CN87106371A - 加压式培养装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及的是加压式培养装置。

本发明的特征是在培养槽上设置了溶存氧浓度检测手段，根据该检测手段测出的值控制氧流量调节部分，将培养槽内保持在氧加压状态，此外，还设置了向培养槽提供培养基的手段和培养液循环流路，能有效地交换培养液。用本发明之装置能进行长时间高密度地培养。

Description

本发明为加压式培养装置。详言之为在体外高密度培养细胞或需氧微生物的加压式培养装置。

在体外高密度培养细胞或需氧微生物时，必须向培养槽内的培养液中供给充足的氧和排除培养液中产生的废物，且需充分地进行培养液交换以补充营养成分。对前者来说，已知有：添加血红蛋白或添加作为氧载体的溶解氧相当于水20倍的氟化碳等（杉野幸夫编、“细胞培养技术”讲谈社，1985.P133）、在常压下进行培养的装置，以及在上述培养槽内的培养液上面或该液中设置可以通气的氧气导入管，在常压下使氧气和该培养液接触或在该液中使之起泡的装置等。对于后者，必须从培养液中分离出细胞，为此采用将含细胞的培养液直接过滤或利用细胞的比重比培养液大的细胞沉淀管方式（杉野幸夫编、“细胞培养技术”讲谈社，1985，P.148）。

但是，培养液中添加多余的物质会导致从培养液中回收、分离精制生产物质时的操作变的复杂，而且在培养液上面通入氧气，由于培养液搅拌速度的不同，其效率受到影响;向培养液中通气虽然能提高效率，但存在使培养液发泡引起细胞破坏等各种问题。

另一方面，从上述培养液中分离细胞，直接过滤培养液时，很快会发生堵塞，因而不能长期使用;采用细胞沉淀管方式时如果周围温度不恒定，会在沉淀管内产生对流，则不能从培养液中分离出细胞，进而，由于能分离的培养液的量受到细胞沉淀速度的限制，以致在进行高密度培养时存在培养液不能充分交换等问题。

鉴于上述情况，本发明提供了能供给高密度培养所需要的足够量的氧并能充分进行培养液交换的加压式培养装置。

本发明具备：可将细胞或需氧微生物的培养液密闭贮存在内部的培养槽;连接该培养槽内上部空隙的从供氧部通过流量调节部能将氧送到上述培养槽内和供氧用管路;同样接在上述培养槽上且通过排气调节部能将上述培养槽内的气体排出的排气用管路;搅拌培养液中培养液的搅拌手段;检测培养液中溶存氧浓度的溶存氧浓度检测手段，以及根据该溶存氧浓度检测手段的检测输出控制上述调节部、以便能保持培养槽内处于氧加压状态的控制部分。

提供的加压式培养装置还设有往培养槽补给培养基的培养基供给手段和培养液的循环通路，并在该循环通路的途中插设不透过细胞等的、但能透过培养液中溶解成分的过滤管路的培养液过滤手段。

本发明装置的构成是根据培养液中溶存氧的浓度自动将培养槽内保持在氧加压状态，从而强制性地使氧溶解在培养液中，并且能充分地供给氧量。其特征是在培养液的循环过程中将培养液中的溶解成分排到该循环流线外，还设置了向培养槽内供给新培养基且能有效地将培养液进行交换的培养液交换手段。

本发明装置是以细胞和需氧微生物（以下称细胞等）作为对象的高密度培养装置。

用于本发明装置的培养槽最好是由培养液贮存槽以及以能装卸的形式安装在该槽上且可以密封该槽的盖体构成。因此，如下所述，安装在培养槽上的规定部件及管路，最好安装在上述的盖体上。此时规定部件及管路的安装应能保持上述密闭状态。

用于本发明装置的供氧管路的安装应能在上述培养槽内的空隙中留有开口。上述供氧管路通过流量调节部分接到供氧部分。在该供氧部分用高压氧气瓶或根据需要用压缩机，以便能按该供给部的供给氧压将上述培养槽内保持在加压状态。上述流量调节部采用能密闭该管路或能调节该管路内氧气流量的结构，例如电磁阀、针阀等。也可在该供氧管路上设置除菌过滤器。

用于本发明的排气管路，其安装应能在上述培养槽内的空隙中留有开口。在上述排气管路上设有排气调节部分。该排气调节部采用能闭锁管路或能调节排气量的结构，例如电磁阀，针阀等。上述排气管路也可以单独延伸到下水道。

用于本发明装置的搅拌手段，只要能使培养液的溶存氧浓度均匀，任何手段均可，但是从不破坏培养液中的细胞等且能将培养槽内的加压状态保持恒定的观点来看，最好是使用磁性搅拌器、搅拌用搅拌桨等的机械装置。

