CS139492A3 - Novel polypeptide and anti-hiv medicament prepared therefrom - Google Patents

Description

- 1 -

Nový polypeptid a z něho připravené anti-jÍHy/^^č^Vo; t' r-” C? j

Oblast technik? • -< r>,

I

Tento vynález se týká nového polypeptidu nebo jeho sole.Podrobněji se tento vynález týká nového polypeptidu, kterýmá silnou afinitu k lipopolysacharidům, zvláště endotoxinu,má zlepšenou protibakteriálni aktivitu a zlepšenou protivi-rovou aktivitu, jeho farmaceuticky přijatelné soli a anti--HIV činidla, který jako účinnou složku obsahuje uvedenýpolypeptid nebo jeho fátoaceuticky přijatelnou sůl.

Dosavadní stav techniky

Do dnešní doby (jak ukazuje následující literatura) by-ly Nakamurou, Iwanagou, Niwou a spol. popsány polypeptidy(tachyplesin a polyphemusin) odvozené od krabů podkovovitých.Tyto polypeptidy vykazují afinitu na endotoxiny. Byly popsá-ny také jejich farmakologické vlastnosti; J. Biol. Chem. 263, 16709 až 16713 (1988), Chem. Pharm. Bull. 32» 2661 až2664 (1989), japonský vyložený patentový spis č. 53799/1990,japonský patentový vyložený spis S. 152987/1990, japonskývyložený patentový spis č. 167230/1990, J. Biochem. 106. 663 až 668 (1989), Taisha (Metabolism) 26, 301 až 311 (1989)a publikovaná rešeršní přihláška 500194/1990«,

Pokud jde o polypeptidy s afinitou na endotoxiny, kte-ré byly isolovány z krabů podkovovitých (rodu Táhypleus.rodu Lumulus a rodu Carcinoscorpius). existuje podle nej-lepších znalostí výzkumníků pět strukturních analog. Každýz nich je polypeptid s cyklickou strukturou se 17 nebo 18přírodními aminokyselinami. Tyto polypeptidy mají navzájemmimořádně analogické vlastnosti. Takový polypeptid je ve-lice zajímavý jako jedna z klíčových sloučenin, která umož-ňuje krabům podkovovitým adaptovat se na změny jejich vněj-šiho prostředí /chránit svůj druh z pradávných dob až do dneš-ních časů jako žijící zkameněliny. - 2 -

Na druhé straně - ε ohledem na zachováni existencečlověka, který je vysoce diferencován - jsou žádoucí léky,o nichž se očekává, že mají profylaktický nebo terapeutickýúčinek na syndrom získané imunitní nedostatečnosti (AIDS)způsobený virem lidské imunitní nedostatečnosti.

Autoři tohoto vynálezu věnovali pozornost shora uvede-ným polypeptidúm afinitním na endotoxin, o nichž se domní-vají, že mají vztah k zachovávání druhů kraba podkovovitého.Autoři tohoto vynálezu studovali vztah mezi strukturnímizměnami těchto sloučenin a aktivitou na vir lidské imunit-ní nedostatečnosti (HIV), Výsledkem těchto studií bylo na-lezení polypeptidů, které se podstatně liší od obvykléstruktury známých polypeptidů z krabů podkovovitých s afi-nitou na endotoxiny, K velkému překvapení autorů bylozjištěno, že tyto nové polypeptidy mají vynikající účineka že jejich hodnoty proti-ELV aktivity jsou de^tkrát nebovícekrát větší než proti-HIV aktivity známého polypeptidů safinitou na endotoxin.

Podstata vynálezu

Tento vynález je založen na uvedených objevech a týkáse nového polypeptidů obecného vzorce 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1) 14 A _ Φ-A1 - )y s-A2-á j-Iy s-A^-A^-AyO ly-A^-A^-A^-A y 15. 16 17 18 A^-Cys-Arg-A^ (i)f v němž Aj znamená atom vodíku nebo jeden či dva zbytkyaminokyselin, jimiž jsou lysin a arginin, A2 nezávisle znamená zbytek tyrosinu, fenylalaninunebo tryptofanu, A-, nezávisle znamená zbytek argininu nebo lysinu, A^ nezávisle znamená zbytek ala^_ninu, valinu, leu- cinu, isoleucinu, šeřinu, cysteinu nebo methioninu, A^ znamená skupinu -OH (odvozenou od karboxylové skupiny) nebo skupinu -NH~ (odvozenou od amidové skupiny), - 3 -

Cys zněměná zbytek cysteinu, Gly znamená zbytek gly-činu, Lys znamená zbytek lysinu, Arg znamená zbytek ar-gininu a Trp znamená zbytek tryptofanu, cysteinové zbytky v polohách. 5 a 16 mohou být navázánydisulfidovou vazbou (-S_S-) a jestliže v obou polohách 7a 12 jsou cysteinové zbytky, mohou být navázány disulfi-dovou vazbou (-S-S}, nebo jejich soli. «

Nový polypeptid podle tohoto vynálezu má zásadně dů-ležitou vlastnost v tom, že i když ve známých polypeptidechodvozených od krabů podkovovitých zbytek aminokyseliny vpoloze 6 obvykle znamená zbytek valinu (Val), zbytek v po-loze 6 téchto nových polypeptidú podle vynálezu znamenázbytek lysinu (Lys). Zbytek bazické aminokyseliny má úplnějiné vlastnosti než zbytek valinu»

