CS200471B2

CS200471B2 - Method of quantitative determination of one from the couple of compounds with reciprocal specific affinity in liquid pattern and apparatus for execution of this method

Info

Publication number: CS200471B2
Application number: CS746904A
Authority: CS
Inventors: Ernest C Adams; Joe W David; John M Yoder
Original assignee: Miles Lab
Priority date: 1973-10-11
Filing date: 1974-10-09
Publication date: 1980-09-15
Also published as: US4039652A; JPS5067191A; DK526174A; GB1489913A; IL45646A; CA1023167A; NO147198C; IT1032099B; HU171139B; IL45646A0; AR203574A1; AT355731B; ES430056A1; CH607025A5; AU7325174A; ATA815574A; BE820934A; NL7413284A; NO147198B; DE2448411A1

Description

Specifické látky se vzájemnou afinitou jsou ty látky, . které vcházeeí do vazby s dalšími specifickými látkami za vzniku vazby s vyloučením dalSíih látek. Takto vzniklá vazba je obvykle fyzikální vazba, v některých případech však může jít o. fyzikálně chemickou vazbu nebo . i o vazbu chemickou. Je možno říci, že specifická látka má.afinitu . ke druhé látce z tohoto páru, takže jejich vzájemná afinita je vyšší než afinita k jiným látkám. Těmito látkami bývají obvykle peptídy, bílkoviny, uhlohydráty, glykoproteiny nebo steroidy. Některými příklady specifických párů těchto látek mohou být antigen a protilátka, hapten a protilátka, enzym a jeho substrát, hormon a receptor nebo vitamíny a jejich receptory.

Termín látka se specifickou vazebnou affnitou může znamenat bu3 látku, která se stanoví, nebo jejího partnera. Termín specifický pár . znamená obě tyto látky.

Metody ke stanoveni těchto látek.jsou založeny na.schopnoosi těchto látek reagovat obdobběfse specifccyy;; partnerem ve značené i neznačené formě.

Většinou jde o imunologické zkoušky, v případě, že se užívá antigenů, haptenů nebo protilátek a o radioimunologické zkoušky v případě,že tyto látky jsou užity v radioaktivní formě.

Poouití dvoufázového systému, který sestává z kapalné fáze a z pevné fáze, . zjednoduuilo tyto zkoušky do značné míry. V těchto dvoufázových systémech sestává pevná fáze z jedné látky z uvedeného páru v nerozpustné formě. Užívá se adsorpce, chemické vazby nebo fyzikalní vazby ke změně této látky na nerozpustný tvar. Výhoda dvoufázového systému .spočívá především ve snadném oddělení vázané značené složky od nevázané značené složky.

Odmění značené složky, která je vázána na druhou sloučeninu z uvedeného páru od zané složky, je nejnesnadnějším stupněm těchto zkoušek. Obvykle závisí míra, · rychlost a uskutečnitelnost tohoto oddělení na celém výsledku stanovení. Při tvorbě jedné z látek v nerozpustné formě se užívá předběžného srážení, kterému se někdy'říká dvojitá zkouška s použitm protilátek, při tomto postupu se včleňuje teto sloučenina většinou do akrylamidového gelu, který se pak polymeeuje. Běžněji se užívá chemické vazby nebo vazby jedné látky z páru . a · nerozpustný polymer nebo edsorpce na .v^i^třní povrch zkumavky.

V současné době se často využívá toho, že se vytvoří například .ve zkumavce nerozpustná látka z páru. k vytvoření uzavřeného nebo téměř uzavřeného systému, který obsahuje tuto látku v částicové formě, nebo se také užívá zkumavek, v nichž jedna z těchto látek je adsorbována na její vnitřní povrch. Protože vzorky neznámých látek jsou obvykle velmi zředěné, je nutno užívat dlouhé inkubační doby k získání reprodukovatelných výsledků. Tyto inkubační doby se pohybují obvykle v rozmezí 6 hodin až 2 dny a někdy mnohem déle. OOděěení vázané a nevázané značené složky stále vyžaduje velmi pracné metody, jako jsou filtrace, odstřelování a důkladné prorvání.

Vyiález si klade za -úkol navrhnout způsob stanovení neznámé látky v kapalném vzorku buá ve formě koncentrace nebo jako absolutního mnoství této látky' ve vzorku.

Nyní bylo zjištěno, že je možno s výhodou užít dvoufázového průtokového systému bud při dosažení rovnovážného stavu, nebo sycením, přičemž v každém případě je možno výhodně, rychle a snadno kývanítativně stanovit jednu z látek ze specifického páru. Stanovenými látkami jsou například antigeny a protilátky, · hapteny a protilátky, enzymy a substráty, hormony a jejich receptůry nebo vittmíny a jejich receptory. Aitigenem může být chemická jednotka nebo látka, která reaguje s protilátkou a váže se na ni. Aitigenem tedy může být jednoduchá antigenní bílkovina nebo poXypeppid, nebo může jít o složitý komplex'antigenu a protilátky, který jeStě má antigenní účin^c^s^t. Vynález rovněž navrhuje zařízeni k provádění tohoto způsobu, které v podstatě sestává ze sloupce s porézní a nerozpustnou maaricí vzhledem ke kapalině, která obsahuje stanovovanou látku, přičemž na tuto maatici je vázána druhá látka ze specifického páru a tato látka slouží v imobilizoverném stavu ke stanovení látky v neznámém vzorku.

