ (3-(/4-aminoibuty Uamino)propyl) karbamoyl ] vinyl) | glykosidů, označovaných jako substituované látky cis-BM123/t a cis-BM123y2, které· jsou blíže charakterizovány dále.

Účinky těchto nových antibakteriálních prostředků na specifické mikroorganismy a jejich chemické a fyzikální vlastnosti jsou odlišné od účinků a vlastností až dosud známých popsaných aniibakt-eriálních prostředků.

Nové antibakteriální prostředky připravené podle vynálezu jsou organickými bázemi a jsou tedy schopny tvořit adiční soli s kyselinami za použití různých organických a anorganických solitvorných reakčních činidel. Adiční soli s kyselinami, vznikající smícháním antibakteriálně účinné volné báze s až třemi ekvivalenty kyseliny, účelně v neutrálním rozpouštědle,, lze· tedy připravit za použití kyselin, jako· kyseliny sírové, fosforečné, chlorovodíkové, bromovodíkové, amidosulfonové, citrónové, · maleinové, fumarové, vinné, octové, benzové, glukonové, askorbové a podobných kyselin. Adiční soli antimikrobiálních činidel podle vynálezu s kyselinami jsou obvykle krystalické pevhé látky poměrně rozpustné ve· vodě, methanolu a ethanolu ale poměr209490 ně nerozpustné v nepolárních rozpouštědlech, , jako v diethyletheru, benzenu, toluenu apod. Pro účely vynálezu jsou antibakteriální volné báze ekvivalentní svým' netolickým adičním· solím s kyselinami. V následujícím textu se pod označením cis-BM123/-látka rozumí směs cis-BM123fr-látky a cis-BM^^-látky v jakémkoli poměru a pod označením trans-123y-látka se rozumí směs trans-BM123y_rlátky a trans-ΒΜ123/2 látky v jakékoli poměru.

Nové antibakteriální prostředky označené jako; substituované cis-BM^y! a cis-BM^Ta-látka se·· připravují substitucí ' (organy lácí) příslušných nesubstituovaných cis- nebo trans-isomerů, · přičemž když se vychází z trans-isomerů provede se· též fotochemická transformace trans-isomerů na· cislisoiimtry a to buď na nesubstituovaných prekursorech, nebo na substituovaných trans-isornerech konečných látek. Fotochemická transformace přednostně provádí tak, že se výchozí trans-isomer , rozpustí nebo> disperguje ve· vodě a pak se roztok ozařuje světlem. Koncentrace výchozího , trans-isomeru ve vodě není kritická.

Světlo, použité při fotolytickém postupu podle předloženého· vynálezu, nemá s výhodou vlnóvou délku nižší než asi 250 mn a přednostně má vlnovou délku v · rozmezí od

250 doi 400 nm. Ozařování světlem takové vlnové dél.ky se účelně dosahuje tím, že¹ se reakce provádí v nádobě vyrobené z takového! materiálu jako je křemen, který odfiltruje v podstatě všechno světlo· procházející nádobou, které má vlnovou délku pod 250 ním. Jako¹ zdroje světla se účelně polužívá vysokotlaké rtuťové lampy o příkonu asi 450 W.

Teplota, při které se fotolýza provádí, nemá rozhodující význam pro· dosažení dobrých výtěžků produktu, ale účelně se pracuje při· teplotě · v rozmezí 5 až 50 °C, například při asi 25 až 30 °C. Doba · potřebná pro· podstatnou konverzi substituovaného trans-isoimieru na odpovídající substituovaný cis-isomer přirozeně závisí na intenzitě světla a teplotě a nejlépe · se proto stanovuje v každém jednotlivém případě pokusem. Obvykle však postačuje doba v rozmezí o)d asi 20 minut do asi 2 hodin.

Po skončení ozařování · se může produkt získat standardními postupy. Tak se· například reakční směs může lyofilizovat nebo odpařit od sucha a zbytek se může rozpustit· v minimálním- množství rozpouštědla, jako ethanolu · nebo methanolu. Výsledný roztok se·, může zředit diethyletherem! nebo acetonem a vzniklý vysrážený produkt se může izolovat filtrací. Další čištění se může provádět standardními · metodami, jakoi krystalizací nebo chromatografií.

Předmětem vynálezu je způsob přípravy substituovaných cis-|p-{2-[ (3-(/4-aminobutyl/amino)prOpyl} karbamoyl ] vinyl} | glykoisidů, označovaných jako cis-BMlZS/] a cis- t

-BM123y2-sloučeniny, obecného· vzorce . 0 ci II

CH^SCH- C-NH(CCHfNH- (CH₂ )fNH~ CH

R

kde

R představuje v případě BMlžS/j-slouče niny skupinu vzorce

nebo v případě BM^y^-sloučeniny · zbytek vzorce

skupinu obsahující až 4 atomy uhlíku, fenylskupinu, benzylskupinu, β-fenylethylskuplnu, alkenylskuyinu obsahující 2 až 8 atomů uhlíku nebo hydrOxyalkylskupinu obsahující až 4 atomy uhlíku nebo^;

R2 představuje alky^-kupinu o-bsalfrující až 3 atomy uhlíku,

R3 představuje alkylskuyinu obsahující až 8 atomů uhlíku, N,N-dh(alkyl Ct—CJaminoialkyl Ci—CJskupinu, chloralkyl209490 s

R2 a R3 společně s přilehlou methylidinovou skupinou představuje cyklobutyl-, cykloipentyl-, monome-thylcyklopentyl-, dimethylcyklopehtyl-, trimethylcyklopentyl-, cyklohexyl-, monoethylcyklohexyl, dimethylcyklohexyl-, trirnethylcyklohexyl-, cykloheptylskupinu nebo' skupinu obecného vzorce kde

R4 představuje vodík, alkylskupinu obsahující až 4 atomy uhlíku, fenyl- nebo benzylskupinu,, vyznačený tím, že se · výchozí amin; obecného vzorce _/CH₂- CH_Á

-CH N-R* ^CH^CH£ .

„ ^irMS í?

nebo „ ^cís θ kde

R má shora uvedený význam, podrobí organylaci ketonem obecného' vzorce

O

II r₂—C—R3 kde

R2 a R3 mají shora uvedený význam, v přítomnosti redukčního činidla, v rozpouštědle inertním vůči reakčním· složkám, přičemž trans-isomer se před nebo po této* reakci podrobí ozařování světlem o vlnové délce 250 až 400 nm tak dlouho, dokud se příslušný trans-isomer v podstatě nepřevede na *odpovídající cis-isotaer.

Pod označením organylace se rozumí zavedení organických zbytků R2 a R3 do výchozího aminu, V případě alkylových zbytků lze tento pochod označit za alkylaci, v případě aromatických zbytků za arylaci apod.

Redukční organylace se může provádět takto: Příslušná výchozí látka se rozpustí ve vhodném· rozpouštědle jako· vodě, methanolu, methylcellosolvu nebo jejich směsi, přidá, se· větší než ekvimolární množství požadovaného· ketonu a pak se přidá _ natriumkyanoborhydrid v množství postačujícím pro provedení redukce. Hodnota pH reakční směsi se během reakce udržuje pomocí zředěné minerální kyseliny na 6,0· až 8,0. Po 1 až 24 hodinách při . teplotě okolí (10 až 35 °C) se reakční směs za vakua odpaří do sucha, zbytek se rozetře , s methanolem a odfiltruje. Filtrát se zředí . acetonem· a pevný produkt, který se vysráží, se odfiltruje · a za vakua vysuší.

Z reakčních směsí po redukční· organylaci lze produkty získat rovněž jinými standardními postupy jako srážením, ' koncentrováním, extrakcí rozpouštědly nebo kombinacemi těchto postupů. Po· izolaci se mohou produkty přečistit jakýmkoli z běžně známých způsobů čištění. Těmito· způsoby jsou · překrystalování z různých rozpouštědel a směsných rozpouštědlových systémů, chromatografické techniky a protiproude rozdělování, kterých se. běžně používá k tomuito účelu.

Ketony, kterých lze takto používat při uvedené redukční organy láci „ (způsobem obecně popsaným· v příkladu 8), jsou uvedeny v následující tabulce I. V této tabulce název derivátu ukazuje zda se jako výchozí látky · používá ' antibiotika trans-BM123y nebo* antibiotika cis-BM123y.