Nový polypeptid nebo jeho sůl podle vynálezu je po-drobněji popsán níže· Nový polypeptid podle vynálezu semůže připravovat známým způsobem, například metodou syntézyv pevné fázi. Konkrétné polypeptid podle tohoto vynálezu spřímým řetězcem shora uvedeného obecného vzorce I se můžezískat napojením karboxylové skupiny N-chráněného argininuna nerozpustnou pryskyřici s aminovými skupinami přímo neboprostřednictvím spaceru (vymezovace) s funkční skupinouschopnou navázač se na karboxylovou skupinu a Jarboxylovouskupinou, postupně se navážou způsobem syntézy v pevnéfázi příslušné chráněné aminokyseliny od polohy 16 do po-lohy 1 sekvence aminokyselin následujícího obecného vzorce I A-,-Trp-Cys-Ap-A,-Lys-A,-Ap-A ,-Gly-A,-A,-Ap-A12 J 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1? lí A^-Gys-Arg-A^ 15 16 17 18 (I), v němž A·^, Ap> A^, A^, Gys, Gly, Lys, Arg a Trp znamenajíjak shora uvedeno pro obecný vzorec I, a potom se eliminuje (odstraní) nerozpustná pryskyři-ce a chránící skupiny aminokyseliny. V tomto případu - 4 - karboxylový konec aminokyseliny v poloze 1? může být bučívolný (A^ odpovídá skupině -OH) nebo může být převeden naamid kyseliny (A^ odpovídá skupině -NH^). V získaném poly-peptidu pak dále dva cysteiny v polohách 3 a 16 mohou tvo-řit disulfidovou vazbu (-S-Sl) merkaptoskupinami. A dále, jestliže jak v poloze 7 tak v poloze 12 jsoucysteinové zbytky, mohou tyto cysteiny tvořit disulfi-dovou vazbu.

Pokud jde o tvorbu této disulfidové vazby, oba dvapáry cysteinových skupin mohou být převedeny na disulfi-dovou vazbu, například oxidací vzduchem. Nebo se disulfi-dová vazba může vytvořit podle způsobu, který uvádí Ather-ton E. a spol.: J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 1985» 2065* To se provádí v několika stupních. Nejdříve se selek-tivně chrání merkaptoskupiny kteréhokoliv páru cysteinů vpolohách 3 a 16 a 7 a 12 chránící skupinou t-BuS (terc.bu-tylthioskupina) a merkaptoskupiny druhého páru cysteinů sechrání chránící skupinou Acm (acetamidomethylová skupina),odstraní se t-BuS částečným oxidováním merkaptoskupin a na-konec se odstraní chránící skupina Acm podle známého způ-sobu. Příslušnými aminokyselinami, které se používají přizpůsobu syntézy v pevné fázi, mohou byt obecně I^-formy neboP-formy·

Pokud jde o nerozpustné pryskyřice s aminovou skupinou,které se používají při syntéze nového polypeptidu podle vy-nálezu, lze používat jakékoliv pryskyřice, pokud se mohouvázat svými aminovými skupinami na kar boxy lovou skupinu N-chráněného argininu na C-konci nebo v některém příkladu nakarboxylovou skupinu spaceru (vymezovače) na něj navázanéhoa následně eliminovat (^ostranit). Aíezi příklady takové nerozpustné pryljísyřice patříaminomethylové pryskyřice (aminomethylované styren-divinyl- - 5 - benzenové kopolymery), benzhydrylaminové pryskyřice, methyl-benzhydrylaminové pryskyřice a aminomethylfenoxymethylovépryskyřice a jejich deriváty atd· Jestliže se používá benz-hydrylaminová pryskyřice, methylbenzyhdrylaminová pryskyřice,dimethylbenzhydrylaminová pryskyřice (BM3HA pryskyřice)nebo aminomethylfenoxymethylová pr^kyřice, amid se přímozíská Štěpením, Z hlediska výtěžku je výhodná aminomethylo-vá pryskyřice.

Jako vymezovač (spacer) s funkční skupinou schopnounavázat se na karboxylovou skupinu a s karboxylovou skupinou,lze například uvést vymezovač schopný převést kerboxylovouskupinu argininu na p-karboxymethylbenzylester, ale nee-xistují žádná zvláštní omezení pokud jde o omezovač·

Chráněaá aminokyselina znamená aminokyselinu, jejižfunkční skupiny jsou chráněny chránící skupinou známýmzpůsobem, Ka trhu se prodávají různé chráněné aminokyseliny. Při syntéze polypeptidu podle tohoto vynálezu je vý-hodné vybrat jakoukoliv z následujících chránících sku-pin. Chránící skupina α-aminové skupiny aminokyseliny jeBoc (terč,butyloxykarbonylová skupina) nebo Fmoc (9-flurenylmethyloxykarbonylová skupina). Chránící skupinaguanidinové skupiny argininu (árg) je Tos (tosylová sku-pina), (ni- skupina) NC^, Mtr (4-methcxy-2,^,6-trimethyl-benzensulfonová skupina) nebo Pmc (2,2,5>7»8-pentamethyl-chroman-6-sulfonylová skupina). Jako chránící skupinu mer-kaptoskupiny cysteinu (Cys) lze uvést Bzl (benzylovou sku-pinu), MBzl (4-methoxybenzylovou skupinu), 4-MeBzl (4-me-thylbenzylovou skupinu), ácm (acetamidomethylovou skupinu),Trt (tritylovou skupinu), Npys (3-nitro-2-pyridinsulfenylo-vou skupinu), t-Bu (terc.butylovou skupinu) nebo t-BuS(terc.butylthioskupinu). Výhodnými chránícími skupinamijsou skupiny MBzl, 4-MeBzl, Trt, ácm a Npys· Chránícískupinou pro lydroxylovou skupinu tyrosinu je Bzl, Cl^BZl(2,6-dichlorbenzylová skupina) nebo t-Bu, ale tato skupinanesmí být chráněna. Chránící skupinou f-aminové skupiny - 6 - lysinu (Lys) je Z (benzyloxykarbonylová skupina), G1Z (2*-chlorbenzyloxykarbonylová skupina), 3oc nebo Npys, Je vý-hodné, aby jako chránící skupina byla vybrána příslušnáchránící skupina ze známých chránících skupin podle pod-mínek syntézy peptidu.

