CN2826438Y - 肝炎与肝硬化的集成检测反应板和蛋白芯片试剂盒 - Google Patents

Abstract

本实用新型涉及肝炎、肝硬化与肝癌的诊断，预测和预后的六项指标：乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg，丙型肝炎病毒抗体HCVAb，甲胎蛋白(alpha－fetoprotein，AFP)，α－L－岩藻糖苷酶(α－L－Fucosidase，AFU)，单胺氧化酶(Mono amine Oxidase，MAO)，透明质酸(hyaluronicacid，HA)集成检测反应板和蛋白芯片试剂盒。所述的反应孔板包括基板和位于基板上的反应孔，所述的反应孔包括2－384个样本孔，2－8个标准品孔，其中，每一反应孔的底部有固相载体，且在固相载体上包被着抗HBsAg，HCVAg，抗AFP，抗AFU，抗MAO，抗HA等六种或以上抗原或抗体的微点阵。本实用新型的反应板和试剂盒可简便、快速、准确地实现多个人份的乙丙型肝炎、肝硬化与肝癌的诊断，预测和预后的六项指标的同时检测。

Description

肝炎与肝硬化的集成检测反应板和蛋白芯片试剂盒

技术领域

本实用新型属于体外临床检验和生物芯片技术领域，确切地说，是一种适用于肝炎、肝硬化与肝癌的诊断、预测和预后的六项指标(HBsAg，HCVAb，AFU，AFP，MAO，和HA)集成检测的反应板和试剂盒。

背景技术

病毒性肝炎是法定乙类传染病，具有传染性较强、传播途径复杂、流行面广泛、发病率高等特点；部分乙型、丙型肝炎患者可演变成慢性，并可发展为肝硬化和原发性肝细胞癌，对人民健康危害甚大。

我国是乙型肝炎大国，全世界75％的乙肝患者都集中在我国。6亿多人已感染过乙肝，约1.3亿人携带乙肝病毒，其中3000万人患有慢性肝炎，又有约30％的慢性肝炎病人发展为肝硬化，其中部分可发尘肝癌，每年因肝病死亡的人数近30万，其中半数为肝癌。尤其严重的是携带乙肝表面抗原的孕妇，其中约40％可直接通过母婴垂直传播使婴儿感染，每年约有80万～100万新生儿成为乙肝病毒携带者。

丙型肝炎主要通过输血及血制品和不洁注射等途径而引起传播，感染患者易发展成慢性肝炎、肝硬化及肝癌。最新调查显示，全国有4000万丙肝感染者。据临床观察研究发现，急性丙肝感染后约50％～70％可转为慢性，20％的人最终发展为肝硬化或肝癌，且其演变为肝癌的速度较乙肝病毒引起者来得快速。

乙型肝炎和丙型肝炎的临床诊断以病原学和血清学诊断为主，乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)是乙型肝炎的特异性免疫学诊断标志，而抗HCV是检测丙型肝炎的主要指标。

乙型肝炎和丙型肝炎引起的慢性肝损均可导致肝硬化的发生。人类肝硬化的病理改变多数较为缓慢，从肝细胞的损伤、炎症甚至坏死，到细胞外基质(ECM)的异常增生和沉积，需要经过数年甚至数十年的时间，平均大约3～5年的时间。由于肝脏具有很强的代偿功能，有时即使肝硬化处于进展活动期，患者的临床表现也不典型；即使患者表现有症状，也往往缺乏诊断特异性。目前为止，基于肝脏活检的病理学诊断仍然为肝硬化诊断的金标准。但其为创伤性诊断，具有致损伤甚至潜在的致死性危险，病人顺从性差，费用较贵。此外，还存在以下一些缺点。首先是标本误导的可能性，典型的莫过于在弥散性的肝脏病变中只能检测一个纤维化的阶段，如活检标本较小，也可能发生标本误导，如会有一个或两个汇管汇高区时，或会有一个肝细胞的小叶，但不会有周围的细胞外基质；另外，在不同的肝脏病理学家之间，在对肝纤维化的分类和程度的评判方面也可发生高达25％的差异；第三，一次的肝活检只是提供静态的信息，不能反应细胞外基质产生和降解之间平衡的动态变化，也不能充分地揭示出潜在性的病原学机制。基于以上种种原因，肝纤维化的无创性诊断越来越引起医生和患者的注目。

目前，在临床上应用较多的是MAO(单胺氧化酶)、HA(透明质酸)、层黏蛋白(LN)等指标。测定它们的血清含量，可反映肝脏内皮细胞、贮脂细胞和成纤维细胞的变化，如果它们的血清水平升高常常提示患者可能存在肝纤维化和肝硬化。

肝纤维化时，多种ECM的组成和含量均发生了明显的变化，参与ECM代谢酶类也有相应的改变。通过对血清中有关酶类的检测，对肝纤维化具有诊断意义。单胺氧化酶(MAO)是一些单胺类物质的氧化酶，分布于肝、脑等器官的线粒体中和血浆中。胶原合成时，MAO催化原胶原分子上的赖氨酰残基，促进胶原分子内和分子间的共价交联，形成稳定的胶原纤维。肝纤维化后期，MAO可升高；门脉-中央静脉纤维间隔形成者80％升高，假小叶形成者绝大多数升高。