Maarice je obvykle .vyrobena z polymeru. Sppccfická látka, na kterou má být vázána látka z . neznámého vzorku se imoobllzuje v maaťici s výhodou chemickou vazbou na mea^c!, v tomto případě pak se s výhodou užije jako maarice polymmrní látky s obsahem hydroxylových skupin, primárních aminoskupin nebo sekundárních aminoskupin. ImobSli.zovaěá látka se chemicky váže k· maarici s výhodou pomocí zvláštního činidla, například halogenkyanu, anorganického nebo organického kyanátu nebo epihalogenhydrinu.

-Předmětem vynálezu je tedy způsob kvaaěirarivěího stanovení jedné ze sloučenin z páru sloučenin se vzájemnou specifickou afinitou v kapalném vzorku, v němž je jako pár sloučenin se vzájemnou specifickou aktivitou přítomna dvojice antigen a protilátka, hapten a protilátka, enzym a subsíriát, hormon a rcccptjr^!neSj vitamin a jeho receptor, vyznnčuuící se tím, že se

- uvede ve styk matnice, uložená ve sloupci a popřípadě předběžně uvedená Ve styk s efodlibrační kapalinou a kapalným vzorkem se sloučeninou, která je značenou formou jedné ze shora uvedených dvou sloučenin ze specifického ·páru, přičemž matrice je porézní a nerozpustná v kapalném roztoku a obsahuje složky, které váží a tak imooblizují složku, která má být stanovena,

- magice se uvede ve styk s eluční kapalinou, schopnou vymýt ze sloupce ·v podd^tě veškerou nenavázanou značenou složku, která byla ve sloupci ponechána předem stanovené časové období pro provedení stupně předchozího, · s výhodou s pufrem, · a

- · stanoví se poměrné moožtví značené složky, zadržené ve sloupe i jako funkce mo^tv! slož- ky, která má být stanovena a které bylo uvedeno ve styk s maticí · v prvním stupni ve · formě kapalného vzorku. '

Relativní qinožství značené složky, které bylo zadrženo ve sloupci specifickou vazbou na imobilizovanou látku,se pak s výhodou srovnává se standardními hodnotami, které jsou založeny na relativních množstvích značené složky, která byla zadržena na sloupci stejného typu stejným způsobem při obsahu známého množství sledované látky.

Kvantitativní stanovení specifických látek je možno provést zásadně třemi způsoby. Metoda, která je založena na vytvoření rovnovážného stavu,se provádí tak, že v podstatě jde o kompetici mezi neznámým množstvím a mezi značenou formou téže látky při omezeném množství druhé specifické látky z páru. Při metodě, při níž se užívá sycení, jde v podstatě o vysycení části přítomného množství jedné látky z páru látkou neznámou, načež se zbývající množství vysytí značenou formou stanovované látky. Přímá metoda spočívá v. tom, že se roztok s neznámým množstvím látky přidá к určitému množství druhé látky z páru, načež se přidá ještě přebytek značené formy, která se pak váže s látkou neznámého množství. Všemi těmito způsoby je možno provést kvantitativní stanovení propočítáním vazby značené složky. Důležité je přesně sledovat množství jednotlivých značených složek, velikost vzorku a inkubační dobu, při splnění těchto podmínek je vazba značené složky na matrici funkcí množství nebo koncentrace druhé látky, jejíž množství je neznámé.

Při použití metody vysycování je značená složka značenou formou látky, která má být stanovena,a stupeň a) se provádí tak, že se

a) (1) uvede matrice ve styk se sloučeninou, jejíž množství má být stanoveno, a to’ s výhodou při použití předem určeného množství kapalného vzorku, přičemž množství specifické látky, imobilizované v matrici, je v přebytku vzhledem к množství látky, která má být stanovena,po celé období, v němž je ve styku matrice s neznámým množstvím látky, takže v matrici zůstává ještě možnost další vazby, načež se

a) (2) matrice uvede ve styk s předem stanoveným množstvím značené složky, která se váže na zbývající vazby specifické látky, imobilizované v matrici. Užije se s výhodou delší inkubační doby, obvykle 15 minut až 12 hodin.

Na konci tohoto způsobu je popřípadě možno provést ještě další stupeň, který spočívá v eluci sloupce, při níž dojde к vymytí nenavázané látky neznámého množství ze vzorku, naneseného v předchozích stupních. Při této eluci se obvykle užívá téže kapaliny jako ve stupni b). Tento stupeň však není nutné provádět, protože referenční vzorek obvykle sám účinkuje jako eluční kapalina, takže fyzikálním způsobem odstraní ze sloupce v podstatě veškeré množství nenavázané látky neznámé koncentrace z kapalného vzorku.