Tabulka I

Použitá karbonylová sloučenina l-dipropylamino-2-propanon

1- chlor-3-pentanon

4- methyl-2-pentanon fenylaceton

6-methyl-6-hepten-2-on

3-methyl-2-pentanon

5- methyl-2-hexanon

3-ethyl-2-pentanon

3.5- dimethyl-2-okkanon 3-oktanon 3-methyl-2-h.exanon

2- pentanon

2- butanon aceton

3- dekanon

3- undekanon mesityloxid

4- methyl-2-hexanon

2,4,4--rrmethylcyklopentanon

3.3- dimethy 1-2-butanon

3.5- dimethylcyklohexanon

4-hydroxy-3-mfe:hyl-2-butanon

1- diethylamino-3-butanon

3-hydroxy--3-nethyl-2-bιltanon

3-pentanon

3- methyl-2-butanon

4- hepťanoin dimethylamlnoaceton

5- diethylamino-2-pentanon cyklobutanbn

2- ok’tanon

4- fenyl-2-butanon

5- chlor-2-pentanon

5-hexen-2-on cyklobexano-n 2-hexanon

2- heptanon cykloheptanon cyklopentanon

4.4- dimethyl-2-peatanon

2.6- ^(^ii^<^1thyl-3-^l^i^'Ptanon

4-oktanon

3- heptanon l-benzyl-4-piperidon

1- miethyl-4-piperidOn

3- mtthylcyklopentanon

3.3- di.methyl-2-butanon

4- methyl-2-h.ieptamion

3.4- dimethyl-2-hexanon

1,3,3-trimethyl1yklopeatanon

5- hexen-2-on

2- methylcykloipentanon

2.4- dlmethylcyklopentanon

3- hexanion

3- hydroxy-2-butanon

4- hydrO'xy-3-methyl·2-buϋanoll 2-nonanon

5- hydroxy-2-pentanon 2-dekanbn

Název l-methyl-2- (Ν,Ν-dipropylamino) ethyl-trans-BM123y l-ethyl-3-chlorpropyl-raans-BM123y

1,3-dimethylbutyl-tra.ns-BM123y 1^mt-thyl-2-feaylethy--rrans-BM123y

1.5- dimethylh'exe^:n-4-y--tran--BM123y

1.2- dime-hylbuty--cis-BM123y 1,4^106^^11:^-0^1-013--^1123-/ 1-me-hyl-2-ethylbutyl-rrans-BM123y

1.2.4- -riπl1tthy1heptyl-trans-BM1.23y 1-ethylh(йίyl-rгnn--BM123y

1.2- dime-ey1pentyl-trans-BM123y 1-methylbuty--cis-BM123y l-methylpoopy--c1s-BM123y inoρroρyl-trrns-BM123y 1-ethyloktýl-tIraas-BM123y 1lethylnoayl-rraas-BM123y

1.3- dim^leteylbutea-2-y--cis-BM123y

1.3- dim'e-hy1pentyl-taans-BM123y

2.4.4- -rime-hylcyklopentyl-rrans-BM123y

1.2.2- -rimethylpropy--cis-BM123y

3.5- dimethy1cyk1Όihexyl-tгaas-BM123y

1.2- dimettlyl-3-hyУdOoypr1rpyl-1rana-BM112з 1lmethy1-3-(N,N-diethylamiao)propy1--raan-

-BM123y

1.2- dimlethyl-2-hydroxypropyl-traas-BM123y

1lethy1plΌpy--cis-BM123y

1.2- dimethylpгopyl-rгnns-BM123y 1-propylbuty--c1s-BM123y 1-me-hy1-2l(N,N-dimetbylamiao)tthy1-

-traas-BM123y l-methyl-4- (Ν,Ν-dit-hy1amino) butyl--rans-BM123y cyk1obu-y1ltгans-BM123y 1-me-hylhfi1-ty--rrans-BM123y 1-methyl-3-feaylpropyl-rrans-BM123y 1-methyl-4-chlΌrbutyl-trnns-BM123y 1-me'thylpeatea-4-y--rгans- BM123y cyklohexyl-traa--BM123y 1lIoe-hylpenty--rran--BM123y 1-methy1hexy1--гans-BM123y cykloheptyl-rraa--BM123y cyk1opeaty1--гaas-BM123y

1.3.3- -rimethylbuty--cis-BM123y 1lisopropyl-4-me-hy1pentyl-cis-BM123y 1-propylpeatyl-rrans-BM123y 1-ethylpentyl-raans-BM123y 1lbenzyl-4-piperidy--rraas-BM123y l-me1^t^y^l^-^4-piper^i^d^y^]^-^1^i^<^asB^M123y 3-mtithylcyklopentyl-tran--BM123y 1-methy--2,2-dinethy1poopy--cis-BM123y

1.3- diaiiefhylhexxll-raas-BMl 2З3

1.2.3- trimethylpeaty--rrans-BM123y

1.3.3- -rimeteylcyklopealyl-rrans-BM123y

1- ra'ethy1peatan-4-y--cis-BM123y

2- me-hy1cyk1opentyl-rraas-BM123y

2,4-dimethy1cyk1opeatyl-tгaas-BM123y 1lethylbuty--tгaas-BM123 1-methyl-2-hydooxypropyl-tгaas-BM 123 1,2ldimethyl-3-hydro>xypropyl-traas-BM123^! 1-methylokty--cis-BM123 1-meteyl-4-eydгoxybutyl-traas-BM123 1lmeteylaoayl-rraas-BM123

Antibiotika označená jako BM123i-6_b BM123^2, trans-BM123._n a trans-BM123/₂ vznikají kultivací za kontrolovaných podmínek nového kmene neurčeného druhu Nocardia. Tento· nový kmen produkující antibiotika byl izolován ze vzorku zahradní půdy odebraného v Oceole ve státě lowa, USA a je chován ve sbírce kultur Lederle Laboratoři es Division, Američan Cyanamid Company, Pearl River, N. Y. jako· kultura číslo BM123. Životaschopná kultura nového mikroorganismu byla uložena ve sbírce Culture Collection Laboratory, Northern Utilizatioin Research and Development Division, United States Department of Agriculture·, Peoria, Illinoís a byla zařazena do stálé sbírky. Je volně dostupná pro veřejnost pod číslem NRRL 5646. Pod označením BM123^-látka se rozumí směs z BM123^_f-látky a BM123./3₂-látky v libovolném poměru.

Obecný popis mikroorganismu Nocardia sp. NRRL 5646 založený na pozorovaných rozpoznávacích znacích je tento; Byly poizoirovány vlastnosti organismu v kultuře a fyziologické a morfologické vlastnosti organismu podle metod, které popsal Shirling a Gottlieb, Internát. Journ. of Syst. Bacteriol. 16, 213 až 240 (1966). Chemické složení kultury bylo určováno postupy, které popsali Lechevalier et al., Advan. Appl. Microbiol. 14, 47 až 72 (1971). Podtržený poipis barvy a číslo barevného· odstínu je použit v souladu s prací Jacobson et al., Color Harmony Manual, 3. vydání (1948), Containér Coirp. of America, Chicago, Illinois. Podrobnosti popisu jsou uvedeny v dalších tabulkách II až VI.

Intenzita růstu

Střední na agaru s kvasničným extraktem,, agaru s dextrózou a asparaginem, Benedictově a Bennettově agaru, agaru s bramborem- a dextrózou a Weinstreinově agaru, slabá na Hickeyově a Tresnerově agaru, agaru s rajským protlakem!, agaru s ovesnou moukou a pablum-agaru a nepatrný růst na agaru s anorganickými solemi a škrobem, s Kusterovými ovesnými vločkami, Czapekoívým roztokem a na agaru s rýží.

Vzdušné mycelium

Pokud je přítomno, je vzdušné mycelium bělavé, vzniká jen na agaru s kvasničným extraktem!, agaru s dextrózou a asparaginem, na Bennettově a Benedictcvě agaru a na agaru s bramborem a dextrózciu.

Rozpustné pigmenty

Nevznikají žádné rozpustné pigmenty.

Reverzní barva

Bezbarvé až nažloutlé odstíny.

Různé fyziologické reakce

Neztekucuje želatinu, dusičnany redukuje na dusitany za 7 dní, na agaru s peptonem a železem netvoří melanoidoivé pigmenty, na mléce s lakmusem nedochází к peptonizaci ani ke tvorbě sraženiny, tolerance vůči chloridu sodnému na agaru s kvasničným extraktem· je větší nebo rovná 4 °/o. ale menší nebo rovná 7 °/o, optimální teplota růstu 32 °C. Využití zdrioje'- uhlíku podle Pridhamovy a Gottliebovy metody [J. Bacteriol. 56, 107 až 114 (1948) ] je následující: dobré využití glycerinu, salicínu, d-trehalózy a dextrózy, střední využití i-inositu a špatné využití až vůbec žádné využití d-fruktózy, maltózy, adonitu, 1-arabinózy, laktózy, d-mannitu, d-melibiózy, d-raffinózy, l-rhamnózy, sacharózy a d-xylózy.

Chemické složení

Organismus náleží к organismům s buněčnou stěnou typu IV, tj. obsahuje meso-2,6-diaminopimelovou kyselinu a má celobuněčné spektrum cukrů typu A, tj. obsahuje arabinózu a galaktózu. Methylované celobuněčné extrakty vykazují při chrom:atografii spektrum mastných kyselin podobné spketru, které poskytuje organismus Nocardia asteroides ATCC 3308.

Mikromiorfologie

Vzdušné mycelium roste ze substrátového mycelia ve formě mírně rozvětvených středně dlouhých ohebných prvků, které obvykle končí v prodloužených jednoduchých spirálách. Ohebné prvky jsou nepravidelně uspořádány do krátkých eliptických· nebo, válcovitých úseků (spory?), které se snadno rozčleňují. Koncové spirálovité části jsou méně nápadně uspořádány do¹ segmentů. Velikost segmentů je obvykle 0,8 až

1,7 ^m x 0,4 až 0,5 ^m, v průměru 0,4 ,^πΐί x x 1,2

Diagnóza

Mioirfologické znaky kultury č. BM123 je obtížné sledovat a interpretovat v důsledku chabého! vývinu vzdušného mycelia na většině médií. V důsledku toho· je nútnb věnovat značnou pozornost při určení rodové příbuznosti organismu chemické analýze; Na základě systému navrženého Lechevalierem a dalšími obsahuje kultura BM123 v celé hmotě buněk kyselinu mesodiaminopimelcivou a na základě analýzy cukrů je zřejmé, že je přítomna arabinóza a galaktóza. Kultura náleží proto к organismům a typem buněčné stěny IV. Porovnáními diagramu plynové chromatografie kultury č. BM123 s diagramem kultury Nocardia asťeroíides ATCC 3308 se zjistí jejich nápadná příbuznost. Jiné vlastnosti kultury č. BM123, které jsoiu v soluladu s chováním Nocardia je zlomkovltý vzdušný nárůst na některých médiích a úplná nepřítomnost vzdušného nárůstu nla většině médií. Vzhledem к tomu, že není к dispozici vhodné kritérium pro charakterizaci Nocardia na úrovni druhu, nebyl činěn pokus provést toto stanovení. Kultura BM123 bude tedy považována až do té doby, než bude diagnóza dosažitelná, za neurčený druh Nocardia.

