CS203542B1 - Zpfísab biosyntszy L-tryptofanu - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu fermentační výroby L-tryptofanu, při kterém se používá bakteriální kultury a indolu jako prekursoru, zvláště způsobu regulování metabolismu produkčního mikroorganismu pomocí pH a velikostí dávek indolu za účelem udržení optimální hladiny rozpuštěného kyslíku v půdě během růstu a produkční fáze.

Je známo, že L-tryptofan je jednou z nepostradatelných aminokyselin pro výživu vyšších živočichů. Podobně jako lysin, methionin a threonin je však nedostatečně zastoupen v krmných směsích na bázi rostlinných bílkovin, které se běžně používají pro výkrm hospodářských zvířat a drůbeže. Celosvětově se proto jeví snaha obohacovat krmné směsi vedle lysinu též tryptofanem.

Ve světové literatuře je popsána řada biosyntetických postupů přípravy L- tryptofanu využívají vhodných kmenů kvasinek nebo bakterií, zpravidla dependentních na některé aminokyseliny jako jsou histidin, methionin apod., nebo bakteriálních kmenů resistentních k analogu tryptofanu. (Enatsu T. a sp., J. Ferment. Technol, 41:500, 1963; Lim-Mateles, Science 140:388, 1963; Ebihara Y. a sp., J. Ferment. Technol. 47:733, 1969; Shiio I. a sp., Agr. Biol. Chem.

39:627, 1975 a jiné práce). Z hlediska fermentační přípravy v provozním měřítku jsou zejména perspektivní postupy využívající bakteriálních kmenů, neboť biosyntéza tryptofanu bakteriemi probíhá několikanásobně rychleji, než při použití kvasinek. Tyto postupy jsou také převážně předmětem patentové ochrany. Jako příklad uvádíme německý patent 2,037763, francouzský patent 2,000641 a britský patent 1,276604. Výtěžky uváděné v patentové literatuře se pohybují mezi 6 až 9 g/1 s 80 až 96% využitím prekursoru, většinou jsou však dosahovány v laboratorní fermentační aparatuře.

Jak potvrzují literární údaje [např. M. Beker a sp., Prikl. biochim. i mikrobiol. VII (1) : 103—106, 1971] 1 výsledky našeho vlastního výzkumu, je vysoký výtěžek tryptofanu z vneseného prekursoru podmíněn vysokým přenosem kyslíku do živné půdy, tak aby fermentační proces nebyl limitován ani ve fázi růstu mikroorganismu, ani v produkční fázi při dávkování prekursoru. Tento požadavek představuje konkrétně při použití bakteriální kultury, zejména při použití prototrofních kmenů, že míchání ve fermentoru musí být takové intenzity, aby zajistilo přenos 70 až 100 mg 02/1/min., na konci růstové fáze dokon203542 ce 120 až 140 mg Cte/l/min. Tyto vysoké přenosy kyslíku je možno snadno realizovat v laboratorním měřítku, v provozních fermentorech je však zvyšování obvodové rychlosti michadla limitováno jak ekonomií, tak především fysiologií produkčního mikroorganismu. Mikroorganismy produkující tryptofan vykazují totiž značnou citlivost na smykové namáhání pohybem míchadla, zejména když je v živné půdě přítomna toxická látka, jakou představuje prekursor. Důsledkem poškození buněk smykovým namáháním (shear-efectem) je, že fermentace dříve končí a je dosaženo nižší produkce, přitom spotřeba uhlíkové ho zdroje na jednotku vytvořeného tryptofanu se zvyšuje. Vzhledem k tomu, že se vzrůstajícím objemem fermentoru vzrůstá při zachování stejného přenosu kyslíku většinou výrazně i shear-efekt, jsou při realizaci biosyntézy L-tryptofanu ve výrobním zařízení hlavními problémy, z hlediska dosažení co největší efektivnosti, udržení dostatečné hladiny rozpuštěného kyslíku a zároveň snížení shear-efektu na přijatelnou míru.