用于本发明装置的溶存氧检测手段，最好是溶存氧电极（DO传感器）。该浓度检测手段接在后述的控制部分上。

上述控制部分有能存储规定溶存氧浓度的存储部;该存储值和用上述溶存氧浓度检测手段测定的测定浓度值进行比较的比较部;根据该比较部的输出信号，上述供氧管路上的调节部分、排气管路上的排气部分和氧气供应部分工作。上述存储部分所存储的溶存氧浓度值根据培养对象物培养时需要的氧量而有所不同，最好为5ppm左右。上述比较部分，当测定浓度值比存储浓度值小时，上述调节部分及排气部分根据比较部分的信号进行工作以致能闭锁各管路，然后供氧部分工作。当该供氧部使用压缩机时，该压缩机根据比较部的信号进行工作。通过该工作使培养槽内处于氧加压状态，而该加压相应于上述存储浓度值最好在0.3～0.7kg/cm²左右。

此外，在本发明装置的培养槽中附设带有过滤手段的培养液循环流路和培养基供给手段。由附设的这些循环流路和培养基供给手段构成培养液交换手段。上述插设的过滤手段采用了主要由不透过细胞等但能透过培养液中溶解成分的过滤器管路组成的装置，即采用了过滤器的面对着循环流路、设在同一轴上，因而当培养液通过该流路的循环过程中，能将上述透过成分排至该循环流路之外，由这种结构构成的所谓横流式装置。上述过滤手段的结构最好是能在循环流道上装卸。上述过滤器管路最好是陶瓷制成的。

上述循环流路中设有输液手段。该输液手段最好是蠕动移液泵。

上述培养基供给手段是由培养基贮槽和从该贮槽通过输液手段接到培养槽的培养基输送用管路构成。上述输液手段最好是蠕动移液泵。该培养基供给手段是在培养槽内的贮存培养液比规定量减少时进行工作，其操作最好能自动控制。该自动控制机构最好是能根据培养槽内培养液的液面变动进行输液手段的工作，例如，在培养槽内设置液面传感器，根据该液面传感器的输出信号，控制上述输液手段的驱动或停止。

根据需要，还可在本发明装置中设置至培养槽的二氧化碳供给管线及空气输入管线。即，当在防止培养液的pH值偏移到碱性侧时，需要供给二氧化碳;在供氧量过多细胞等产生障碍时，为了降低培养槽内的氧浓度则有必要输入空气。上述二氧化碳供给管线及空气输入管线可以各自具有调节部件并独立配置，还可以各自具有调节部件以管线形式接到上述供氧管上。

本发明之培养槽中可以设置普通的培养液pH测定手段和控制培养液温度的手段。

按照本发明，能在培养槽内保持氧加压状态，由此能使氧气强制性地溶解在培养液中，以致溶存氧经常以高于一定浓度的状态存在，因此能高密度地进行细胞或需氧微生物的培养。培养液由设有过滤手段的循环流路循环，因此可以将培养液中的溶解成分排至该循环流路之外，又可以将细胞分离出来并残留在该流路内，培养液通过循环再次返回培养槽中。此外，由培养基供给手段提供新鲜培养基，在培养槽内将以贮存一定量的培养液。

以下根据实施例详细说明本发明，但本发明并不受实施例的限制。

实施例：

图1是本发明之加压式培养装置的一实施例的构成说明图。图中，加压式培养装置（1）由培养槽（2）、搅拌装置（3）、DO传感器（4）、控制部分（5）、供氧管路（a）、排气管路（b）构成。

培养槽（2）具有可以密封的培养液注入口和排出口（图中设示出），且设有搅拌装置（3）。设置该搅拌装置的目的是搅拌培养液并使该培养液中的溶存氧浓度均匀。

供氧管路（a）由氧气瓶（6）顺次通过电磁阀（7）、流量计（8）、除菌过滤器（9）、洗气瓶（10）与培养槽相接、排气管路则通过电磁阀（12）及除菌过滤器（11）与培养槽（2）相接。

控制部分（5）包括存储部分（51）和浓度比较部分（52），存储部分（51）存储预先设定的溶存氧浓度的浓度值。浓度比较部分（52）与DO传感器（4）相接，对用该DO传感器测定的溶存氧浓度和上述存储浓度值进行比较。根据该浓度比较部分传出的信号，控制部分（5）使供氧线（a）上的电磁阀（7）及排气管线（b）上的电磁阀（12）进行开闭动作。