Tabulka II

Charakteristické vlastnosti kultury kmene Nocardia sp. NRRL 5646

Inkubace: 14 dní Teplota: 32 °C

Médium Intenzita růstu Vzdušné mycelium a/nebo Rozpustné Reverzní barva Poznámky

Й		'0)
E		Й φ		CD co
'Φ в	Φ	φ N	Й	.2
гй U f-ч	11	>Φ š	>0) й ω	φ ω
>		>	'cd	S

	'cd	'cd		co *	'cd	'Ctí
r—,	>	>	>	w	>	>
Φ	Ui	R	R	Φ	R	R
I—<	cd	Ctí	Ctí	'Cd ·φ	cd	Ctí
	ti	Q	ti	XJ	ti	ti
N	N	N	>Φ °°	S1	N
	Φ	Φ	Φ	ti' ’	Φ	Φ
	ti	ti	ti	ri	ti	ti

G	Й	G	й	G	G	Й
0	O	O	o	O	Q	o
д	д	д	д	Ά	д	д
’φ	aP	’φ	aP	aP	’aP	aP
й	Й	fí	Й	Й	Й	a

CO

'Φ	Й	'Φ Й >co	'ф > й	'Ф Й >СО	ň	Y>—1 Й	'Φ 4 > 'ti ~	H
)φ	Ф	Й	S	Й	φ	Φ	Φ >φ	φ
ti	Й	TJ	ti	TJ	s	ti	ti ti	ΰ
8	E	N >	Е	N >	s	8	8 a	a
G	Й	'Ф	Й	'Ф	Й	ti	G G	—
					•R	•H •G
		>		>
Φ	Ф	cd	ф	cd	φ	Φ	Φ Φ	φ
CD	CD	^-1	CD		o	ω	G) O	CD
>>	>>	>ф	>»	>ф	>>			>>
Ё	s	ti H	S	ti	8	s		8
'Φ	'Ф	'Ф Й Й G	'ф	'Φ Е й ti	'Φ	'Φ	'Φ 'Φ	'Φ
Й	Й	U zí	й	R r—	ti	ti	ti ti	ti
>CO 'Ф	>co	Й ω	>со	'ф -й ·φ	>CD	>00	>00 >00	'Φ >00
Й £	G	S ω	Й	£ s Φ	ti	ti	ti ti	£ ti
TJ >ф	TJ	& >	TJ	>Φ >>	TJ	TJ	XJ TJ	>Φ TJ
N >	N	Ϊ й	N	> φ R	N	N	N Ň	> N
> S	>	й й	>	со Й ti	>	>	> >	CD >

ti >ώ ti

TJ 'Φ ti >oo ti TJ

N >

						'P*'	'>ϊ
'8	'Ctí	R ti	Й	'8	'Ctí	ti R	g Й	'>>	8 T
TJ	ti	TJ	Ί5	TJ	rQ		ΰ -a	rQ	13 TJ
Φ	jej	Φ	Φ	Φ	Й	Έ	Й CD	Й	ctí Φ
>R		>R	>u	>R		л	PUK-<	To	Q.>U
R* CD	To	Rl CD	to	Rl CD	00	φ Й	S	2

(V bO <

			VJ	'>Y
cu			8	Й ω
6				Φ
φ Д			ti CD	í> O
’δο	u cd	u	Й	co
cd	00	cd	Ctí	ÍH
u	cd	oo	00	cd
cd	> оЙ	cd		00
a ~ G	>	O й E	Ctí
ctí Ó	4—»	•Й	co φ	>
<o£	ti 5	4—· RJ Φ	И §	0Й u Φ R-> co
«U x	φ й	Й Й	u
00 u	φ	Φ	00>сл	G
< Td	CQ	DQ	< ctí

ctí

CD ti

CJ

P O U >N u ω ú cd <

Tabulka III

Mikrornorfologie kmene Nocardia sp.NRRL 5646

Medium Vzdušné mycelium, a/nebo struktury typu spor agar s kvas- Vzdušné mycelium. roste ze nicnýto substrátového mycelia ve íorextraktem mě . mírně rozvětvených středně dlouhých ohebných prvků, které obvykle končí v prodloužených jednoduchých spirálách. . Ohebné prvky jsou nepravidelně uspořádány do krátkých úseků (spory?), které se snadno rozčleňují. Koncové spirálové části jsou méně ná- w pádně uspořádány do segmentů. Velikost segmentů je obvykle 0,8 až 1,8 pm. x 0,3 až

0,5 pm. v průměru 0,4 /um x » x 1,2 pm.

Tabulka IV

Různé fyziologické reakce kmene No'cardia sp. NRRL 5646

Médium Inkubační doba Intenzita Fyziologická reakce růstu

želatina	7 dní	nízká nedochází ke ztekucování1
želatina	14 dní	dobrá nedochází ke ztekucování
bujón s organickými dusičnany	7 dní	dobrá. dusičnany se redukují na
		dusitany
bujón s organickými dusičnany	14 dní	dobrá dusičnany se redukují na
		dusitany
agar s peptonem a železem	24 až 48 hodin	dobrá neredukují se melaninové
		pigmenty
mléko s lakmusem·	7 dní	dobrá nedochází k peptonizaci nebo
		tvorbě sraženiny
kvasničný extrakt se (4, 7, 10	7 dní	střední tolerance vůči chloridu sod-
a 13 %) chloridu. sodného		nému 5 4 % ale ξ7 %
Tabulka V		*) 3 dobré ýyužití
		2 střední využití
Využití zdroje uhlíku kmenem. Noicardia	1 slabé využití
sp. NRRL 5646		0 žádné využití
Inkubace: 10 dnů Teplota 32 °C	T a b u 1 k a · V I
Zdroj uhlíku	Využití Ί	Chemické složení kmene Nocardia sp. NRRL
-----------		5646
adonit	0
1-arabiniéza	0	Typ buněčné stěny Hlavní složky
glycerin	3
d-fruktóza	1	Typ IV meso-DAP, arabinóza, galaktóza
i-inosit	2
láktóza	0	Produkce. ΒΜ123β a trans-BM123 není o-
d-mannit	0	mezena na tentoi konkrétní organismus ne-
salicin	2	bo. na organismy, které. plně odpovídají sho-
d-malibióza	0	ra uvedeným charakteristikám růstu a vzhle-
d-raffinóza	0	du pod mikroskopem. Uvedené charakte-
rhamnóza	0	ristické vlastnosti jsou uvedeny pouze pro
maltóza	1	ilustraci. Ve skutečnosti se může použít
sacharóza	0	mut-ant získaných z tohoto organismu růz-
d-trehalóza	3	nými prostředky, jako vystavením rentge-
d-xylóza	0	novému záření, UV-zárení, dusíkatému ype-
dextróza	3	ritu, aktinofágům apod. Životaschopná kul-
negativní kontrolní		tura takové typické mutanty je uložena . v
pokus	0	Culture CoHection Laboratory, ' Northern

Utilization Research and Development Division, United States Department of Agriculture·, Peorie, Illinois, a byla zařazena do stálé sbírky pod číslem NRRL 8050. Ačkoli vlastnosti kultury tohoto organismu, fyziologické a morfologické vlastnosti kmene NRRL 8050 jsou v podstatě stejné, jako u kmene· NRRL 5646, produkuje při aerobním kvašení kmen NRRL 8050 zvýšené množství látky BM123. Kmen NRRL 8050 se liší od mateřského kmene NRRL 5646 rovněž těmito vlastnostmi:

a) redukce dusičnanů na dusitany je pomalejší, b ] na Bennettově agaru a na aga.ru s kvasničným ·extraktem poskytuje myceliální pigment světle hnědého narůžovělého odstínu (rosewood tan).

Nové· anítibakteriálně účinné látky podle vynálezu jsou obecně pevné krystalické látky s poměrně nízkou rozpustností v nepolárních rozpouštědlech, jako v diethyletheru a n-hexanu, ale se značnou rozpustností v rozpouštědlech, jakoi je voda a nižší alkanoly. Antibiotika ti^ar^s^-^BM^123y₁ a trans-BM123y jsou' strukturními isomery a lze je znázornit následujícími strukturními ’ vzorci:

-ieqe b.íj míkknq -rfanc

í.qíííxv bx ioxok-rí - ^! ' trans-BM123yi

209490*

trans-BM123y₂

Redukční oirganylace trans-BM123y-látky, trah-BM123y₁-látky, trans-BM123/₂-látky, cis-BM1237-látky, cis-BM123yi-lá'tky nebo· cis-BM123y₂-látky ketony probíhá na spermadinovém postranním řetězci za vzniku derivátu vzorce:

kde

R představuje skupinu vzorce

nebo

kde

R2 a ’ R3 mají shora uvedený význam.

Užitečnost cis-isomerů shora uvedeným způsobem substituovaných derivátů trans-BM123 je demonstrována na jejich schopnosti potlačovat - systemické lethální infekce u myší. Tyto nové látky vykazují in vivo vysoký antibakteriální účinek u myší proti Ešcherichia- - coli US 311 při podání jedné subkutánní dávky skupinám myší o· hmotnosti - asi 20 g (Carworth Farms FC—lj.Irífikace se provádí intraperitoneálně - letální dávkou těchto bakterií pětihodinové - ' - TSP krevní kultury zředěné tryptikázovým- - bujónem se sójou TSP' - na koncentraci 10V³. Aktivita- typických produktů podle -' vynálezu proti Ešcherichia coli US - 311 in vivo - u myší je uvedena v tabulce VII.