Při metodě, využívající rovnovážného stavu, je značená složka značenou formou látky, jejíž množství má být stanoveno, a stupeň a) se provádí tak, Že se buč matrice uvede ve styk se směsí, obsahující stanovovanou látku a značenou složku, přičemž množství imobilizované složky je v přebytku vzhledem к množství obou těchto složek včetně značené složky v období, v němž je směs matricí ve styku, nebo se

a) (1) uvede ve styk matrice s předem stanoveným množstvím značené složky, která je v přebytku vzhledem ke složce, která je schopna se vázat na sloučeninu, imobilizovanou v matrici v době, kdy jsou ve styku značená složka a matrice, načež se a) (2) uvede ve styk matrice se sloučeninou, jejíž množství má být stanoveno, s výhodou při použití předem stanového množství kapalného vzorku, takže látka, jejíž množství má být stanoveno, nahradí část vázané značené složky, vázané na druhou látku z páru, imobilizovanou v matrici. Z tohoto důvodu musí být množství značené složky, které se váže v matrici ve stupni a) (1) v přebytku vzhledem к množství, které by mohlo být úplně nahrazeno sloučeninou, přidávanou ve stupni a) (2) v období, v němž je ve styku stanovovaná látka a matrice. V obou případech se matrice se sloučeninou, jejíž množství má být stanoveno, nebo se značenou složkou uvádí ve styk po

200471 , delší dobu, s výhodou 15 minut až 12 hodin.· Při provádění tohoto· stanovení přímou metodou je značená,složka značenou formou specifické látky, která je druhou· látkou z páru, vzhledem k látce, která má být stanovena,a stupeň a) se provádí tak, že se nejprve

a) (1) uvede ve ' styk matrice s·látkou, jejíž množství má být 'stanoveno, 's výhodou při použití předem stanoveného m^nost^i^ií kapalného produktu, přičemž množní látky, imooilizované v )maariei, je v přebytku vzhledem ke sloučenině, jejíž množtví má být stanoveno v období, kdy jsou ve styku magice a stanovovaná látka, načež se

a) (2) uvede ve styk magice s předem stanoveným minžstvím značné složky, která se váže na část nebo na veškeré množní látky, jejíž množní má být stanoveno.

Pro každou z těchto metod je rozsah vazby značené složky závislý ·na parametrech magice, a to zejména mmаžství sloučeniny, která je imobilizována v ΐΏδ^Ιοί, rozsah inhibice a rozsah kapalného produktu, na Čemž také závisí koncentrace nebo mnžžtví stanovované látky ve vzorku, které · je vůbec možno stanovit pomooí jednotlivých metod. S výjimkou koncentrace nebo mnnožtví neznámé látky je ostatní uvedené faktory možno řídit a upravit tak, aby bylo možno získat měřící rozsah, který přibližně odpovídá očekávanému rozmezí koncentrace stanovované látky. Obvykle · se tyto hodnoty upravují tak, že se přibližně 30 až 50 % mnnožtví značené složky váže a zadrží ve sloupci, pak teprve se nechá procházet sloupcem roztok, který obsahuje nebo neobsahuje stanovovanou složku.

Způsob podle vynálezu tedy · využívá dvoufázové metody, se specifickou vaznou látkou, vyžaduje pevnou fázi, v níž je v nerozpustném stavu vázána jedna sloučenina ze specifického páru. Protože je tato sloučenina nerozpustná, je celý kommlex po navázání druhé látky rovněž nerozpustný. Marice · může sestávat z jakékoli látky, která je nerozpustná a porézní, takže dovoluje průchod kapalné fáze v takové míře, aby docházelo k účinnému vstupu · s touto kapalnou fází, přičemž magice musí rovněž být schopna imooHizovat jednu sloučeninu ze specifického páru. Použitelnými látkami jsou polymery, gely, koloidy, vláknité tkaniny apod. Marice má být tak porézní, aby docházelo k dobrému styku mezi kapalnou fází a sloučeniny, které se mmaí na sebe vázat v minimálním časovém období, takže se značená složka·dostává do styku se složkou, jejíž mnnožsví má být stanoveno rychle a účinně.

Existuje celá řada ·způsobů k ι^^Ι^^Ι jedné ze sloučenin v nerozpustné mařici. Jde například · o · zachycení fyzikálním způsobem, polymeraci nebo konjugaci, polymer nebo konjugát může pak ještě být fyzikálně·zachycen v matrici. Sloučeniny, které tvoří konjugáty, jsou například latex, meehaafylát a b^l^t^(^i^:ie. Delším způsobem imobillztce je adsorbce · na mat^r^i^i. Tato adsorbce ·musí být dostatečně · silná· k tomu, aby výsledný komplex byl nerozpustný v prochááející kapalině. Marice, které jsou schopny fyzikálně zadržet komplex nebo konjugát, popřípadě polymer, jsou různé ·kommlexní polymery, koloidy a gely, například akrylamidový gel. Marice, které imooblizují kommlex ;aďsorpcí , jsou například aktivní uhlí, sklo·a různé plastické hmoty.

Při ^obiizaci specifických sloučenin na mat^ÍLcI ziůstat specifická místa pro příští vazbu v obou sloučeninách volná. Změny pH, teplotní změny a další podmínky, které mohou oviiinar stupeň této ·iahiiice>jj nutno vooit tak, aby ·výsledkem byly optimální podmínky. Všechny reakce včetně reakcí mezi bíll^c^x^L^nnýлml strukturami, například · anti^eny, hapteny, enzymy, hormony, recepto^ a lrotllátкl^ je nutno provádět při tak nízké ·teplotě a v takové blízkosti · neutrálního pH, aby nedošlo k lieiereiiilaí denaturaci. OoHmální podmínky se mění při pohltí různých specifických dvojic s ohledem na zvláštnosti jejich ·struktury.