Kondenzaci chráněných aminokyselin lze provádět obvyk-lým kondenzačním způsobem, jako je například DCC metoda(dicyklohexylkarbodiimidová metoda), DIPCDI metode (diiso-propylkarbodiimidová metoda) ÍTartar A, a spol,: J. Org. Chem.44, (1979)3, metoda aktivního esteru, metoda směsného nebo syní7'etického anhydrídu kyselin, karbonyldiimiazolovámetoda, DCC-HOBt metoda (1-hydroxybenzotriszolová metoda)ÍKonig W. a spol,; Chem. Ber. 103, 788, 2024 a 2034 (1970).3nebo difenylfosforylazidový způsob. Výhodnými jsou DCC me-toda, DCC-HOBt metoda, DIPCDl-HOBt metoda a metoda symetric-kého anhydridu kyseliny. Tato kondenzační reakce se obvykleprovádí v organickém rozpouštědle, jako je například dichlor-methan nebo dimethylformemid nebo ve směsi takových r ozpou-štědel. Jako deblokační reakční činidlo (činidlo, kterýmse odstraňuje chránící skupina) chránících skupin u-smino-vé skupiny se používá trifluoroctová kyselina ·* dichlorme-than, kyselina chlorovodíková-dioxan, piperidin-dimethyl-for^mid nebo podobná směs. Příslušný výběr se provede po-dle druhu chránící skupiny. Stupeň postupu kondenzační re-akce v kaž.. ,m stupni syntézy se sleduje způsobem podle 3.Kaisera a spol. ÍAnal. Biochem. 34, 595 (1970) (ninhydri-nová metoda).).

Podle předcházejících způsobů se může získat pryskyřices chráněným peptidem, který má žádanou sekvenci aminokyselin.

Jestliže se jako nerozpustná pry^syřice použije amino-methyl-pryskyřiče, může se pryskyřice odstranit napříkladreakcí pryskyřice s chráněným peptidem s amoniakem v pří-slušném rozpouštědle. Výsledný chráněný peptid se pak necházreagovat s fluorovodíkem. Získá se tak amid pólypeptidushora uvedeného obecného vzorce, ze kterého jsou odstra- - 7 - něny všechny chránící skupiny. Jestliže se jako nerozpustnápryskyřice použije benzhydrylaminová pryskyřice, nethylbenz-hydryleminová pryskyřice, aminomethylfenoxymethylová prysky-řice nebo pryskyřice BMBH1 (Punakoshi S. a spol.: J. Chem.

Soc., Chem. Commun. 1932, 382,), pak se pryskyřice a chrá-nící skupiny mohou odstranit současně reakcí pryskyřice schráněným peptidem s fluorovodíkem, TFMSA (trifluormethen-sulfonová kyselina) [publikováno Academie Press, red· E.

Gross, Yajima Ξ.a spol·i The Peptides 69 (1983).3,

TlíBOTf (trimethylsilyltriflát) ÍPujii N. a spol.: J. Chem.

Soc·, Chem, Commun. 1987, 27^*3 nebo TMSBr (trimethylsilyl-bromid) ÍPujii N. a spol,: Chem. Pharm. Bull. 35« 3330 (1937).3nebo podobnými činidly.

Potom, jestliže je to žádoucí, výsledný po^lypeptidse zredukuje 2-merkaptoethanolem, DTT (dithiothreitolem)nebo podobným Činidlem, čímž se nrerkaptoskupiny cysteinuzískají v redukované formě. Oxidací se pak získá cyklickýpolypeptid podle tohoto vynálezu.

Oxidační reakce se provádí známým způsobem. Obvykle sepoužívá takové oxidační činidlo, jako je například vzdušnýkyslík nebo hexakyanoželezitan (například hexakyanozelezi-tan draselný). Takto získaný polypeptiise pak může isolovata vyčistit způsoby známými z oblasti polypeptidů, napříkladextrakc·, rekrystalizací, různými chromatografiemi (gelc-váfiltrace, na ionexu, rozdělovači, absorpční, s obrácenýmifázemi), elektroforesou, protiproudým roztřepáváním atd.Nejúčinnějšími je vysokoúčinná kapalinová chromátografiena obrácených fázích.