Tabulka - VII

Sloučenina	Orální ' dávka mg/kg tělesné hmotnosti	Poměr počtu živých, myší-., k celko vému počtu - zkoušených myší- 7 dní po infekci
isopropy--cis~BM123y	2,0	5/5
	1,0	5/5
	0,5	3/5
	0,25	1/5
	0,12	2/5
l-pťopylpenty--cis-BM123y	2,0	5/5
	1,0	2/5
	0,5	0/5 '
	0,25	0/5
	0,12	0/5
l,5-dimethyl-4-hexenyI-cis-	2,0	5/5
-BM123y	1,0	5/5
	0,5	5/5
	0,25	0/5
	0,12	0/5
l-benzyl-4-piperidyl-	2,0	5/5 .
-οίβ-ΒΜ123χ	1,0	3/5
	0,5	0/5
	0,25	0/5
	0,12	0/5
infikované neošetřené		5/25
kontrolní myši		(3 dny po infekci)

Postup fermentace upravený pro· produkci především látky BM123 a trans-BM123y

Kultivace Nocardia sp. NRRL 8050 se může provádět na velkém počtu kapalných kultivačních médií. Média užitečná pro produkci antibiotik obsahují asimilovatelný zdroj uhlíku, jako· škrob!, cukr, melasu, glycerin atd, asimilovatelný zdroj dutíku, jako je bílkovina, hydrolyzovaná bílkovina, polypeptidy, aminokyseliny, kukuřičný extrakt, atd, anorganické anionty a kationty, jako je: draslík, · hořčík, vápník, amonium, sulfát, · uhličitan, fosforečnan, chlorid, atd. Stopové prvky, jako bór, molybden, měď atd. se- dodávají · ve formě · nečistot spolu s ostatními složkami média. Provzdušňování v nádržích a lahvích se provádí tak, že se do kvasného prostředí nebo na jeho povrch' vhání sterilní vzduch. Míchání v nádržích se provádí pomocí mechanického rotačního· míchadla. Podle potřeby se· může přidávat protlpěnový prostředek jako Hodag (R) · FD 82.

Příprava inokula pro BM123Ž a trans-BM123

Primární inokulum Nocardia sp. NRRL 8050 v třepací baňce se připraví inokulací 100 ml sterilního kapalného média v 500 ml baňkách pomocí stěru nebo' promývacího louhu obsahujícího spory, získaného ze šikmého agaru kultury. Obvykle se používá tohoto média:

bakto-trypton 5g kvasničný extrakt 55 extrakt z hovězího masa 3g glukóza КЦ voda do 1000 ml

Baňky se inkubují při teplotě 25 až 29 °C, přednostně 28 °C . a intenzívně se promíchávají 30 až 48 hodin na rotační třepačce. Pak se inokula převedou do sterilních tub pro uchovávání kultur se šroubovým· uzávěrem· a skladují se při teplotě pod +18 °C. Této' zásoby vegetativního inokula se používá místo· stěru ze šikmého· agaru pro inokulaci 'dalších třepacích baněk určených pro přípravu tohoto inokula prvního stupně.

Takto získaného inokula prvního· stupně se používá prio inokulaci 12 litrů dávek stejného média ve 20 litrových skleněných fermentačních nádobách.

Médium s· ínokulem' se provzd^ě^e sterilním' vzduchem' a v růstu se pokračuje 30 až 48 hodin.

litrů dávek inokula druhého stupně . se používá pro očkování nádržových fermentačních nádob obsahujících 300 litrů násle^t^i^jůín^o sijejilního kapalného média.

masový extraktů' 15 g síran amonný 3 g střední ' fosfrfcnan (j^sený 3 g uhličitan vápenatý1 g síran hořečnatý (heptahydrát)1,5 g glukóza10 g vďda do lOOOrnl

Glukóza se sterilizuje odděleně. Uvedeným způsobem se získá třetí a konečné stadium inokula. Kultivace se provádí · tak, . . , že se půdou v nádobě prohání sterilní · vzduch rychlostí 0,4 až 0,8 litrů na· litr půdy . za minutu a fermentační směs se míchá · · rotačním: míchadlem pracujícím při 150 až · 300 ot./imn. Teplota se· udržuje · na 25 až .. 29 ·'°C, obvykle na· 28 °C. Kultivace se provádí po dobu 48 až 72 hodin a pak se inokula použije pro očkování nádržové fermentační . nádoby o · obsahu 3000 litrů.

Fermentace v nádržích pro výrobu látky BM123$ a látky trans-BNI123y

Jaki živné půdy se pro výrobu ΒΜ123/3-látky a tгans-BMO23y-átky přednostně · používá následujícího média masový extrakt30 g síran amonný6g střední fosforečnan draselný6g uhličitan vápenatý2g síran hořečnatý (heptahydrát)3g glukóza20 g voda do 1000 ml

Glukóza se sterilizuje odděleně.

Každá nádrž se inokuluje 5 až 10 , % · inokula třetího · stupně získaného shora · · uvedeným· způsobem. Fermentační směs. . · se· . udržuje při teplotě 25 až 28 °C, obvykle 26 stupňů Celsia. Směs se provzdušňuje · sterilním vzduchem rychlostí 0,3 až 0,5 -litrů sterilního· vzduchu na litr směsi za minutu a míchá se rotačním míchadlem, pracujícím při 70 až 100 ot/min. Fermentace se · provádí po dobu 65 až 90 hodin a pak se výsledný produkt zpracuje.

Následující specifické příklady slouží - · k bližšímu objasnění vynálezu. Příklady .· · mají pouze ilustrativní charakter a rozsah .. vynálezu v žádném směru neomezují.

Produkt „Hodag FD—82” používaný jako pomocná látka je podle udání výrobce · silikonové protipě^ové činidlo. · Vý^ftKB^O „Agar publum” rovněž používaný v příkladech je vysokokapacitní katexová a · anexová pryskyřice, popřípadě nwuštěná · papíru.

-гiυ-[γπΘxθгí-O--^γШ9fπib-c,O xesiMB^upjsjfciad ¹ csu , ^s1*0 příprava inokula pro· produkci BM123 a _ trans-BM123 -fýbheqtq-l-h^jins^d-i

1Д xESIMfl-gio·

Podle následujícího· receptu se· připraví

I“ ' 'typické médium pro· kultivaci inokula ' · · prv^s druhého stupně

0Π91ίθ2Ο9Π θΠΓ .

i2vm 1 lakto-trypton 5g kvasničný extrakt 5g extrakt z hovězího - masa 5g glukóza 10g voda, do 100-0 ml g

g g

g

1,5 g g 1000 ml

Dvě 500 ml baňky, z nichž každá obsahuje 100 ml shora uvedeného sterilníhoprostředí se inokulují vždy 5 ml zmrazeného vegetativního inokula Nocardia sp. NRRL 8050. Baňky se umístí na rotační třepačku a intenzívně se míchají 48 hodin při 28 °C. ' Výsledné inokulum· v- baňce se převede do· 231itrcvé skleněné fermentační nádoby obsahující 12 litrů shora uvedeného- sterilního média. Směs se provzdušňuje sterilním vzduchem a růst se provádí po dobu asi 48 hodin a pak se obsahu nádoby použije pro inokulaci 454 litrové fermentační nádrže obsahující 300 litrů následujícího- sterilního- kapalného média.

masový extrakt síran amonný střední fosforečnan draselný uhličitan, vápenatý síran hořečnatý (heptahydrát) glukóza voda do·

Do média pro- přípravu inokula třetího stupně se vhání sterilní vzduch rychlostí 0,4 litru - vzduchu na litr směsi za- minutu. Míchání se provádí rotačním míchadlem pracujícím při 240 ' ' ot./min. Směs se udržuje- při 28 °C ai pak se jí použije po· přídavku Hoidag (R) FD 82 pro inokulaci 3000 litrů živné půdy.

Příklad 2

Fermentace za použití Nocardia - sp. NRRL 8050- a média favorizujícího- produkci BM123 a trans-BM123y

Fermentační médium se připraví podle následujícího receptu masový extrakt síran amonný střední fosforečnan draselný uhličitan vápenatý síran hořečnatý (heptahydrát) glukóza voda - doGlukóza se sterilizuje odděleně.

Fermentační médium se sterilizuje při 120 stupních Celsia párou o tlaku 138 kPa po dobu 60 minut. Hodnota pH média po· sterilizaci je 6„9. 3000 litrů sterilního média- ve 4000 litrové fermentační nádrži se inckuluje 300 litry inokula popsaného v příkladě 1 a fermeintace se provádí za použití protípěnolvého činidla Hodag (Rj FD 82. Vzduch &e dodává rychlostí 0,35 litru sterilního' vzduchu na litr směsi za minutu.

0 6g 6g 2g 3g

0 1000 ml

Směs se míchá rotačním míchadlern pracujícím při 70 až 72 ot./min. Po· 67 hodinách fer.mcntacc se fermentační - směs zpracuje.