Nejvýhodnějším způsobem imooblizace jedné ze specifických sloučenin na maatici je chemická vazba na tuto matrici. Tato vazba úplně zajišťuje ^©obiizaci a je možno ji provést různým způsobem. Je totiž možno voit celou řadu reaktivních chemických skupin v příslušně volené mai^^ci pro chemickou · vazbu, která je nejvýhodnnjší pro typ chemické dvojice, jejíž jeden člen má být určen.

Látky, kterými je·možno způsobit imobilizaci ·tvorbou chemické vazby, jsou . například různé polymery, gely, koloidy a tkaniny. Může jít bu3 o přímou chemickou vazbu na maarici, nebo o vazbu prostřednictvím chemického činidla. Marice, na něž se předem váže chemické činidlo, mohou být nazývány .aktivovanými maaricemi. Hlavními chemickými reaktivními skupinami ve specifických dvojicích sloučenin jsou obvykle volné karboxylové skupiny, iminoskupiny, volné thiolové skupiny, guanidinové skupiny, alifatické hydroxylové skupiny, methylmerkaptostaapiny, fenylové skupiny, amidové skupiny, disulfidické vazby a peptidové vazby. Látky, které mohou být aktivovány chemickými činidly, jsou například vláknité maateiály jako deriváty celulózy, přírodní polymery, například některé polysacharidy a syntetické polymery.

Skupina syntetických polymerů má široké použžtí při tvorbě maarice. Zvláště výhodnými polymerními látkami jsou sloučeniny, které obsaHuj alespoň jednu chemickou skupinu·ze skupiny hydroxyl, primární aminoskupina nebo sekundární aminoslkipina. Výhodnými chemickými· činidly pro použžtí se shora uvedenými látkami jsou halogenkyany, jako bromkyan, anorganické a organické kyanáty, například kyanáty alkalických kovů a epihalogenhydriny, například epichlorhydrin. Zv^ště použitelnou kombbnací je agaróza, aktivovaná bromkyanem. Dalšími chemickými činidly, která je možno užít·k ·provádění způsobu podle vynálezu, jsou diazosloučeniny a hydraziny, které lze užít k aktivaci polystyrenů, akrylamidů a jejich derivátů, glutaraddehydu a částečně hydrolyzovaného nylonu. Polymery mohou. mít dispergovanou .formu, strukturně integrovanou formu nebo mohou být v jakémkooi meezstupni. Formami mohou být prášky, pryskyřice, membrány apod.

Předmětem vynálezu je i přístroj k provádění způsobu podle vynálezu, vyznaauuící se tím, že sestává ze sloupce, obsahuuícího maarici, která je porézní a nerozpustná vzhledem ke kapalině vzorku a která obsahuje specifickou složku pro vazbu stanovené sloučeniny v Zmobilizovaném stavu. . '

Přístroj tedy sestává v podstatě z válce, který lze popsat jako prodloužené duté těleso s oběma konci otevřenými, které však lze s výhodou ·alespoň na jednom konci uzavUt. Tento sloupec má být schopen udržet pevnou fázi a zajistit a usnadnit průchod kapalné fáze. Jde tedy i o běžně užívané sloupce jakéhokooi · jiného typu. Maaterál, z něhož je sloupec vyroben, má být inertní vzhledem ke kapalné fázi a nemá absorbovat ani značenou složku, ani složku, jejíž minoství má být stanoveno'. V případě, že jde o značení radioaktivním isotopem, má mít sloupec stálé předem určené rozměry k usnadnění následujícího mmření radioaktivity. Pevná . fáze je uložena ve sloupci jako kotouče, permenablní meembány, prostupné zátky apod. a může být také přímo natanena do sloupce. Má být porézní a inertní vzhledem ke kapalné fázi a nemá vázat ani jednu z použitých složek.

Na při Loženém výkrese je znázorněno jedno z výhodných provedení přístroje podle vynálezu, Jde o válcovité tělo 11 přístroje, které je . na jednom svém konci opatřeno zúženým koncem 13. Tělo 11 je vyrobeno z polypropylenu nebo jiného vhodného mat^ei^i^^Lu, na konec 12 nasedá klobouček 12. který je udržován ve své poloze třením a který lze· kdykooi sejmout. V těle 11 je uloženo příslušné mioožs„ví mařice 15 pomooí polyethylenových kotoučů 14 ve spodní části těla 11. V horní části těla 11 je možno uložit konzervační směs _£6, která sestává například z fyziologického roztoku s iakteriociSníbl přísadami a která chrání přístroj při dopravě a skladování před kontaminací. V horní části ·těla 11 je v případě potřeby možno uložit i jakoukoli jinou kapalinu. Horní konec těla. Ц je popřípadě zakončen přírubou 17. která slouží k udržení přístroje ve vzpřímené poloze ve stojanu. Přístroj je uzavřen snímateliým kloboučkem 18 při přepravě a skladování.

Kaaaaina, jíž se užívá k eluci ve stupni b), musí být schopna vymý ze sloupce v podstatě veškerou nenavázanou značenou složku z referenčního vzorku. Obvykle eluční kapalina prostě oddděí od sloupce fyzikálně lnoucí složky. S výhodou jde o pufr, volený s ohledem na sloučeninu, o jejíž zjištění běží. Jde o to, aby -postup probíhal při pH, při němž je afinita mm oběma složkami páru největší. Lze užít anorganických i organických pufrů, je možno přidat i detergencia k usnadnění vymyyí zbytku jedné·ze sloučenin ze sloupce.