以下说明本装置的操作。

首先将应该设定的溶存氧浓度预先贮存在存储部里。另一方面在培养槽内贮存含有细胞或需氧微生物的培养液并搅拌之。在该状态下将供氧管线上的电磁阀和排气管线上的电磁阀都处于开启状态，并在培养液上使氧气接触通过。然后，关闭上述各电磁阀，在此状态下开始培养。此期间在控制部分的浓度比较部用设置在该培养液中的DO传感器测出来的溶存氧浓度和开始设定的浓度值进行比较。如果在该状态下培养下去，培养液中的溶存氧为细胞或需氧微生物所消耗，则用DO传感器测出的浓度值会低于上述有储浓度值。这样，供氧管路上的电磁阀及排气管路上的电磁阀工作至开启状态并由氧气瓶供给氧气使其通往培养液上面。如果在此状态下继续进行培养，细胞密度或需氧微生物的密度就会变高，该培养液中溶存氧的消耗速度加快，象上述那样仅仅靠在培养液上面通氧气是不能维持上述存储浓度值的。这种状态意味着用DO传感器测出的测定值比上述记忆浓度值低，而此时控制部分进行工作仅使上述排气管路上的电磁阀关闭，其结果是在培养槽内由于供氧而呈加压状态。在此状态下氧气强制性地被溶解在培养液中，培养液中的溶存氧浓度变高，使培养继续进行达到高密度的培养效果。

以下对装置加以说明，该装置中装有向培养槽进一步补给培养基的培养基供给手段和培养液的循环流路，并在该循环流路的途中插设有不让细胞透过而让培养液中溶解成分透过的过滤器组成的培养液过滤手段。

图2是本发明之加压式培养装置一实施例的构成说明图。图中，加压式培养装置（1）主要由培养槽（2），搅拌手段（13）、供氧手段（23），排气手段（15），培养基供给手段（16），培养液过滤手断（17），控制部分（18）组成。

培养槽（2）由培养液贮存槽和可以装卸能使它密闭的盖体组成。在该盖体的规定位置上分别设有，DO传感器（21）、pH电极（22）、液面传感器（23）及后述的各管路。在该培养槽上还设有图中未示出的温度调节器，其结构为能将培养液的温度保持稳定。

搅拌手段（13）中采用了磁性搅拌器。（31）是其旋转体。通过该搅拌手段搅拌培养液，使该培养液中的溶存氧浓度变得均匀。

供氧手段（14）由从未图示的氧气瓶开始依次通过电磁阀（4），除菌过滤器（42）并接到培养槽（2）之盖体上的供氧管路（a）组成。该管路（a）在培养槽内的上部空间开口设置。在该管路的电磁阀（41）和除菌过滤器之间也可设置洗气瓶。氧气流量用附属在气瓶上的流量计调节。

排气手段（15）由排气用管路（b）构成，该排气用管路在培养槽内的上部空间开口，并安装在培养槽（2）的盖体上，顺次将除菌过滤器（151）及电磁阀（152）进行管路接续，并延伸到图中未示出的排气口。

培养基供给手段（16）由贮存新鲜培养基的培养基罐（61）和培养基供给用管路（c）构成，培养基供给用管路在培养基罐（61）的底部近傍开口，通过蠕动移液泵（62）接到培养槽（2）的盖体上，并且在培养基槽内的上部空间开口。

培养液过滤手段（17）是由，在培养槽内的底部附近开口且安装在盖体上，并顺序通过蠕动移液泵（71）、过滤部分（72）、再次接到盖体且在培养槽内的上部空间开口设置的培养液循环流路（d）构成。上述过滤部分（72）采用横流式过滤装置。也就是将具有筒状过滤面的过滤器管路插设到上述循环流路（d）上，以致过滤面设置在与该流路的同一轴上，在该过滤管路的外侧收容滤液的外筒状容器。该过滤器管路是按可以交换安装的。在上述过滤部分（72），上滤液排放管路（e）通过蠕动移液泵（73）接到培养液回收罐（74）上。

（f）是与二氧化碳瓶相接并有电磁阀（19）的二氧化碳供给管路，（g）是与空气瓶相接、并有电磁阀（20）的空气导入管路。

控制部分（8）分别与DO传感器（21）、pH电极（22）、液面传感器（23）、电磁阀（41）、（52）、（9）、（10）、蠕动移液泵（62）、（71）、（73）、电气相接，控制它们的工作。该控制部分主要由控制培养液中溶存氧浓度的溶存氧浓度控制系统，和控制培养液交换的培养液交换控制系统构成。在上述溶存氧浓度控制系统中，有存储部和浓度比较部，存储部存储预先设定的溶存氧浓度的浓度值。浓度比较部是对DO传感器测出的溶存氧浓度值和上述存储浓度值进行比较。而且根据来自浓度比较部的信号，供氧管路（a）上的电磁阀（41）及排气管路（b）上的电磁阀（152）进行开闭动作。在上述培养液交换控制系统中，根据液面传感器（23）是否接通，该养基供给手段的蠕动移液泵进行一定时间的工作。