Příklad 3 izolace BM123jS-látky a trans-BM123y-látky

Hodnota- pH 3000 litrů fermentační směsi získané způsobem- popsaným- v příkladě 2- o pH 4,3 se nastaví na pH 7,0 pomocí- hydroxidu sodného a- pak se směs přefiltruje za použití 5% křemeliny, jako - pomocného filtračního prostředku. Filtrační koláč se promyje asi 100 litry vody a.- pak se- zlikviduje. Směs filtrátu a promývacího louhu se čerpá zdola nahoru třemi paralelními nerezovými kolonami- o rozměrech 2·10 x 1220 mm, z nichž každá obsahuje 15 litrů ionexu CM Sephadex (Rj C—25 v sodíkové formě (zesíťovaný dextran-epichlorhydrinový katex v gelíivé formě). Sloupce: katexu se- po- adsorbci promyjí celkem asi 390 litry vody a pak se eluují 200 litry - 1% - vodného- roztoku chloridu sodného a pak ' . . .560 litry 5% vodného- roztoku chloridu sodného. Eluát tvořený 5% vodným roztokem chloridu sodného se vyčeří filtrací . -přes křemelinu a vyčeřéný filtrát se - nechá - projít skleněnou kolonou o rozměrech 229 - x x 1524 mm obsahující 25 litrů granulovaného produktu Darco (R) G—60 (o· -zrnění 20 - až 40 mie-slh), což je granulované aktivní uhlí.· Sloupec se promyje- 12 litry vody a pak se vyvíjí 120- litrů 15%- vodného methanolu a pak- 340 litry 50% vodného methanolu a nakonec 120 litry 5Q% vodného- acetonu. Eluát tvořený 15% vodným methanolem se za vakua zkoncentruje na asi 7 litrů vodné fáze - a pH vodné fáze se ze 4,5 nastaví na 6,0 pomocí ionexu Amber lite (R) iR—45 v hydroxylové formě (slabě zásaditá anexová pryskyřice- polystyren-polyaminovéhó typu). Pryskyřice se odfiltruje a- filtrát se zkoncentruje za vakua na -asi 1 litr a pak se lyofilizuje, čímž se získá* 38 g látky sestávající především z látky BM123 -spolu s malým množstvím látky trans-BM123y (převážně trans-BM123y2-látky). Eluát tvořený 50_;% vodným' methanolem se z- hodnoty 4,65 zalkalizuje ionexovou pryskyřicí Amberlite iR—45 v hydroxylové formě na hodnotu 6,0. Pryskyřice se odfiltruje a filtrát se za vakua zkoncentruje na asi 6,3 litru a- tento koncentrát se- lyofilizuje. Získá- se 213 g látky sestávající převážně z látky trans-BM123y. Eluát tvořený 50% vodným acetonem se z hodnoty 4,0 zalkalizuje pomocí ionexové pryskyřice Amberlite (R) iR—45 v hydroxylovém cyklu na hodnotu 6,0. Pryskyřice- se odfiltruje a filtrát se za vakua zkoncentruje na asi 1,5 - litru. Koncentrát se - pak lyofilizuje, čímž - se získá 56 - g nečisté látky trans-BM123.

Přiklad 4

Další čištění tt’anis-BM123;/-látky

Suspenze CM Sephadexu (R) C—25 v amonnémi cyklu (NH₄ ⁺) ve 2% · vodném roztoku chloridu amonného se nalije do1 skleněné kolony o průměru 2,6 cm, až je sloupec pryskyřice v koloně asi 62 cm· vysoký. Přebytek 2% vodného· roztoku chloridu amonného se odpustí. Vzorek trans-BM123y-látky o· hmotnosti 5 g, vyrobený způsobem popsaným v příkladě 3 se rozpustí v asi 10 ml . 2% ·· vodného chloridu amonného· a roztok se nanese na sloupec. Sloupem se eluuje· vodným chloridem amonným o koncentraci jednak 2 a jednak 4 · % (vždy 6 litrů), přičemž se používá koncentračního gradientu. Každých 15 minut se automaticky · · odebírají 75 ml frakce. Antibiotikum trans-BM123y · se lokalizuje v jednotlivých frakcích kontrolou eluátu vytékajícího· z kolony pomocí ultrafialového světla a bioautografií pomocí navlhčených · papírových kotoučů na velkých agarových deskách inokulovaných kmenem Klebsiella pneuímoniae · AD. Většina látky t^:rans-BM123y se· lokalizuje mezi frakcemi 71 až 107 včetně.

130 ml granulovaného produktu Darco (R) G—60 o zrnění 20 až 40 mesh se suspenduje· ve vodě, suspenze se převede doi skleněné kolony, nechá se usadit a přebytek vody se nechá odtéci. Frakce· 84 až 96 včetně, ze shora uvedené chromatografie na CM Sephadexu,· se spojí a nechají projít sloupcem granulovaného uhlí. Sloupec s· absorbovanou látkou se promyje 600 ml vody a vyvíjení se· provádí 1 litrem^ 50% vodného acetonu. Eluáty, z nichž oba obsahují trans-BM123y--átku, se· zkoncentrují za· vakua na vodné · fázi a koncentráty se lyofilizují. Získá se celkem 886 mg trans-BM123/-látky ve formě hydrochloridu. Mikronalytický vzorek se získá tak, že se tato· látka podrobí shora uvedenému čištění ještě jednou.

Antibiotikum trans-BM123y nemá určitý bod tání, ale· postupný rozklad začíná v blízkosti · 200 °C. Mikroanalýzou vzorku ekvilibrovaného 24 hodin při 22,2 °C v atmosféře o relativní blhkosti 23 % se zjistí toto· složení: C: 39,44 %, H: 6,10 %, N: 16,19 proč., Cl (iontový): 11,54 %, ztráta sušením 8,19 %. Ve vodě poskytuje ^^13--^123/-látka v U. V. absorpčním· spektru maximum při 286 nm s· E Ji = 250.

Poloha · tohoto maxima se nemění s· hodnotou · pH. Trans-BM123/--átka má úhel optické otáčivosti [a]D2⁵° = +71° (c = 0,97 ve vodě) · a vykazuje charakteristické absorbce v· infračervené oblasti spektra při následujících vlnočtech: 770, 830, 870, 930, 980, 1035, 1105, 1175, 1225,· 1300, 1340, 1370, 1460, 1510, 1555, 1605, 1660, 1740, 2950 a 3350 cm-2.

Příklad 5

Izolace trans-BM123yí-látky

Suspenze CM Sephadexu (R) C—25 v sodíkové formě (Na+) ve 2% vodném roztoku chloridu sodného se nalije do· skleněné kolony o průměru · 2,6 cm, až je· sloupec pryskyřice v koloně 70 cm vysoký. Přebytek 2·% vodného roztoku chloridu sodného se· odpustí. Vzorek transBM123/i-látky a malého· množství trans-BM123y2-látky a jiných' nečistot o hmotnosti 4,11 g, vyrobený způsobem· popsaným v příkladě 3 se rozpustí v asi 10· ml 2% vodného roztoku chloridu sodného a nanese na sloupec. Sloupec se eluuje vodným chloridem sodným o koncentraci jednak 2 a jednak 4 % · (vždy 4 litry), přičemž se používá koncentračního gradientu. Každých 15 minut se automaticky odebírají 75 ml frakce. Antibiotikum! trans-BM123y se · lokalizuje v jednotlivých frakcích kontrolou eluátu vytékajícího z kolony pomocí ultrafialového světla a bío- . autografií pomocí navlhčených papírových kotoučů na velkých agarových deskách inokulovaných kmenem Klebsiella pneumoniae AD. Většina látky trans-BM123y se lokalizuje mezi frakcemi 64 až 90 včetně. První frakce (64 až 80) · obsahují směs trans-BM123/( a trans-BM123y₂--átky zatímco pozdější frakce (81 až 90) obsahují v podstatě čistou trans-BMIZSyplátku.

100 ml granulovaného produktu Darco (R) G—60· o zrnění 20 až 40 mesh se suspenduje ve-· vodě, suspenze se převede do skleněné kolony, nechá se usadit a přebytek vody se nechá odtéci. Frakce 81 až 90 včetně, ze shora· uvedené chromatografie na· CM Sephadexu, se spojí, a · nechají projít sloupcem granulovaného uhlí. Sloupec · s absorbovanou látkou se promyje 500 ml vody a vyvíjí 500 ml 10% vodného methanolu a pak 1 litrem 50% vodného methanolu. Hodnota pH eluátu v 50% vodném methanolu, který obsahuje většinu trans-BMlŽS^-látky se upraví z 5,9 na 6 pomocí Ionexové pryskyřice Amber lite (R) IR—45 v hydroxylovém cyklu. Pryskyřice se odfiltruje· a filtrát se za vakua zkoncentruje na vodnou fázi, která se lyofilizuje. Získá se· 294 mg bílé amorfní trans-B3M123y_rlátky ve formě hydrochloridu.

Antibiotikum trans-BM123/1 nemá ostrou teplotu tání, ale postupný rozklad začíná v blízkosti 200 °C. Mik-roanalýzolů vzorku ekvilibrovaného v atmosféře o určité vlhkosti se zjistí toto· složení: C: 37,84 %, · H: 5,73 %, N: 15,58 . %, Cl [iontový: 10,01 %, ztráta sušením 10,45 %. V methanolu poskytuje· trans-BM123/j-átka U. V. absorpční maximům při 286 nm s E í™ = 225,

Poloha maxima se nemění s hodnotou pH.

Trans-BM123yi-látka má úhel optické otáčivosti +55° · (c = 0,803, ve vodě) a vyká209490 zuje charakteristickou absorbci v infračervené oblasti spektra při následujících vlntfčtech: 770, 830, 870, 930, 980, 1045, 1080, 1110, 1125, 1175, 1225, -1305, 1345, 1380, 1465, 1515, 1560, 1605, 1660, 1730, 2950 a 3350 cm^_1.

Příklad 6

Izolace trans-BM123v_rlátky

25gramový vzorek obsahující především trans-BMW^- a BM123j--átku připravený způsobem popsaným v příkladě 3, se rozpustí v asi - 120 ml 2% vodného- chloridu sodnéhb’ a nanese na sloupec obsahující 1800 ml CM Sephadexu (R) C—-25 v sodíkové formě ve 2% vodném- chloridu sodném. Sloupec se eluuje gradientem mezí 20 litry 2% a 20- litry 4% vodného chloridu sodného. Prvních 12 litrů eluátu se jímá do velké láhve a pak zlikviduje. Pak se každých 40 minut automaticky zachytí frakce asi -oi objemu 800 ml. Antibiotikum trans-BM12Í3 se- loikalizuje sledováním- frakcí eluátu v ultrafialovém světle. Většina trans-BM123/-látky se lokalizuje mezi frakcemi 7 až 18 včetně. Počáteční frakce (7 až 15) obsahují v podstatě čistou trans-BM123y2s -látku a pozdější frakce (16 až 18) obsahují směs trans-BM123yi a trans-BM1237_r -látky.