Nyní jsme zjistili, že s ohledem na shear-efekt je účelné provádět biosyntézu tryptofanu při středně silné intenzitě míchání (přenos O2 cca 55 až 70 mg Oz/l/min.) a že dostatečné zásobování produkčního mikroorganismu kyslíkem během jeho růstu je možno zajistit opakovanými změnami pH živné půdy, které ovlivňují intenzitu metabolismu mikrobiálních buněk, zvláště dýchání a umožňují tak udržovat v půdě optimální hladinu rozpuštěného kyslíku. S výhodou je k tomu možno využít samovolného poklesu pH živné půdy vlivem metabolické činnosti produkčního mikroorganismu na hodnoty 6,0 až 5,0, kdy spotřeba kyslíku výrazně klesá a hladina rozpuštěného kyslíku v půdě stoupá. Aby nedošlo k přílišnému zpomalení, resp. k zastavení metabolismu, je nutno v 1,5 až 3hodinových intervalech provádět úpravu pH hodnoty 7,0 až 8,2, s výhodou na hodnotu 7,3 až 7,6, při které intenzita metabolismu opět dosahuje maxima. Tyto periodické změny pH jsou doprovázeny charakteristickými křivkami rozpuštěného kyslíku v půdě a kyslíku a kysličníku uhličitého ve výstupu vzduchu z fermentoru. Podle našeho vynálezu se pomocí těchto křivek volbou intervalů mezi jednotlivými úpravami pH aktivně reguluje proces růstu mikroorganismu tak, aby probíhal optimální rychlostí, bez limitace kyslíkem, čímž je příznivě ovlivněna produkční aktivita po celou dobu průběhu fermentace. Vlastní regulace této fáze fermentačního procesu se provádí buď podle křivky CO2, nebo křivky úbytku O2 ve výstupu vzduchu, a to tak, že úpravy pH na hodnotu blízkou neutrální se provádějí tehdy, když intenzita dýchání, sledovaná alespoň na jedné z uvedených křivek, poklesne v důsledku snížení pH živné půdy na 40 až 20 % své předchozí maximální hodnoty. Přitom množství rozpuštěného kyslíku v půdě, která obsahuje sacharózu a jako zdroj dusíku kukuřičný výluh a minerální soli, během růstu mikroorganismu klesá z počáteční hodnoty odpovídající 100% nasycení půdy kyslíkem na hodnoty 50 až 20 % nasycení.

Dále jsme zjistili, že v produkční fázi, tj. po ukončení růstu a zahájení dávkování prekursoru ve formě 25% roztoku indolu v sójovém oleji, intenzitu metabolismu a tím i hladinu rozp. O2 v půdě je možno regulovat dvojím způsobem. Za prvé je možno pokračovat v regulaci pomocí pH jako v růstové fázi s tím rozdílem, že hodnota pH se nechává klesnout na 6,3 až 5,7 a pH se upravuje na hodnoty 7,0 až 8,2, s výhodou 7,3 až 7,6 v 1 až 2hodinových intervalech při poklesu intenzity míchání na 60 až 40 % své předchozí maximální hodnoty. Rozpuštěný kyslík v půdě se při tom pohybuje na hodnotách odpovídajících 10 až 30 % nasycení. Při tomto způsobu se prekursor s výhodou dávkuje kontinuálně nebo semikontinuálně v malých dávkách tak, aby jeho koncentrace nepřesáhla 1 mg/1, což umožňuje operativně řídit dávkování prekursoru podle analytických údajů. Další možností, jak regulovat intenzitu metabolismu a tím i výši hladiny rozp. O2 během produkční fáze, je regulace pomocí odstupňovaných dávek prekursoru. Při tomto způsobu se v produkční fázi udržuje konstantní pH v neutrální oblasti na optimální hodnotě 7,0 až 7,2 automatickým dávkováním čpavku, což by při současné nízké hladině indolu v půdě vedlo k intenzivnímu metabolismu, který by byl limitován nedostatkem kyslíku. Proto se v tomto případě intenzita metabolismu brzdí vhodnou velikostí jednotlivých dávek indolu, které se přidávají do živné půdy během produkční fáze ve 3 až 5hodinových intervalech. Velikost první dávky se zpravidla pohybuje, podle vitality biomasy, mezi 0,20 až 0,25 0/0 indolu počítáno na objem půdy. Úměrně s poklesem vitality biomasy se další dávky indolu též snižují, a sice: druhá dávka na 0,15 až 0,20, třetí na 0,12 až 0,17, čtvrtá na 0,07 až 0,12 a event. další dávky na 0,03 až 0,05 %. Z hlediska dosažení optimálního průběhu produkční fáze indikují přesnou velikost dávek indolu opět křivky CO2 nebo O2 ve výstupu vzduchu z fermentoru. Olejový roztok indolu se přidává do fermentoru pomocí čerpadla takovou rychlostí, aby celá dávka byla načerpána přibližně za 30 minut. Přítok roztoku indolu se zastaví, jakmile intenzita dýchání sledovaná na křivce CO2 nebo O2 ve výstupu vzduchu poklesne na 60 až 20 proč. své předchozí maximální hodnoty s výhodou na 40 %. Další dávka se aplikuje po opětném vzestupu intenzity dýchání na původní hodnotu, nebo když vzestup intenzity dýchání se zastaví a dále se již němě203542 ní. Hladina rozpuštěného kyslíku v půdě se při tom pohybuje jako v prvním případě regulace produkční fáze na 10 až 30 proč nasycení.