Jako specifické příklady polypeptidů podle tohotovynálezu obecného vzorce I lze uvést polypeptidy násle-dujících vzorců 1 až 22, V následujících vzorcích 1 až 22každý symbol označuje zbytek aminokyseliny podle mezinárodněpřijaté.'ό třípísmenkového kódu: Arg = arginin, Trp = tryp-tofan, Cys = cystein, Tyr = tyrosin, Lys = lysin, Gly = = glycin, Phe = fenylalanin, Ile = isoleucin, Ser = serin,Leu ~ leucin, Met = methionin, Val = valin a Ala = alanin. 8 OO ZZ". r%l F ť ) DO CJ e4 c-J ΓΤΖ 7ZL C'J 2-L C4 ¢-4 L2Z eJ r-J CJ LdZ Γ4 2^; I C'J { c-j r-j Γ4 vz ^r. i □Z | [ — í bů 1 bů 1 oo oo 1 oo 1 oo 1 oo í oc 1 oo CX> t bů bfl bo bú bO bO bo bů bů bů bů i i·^ u v Uc k-i v 1 - v V 1 - s~. 1- V 1 . —st -< -c -r: -c -c -< **“ I -c: i *c -c f ( 1 CO 1 to J to 1 to 1 tO i tO ( to 1 <0 1 to 1 to 1 to to to to co to tO to (O to to ,—, >. >, L>. *>-. >% >-. >ϊ >x >, >V >A p’-, >> >-* y>~i >» O O O O O o o o O i O 1 O I o O O ) O I O I O 1 C2> 1 O | o O f IO 1 tO 1 to 1 LO 1 co 1 to J co 1 to to b to 1 to 1 bo bfl bů 1 bů bů to to to to to co >, L~·^ >1 >» F >> v —, v v V >» >> >Λ >, >. s Xl _2 -21 _Ί -23 -23 —i .-3 -< -T- -c -< j —3 4 -2J i -23 -23 | —3 ( "ΓΓ 1 bů 1 OO 1 OO 1 OO 1 oo 1 oo 1 OO 1 oo 1 OÚ 1 bo 3 bO bů bů bů bů bů bů CO to bů bů ,-< V 3—i V V V 4 V, v v v v V V v V v V >1 í>> V V "**- -< -C —3' -c *c "*- j I j j i co f 1 V 1 l v 1 —-i 1 v. i v i 1 v ( v l v v 1 v 1 V v V to V V v J—< 2*^ >> F >> >1 >1 >. >> >. 3>* >. _£2 >» >. >. f—· F f - F f F f— F- F- F- F- F- F- F F- í—* j F- 1 Ο- Ι F 1 F | F 1 OQ 1 m 1 <0 3 CO 1 ω 1 to €0 i to f cO j (O i to i to co CO co to CO CO to CO cú to τ—1 >. >, >> >. >1 >- >> >x >. >» >> >, >, >> >> 1—i >1 O O O O O O o o O o | O 1 O 1 O 1 O I O [ O O | O i O i -c O | r-Η 1 o 1 ω 1 to 1 +-> 23 i to t Q) 1 <D i Cl 1 i—4 1 <D 1 ω 1 <D i v co CJ v V 23 T—< i —1 r-H r-H 1—1 o to < 4 Γ· Ϊ—t <D Λ r ( 1—t 1 t <D i—í <D to to to to σ3 l·—1 l·—{ F -23 1—1 f-H 1—1 1 (— *—I I 1 4 | CO 1 | .VI [ -23 1 oo J co i -23 | CD í >1 1 >* 1 t >-> t —’ΐ 1 ΐ>» t >, J >1 1 >> 1 >. 1 1 >ΐ >» >1 >. >» >> >. T—1 T-1 í 4 1 { r—4 T—! i—1 __( r™ 1—( 1 1—< » í , < ——4 τ-·4 i—( τ—·4 i—H τ—1 7—1 i—ť o o o O O O C3 o 1 co I o o 1 o o j e> _ j O i o | O J o | O | O t <2? | 1 bů 1 oo I oo oo 1 oo ( to 1 CO 3 <0 I to to 00 oo bO bů bů to CO <0 to to <0 cn V v v V v. >. >> >. v v Cl v v >> >1 >1 >> í>b -o -< -rit —} —3 -23 -23 -< -i- -c -21 —3 —3 | -2l r -21 1 —2 1 3-, 1 v ( v 1 V 1 v 1 V l v. í V l V 1 V 1 u 1 v 1 Ví V 1 V f=L CL to to v V oo >1 >> >» F >% >X >, >b >» >* >> >, >» >, >1 f - ( - f—1 F F ř— É—- F- F- f-w F- F* I F“· I F- I F- I ř— I F- CV cu | F1 F I 1 CO 1 v? to 1 ω i to co to 1 to I CO l co I to ( <0 1 to 1 co CO to to to CO <ΰ <0 C-— >> >> >-* f >1 >» >> >, >* >< >% >> r*-4 i—1 O O o o O o -O o o o ( o o O I O O I O J O J o o -c 1 to co 1 to 1 CO 1 to 1 co 1 CO 1 to to I co 1 co 73 1 co CO co CO to CO to to co >» >> >» F >» >1 >* >> >·. >% >> >> >% >» >» -2l —2 -21 —2 -2 —1 _21 —23 —3 —2 -23 j —3 i .—3 t I -2 t -21 | -2 j ~-2 i 2 I -23 | 1 bů t OÚ 1 oo I 00 oo OO 1 oo oo OO bo J bO 1 bO i bO bO bů bů bQ <0 CO bů bů to V v V v v v Ví v v v v V V V v V V >· >> V V -rC -< “'C -r: -c -c -c -c -r í -c 1 -< | I | -< | -2 | -23 I -el 1 -c 1 l V v 1 v Γ 1 —i 1 v 1 l I l 1 •L, to to r—1 >> >, F >-* >. í>í >> >* v. V x: 22 >-k F F F F f F F"1 F— F^ (- » e- E—’ i F* I t— i t— | F- | Cu t σ- ι F j F 3 co 1 co 1 co t co I to 1 co 1 to 1 to co I w 1 co 1 to CO <0 (O V) CO to ¢0 to to co >* >> >, >> >. F >1 >» >> >, >» >, >, >* >. >, O O O o o o o O o O o i O 1 o O $ O I O 1 O | O 1 O 1 O I O ! 1 cx 1 Cl 1 cx l CL CL CL Cl 1 CL 1 CL l cx 1 Cl 1 Cl CL ο- O. Cl CL CL CL CL CL co V V v Ví V v v V V V íi Vt ν C V V V V V F F E—” F F t— F- €- F- t— F-1 f- ) F- | F I f— ] F· ( F | F ( F F 1 oo 1 oo 1 OO l oo I oo 1 OÚ 1 OO bii bo bů bfl b£ bo bfl bů bů bů bů Ί , v v v V u v u Cl v V Lc i-. V V V V v -<c -< -< -c -< < I -ť -< -2 t -< | 1 oo oo 1 oo OO bo 1 bů bů bů bů v V Ih v v V V V -rC -< -«t; -< -c z-"\ ,—\ z— z^-\ Z-X s~\ i c i co ' 7 O ( O r— oo co