600 ml granulovaného produktu Darco (R) G—60 o zrnění 20 až 40 mesh se suspenduje ve vodě, suspenze se převede do; skleněné kolony, nechá se usadit a přebytek vody se nechá odtéci. Frakce 7 až 15 včetně, ze shora uvedené chromatografie na CM ' Sephadexu se spojí a nechají projít sloupcem granulovaného uhlí. Sloupec s absorbovanou látkou se promyje 3 litry vody a vyvíjí se 3 litry 10% vodného methaniolu a 6 litry - 50% vodného methanolu. Hodnota pH 10% vodně-methanolickéhoeluátu se upraví z 5,8 na 6,0 pomocí ionexové ' pryskyřice Amberlite (R) IR—45 v hydroxylové formě. Pryskyřice se odfiltruje a filtrát se za vakua zkoncentruje na vodnou fázi, která se lyofilizuje. Získá se 595 mg bílé amorfní trans-BM123/₂-látky ve formě hydrochloridu. Hodnota pH 50% vodně-methanolického eluátu se nastaví z pH 4,6 na pH 6,1 pomocí ionexové pryskyřice- Amberlite (R) IR—45 v hydroxylové formě. Pryskyřice se -odfiltruje a filtrát se za vakua zkoncentruje na vodnou fázi, která se lyofilizuje. Získá se 3,645 - g poněkud méně čisté bílé amorfní trans-BM1237₂-látky ve formě hydrochloridu.

Antibiotikum trans-BM123/₂ nemá ostrou teplotu tání, ale postupný rozklad začíná v blízkosti teploty 200 °C. Mikroanalýza vzorku ekvilibrovaného· 24 hodin při 22,2 °C v atmosféře -o 60'% relativní vlhkosti poskytuje tyto výsledky: C: 36,14 %, H: 5,67 '%, N: 15,1 °/o„ ' Cl· (iontový): 11,11 °/o, ztráta sušením 10,87 ' %. V methanolu poskytuje trans-BM123/<2-látka U. V. absorpční maximum při 286 nm s E ) cm = 220.

Poloha tohoto- maxima se nemění s pH. Trans-BM123y₂-látka má úhel - - optické otáčivosti +60 (c = 0,51 ve vodě) a vykazuje charakteristické absorbce v infračervené oblasti spektra při následujících vlnočtech: 770, 830, 870, 950, 980, 1035, 1110, 1175, 1225, 1285, 1345, 1380, 1470, 1515,

1560, 1605, 1660, 1755, 2950, a 3350 стЧ

Příklad 7

Papírová rozdělovači chromatografie a chroímatografie v tenké vrstvě ' látek VM1230 a trans-BM123y

Antibiotika VM123 lze rozlišit papírovou chromatografií. K tomuto účelu se na proužky papíru Whatman č. 1 nanesou skvrny vodného; nebo methanolického roztoku látek - a- ekvilibrují se 1 až 2- hodiny v přítomnosti jak -horní, tak dolní fáze. Proužky se vyvíjejí přes noc spodní (organickou) fází získanou smícháním 90% fenol : m-kresol: : kyselina octová : pyridin : voda (objemově 100 : 25 : 4 : 4 : 75). Po vyvíjení se proužky vyjmou z chromatografické komory, 1 až 2 hodiny se suší na vzcfuchu, promyjí se etherem, aby se odstranil zbylý' - fenol a bioautografují na velkých agarových deskách naočkovaných Klebsiella pneumoniae kmenem AD. Reprezentativní hodnoty Rf jsou uvedeny v následující tabulce VIII:

Tabulka VIII _

Složka Rf trans-BM123r-látka 0,85

BM123j-látka 0,50, 0,70 β složka se za- použití tohoto systému chová jako- směs 2 antibiotik. BM123j---áts ka se skládá z hlavního antibiotika (Rf = = 0,50) označeného BM1230 a z v menší míře zastoupeného antibiotika (Rf — 0,70) označeného BM123£₂.

ByHS-antíbiotika lze rovněž rozlišit chroimatografií v' tenké - vrstvě. K tomuto účelu se nanesou na desky předem povlečené celulózou- F - (R) (o tloušťce- 0,10 mm), tj. celulóza ve formě tenkých vrstev, skvrny vodného roztoku látky, která má být chromatografována (asi 20 až 40 /ig na skvrnu). Desky se- vyvíjejí přes noc rozpouštědlem získaným smícháním 1-butanoilu, vody, pyridinu a kyseliny octové (objemově 15 : 12 : 10 : 1). Po vyvíjení se desky odstraní z chromatografické komory a nechají na vzduchu během asi 1 hodiny uschnout. Antibiotika se detegují za použití buď standardního ninhydrinového- nebo Sekaguchiho- reakčního činidla ve- formě spraye. Reprezentativní Rf hodnoty jsou uvedeny v tabulce IX:

Tabulka IX

Složka Rf

BM123y-látka 0,17,0,23

BM123i/3-látka 0,08,0,14

Jak BM123/S, tak trans-BM1237-látka se za použití tohoto systému chová jako směs dvou složek. BM123/3-látka se skládá z hlavní složky (Rf = 0,08) označená jako ВМ123Д-složka a z vedlejší složky (Rf = = 0,14) označené jako VM123,/3₂. Méně polární složka trans-BM123y-látky (Rf = 0,23) je označována jako trans-BMlŽS/!-látka a polárnější složka (Rf - 0,17] jako trans* -BM123ý₂-látka.

яя·*·**· Příklad 8 , fe**. ~

Obecný postup redukční organylace antibiotika trans-BM123y nebo antibiotika cis-ВМ123/

К míchanému roztoku 100 mg antibiotika trans-BM123y nebo antibiotika cis-BM123/ ve 20 ml methanolu se přidá 5 ml (nebo 5 gramů) vhodného ketonu a 100 mg natriumkyanoborhydridu. Hodnota pH výsledného roztoku se udržuje na 7,0 pomocí methanolickéhoi chlorovodíku po dobu 3 až 24 hodin. Postup reakce se sleduje chroimatografií v tenké vrstvě podle mizení výchozího antibiotika. Pak se reakční směs přefiltruje a filtrát se odpaří do sucha. Zbytek se trituruje s 3 ml methanolu a směs se přefiltruje. Filtrát se zředí 50 ml acetonu a sraženina, která vznikne se odfiltruje a vysuší. Methanol, jako rozpouštědlo se může nahradit 20 ml vody, pokud je výchozí keton rozpustný ve vodě.

Příklad 9

Příprava isopropyl-trans-BM123y-látky

К roztoku 200 mg trans-BM123y-látky v 30 ml methanolu se přidá 5 ml acetonu. К ttoimuto, roztoku se přidá 139 mg natrium-kyanborhydridu a reakční směs se míchá při teplotě místnosti po dobu 30 minut. Během, této doby se hodnota pH reakční směsi udržuje m!ezl 7,4 až 7,8 přidáváním 0,1 N methanolického chlorovodíku. Malé množství sraženiny, která vznikne, se odfiltruje a filtrát se za vakua odpaří do, sucha. Zbytek se rozetře se 2 ml methanolu a přefiltruje. Filtrát se zředí 100 ml acetonu a pevný produkt, který se oddělí se odfiltruje a vysuší. Výtěžek 184 mg.

Příklad 10

Příprava l,3,3-trimethylbutyl-trans-BM123)--látky

К roztoku 200 mg trans-BM123/-hydrochloridu v 50 ml methanolu se přidá 3 ml

4,4-dimeithyl-2-pentanonu a 106 mg natriuímkyanborhydridu. Reakční roztok se udržuje na pH 7 přikapáváním methanolického chlorovodíku. Reakční směs se míchá 18 hodin při teplotě místnosti a pak se přefiltruje. Filtrát se odpaří za vakua do sucha, zbytek se rozpustí ve 3 ml methanolu, roztok se zředí 50 ml acetonu a přefiltruje. Výtěžek je 125 mg.

Příklad 11

Příprava l-methylfenethyl-trans-BM123ylátky

К roztoku 200 mg trans-BM123y-látky v 50 ml methanolu se přidá 5 ml fenylacetonu. К tomuto, roztoku se přidá 170 m,g natriulmkyanborhydridu a reakční směs se míchá 3 1/2 hodiny při teplotě místnlosti. Během, této doby se pH reakční směsi udržuje na hodnotě 7,0 methanolém nasyceným chlorovodíkemi. Reakční směs se zkoncentruje na objem asi 5 ml, zředí se 2 ml methanolu a přefiltruje-. Filtrát se vlije; do 100 m.1 acetoiniu a pevný produkt, který se vyloučí, se odfiltruje, a vysuší. Získá sé 233 mg produktu.

Příklad 12

Příprava l-im,ethylnonyl-trans-BM123f-látky

Natriumkyanborhydrid (100 mg) se přidá к roztoku trans-BM123/-látky (200 mg) a 2-dekanonu (1 ml) ve 40 ml methanolu. Hodnota, pH rčiztoku se nastaví na 7,0 a udržuje se na 7,0 + 0,2 přidáváním 0(,1 N methanolického, chlorovodíku podle potřeby. Po· 19,5 hodinách se reakční směs přefiltruje a filtrát se zkoncentruje za vakua při 35 °C. Zbytek se suspenduje v, 5 ml méthanolu a přefiltruje. Filtrát se přidá doi 50 ml acetonlu. Špinavě bílé pevná látka, která se vysráží, se odfiltruje, promyje acetonem a za vakua vysuší. Získá se surová l-methylnonyl-trans-BM1237-látka v množství 167 mg.