Oba způsoby regulace rozpuštěného kyslíku v půdě během produkční fáze, pomocí pH a pomocí dávek indolu, je možno též vzájemně kombinovat, a to s výhodou v případě, že intenzita míchání ve fermentoru je nižší a přenos kyslíku je pouze cca 50 mg Ch/l/min. nebo méně.

Během fermentace se ve všech případech ještě přidává 70% roztok sacharózy v několika dávkách tak, aby podle analytického stanovení obsah cukru neklesl před koncem fermentace na nulovou hodnotu.

Blíže objasňují způsob biosyntézy L-tryptofanu podle vynálezu následující příklady. Aby byl demonstrován dosažený efekt při postupu podle vynálezu v provozním zařízení, jsou uvedeny v měřítku 5000 litrů jak postupy s aktivní regulací hladiny rozp. O2 podle vynálezu, tak i kontrolní postup bez této regulace.

Příklad 1

Kulturou kmene Corynebacterium glutamicum CCM sp. VÚAB kultivovanou při teplotě 28 °C po dobu 24 hod, za aerobních podmínek na třepacím stroji v Erlenmayerových baňkách plněných á 60 ml média o složení 2 % sacharózy, 1,5 % kukuřičného výluhu (65 % suš.), o pH 7,0 byla inokulována sterilní očkovací půda obsahující 2 % sacharózy, 1,5 % kukuřičného výluhu (65 % suš.), 0,003 % techn, biotinu (1 % úč. 1.) a 0,1 % sójového oleje, o pH 7,8, rozplněná po 250 1 do dvou 500 litrových očkovacích tanků. Inokulace byla provedena po 1 1 inokula. Inkubace inokula v očkovacích tancích se uskutečnila při 29 °C po dobu 14 hodin za stálého míchání 300 ot./min a vzdušnění 130 litrů vzduchu/min.

Do dvou 5000 litrových fermentorů bylo připraveno po 2500 1 živné půdy následujícího složení:

sacharóza 20 % kukuřic, výluh (65 % suš.) 6 %

NH4CI 2,4 %

KH2PO4 0,24 %

MgSOr 0,012 % techn. biotin (1%) 0,003 % sójový olej 0,2 % pH 7,0

Živné půdy v obou tancích byly sterilizovány 30 minut při 120 °C. Sterilní živné půdy byly inokulovány z očkovacích tanků. Kultury byly kultivovány při 29 °C za aerobních podmínek při míchání 2 otevřenými šestilopatkovými turbinami o průměru 1/3 průměru tanku, a otáčkách míchadla 300 ot./min. a vzdušnění 1500 1/min. Přenos kyslíku při tomto uspořádání byl 65 mg Ož/l/min. Ve fermentorech byly umístěny elektrody na měření pH a rozpuštěného kyslíku a z odcházejícího vzduchu fermentorů byly automaticky kontinuálně odebírány vzorky do přístroje měřícího obsah O2. Do obou fermentorů byl od 18. h. kultivace každou hodinu až do 48. h. kultivace přidáván indol v množství á 0,6 kg. Během fermentace bylo ve fermentorů I pH udržováno automaticky 25% roztokem čpavku na hodnotě 7,1 až 7,2, ve fermentorů II byla v růstové i produkční fázi prováděna pomocí pH regulace metabolismu na hladiny rozpuštěného kyslíku, tzn. pH bylo upravováno periodicky, vždy když úbytek kyslíku ve výstupu vzduchu klesl v růstové fázi na 40 % a v produkční fázi na 60 % oproti předchozímu maximu. Hodnota pH byla upravována v 10., 13., 15,5. a 18. kultivační hodině a dále pak každou hodinu 20% čpavkem. Ve fermentorů I poklesl rozp. O2 již ve 14. h. kultivace na nulovou hodnotu a měřitelné množství rozp. O2 v tomto fermentorů bylo zaznamenáno opět až po 38. h. kultivace. Ve fermentorů II neklesl obsah rozp. O2 až do 18. h. kultivace pod 30 % nasycení, a dále pak kolísal mezi 20 až 30 % nasycení. Do fermentorů I bylo v důsledku rychlého poklesu hladiny cukru v půdě nutno přidat ve 26., 34., 40. a 46. h. kultivace po 100 kg sacharózy ve formě 70% roztoku. Do fermentorů II byly stejné dávky přidány vzhledem k pomalejší utilizaci cukru pouze ve 30. a 40. h. kultivace. V 56. h. kultivace, když obsah indolu v půdě klesl v FT I na nulu a v FT II na 0,08 mg/ml, byla fermentace ukončena. Ve fermentorů I bylo dosaženo produkce 6,3 g/1, ve fermentorů II 10,8 g/1 tryptofanu.