Sloupec·se obvykle před stupněm a) přivádí do rovnovážného stavu pomooí vhodné kapaliny, kterou je například pufr, který upraví podmínky ve sloupci tak, aby byly vzhledem ke specifické reakci · optimální. Jde obvykle o tutéž kapalinu jako ve stupni b).

Styk mezi pevnou fází a kapalnou fází se uskutečňuje průchodem kapalné fáze přístrojem·. Průchod obou kapalných fází, tj. vzorku s obsahem neznámé koncentrace jedné ze sloučenin ze · specifického páru a referenčního vzorkujte uskuteční tak, že se kapalná fáze nanese do sloupce v jeho otevřeném konci, čímž dojde ke styku fáze kapalné a pevné. Doba styku mezi oběma fázemi závisí na tlaku, který je vykonáván na kapalnou fázi a na průtokových vlastnostech pevné fáze. Tlak, vykonávaný na kapalinu k usnadnění jehího průtoku sloupcem, může·být způsoben mechanickou nebo pneumaaickou pumpou, sáním apod. Výhodným způsobem je průtok pomocí gravitace.

Je výhodné, aby průtokové vlastnosti pevné fáze byly takové, že pevná fáze absorbuje a'zadržuje kapalinu,·proudící vlivem gravitace. Je zapotřebí podle tohoto požadavku voUt hustotu maarice. Kopalna v maarici zadržená může být odstraněna jinou kapalinou. To znamená, že nanesená a · absorbovaná kapalina bude zadržena do té doby, než bude nahrazena jinou steným způsobem nanesenou kapalinou.

V případě, že zvolená pevná fáze nemá žádoucí · průtokové vlastnosti, je nutno užít větší síly než gravitace k uskutečnění průtoku sloupcem. V tomto případě, stejně jako v případě, že vzorek má větší rozměry, je vhodné upravit konec sloupce tak, aby mohl být volný, zčásti prostupný nebo zcela neprůchodný. Částečnou prostupnost je výhodné volit například tehdy, když má být·snížena rychlost průtoku a prodloužena doba styku mezi pevnou a kapalnou fází, úplné uzavření lze voHt v případě, že má být pevná fáze s fází kapalnou inkubována.

Délka inkubace je několik minut až několik dní, s výhodou 15 minut až 12 hodin. Tato inkubace je vhodná k zajištění téměř taгaacttativcí reakce mezi neznámým ·vzorkem a značenou složkou.

Způsobem a přístrojem podle vynálezu lze kvaacrrtrivcě stanovit jakoukooi látku, která se specificky váže na jinou látku. Vyyžitím této druhé látky způsobem podle vynálezu vzniká možnost specificky kveonitativně stanovit látky·se . vzájemnou afinitou, například inzulín, prliczulic, růstový hormon, angi^enz^ I a II, lidský placentární laktogen, lidský choriový gonadolrspic, luteinizační hormon, thyrostimulační hormon, parathornom, pr^este!^, aldostei^on, cholestersl, fllikullstimulačcí hormon, rjstosterlc, vitmíny' skupiny D, п^Шир^еИ^ l-l-antitryptin, · renin, moofin. Dalšími látkami, které lze tímto způsobem zjistit, jsou ^r^^idy, l^otropin, vesopresin, oxy^c^, relaxin, gastrin, bradykin-in, kalcirlcic, plasmin, glukagon, vitimíny ' skupiny B, estrogeny, digoxin, digitoxin, australský antigen, retacltlxic apod.

Značená složka může být značena například radioaktivním způsobem, reakcí enzym--ubsSrár apod. Při d_ruhém z uvedených způsobů se látka, která má být značena, chemicky · váže buá na enzym, nebo na jeho substrát běžným způsobem, kterým však nedojde k blokování aktivních skupin pro enzymatickou reakci. Některé látky lze takto vázat přímo · za vzniku značené složky, jiné je nutno vázat pomocí činidel jako karbodiimidů, dHaokyanátů, aldehydu kyseliny glurtrlvé, SitdiazlSeczidicu apod. · Mndství značené složky · zadržené ve sloupci lze stanovit stanovením zkoušky na enzym v eluátu nebo ve sloupci, a to kolorimetricky, tpektrofltoaetricky, flulrlaejricky, radiograficky nebo jakýmkoli jiným způsobem.

Isoto^py, jlcd lze užít při zna^n^ jsou nap^klad ¹⁴C, 3' a^pod., zvl^ášt^ě vhodným isolopea je ^²^I, proMe jodace je ^běžně ^dltru^pnou 'technikou a také ^protl^{, ž}e '³'l má kratší p^:l^čas. R^a^dc^^^l^ki^^^· značení lze provést přímo značením jedné z látek te tpecifickou afinitou nebo značením druhé složky, která tvoří krnjugát s látkou,·která má být značena, aniž by přitom došlo k blokování specifické afinity. Má-li sloupec stálou geometrii, lze mnosSví značené složky zadržené ve sloupci stanovit měřením radioaktivního záření vychá-ejícího ze sloupce a srovnávat tuto hodnotu se standardními hodnotami. Obvykle se značená složka dostává do styku s matricí ve formě kapalné, například v pufru, .inertním ke sloučenině neznámé koncennrace, vázané na pevnou složku.