P ří к lad 1 3

Příprava l,3-dimethylbutyl-trans-BM123)'-látky

К roztoku 210 img trans-BM123y-látky v 50 ml methanolu se přidá 5 ml methylisobiutylketonu. К tomuto roztoku se přidá 166 mg natriumkyanborhydridu a reakční směs se míchá 5 hodin při teplotě místnosti. Během této doby se pH reakční směsi udržuje na hodnotě 7,0 pomocí methanolu nasyceného plynným chlorovodíkem. Reakční slměs se za vakua odpaří do sucha a zbytek se rozetře se 2 ml methanolu a přefiltruje. Filtrát se zředí 100 ml acetonu a pevný produkt se odfiltruje a vysuší. Získá se 210 mig produktu.

Příklad 14

Příprava isopropyl-trans-BM^S/i-iátky

Směs 50 mg trans-BM123yi-látky, 5 mi acetohu a 60 mg natriumkyanborhydridu v 35 mi methanolu se míchá 40 minut při teplotě místnosti. Hodnota pH roztoku se udržuje na 7 přikapáváním¹ methanolického chlorovodíku. Směs se odpaří do sucha za vakua. Zbytek se rozetře, s 5 mi methanolu a výsledný roztok se zředí 50 mi acetonu. Výtěžek je 49 mg produktu.

Postupuje se shora uvedeným způsobem, aie místo· acetonů se použije jako výchozích iátek karttonylových sloučenin uvedených v násiedující tabulce. Získají se odpovídající aikyioVané produkty.

Výchozí Produkt látka

2- butanon

3- pentainoln methyiisobutyiketon sek.butyi-tranš-BM123/j-látka eththylbutyl-trsstó-BM 133^-látka

1,3-dimelhyiyutyl-trans-BM12·3ut-iátka

Příkiad 15

Příprava esoipro|pyl-trans-BM12372-látky

Směs 41 mg trans-BM123з2-látky, 5 mi acetonu a 50 'mg natriumkзanbcrhзdlidu v 35 mi methanolu ,se míchá při tepiotě místnosti po dobu 40 minut. Hodnota pH roztoku se přikapáváním nasyceného methanolického roztoku chiorovodíku udržuje na

7. Směs se prefiitruje a za vakua odpaří do sucha. Zbytek se rozetře s 5 ml methanoiu a výsiedný roztok· se zředí 50 · ml acetonu. Získá se 46 mg produktu.

Postupuje· se shora uvedeným způsobem aie místo acetonu se použije jako výchozích iátek' karbonyiových sioučenin· uvedených ' v násiedující tabuice. Získají se odpovídající aikyiované produkty. ...... ..... ....

. ’ ' / Výchozí Produkt iátka

2- butanon

3- pentanon methylisobutyiketon sek.bιutul·trans-BM123з2-látka ltethylbulsl-trssв-BM233y2s -iátka

1,3-dimiзthylУutyl-tr'ans-BM123y2-látka

Příkiad 16 ho· roztoku chiorovodíku. Směs ' se· odpaří za vakua db sucha. Zbytek se rozetře· s 5· mi mettíanoiu a výsledný měthanoiický· roztok se zředí asi · 50 mi acetonu. Výtěžek· je 233 mg produktu.

Příkiad 17

Příprava isoprloipyl-cis-BM123y--átku

ROstok 200 mg isopropyl-trans-BB1123з-látky· ve 200 mi vody se fotolyzuje světlem Hanoivia v tříhrdlé baňce s kulatým dnem opatřené vodním pláštěm poi dobu jedné hodiny. Během této doby se maximum ultrafialové · absorbce reakčního roztoku přesune· z vlnové délky 290 ·/zm na 275· jum. Produkt se· z reakční směsi získá lyofilizací. Výtěžek· jě 160 mg.

Tato' fotolytická reakce se· nejlépe sleduje tak, že· se 'odebírají v různotu dobu z reakční směsi alikvótní vzorky a měří se· jejich ultrafialová absorbce. Reakce je skončená poté, co· se· maximum· absorbce' přesune· z 290 /zm na 275 μΐη.

Postupuje se shdra uvedeným: způsobem, ale místo· isOpropyi-trans-BM123з-látky · se použije alkyl^oi^i^ných derivátů uvedených v příkladech 14 a 15. Získá se látka isopropu1-cís-BM123u_i, sek.tultyl-cis-BM123зl, 1-ethyibuty--cis-BM123'y1, 1,3-dimethyibutUi-cís-BM123u₁,· isopropul-cis-BM123y2, sek.butul-cis-B^í123;u), l-ethylbu3y--cis-BM123з2 a l,3-dimethylbu3y--cis-BM123з2.

Příklad 18

Příprava l-propylpen3y--cis-BM123з-látky

Roztok 175 mg 1-propylpentyl-trans^123/--33^ ve· 175 mi vody a· 45 ml methanoiu se ozařuje vysokotlakou ultrafialovou lampou po dobu 1 hodiny ' a 15 minut. Roztok se odpaří za vakua do sucha a získá se 169 mg produktu.

P ř í k 1 a d 1 9

Příprava l,5-dшlethy--4-hexeny--cis-BM1237-látky

Roztok 200 mg l,5-dimethyl-4-hexenui-trans-BM123y-látky ve 200 mi Vody sě ozařuje vysokotlakou ultrafialovou lampou po dobu 1 hodiny. Roztok se luofШzuje. Získá se· 182 mg produktu.

Příkiad 20

Příprava l-benzy--4-pipeгidy--cis-BM123з-látky

RoZtok 200 mg l-benzyi-4-piperidyl-trans-BM^Sr-átky ve 200 mi Vody a 20 mi mlethanolu se . ozařuje vysokotlakou ultrafialovou lampou po dobu 1 hodiny. Roztok se lyofiilzuje a získá se 125 mg produktu.

Příprava l-methyl-2-fenylethзitranssBM123u2-látkU

Směs 200 mg iátky trans-BM^y^, 5 mi fenyiacetonu a . 170 mi natriumkзanborhydridu v, 50 mi methanoiu se míchá 3 hodiny 45 minut při tepiotě místnosti. Během této doby se pH reakční směsi udržuje· na

Ί přikapáváním nasyceného methanoiické1181 «12 lí.® dríŽtíld - .u'.;Síbovi'vulil..> u' dcdxo ' t ml lín 3 ň 'dŤhtxw-.i tis: iit»f^dX rubni« mU ..i.4rcv tu jlBřlp^ital;8S^Hdiiibis*]aylpy4řlol'tBx^l^-tu^^^iif--n4 i’£BMH23li]í'>t3iáky nuofti ->t> liu í.li^J uni ítiriix ·->< ilfdifuiin giit

Roztok 200 mg ]rans-BM'23/-lá]ky, 5 ml

3,5-dlnyithylcykloihexanoriu a' 200 n mg i iriátriumkyanborhydridu v 50 ml metkhnolu se nechá stáHitl· ^hCdinui.; přiytpplctiěi místnosti. Během' - této doby se pH roztoku udržuje při-ýiáVá.tMfdιmeeý¢qnál|Oí^,г ogtoku Hóhl^é^inol^iC^ílllí^^u im)lítóStkhphl0lMhi 7u Réhkčníi směs-t«e\’ '.tritumwjdé en^lHlli ítofetheMfoMi, reeúariiiil-

ЬЬОД^о.ЗШН^Р miíamatpnuiiZíská SetáOldtmg -qEttdU^^tu^ilxmn o«t ydck oiIí .irúííftíi ynihcii -iraelq mlcijxri odliit^.^trun u-nhotólk drtilm' H(IíhBíkilija^d2'fíii ш-ц Oir; v-,ι-])1.ί rtvoulv i trn JOBSlHloyl ínum 1001110 niíáiwi x- w 'biiib Příprhvh 2,4··dimedhylcykllapetlltιýl—rekymtiY V WBM299dl3tky í>n а'гЯ1ЮТ hdídíyíkiíoi cmT

-91 x ífdob iwm^íri v ' i|H7ldoí>ň 90 uX , áal i] -э[ R>@z6íCfai2!(36 ^,Wgx-Yaπt6BMiíJ2^3)i.tSíky,ílfflr]el -йfWdiídetVlιyteykCoptíйwhnшválftl|Иll'engri·e¢- ΦĎtpmkyaetObahydIktaиtv> ι515^Κ^4ΐσ1ιΐ!:>β nechá stát 6 hodm. při. AepithtěcimísaiifDetL ,íβёHθalИét®ldobý'^;ιdθlpЫι.E'dz]@kU!^^iidjdu<ao''při'odříA^áíi^rirti- -ihSÉýbÉn:é(toci - fízKísCh^Jk-i^l^^CiiEo^c^líl^u w drnigtWwídu nta/ iTelRtóíhttó/iíímási sq i íi^itaj, -«ujeas BItMMí mdth'síйШu,3přefi^]truijθdámalfijl· taát Siř(&EéM!4θiml]^,·vád3tйmι., ZfCkiáMsě-diQLi’ mg produfctdlYiílioínib-k.r _ťlv£SiMB - - 0-it--lyiíidíyili

-.Jlež .^ÉSffMH-žío ^- ívqmqodí . MS ^{- 019}

RstSJtllMdřií Bflrndlyiím -jr .^Ι—Π/Η ·ί:'ί - ívtod Μβ-·;>.ί·)-·-7)ijdívdlMllili - ^; - , i ti

Příprava 3-me'thylcy^,kl·ckdxyl-trans-BM123y--átky k f L n ; 1 / ϋ 3

RiÍC^l^^daf.t^Mi^ťJj-tl^a^i^^BMl^a^^ar^Hůtky/iil.a^rml

3-mettylcyklotdxaecnu a 200 mg natriumlgdttвec)t^мusd'Яed-gteá ístáejíí jkodiny Bří rtepletě /umstinastb/Bě•le^Hiiíirt^tt^o-Jď^^y^^-i^s^jjlH roztoku- udržuje--.přiídÉáMnéím- -^назаутаё &ο>· - .ďtcgtoRu· i_Ictlorovo!3íku .y?5m^t^]khРР4u_ÍJ..pí^l^j^^й]tJ’ujβísej_fa.; ítiltrát .^.даdí 40 ml acetonu. ZískáuSe-iiZ^í^^B-^í^kú^iisa^daktu. '' d ' t ' z ‘ Příklad 24

O V.'·;.'? У <·.\ i- ' V .V.’ — C :> vk-7'j'í?