以下说明装置的工作。

溶存氧浓度的检测及供氧，由于与图1示出装置的工作相同，因而省略，只对培养液的交换进行说明。

首先，根据控制部的指令，设在培养液循环流路上的蠕动移液泵起动，使培养槽内的培养液循环通过该流路。随着该循环，在该流路的过滤部分，溶解在该流路内培养液中的废物和培养基成分等的溶解成分，从过滤管路浸出而排至该流路之外，而由此分离并残留的培养细胞随循环流再次返回至培养槽内。上述排出的溶液成分通过设置在回收管路上的蠕动移液泵的工作送到培养回收罐。由于这种过滤操作，培养槽内的贮存培养液量减少，随之液面下降，一旦预先设定的液面传感器离开液面，该传感器就不会接通，这将成为液面检测信号并输到控制部，根据输出功率值，培养基供给手段的蠕动移液泵进行一定时间的工作。从而，新鲜的培养基能定量地供入培养槽内，能更加高密度地进行培养。

采用上述图2示出的装置培养人淋巴系统细胞NAT-30的结果示于图3。下面列出此时的各种条件。

培养液量：500ml

培养基：牛血清白蛋白、胰岛素、铁传递蛋白、乙醇胺、亚硒酸钠添加RDF培养基

培养条件：温度37℃

搅拌转数60rpm

DO5.0ppm

pH7.2

培养液交换率    1.0l/天

过滤器管路：孔径10μm

外径10mm，内径7mm，长200mm的陶瓷过滤器

图3的结果证明，用本发明之装置可以长期进行高密度培养。

按照本发明，培养液中氧气用加压方法被强制地溶解，并且通常是存在超过一定浓度的溶存氧，因此能以比原来更高的密度培养需氧微生物，而且能从少量的培养液中回收大量的细胞生产物。还由于没有必要往培养液中添加供氧用的物质，故可以很容易进行细胞生产物的回收、分离精制。该装置还可长期而有效地进行培养液更换。因而能长期进行高密度培养。

以下简单说明附图

图1、图2是本发明之加压式培养装置的一实施例构成说明图，图3是采用本发明装置培养人淋巴系细胞时的培养时间和细胞密度关系的曲线图。

（2）……培养槽    （3）……搅拌手段

（4）……DO传感器    （15）……排气手段

（16）……培养基供给手段

（17）……培养液过滤手段    （8）……控制部分

（21）……DO传感器    （22）……pH电极

（23）……液面传感器    （31）……旋转体

（61）……培养基罐    （72）……过滤部分

（41）、（52）、（9）、（10）……电磁阀

（62）、（71）、（73）……蠕动移液泵

（a）……供氧管路

（b）……排气管路

（c）……培养基供给管路

（d）……培养液循环流路

（e）……滤液排出管路

（f）……二氧化碳供给管路

（g）……空气导入管路

Claims (4)

1、加压式培养装置，该装置中具备：能将细胞或需氧微生物的培养液密闭地贮存在内部的培养槽、能从供氧部分通过流量调节部分将氧供入上述培养槽内的供氧管路、能从上述培养液中通过排气调节部分将培养槽内气体排出的排气管路、搅拌培养槽内培养液的搅拌手段、检测培养液中溶存氧浓度的溶存氧浓度检测手段、以及根据该溶存氧浓度检测手段的检测输出功率控制上述调节部分从而能将培养槽内保持为氧加压状态的控制部分；

上述供氧管路是在处于培养槽内液体上部的空隙部分开口，以便由它供给的氧实际上不会使培养液起泡，排气用管路是在上述空隙部分开口。

2、权利要求1所述的加压式培养装置，其中控制部分备有存储规定溶存氧浓度的存储部、对存储在该存储部的存储浓度和用溶存氧浓度检测手段测定的测定浓度进行比较的比较部，并能对供氧部分、流量调节部分及排气调节部分发出动作指令，以致当该测定浓度值小于上述存储浓度值时向培养槽供给氧直到溶存氧浓度超过上述存储浓度值，从而使该槽内保持氧加压状态。

3、权利要求1所述之加压式培养装置，其中装设了向培养槽中补给培养基的培养基供给装置和培养液的循环流路，并在该循环流路途中插设了由不透过细胞但能透过培养液中溶解成分的过滤器管路组成的培养液过滤手段。

4、权利要求1所述之加压式培养装置，其中，供氧管路上至少接有二氧化碳供给管路及空气导入管路的任何一种。

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