Kapalné vzorky, které lze · zkoumat způsobem podle vyiááezujjsou například anorganické i organické roztoky sloučenin se specifickou afinitou. Velikost vzorku není prakticky stanovena, protože jde o průtokový systém. V případě některých látek jsou k dispozici jen velmi zředěné vzorky, pak je nutno nechat větší vzorek postupně projít sloupcem, 'protože sloupec pejen oddělí zkoumanou látku, nýbrž také ji Reakce mezi oběma specificky se vážícími látkami závisí na konncmraci, lze tedy tímto způsobem reakci urychhlt a zkrátit potřebnou dobu inkubace. Způsob i přístroj/ podle vynálezu jsou tedy velkým zlepšením při stanovení konncenrací uvedených látek v tělesrých tekutinách ' a tkáňových extraktech, například v aminotické опгпЬг-Ш a spinální tekutině, séru, ' plazmě, a mooč.

Vynález bude osvětlen následujícími příklady.

P ř -íkl a d 1

Tento příklad se vztahuje na použití způsobu a přístroje podle vynálezu na vytvoření kalibrační křivky pro stanovení inzulínu saturačním způsobem.

a) Výroba protilátek proti inzulínu

Capybarám bylo injekčně podáno inokulum, su^^táv^ij^Lcí z ·homooenizované směsi krystalického einkineulinu o 8 mg/ml (vepřový inzulín rozpuštěný v 0,01 N kyselině solné \ a neutrclejovcný 0,01 N roztokem hydroxidu sodného) a Freundovo adjuvans v poměru 50/50. ť Do každé tlapy bylo vstřílmuto 0,25 ml homooemntu. 21, 23, 56 a 58 dní po první injekci bylo podkožně k zesílení reakce podáno ještě 0,25 ml шattniálu, sestávajícího z 8 mg/ml krystalického vepřového 'zinkinzulinu, smíšeného se stenným objemem Freundova adjuvans.

Tento шэСгп!-! byl podán podkožně na čtyři místa na zvířeti. 68. dne byla zvířatům pokusně odebrána krev a poslední dávka séra byla vstříknuta v obdobb, kdy titr se blížil ·nule (přibližně po 70 dnech). 10 dní nato byla zvířata-usmrcena vykrvácením.

b) Příprava přístroje k provedení zkoušek ’ CNBr-ikkivovaná Sepharosa 4B (РИатас^ AB, Ups^a, švédsko) se ·nechá nabobtnat v 0,001 M kyselině solné, po 15 minutách se promyje v nálevce se skleněným sintrem 0,001 M kyselinou solnou. Celé, nefrakcionované anriséuιш se pak váže na CMBr-ik^vovanou Sepharosu 4B tak, že se toto sérum, získané ve stupni a), smísí s objemem 0,2 M •citrnnanového pufru o pH 6,5, který je totožný s objemem Sepharosy·ve sloupci. Výsledná směs se míchá přes noc při teplotě 4 °C. Suspenze se pak promývá · 0,2 M cirmnnnovým pufrem o pH 6,5 · tak dlouho, až optická hustota srnщývacíán pufru při 280 nm je nižší než 0,05, načež se suspenze dále prom/vá fyziologckýým roztokem tak dlouho, až optická hustota prom/vacího roztoku přt215 nm je nižší než 0,05. Pák se suspenze Sepharosy ředí Sepharosou tak, aby při provádění stupně c) bylo ve sloupci zachyceno 30 až 50 % celkového množiví radioaktivně značeného inzulínu, a to po prometl vzorkem bez obsahu inzulínu. Pak se suspenze v 0,9% roztoku chloridu sodného a obsahem 0,,1% NaNj plní do injekčních stříkaček Stylex z plastické hmoty (Pharmaaeal laboratoři^, Geendale, СсС1^гп1с) s podpůrnými · kotouči z polyethylenu, čímž se získají sloupce se Sepharosou o objemu 1 ml.

c) Provedení pokusu

Naplněné sloupce byly uvedeny do rovnovážného stavu tak, že ke sloupcům bylo přidáno příslušné moŽsSví boritanového pufru o pH 9,0. Tento pufr byl vyroben smísením 50 ml 0,1 M KOI/H3BO3, 20,8 ml 0,1 M NaOH, 1,7 m 30% lidského sérového albuminu a 27,5 ml vody. Standardy vepřového inzulínu byly připraveny s následujícími koncentracemi inzulínu:'50 miikro jedno tek/ml, 100 mikrojednotek/d a 250 mikrojednotek/ml. Ke sloupcům, vyrobeným ve stupni b), pak ·byl přidán kontrolní vzorek a tři inzulínové standardní vzorky v množství 0,5 d, · načež byly sloupce inkubovány 25 minut. Pak byl ke každému ze sloupců přidán vzorek, obsahující iozulio, značený '25i v mtoožtví 0,5 ml a sloupce byly inkubovány 25 minut. V průběhu této doby byly počítány impulsy přístrojem Gaimmaord (Mi.es Labooatooies, lne., Elkhart, Iodiaoa). Sloupce pak byly prom/ty 10 ml boritanového pufru a pak bylo opět provedeno počítání impulsů. Výsledky jsou uvedeny · v následující tabulce (% vázaného inzulínu je propočítáno tak, že se uvádí 100% vázané složky jako procenta kontroly):

Konoen0race · inzulínu · milkroOjdnotky/d % vázané složky

0100

2566

5043

10028

25017

Tyto údaje pak byly graficky vyneseny k vytvoření standardní křivky, takže bylo lze stanovit konocnOraci neznámých vzorků srovnáním s hodnotami této křivky.