Ol CO -ττ to to Γ- 1—I 1—i 1—l 1—I 1—( ’ 1 OO O O oη h c-q cí 2 2) Arg-Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Tyr-Lys-Gly-Ile-Ser-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH; - 9 -

Takto získané polypeptidy podle vynálezu obecného vzor-ce I mají ( podobně jako známé polypeptidy odvozené od kra-bů podkovovitých) schopnost vázat se na endotoxiny, majíantibakteriální aktivitu, mají aktivitu hemolyzovat hemocy-ty citlivé na endotoxin, mají protivirovou aktivitu azvláště pak mají dobrou protivirovou aktivitu proti virůmlidské imunitní nedostatečnosti (HIV). Tyto polypeptidymají desetkrát nebo vícekrát vyšší anti-HIV aktivitu než známý polypeptid Tachyplesin I. Některé z těchto polypeptidůmají několik tisíckrát vyšší anti-HIV aktivitu než Tachyple-sin I.

Pokud jde o strukturní vlastnosti známých polypeptidůodvozených od krabů podkovovitých, bylo zjištěno, že díkyexistenci zbytku 4 Cys v polohách 5, 7, 12 a 16 zaujímajístrukturu/^skládaného listu, takže v polohách 9 a 10 jeohnuta 0-turnem, část peptidu od polohy 3 ho polohy 8 a částpeptidu od polohy 11 do polohy 16 jsou k sobe přikloněny aČtyři zbytky Cys v polohách J a 16 a v polohách 7 a 12 jsousvázány příslušnými disulfidovými vazbami (-S-S-). Jakostrukturní vlastnosti pro projevení se antivirové aktivitypolypeptidů, jejichž zbytek v poloze 6 byl změněn na Lys,jsou pro sloučeniny podle vynálezu zásadně nutné strukturníčásti sekvencí konstitutivních aminokyselin navzájem mimo-řádně podobných, jak je vidět u yCys Lys přikloněné

Je charakteristické, že dalším navázáním bazické aminokyse-liny v k těmto strukturním částem v poloze 1 se získátaková struktura, která má mimořádně vysokou anti-HIVaktivitu.

Polypeptid podle vynálezu obecného vzorce I má bazickévlastnosti díky vlastnostem konstitutivních aminokyselin.Vytváří tedy s kyselinami soli. Například polypeptid tvořísůl s anorganickou kyselinou (kyselinou chlorovodíkovou,kyselinou bromovodíkovou, kyselinou fosforečnou, kyselinoudusičnou, kyselinou sírovou nebo podobnými kyselinami) ne-bo s organickou karboxylovou kyselinou (kyselinou octovou, - 10 - kyselinou propionovou, kyselinou maleinovou, kyselinou jan-tarovou, kyselinou jablečnou, kyselinou citrónovou, kyseli-nou vinnou, kyselinou salicylovou nebo podobnými kyselinami)nebo s organickou sulfonovou kyselinou (například methansul-fonovou kyselinou, p-toluensulfonovou kyselinou nebo podob-nými). Polypeptid podle tohoto vynálezu obecného vzorce Ise může používat jako takováto farmaceuticky tsůj)při jatelná. Léčivo podle vynálezu se připravuje jako farmaceutickýprostředek, který jako účinnou složku obsahuje polypeptidobecného vzorce I nebo jeho súl a farmakologicky přijatelnýnosič, který se vybere podle způsobu podávání a formy po-dávání léčiva» Léčivo podle vynálezu se podává orálně neboparenterálně podle objektu, který je léčen nebo dezinfikována to aí jde o léčení in vivo virového onemocnění nebo odezinfikování in vitro virové infekční části. Léčivo semůže připravovat jako prášek, granule, roztok pro injekcenebo orální podávání, tobolky, Čípky, mast, krém nebo ae-rosol s příslušnými farmaceutickými nosiči podle způsobupodávání.