Příklad 2

Z očkovacího tanku o objemu 500 1 bylo kulturou kmene Corynebacterium glutamicum CCM sp. VÚAB, připravenou stejným postupem jako v příkladu 1, očkováno 2500 1 sterilní živné půdy stejného složení jako v příkladu 1 ve fermentorů o objemu 5000 1. Kultura byla kultivována při 29 °C za aerobních podmínek při míchání dvěma otevřenými šestilopatkovými turbinami o průměru tanku a otáčkách míchadla 260 ot./min. a vzdušnění 1500 1/min. Přenos kyslíku při tomto uspořádání byl 55 mg 02/l/min. Ve fermentorů byly umístěny elektrody na měření pH a rozp.. O2 a během fermentace byl kontinuálně též měřen CO2 ve výstupu vzduchu. Regulace metabolismu a hladiny rozpuštěného kyslíku byla v růstové fázi prováděna pomocí pH, v produkční fázi dávkováním indolu. Do 18. h. kultivace bylo tedy pH upravováno 25% čpavkem periodicky v 11., 13., 16. a 18. h. kultivace, vždy při poklesu CO2 ve výstupu vzduchu na 25 % předchozího maxima.

Od 18. h. kultivace bylo pH upravováno automaticky a jeho hodnota byla udržována na 7,1 — 7,2. V 18. h. kultivace bylo též zahájeno čerpání 25% roztoku indolu v sójovém oleji, přičemž byl na analyzátoru CO2 sledován pokles intensity míchání. Když koncentrace CO2 ve výstupu vzduchu klesla na 40 % hodnoty, které bylo dosaženo v 18. h. kultivace (při neutrálním pH), bylo čerpání (v 18,5. h. kultivace] zastaveno. Za stejných podmínek byly přidány další dávky indolu ve 22., 26., 30. a 34. h. kultivace, vždy když koncentrace

CO2 ve výstupu vzduchu dosáhla úrovně stejné, jako před zahájením prekursorování. Jednotlivé dávky činily 21, 18, 15, 10 a 7,5 1 25% roztoku indolu v sójovém oleji. Hladina rozpuštěného kyslíku se přitom v růstové fázi pohybovala mezi 40 až 20 %, v produkční fázi mezi 30 až 5 % nasycení. Ve 36. h. kultivace bylo přidáno 100 kg sacharózy ve formě 70% roztoku. V 50. h. kultivace, kdy koncentrace indolu v živné půdě klesla na nulovou hodnotu, byla fermentace ukončena. Bylo dosaženo produkce 11,4 g tryptofanu/litr.

Claims (2)

1. Způsob biosyntézy L-tryptofanu kultivací produkčního bakteriálního kmene, například Corynebacterium glutamicum, v tekuté živné půdě obsahující uhlohydráty, zdroje organického a anorganického dusíku, stimulující biofaktory a indol jako prekursor, za submerzních podmínek, vyznačující se tím, že se v růstové fázi mikroorganismu reguluje hladina rozpuštěného kyslíku v půdě střídavým udržováním hodnoty pH v rozmezí od 6,5 až 5,0 do 7,0 až 8,2, v závislosti na obsahu kysličníku uhličitého nebo kyslíku ve vystupujícím vzduchu při poklesu intenzity dýchání produkčního mikroorganismu na 40 až 20 % předchozí maximální hodnoty a v produkčYNÁLEZU ní fázi se hladina rozpuštěného kyslíku reguluje střídavým udržováním hodnoty pH v rozmezí od 6,3 až 5,7 do 7,0 až 8,2, s výhodou 7,3 až 7,6, při poklesu Intenzity dýchání na 60 až 40 % předchozí maximální hodnoty a/nebo dávkování indolu.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se při regulaci hladiny rozpuštěného kyslíku v produkční fázi při udržování pH na hodnotě 7,0 až 7,2 dávkuje co půdy indol až do poklesu intenzity dýchání na 60 až 20 %, s výhodou na 40 %, předchozí maximální hodnoty a další dávka se opakuje po opětném vzestupu intenzity dýchání na hodnotu původní nebo na hodnotu konstantní.