Příklad 2.

Tento příklad se vztahuje na pouští způsobu a přístroje podle vynálezu při stanovení vit^imíou Bjg při pouužtí jkillOrtíoí metody.

a) Příprava přístroje

Vvótřoí faktor (17) pro vazbu vitamínu В · · (Ν^ρΙΛΗο^ Biochemicals Coop., Cleveland, Ohio) se kovalentně váže na CNBB-aktivovanou Sepharosu 4B (Pharmacia AB, Uppssaa, švédsko) způsobem, popsaným v subOikaci Scand, J. Clio. Lab.. Invest. 27, 151 (1971).· Sepharosa s oa.vázaoýrm vnitřním faktorem se ř.· 'í Sepharosou tak, že se 40 až 60 % radioaktivně značeného vitamínu B]2 zadrží ve sloupci pc provedení stupně b) v případě, že vzorek neobsahuje žádný vitamín B^g. Užžt byl radioaktivní vitemín В · · (cyaoocobalamin), dodávaný firmou Anersham Searle, Arlington Heights, Illioois. Zředěnájsměs byla uvedena v suspenzi, v 0,9% roztoku chloridu sodného a· plněna do injekčních stříkaček z plastické hmoty o obsahu 3 í., čímž byly získány sloupce o obsahu 1 ml Sepharosy stejně jako v příkladu 1b).

b) Provedení pokusu

Standardní · roztoky vitamínu byly připraveny v následujících konocntracích:

000 pg/d, 1 000 pg/d, 500 pg/ml, 250 ps/m¹» 125 pg/ml, 63 pg/ml a 31 pg/ml. Kontrolní vzorek bez obsahu vitamínu Bgg a sedm vzorků s obsahem tohoto vitimínu bylo smíšeno vždy s 0,5 m roztoku radioaktivně značeného vitimíou Bjg na konečný objem 1 ml.·Pak byla tato směs nanesena vždy na sloupec, připravený ve stupni a), a sloupce byly inkubovány 70 minut. Pak byly sloupce promyty 6 d p^ru [vyrobeného podle Scand. J. Clio. Lab. Invest. ·2Ζ» 151 (1971)] a byly po Čítány impulsy při pouHlí počítače Gřamaaood. Výsledky jsou uvedeny v oáledující tabulce, přičemž % vázané složky jsou propočítána tak, že 100 % této složky je vyjádřeno v procentech složky kontrolní.

2OO47V

Koncentrace vitamínu B₁₂ v pg/ml % vázané složky

0	100,0
31	94,9
63	87,8
125	79,8
250	65,6
500	44,7
1 000	24,2
2 000	13,6

Vzorky s neznámým obsahem byly stanoveny vytvořením cejchovací křivky a srovnáffím s touto křivkou, tak jak bylo uvedeno v příkladu 1c).

Příklad .3

Tento příklad se vztahuje na použití způsobu a přístroje podle vynálezu ke stanovení lidského placentárního laktogenu (HPL) při použití značeného HPL pomocí enzymu.

a) Příprava enzymaticky značeného HPL

HPL se značí peroxidázou způsobem, uvedeným v Immunochemistry 2, 43 (1969), s následujícími modifikacemi: 10 mg HPL a 10 mg peroxidázy z křenu se rozpustí v 1,4 ml 0,05 M uhličitanového pufru o pH 9, načež se к roztoku přidá 0,05 ml 3% roztoku glutaraldehydu. Směs se pak míchá při teplotě místnosti 90 minut a pak se dialyzuje proti 128 ml 0,1 M boriternového pufru o pH 8, přičemž pufr se několikrát mění.

b) Příprava přístroje

Přístroj se připravuje stejným způsobem jako v příkladu 1b).

c) Provedení

Naplněné sloupce se uvedou do rovnovážného stavu tak, že se к nim přidá 20 ml boritanového pufru o pH 9 a tento pufr se nechá protéci.,Jde o tentýž pufr jako v příkladu 1c). HPL-standardy byly vyrobeny pro koncetraci HPL 1 000 mg/ml a 62 ng/ml. Kontrolní vzorek bez HPL a oba vzorky HPL byly naneseny na slupce, připravené ve stupni b) v množství 0,5 ml a sloupce byly inkubovány 25 minut. Pak byl ke každému ze sloupců přidán vzorek HPL, značeného peroxidázou, vyrobený ve stupni a). Značený HPL byl přidán v množství 0,5 ml, inkubace sloupců byla opět 25 minut. Sloupce byly promyty 10 ml 0,1 M boritanového pufru o pH 8,3 ml 0,1 M fosforečnanového pufru o pH 6, načež byl ke každému ze sloupců přidán roztok subatrát- indikátor, který byl vyroben smísením 0,28 ml 0,03% peroxidu vodíku ve vodě 0,1 ml 0,25% roztoku 3,3^z-dimethylbenzidinu a 0,12 ml 0,1 M fosforečnanového pufru o pH 6, načež byly sloupce inkubovány 10 minut. Pak byly sloupce promyty 3 ml 0,01 N kyseliny solné a byla měřena optická hustota (OD) promývací kapaliny při 460 nm s následujícími výsledky:

Koncentrace HPL ng/ml	^OD46O	% vázaného barviva
0	’,2	100
62	0,96	63
1 000	0,78	35

Vzorky s neznámou koncentrací byly stanoveny při použití standardní křivky, připravené ze získaných údajů stejně jako v příkladu 1c).