Jestliže se léčivo podle vynálezu podává přímo injekcído živého těla» polypeptid nebo jeho sůl podle vynálezu semohou podávat kontinuálně nebo přerušovaně v množství 10až 5θθΟ mg na kg tělesné hmotnosti člověka za den a intra-venosní kapačkou jako roztok ve fysioiogickém solném roztoku.

Na připojeném výkresu je jako příklad uvedeno schémastupňů syntézy nového pdypeptidu podle vynálezu.

Tento vynález je dále podrobně popsán pomocí příkladů,ale není těmito příklady omezen. Příklady provedení vynálezu V následujících příkladech jsou použity následující přístroje a následující reakční činidla: HPLC aparatura - Waters Co. (USá) model 600, kolona ásahipak 0LP-9Q (Jisshi - 11

Chemical Industry Co., Ltd.), Fmoc aminokyselina vyrobenáfirmou Kokusan Kagaku Co., Ltd., aminopryskyřice a konden-zační činidlo vyrobené firmou Peptide Kenkyusho Co., Ltd.a pro FAB-MS byl používán FAB-hmotový spektrometr VG Co.(USA), model ZAB-SE. Příklad 1

Syntéza polypeptidu následujícího vzorce A Arg-Trp-Cys-Tyr12 2 4

Arg-Lys-Cys-Tyr-Arg-Gly-lle-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-NH^ (A) 5 6 7 8 9 10 11 12 12 14 15 16 17 18

Ve shora uvedeném vzorci A Arg, Trp, Cys, Tyr, Lys,Gly, Ile znamenají zbytky shora uvedených aminokyselin,zbytky Cys v polohách 2 a 16 a v polohách 7 a 12 jsou spo-jeny příslušnou aisulfidovou vazbou. (1) Zavedeni Fmoc-DMBHA-CHgCHgCOOH í(2-(a-Fmoc-amino-4-me-thoxybenzyl)4-methoxy-fenyl)propionóvá kyselina] 270 mg (0,2 mmolu) aminomethylové pryskyřice (0,74mi li ekvivalentu na gram) a 268,5 mg (0,5 mmolu, 2,5 ekviva-lentu) Fmoc-DMBHA-CHgCH^COOH (molekulová hmota 537) se umí-stí do kolony pro syntézu v pevné fázi. Kondenzační reakcese provádí dvě hodiny způsobem DIPCDI-HOBt v dimethylform-amidu po ile metody lup L, a sp'I. (Clem. Pharm. Bull. 26,4989 (1988». Po ukončení kondenzační reakce se provedereakce, jíž se chrání volné aminové skupiny působením anhy-dridu kyseliny octové (DMBHA pryskyřice). (2) Zavedení argininu z polohy 17 do DMBHA pryskyřice řo odstranění Fmoc skupin z DMBHA pryskyřice připra-vené podle odstavce (1) působením 20% piperidinu v dimethyi-formemidu se přidá 2,5 ekvivalentu Fmoc-Arg/®ti/OH vztaženona DMBHA pryskyřici. Kondenzační reakce se provádí v dime-thylformaaidu podle DIPCDI-HOBt metody. Postup kondenzačníreakce se sleduje měřením ninhydrinovým testem podle Kaiseraa spol. (And. Bločkem. ^4, 595 (1970).), - 12 - (5) Zavedení cysteinu z polohy 16

Po odstranění Pmoc skupin z D^ELA pryskyřice, která se připraví podle odstavce (2), do níž byl zaveden arginin,působením 20% piperidinu v aimethylformamidu, se přidá 2,5 ekvivalentu Emoc-Cys(M3zl)-QH vztaženo na DfóBHA prysky-řici. Kondenzační reakce se provádí v dimethylformamidupodle DIPCLI-HOBt metodyf podobně jako je tomu v odstavci(2) se postup kondenzační reakce sleduje měřením ninhy-drinovým testem. (4) Zavedení aminokyselin od polohy 15 do polohy 1

Podobně jako shora uvedeno byly zbytky Lys(Boc),

Arg(iítr), Tyr(t-Bu), Cys(MBzi), Ile, Gly, árg(Mtr),Tyr(t-Bu), Cys(MBzl), Lys(Boc), árg(lítr), Tyr(terc.Bu),Cys(MBzl), Trp a árg(Mtr) postupně zavedeny do BMBHApryskyřice podle sekvence od C-koncové aminokyseliny. Získá se tak pryskyřice s peptidem A chráněným chránícískupinou. Kondenzační reakce každé aminokyseliny při syntézev pevné fázi se provádí podle podmínek, které jsou uvedenyv následující tabulce.