Příprava 2,4.4-trimethylcyklopentyl-aгaда-.-~·: -BM123_r--átky dý-s x ->-- >1·.’ 'У'¹'-· Xc:n:vZ'

Claims (4)

1. -ty. Ά v.b'.’ '.' — Ί-.' ; -:'V v/?d -d’..·'PREDMET ř i π . o l . -i i · i η

   Roztok 200 mg trhns-BMi.23y-látky, 5 ml 2Д4Ч^dMУyl¢yCloptmtenoeu. a* *179- - mgma]rlumkyaebcrty3rl3u v 50 ml metkanolu' se i .necká, estéti - - -Jfodimipi^i tgploté· mMitosti. v Běhám dtto i -doby· «se o pH.. roztoku o udržuje i -přid^é^i^íníimm^is&yi^enéla^ eoιιz1tCk!ЬU!e =chlar .vodítku ri v. methenoltb - na 17, i -Rea^ní osměs^ise qtrl. 'ttu>U;|eBdr>ai.ml - lmetíálmmdΠφРedШtc.ьjeÝhéila n£iltflátiise_: <ε1τι3&40. .ml· acetonu. ·- Získá. .sei 176 iimgip)t^íd(^uki^iu. Г ά áŤJ'ó-..O I σο ΊΟΙ·;·ΊΔ ň.i.Hů·· iiíúijir-m · Ιιϊι 0Γ lÍíóT-.i oo dóiSío . ·' ubolřVv o Příklad 2 5 HjAíjnuiq и-.· а - *is'sájjýv mo^|li >-£Ш.р ·ιιιγιϊο·ίκό ν' и mi-Uíl^ó ό·ο ο[ i.íq^J LoG⁴! dBříprtvoa 2rfflufthjytoykj(opemylitransric.í.i uio -BMtlZltyrlÁtkyi Ňb-Ji» jIc .11-17 μ · о I ⁷ n. _ί· t'l 'i . ^o Я /ΙαΙΒ.Ι I · Oj ηΓί vi h] Í»o ód Hnřldl:'· · ó-jbllol I..jl|ij.íjolckin

   Roztok' 211 mg tr^J^nseBilMláky^-tMtHcyři&íiml
2. 2-mtthylcyklopeIleanonu a 98 mg natriumkyanbortydíliďu>''M 50 ml mehanolUMm^bcká stát
3. 3,5 hodiny při teplotě- mísihthsiti. Během -této doby se pH roztoku - udržuje pčkíí^í^í^iiStm' 141ayymalθIг»τrstCюkuct&lM)ΦC^vodíku 'i vi hi1YtltkneolW ÝMď7/.« i Reakční. mměsi - se trituruje s 3 ml mettanhlw^přeliltrujd -se - a filtrát seiB^d3íΊIéO1mlJadld]oeu. Zíískáva® =157 mg produktu. rílifeí - , -á-l ít/ďi <ι·Β..ίι vi-hii

   P ř í k- 1 a d 2 6 c x r>« i ai 1 n -i

   Příp ravaai c-is+BlMllžf-ixiáltlky \ - qp'· iqú «I ϋ v'c 1 q'í l4i !.ш ^Č , v ^J ) fc J y' < «^{Λ l} Μ?¹ · · ČlljjJ >^^l^l¹' ^j|: óšídi' ].JC^йt^okI|2Qз_JJ®^etDaм1IdfeM^žl1^^Hálk^^!kJ^njé86QЮ mil:.ivoi^^^;í.^e f^ot(oíl,^^:Éaj^^ -světlflm.it.^Hano^yia-rv Η.Ηιι31ιΙ£ cbaá^-eHs - -i kulatým dnem .opatřené - radním < pláštěme φ omdobuk 412х10КНум xB$ rdaemj.í;EíóidolEyLse >-m^^atoi^a^iUM^jii^tj^al^iíihth7éit<abf soiibce --rea^n^l^o..·. rcztckui1¢ps1wegřeгylnoiv<^:id(^llky.'290 ...,итз11а?275ь^т0 áyCCi .. PO ^·r,.^a(tc fotoíLyticití· reakce ýsh>дaa©Ultθm8teduje tak, že - .se-odebírají M- FŮ^iBíiU^idQibttiiz’ lr^láa^ι^l^^^csвěSitivχíai^kV.vtOíзíi·V^з^<м^yř_>l>^ϊлěiC se jejich -''·uιttrataad0ά.· ·ebscrbce;r·- 8ЙЙИЦ skcnčd'nalφ(tté,·- cavse. - -—Μ——π0;&·&.8ΟΤ1κο přesune. uó29O a^anjd^- 275.mгfPodUikS]/lSd z reakční směskzísta? lyrDfíiizasíx i/šbvwje

   Shora uvedený postup se -opakuje s tím rozdílem, žezse. roztok fotolyzuiC laáQddiny. L^(^:^ilizací se získá 170- mg látkyt.Qs-BM123y.

   ,í& v’'X:>ióř .'i'j..: jó. uC-S.

   i··'·’···’ I. /.i/л:·. -71,· ΊУел·' · · γ · Gjš . .· j’?£?·;Ot>‘.i -t

   VYNALEZU aíit:

   гл·· :ji·igcJ· 1 .·..· ·.··.'ί·Ά^·’1-: >. <ituxXňi?vv -у:У^л , -^р^оЬ - . přípravy, ¾pb^titucyanýfth cis-.|p-{2*-^,f(3-()^'4^;^-^šmi^ibutyl/a^^m^^í99^^jrjp'pyyj!kai^.1 bamCyl] vinyl] Iglykosidů, ' označovaných jako

   А C t . > / ^r:' *^J . O .... veK-o .' ехЦ-1ф-’'>

   'Ji’ rr - ' l ni ÍIU* <i>

   JI >·.’ v:

   •J V

   - К—Ш?. ? · - v, ‘W X t '.ýz.vv :

   - .i·i ·β711γ nnt - υ i j j a v ^v o*. у'А'АЬпг / .jo .--ΛΑ·· IK-l:· > ... ν7υηχ·ή lUb· .ÚC’V< <.)! vel cis-BMl23yí nd^jt)p.в obecného vzorce уйШ..·

   С1а-ВМ123/2-^1ои^ШРУ.

   -n f : i * \>

   >'.· -.ti.

   tj!,; ti

   7.κ7·._{ό

   L·· j; i v .jVřÍi.··:

   IíU --'Ь'! v ti·?

   V JiJi·

   Cl- V·;·:

   JL ’JÍ9?·

   ;.'U.

   V Cd ί?λ ν;’·.: Y η,ιόΐΑΑΛ ^R₂ vitá řV··.! ’·'
4. 4¹¹ ? jťtfv i a : ПС .nn

   Й v jr li Iiíb v b mx>Z

   ...U

   X

   23943« ”33 «34 г

   <1 kde

   U<i

   R představuje v ' případě BM123y₁-slóučeniny skupinu vzorce

   ..... ’..4 - ,_v •V =

   Á.

   '1 i» Job O-Jj λ ;vi.

   h:1..(.1 li nebo v případě BM123y2-sloučeniny zbytek vzorce kde

   R2 představuje alkylskupinu obsahující až 3 atomy uhlíku,

   R3 představuje alkylskupinu obsahující až 8 atomů uhlíku, N,N-di( alkyl Cx—CJamino(alkyl-C₁—C₄ jskupinu, chloralkylskupinu obsahující až 4 atomy uhlíku, fenylskupiniu, benlzylskupinu, β-fenylethylskupinu, alkenylskupinu obsahující 2 až 8 atomů uhlíku nebo- hydroxyalkylskupinu obsahující až 4 atomy uhlíku nebo

   R2 a R3 společně s přilehlou methylidl* novou skupinou představuje cyklobutyl-, cyklopentyl-, . monomethylcyklopentyl, dimethylcyklopentyl-, triinethylcyklopentyl--, cyklohexyl-, moi^^^i^^e^t^hylcyklohexyl-, dimeí .

   thylcyklohexyl-, trimethylcyklohexyl-, cykloheptylskupinu nebo skupinu obecného vzorce y^CH2~ ~CH N — R.

   ^CHrcH kde

   R4 představuje vodík, alkylskupinu obsahující až 4 atomy uhlíku, fenyl- nebo^ benzylskupinu, vyznačený tím, že se výchozí amin obecného vzorce '-гсн₂;₃-нн-гсн₂^-нн₂ nebo kde

   R má shora uvedený význam podrobí organylaci ketonem· obecného vzorce фМГ ·>...

   —г—— ₀

   R2-C-R3 kde

   R2 a R3 mají shora uvedený význam, v přítomnosti redukčního činidla, v rozpouštědle Inertním vůči reakčním složkám, .. přičemž trans-isomer se . před, nebo po této reakci podrobí Omřování světlem o' vlnové délce. 250' až 400 μία tak dlouho, dokud se příslušný trans-isomer v podstatě . nepřevede na odpovídající cis-isomer.