Př í kl , ad 4

Tento příklad se týká použití způsobu a přístroje podle vynálezu ke stanovení antigenu hepatitidy B'při přímém radiolmunologickém stanovení.

a) Tvorba ' protilátek proti heppaitidě B

Aitiserum s obsahem protilátek proti hej^e^ai.ti^dě B bylo získáno způsobem, popsaným v The Journal of Imnmunlogy, 109. č. 4, str. 835.

b) Příprava přístroje

CINr-aktivovaná Sepharosa 4B (Pharmacia AB,iUppsaaa, Švédsko) byla nabobtnána v 0,001 M kyselině solné. Protilátky, obsažené v antise*ru, vyrobeném ve stupni a), byly navázány na nabobtnanou C№r-aktivovanou Sepharosu 4B tak, ie antiserm bylo smíseno s gelem Sepharosy 4B v poměru 5 ai 20 mg bílkoviny na 1 g aktivované Sepharosy 4B inkubací 1 hodinu při 25 °C. Výsledná směs byla míchána 17 hodin při 4 °C. Suspenze Sepharosy s navázanou protilátkou byla prom^a pufreu 0,1 M tria-(ydrooxmelhyl)minometh&n- 0,5 M' NaCC, jehoi pH bylo kyselinou solnou upraveno na 8,2 a pufrem s obsahem 0,1 M octanu. sodného a 0,5 K NaCC,· jehoi pH bylo upraveno, kyselinou octovou na 4,0. Promytý komplex byl uveden v · suspenzi v trisa(hyrdr^c^o^y^(^thy].)mi^r^c^m^^,thanu za vzniku 50% · suspenze a 1 ai 2 il této suspenze bylo plněno do plastických injekčních stříkaček Styleo (Pha)rnaseallLaktrrkoгiei, Glendale, СсН^ггП)) o obsahu 3 ml s podpůrnými kotouči z plastické hmoty.

c) Provedení

Pooitivní nebo negativní séra (vzhledem , k přítomno o ϋ antigenu · hepaaitidy B) byla přidávána do sloupců, připravených ve stupni,b) v objemu 0,1 ml, inkubace 30 minut. Pak byl ke kaiclému ze sloupců přidán vzorek, obsahující protilátku proti heppaitidě B, značenou ¹²⁵I, způsobem podle The Jou^a! Imnunnoogy, č. 4, str. 835 a rniroitví 0,1 ml a sloupce byly inkubovány 1 1/2 hodiny. Pak byly sloupce prouyty 25 ml puf™ s obsahem 0,1 M trsa-(УсГх* oxuuet(yL))мlrnouethkn - 0,5 M NaCl - 0,01 % Tween 20 (neiontové povrchově aktivní činidlo, dodávané·Atlas Powder Co., Wilminntoo,.Delawaae), načei byly počítány impulsy při pou2iií počítače gamma záření Goauaord. Bylo zjištěno, ie 12x více značené protilátky bylo zadrieno ve sloupcích s obsahem · pozitivních antisér nei ve sloupcích s obsahem negativních sér.

Claims

1. Způsob kvantitativního stanovení jedné ze sloučenin i páru sloučenin se videohrou specifickou afinitou v kapalném vzorku, v·něui je jako,pár , sloučenin se vzájemnou speelfickou aktivitou přítomna dvojice antiger a protilátka, hapter a protilátka, enzym a substrát, hormon · a receptor nebo vitími, a jeho receptor, vyzneaující se tím, ie se

- uvede!. ,ve styk mařice, udřená ve sloupci a popřípadě , předběirě uvedená ve styk s efodИЬг^,! kapalinou a kapalným vzorkem se sloučeninou, která je značenou formou jedné ze svrchu uvedených dvou sloučenin ze · spec laického páru, přičeui mařice je porézní a nerozpustná v kapalném roztoku a obsahuje iltžty, které váží a tak ^ο^ΙΙο^ sl^oiku, která má být stanovena, uaarice · · se uvede ve·styk s ^lučmí kapalinou, schopnou vymýt ze sloupce v podstatě veškerou nenavázanou značenou ^2^, která byla ve sloupci ponechána předem stanovené Sasové období pro provedení stupně předchozího, s výhodou s pufreu, a stanoví se poměrné množství značené složky, zadržené ve sloupci jako funkce množství složky, která má být stanovena, a které bylo uvedeno ve styk з matricí v prvním stupni ve formě kapalného vzorku.

2. Přístroj к provádění způsobu podle bodu 1, vyznačující se tím, že sestává ze sloupce (11), obsahujícího matrici (15), která je porézní a nerozpustná vzhledem ke kapalině vzorku a která obsahuje specifickou složku pro vazbu stanovené sloučeniny v imobilizovaném stavu.

3. Přístroj podle bodu 2, vyznačující se tím, že matrice (15) je vyrobena z polymerního materiálu.