Tabulka I operace činidlo rozpouštědlo dobaxpočet opakování odstranění Pmoc skupiny 20% piperidins dimethylform- amidem Diú? 5 minut x 5 promytí — LMF 1 minuta x 6 kondenzace Fmoc-aminokyse-lina (2,5 ekv„)+ DIPCDI + HOBt DME 2 hodina x 1 promytí — BMP 1 minuta x 4 - 13 - (5) Příprava peptidu vzorce A odstraněním chránících skupin,postup odstranění pryskyřice a částečné Čištění

Pryskyřice s peptidem vzorce A chráněným chránící sku-pinou, která se připraví podle postupů uvedených v odstav-cích (1) až (4), se nechá zreagovat s 20% piperidinem vdimethylformamidu. Odstraní se tak skupina Fmco. Potom seprovede dvouhodinová reakce při 25 °0 v systému 1M TíáSOf- -thioanisol-TPá (10 ml trifluoroctovékyseliny v přítomnosti m-kresolu (100 ekvivalentů·) a ethan-thiolu (500 ekvivalentů) na 100 mg pryskyřice. Pryskyřicese odfiltruje od reakční směsi a promyje se dvakrát 1 mltrifluoroctové kyseliny. Ke směsi filtrátu a promývacíchpodílů se přidá 100 ml ledem ochlazeného suchého etheru.Vytvořená sraženina se odstřeluje. Zbytek se oddělí od su-pernatantu dekantací. Výsledný zbytek se promyje studenýmetherem, rozpustí se v 10 ml 4N kyseliny octové, přidáse 85Ο mg (80 ekvivalentů) dithiothreitolu a směs se míchápřes noc za teploty místnosti.

Reakční roztok se odstřeluje, supernatant se pak nane-se na Sephadex G-l0 (5,7 x 50 cm) a zfiltruje se na gelupromýváním 4N kyselinou octovou. Prakce, které projdouSephadexem bez zastavení, se spojí jako hlavní eluční část.Lyofilizací se získá prášek částečně vyčištěného necyklizo-vaného polypeptidu vzorce A, (6) Příprava polypeptidu vzorce A vzdušnou oxidací

Hodnota pH poloviny frakcí, které při gelové filtraci projdou Sephadexem bez zastavení, se koncentrovaným vodným amoniakem upraví na 7,5. Tento roztok se oxiduje provduš- nováním, aby proběhla cyklizační reakce. Po ukončení vzdušné* . oxidace se zcyklizovaný polypeptid vzorce A adsorbuje na10 g pryskyřice Diaion HP-20, desorbuje se a eluuje se 60%acetonitrilem (v 1H kyselině octové). Eluát se zahusti zateploty místnosti a za sníženého tlaku, aby se odstranilacetonitril. Lyofilizací se získá prášek, ^ento prášekse rozpustí v malém množství vody. Roztok se nanese naásahipak a vyčistí se vysokoúčinnou kapalinovou chromáto-grafií (HPLC-híodel 600 vyrobený firmou řííaters Co.). - 14 -

Gradientovou elucí acetonitrilem se získá peptid vzorce Ajako jediné maximum ve výtěžku 27 % (vypočtená hodnota je za-ložena na vztahu k pryskyřici s peptidem vzorce A chráněnýmchránící skupinou). (7) Analýza polypeptidu

Složení aminokyselin polypeptidu vyčištěného podle sho-ra uvedeného postupu v odstavci (6) podle štěpení aminopep-tidasou dobře odpovídá vypočtenému složení na základě sek-vence aminokyselin vzorce A. Hodnota molekulové hmoty podlehmotové spektrometrie (PAB) byla 2310,048, vypočtená hod-nota (M+H)+ byla 2309,736. Specifická rotace získa- ného polypeptidu byla + 14,2 0 (c =; 0,3» 1N kyselina octová). Příklad 2 a srovnávací příklady 1 a 2

Protivirová aktivita na virus lidské imunitní nedostatečnos-ti (HIV)

Protivirová aktivita proti HIV polypeptidu vzorce Akterý byl syntetizován v příkladu 1, byla tepována s vyhod-nocována následujícím způsobem.

Buňky MT-4 infektované HIV (2,5.10^ buněk na jamku,multiplicita infekce (MGl)í 0,001) byly naneseny bezpro-středně po infekci spolu s testovanou látkou v různýchkoncentracích na mikrotitzcvaci degku s 96 jamkami. Popěti dnech inkubace při teplotě 7 0 v CX^ inkubátoru se po- čet buněk, které přežily, změřil MTT metodou (Pauwels aspol.í J. Virol. Methods 20, 309 až 321 (1988).). Proti-virová aktivita je vyjádřena jako koncentrace, při kterézasažení buněk HIV infekcí je inhibováno z 50 % (EC 50znamená 50 % efektivní koncentrace). Na druhé straně, abyse zjistila cytotoxicita testované sloučeniny na buňkyMT-4, inkubují se virem neinfektované buňky, podobně jakobylo shora uvedeno, s testovanou sloučeninou v různýchkoncentracích. Cytotoxicita je vyjádřena jako 50% cytoto-xická koncentrace (CG 5θ) testované sloučeniny. A dále, - 15 - hrubý poměr CC 50 k EC 50 (CC 5O/ED 50) je vyjádřen jakoefektivní poměr (SI). V tabulce II jsou uvedeny hodnoty EC 5θ» CC 50 a SIpolypeptidu V2orce A, tachyplesinu I, známého polypeptidu safinitou na endotoxiny, a azidothymidinu, anti-HIV-činidla.Poslední dvě sloučeniny jsou uvedeny pro srovnání.

Tabulka II testovaná látka CC 50 EC 50 (yUg/ml)(/Ug/ml) SI příklad 1 polypeptid (A) 59 0,55 110 srovnávacípříklad 1 tachyplesin I 49 18,1 5 srovnávacípříklad 2 azidothymidin (AZT) 0,80 0,0004-8 1700

Jak je zřejmé ze shora uvedené tabulky, polypeptidvzorce A podle vynálezu má poněkud siln^ěší cytotoxicitunež tachyplesin I, jehozanti-HIV aktivita byla již dříveobjevena, ale vykazuje protivirovou aktivitu v koncentraciI/5O. Při srovnání s azidothymidinem má polypeptid vzorce AEC 50 při vyšší koncentraci, ale má 60-krát vyšší CC 50»což ukazuje nízkou cytotoxicitu. Příklad 5

Tabulka III ukazuje strukturní vzorce a fyzikální vlastnosti různých polypeptidu podle vynálezu připravených stej-ným způsobem jako v příkladu 1 a jejich protivirové aktivityna HIV, které byly testovány a vyhodnocovány podobně jakov příkladu 2.

Ve sloučeninách tohoto příkladu ve shora uvedené ta- bulce jsou zbytky Cys v polohách 3, 7, 12 a 16 spojeny disul· fidovou vazbou mezi polohami 3 s 16 a polohami 7 a 12, pokud není uvedeno jinak. Ve shora uvedené tabulce "AZT” znamená azidothymidin (obvyklý název i zidovudin). 16

Tabulka III

η (3H) znamená redukovanou formu (3) 17

Podle tohoto vynálezu se získává nový poljpeptid nebojeho sůl s protivirovou aktivitou proti viru lidské imunitní nedostatečnosti (HIV) a anti-HIV činidlo, které jako u-činnou složku obsahuje tento nový poljpeptid nebo jeho sůl

Claims (6)

18 - PATENTOVÉ NÁROKY 1* Nový polypeptid obecného vzorce I A1-Trp-Cys-A2-A^-Lys-A4-A2-A^-Gly-A4-A4-A2-A^-A^-Cys-Arg-A5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1S (1), v němž Aj znamená atom vodíku nebo jeden či dva zbytky ami-nokyselin, jimiž jsou lysin a arginin, A2 nezávisle znamená zbytek tyrosinu, fenylalaninunebo tryptofanu, A, nezávisle znamená zbytek argininu nebo lysinu, JL nezávisle znamena zbytek ala ninu, valinu, leuci- nu, isoleucinu, šeřinu, cysteinu nebo methioninu, ir znamená skupinu -OH (odvozenou od karboxylové sku-— ----- P ! piny) nebo skupinu -NH^ (odvozenou od amidové skupiny), _______ Cys znamená zbytek cysteinu, Gly znamená zbytek gly— ~'r'činu, Lys znamená zbytek lysinu, A.rg znamená zbytek argi- i ?··;' ninu a Trp znamená zbytek tryptofanu a ; cysteinové zbytky v polohách 3 a 16 mohou být navá-í * zány disulfidovou vazbou (-S-S-) a jestliže v obou polohách7 a 12 jsou cysteinové zbytky, mohou být navázány disul- fidovou vazbou (-S-S-), { nebo jeho sul* í

2. Anti-HIV č.-nidlo, vyznačující se tím, ---že jako účinnou složku obsahuje nový polypeptíd obecnéhovzorce I i j-Tr p~Cy s-A 2-A ^-I/y s -A4-A 2-A ^-Gly -A4-A4 -A 2»A ^-A Cy s - Ar g-A - 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 (I), v němž A^ znamená atom vodíku nebo jeden či dva zbytky a-minokyselin, jimiž jsou lysin a arginin, A2 nezávisle znamená zbytek tyrosinu, fenylalaninu nebo tryptofanu, A^ nezávisle znamená zbytek argininu nebo lysinu, A4 nezávisle znamená zbytek alaninu, valinu, leucinu, - 19 - isoleucinu, šeřinu, cysteinu nebo methioninu, A^ znamená skupinu -OH (odvozenou od karboxylové skupiny) nebo skupinu (odvozenou od amidové skupiny), Cys znamená zbytek cysteinu, Gly znamená zbytek gly-cinu, Lys znamená zbytek lysinu, Arg znamená zbytek argi-ninu a Trp znamená zbytek tryptofanu a cysteinové zbytky v polohách 3 a 16 mohou být navázány disulfidovou vazbou (-S-S-) a jestliže v obou polohách7 a 12 jsou cysteinové zbytky, mohou být navázány čLisulfi-dovou vazbou (-S-S-), nebo jeho sul. Zastupuje: Aminomethylová pryskyřice | (l) Fmoc-DMBHA ♦ propionová kyselina DMBHA pryskyřice Kondenzace chráněných aminokyselin v pořadí podlesekvence peptidu v (2) Fmoc-Arg(Mtr)-DMBHA pryskyřice J,

(3) Fmoc-l^CystMBzl )-^^Arg(Mtr )DMBHA pryskyřice I

(4) Pryskyřice, kde se kondenzují aminokyseliny (chrá-* něné) v polohách 15 až 1 DMBHA pryskyřice s polypeptidem vzorce I chráněným chránící-mi skupinami

(5) Odstranění chránících skupin a pryskyřice a redukceRedukovaná forma polypeptidu vzorce A Ar g- Trp-C y &amp;- Ty r- Ar g- Ly s- (j: y s- Ty r- Ar g- G1 y-11 e- j! y s- Ty r-' Ar g- Ly s-SH SH SH -CySwArg-NH9 I 2 SH

(6) Oxidační cyklizace, vyčištění (HP adsorbce na pry-skyřici, desorbce, HPLC chromatografie) Polypeptid vzorce A ______— - ' “ — ' i f L\?rňC Obrázek 1