透明质酸(HA)是由间质细胞合成的一种大分子葡胺多糖，分布在各种结缔组织中。肝脏中的内皮细胞是血液中HA清除的主要场所。肝纤维化后期至肝硬化时，肝窦内皮细胞的窗孔因毛细血管化减少或消失，血清中的HA可显著增高。所以，一旦HA明显增高，常提示纤维化程度较重，或已在肝硬化阶段。

因为血清学指标比明显的临床症状出现早，在健康人群中定期或不定期的进行肝炎、肝硬化相关血清指标的检测，对于肝脏疾病的早发现、早治疗有着重要意义，有利于肝病的预防，改善预后状况。另一方面，由于乙肝、丙肝容易诱发肝癌，在对肝炎患者检测肝炎指标的同时检测肝癌相关指标也有重要意义。

甲胎蛋白(AFP)被广泛用于原发性肝癌的早期诊断及肝癌手术疗效的监测、术后的随访以及高危人群的随访。病毒性肝炎、肝硬化患者AFP浓度有不同程度的升高，但其水平通常低于100μg/L。其升高原因主要是由于受损伤的肝细胞再生而幼稚化时，肝细胞便重新具有产生AFP的能力，随着受损肝细胞的修复，AFP逐渐恢复正常。

值得提出的是α-L-岩藻糖苷酶(AFU)，血清AFU测定以其对检出小肝癌的高敏感性，对预报肝硬变并发肝癌的高特异性，和与AFP测定的良好互补性，而越来越被公认为是肝癌诊断、随访和肝硬变监护的不可或缺的手段。国内对24例肝细胞癌患者进行血清AFU和AFP相关研究，发现AFU诊断敏感必为87％，特异性为78％，而AFP则分别为65％和89％(诊断界限为，20ug/L)。提示AFU诊断的敏感性好，而特异性较AFP低。血清中AFU活性和阳性率与肝癌直径大小无明显相关性。小肝癌组血清AFU阳性率70.8％显著高于AFP(37.5％)。AFP阴性和AFP升高而不足以诊断原发性肝癌者，其血清AFU的阳性率达80.8％。肝组织活检证实为原发性肝癌者，血清AFU的阳性率为AFP阳性率的3倍以上。在肝硬化患者中检测AFU，如其活性增加，对发现一些较小的肿瘤更具有价值，此时AFP不能对较小的肿瘤做出诊断。因此，应用和推广AFU作为原发性肝癌新的诊断指标，具有重要的意义，尤其是AFP阴性和小细胞肝癌的诊断价值更大。因与AFP无明显相关可互补诊断，联合检测可提高肝癌的检出率。

目前的血清学检测方法以ELISA方法为主，每次只能检测单个指标，在进行多指标检测上费时、费力、费钱，难以满足人数众多的检验市场，不利于体检的日常化、平民化普及。蛋白芯片技术与免疫诊断技术相结合产尘的诊断用蛋白芯片技术是最近几年来新兴的高科技技术，在多指标并行快速检测方面有着无可比拟的优势，具有集成化、高通量、自动化、微型化、信息化等特点，是免疫诊断的发展方向。本实用新型通过对六个指标的快速检测实现对肝炎、肝硬化与肝癌的诊断，预测和预后，对疾病的预防和治疗有着重要的指导意义。

发明内容

本实用新型的目的是提供一种可同时对乙丙型肝炎、肝硬化与肝癌进行预测，诊断和预后判断的方法。我们的试剂盒通过检测血清或血浆中的HBsAg，HCVAb，AFU，AFP，MAO和HA这六项或六项以上指标，来达到这一目的。

在本实用新型的第一方面，提供了一种乙丙型肝炎、肝硬化与肝癌的诊断和预测六项指标集成检测反应板，反应孔板包括基板和位于基板上的反应孔，所述的反应孔包括2-384个样本孔，1-300个标准品孔，其中，其特征在于：每一反应孔的底部有固相载体，且在固相载体上包被着抗HBsAg，HCVAg，抗AFP，抗AFU，抗MAO，抗HA等六种或以上抗原或抗体的微点阵。在每一反应孔内还设有一定位基准点。

在一优选例中，所述的固相载体是NC膜、或PDVF膜。

在另一优选例中，所述样本孔的数量为1-300个。

在另一优选例中，所述的抗HBsAg，HCVAg，抗AFP，抗AFU，抗MAO，抗HA等六种抗原或抗体在固相载体上各有2-8个点样点。

在另一优选例中，所述反应孔每孔设有一个定位基准点。

在本实用新型的第二方面，提供了一种乙丙型肝炎、肝硬化与肝癌的诊断和预测六项指标集成检测试剂盒，它包括本实用新型上述的乙丙型肝炎、肝硬化与肝癌的诊断和预测六项指标集成检测反应板。

在另一优选例中，还包括：酶标工作液、检测液和标准品。

在另一优选例中，所述的酶标工作液由HRP标记的相应抗原或单克隆抗体组成，所述的检测液由发光物和过氧化氢二种试剂组成，使用前混合。

在另一优选例中，所述的发光物为鲁米诺、异鲁米诺或其衍生物。

附图说明

图1是本实用新型一种固相载体上乙丙型肝炎、肝硬化与肝癌检测的六项指标的点样示意图

图2是本实用新型的反应孔中进行的各抗原——抗体反应的示意图

具体实施方式

乙丙型肝炎、肝硬化与肝癌六项指标集成检测的关键是要使六项指标检测的灵敏度和特异性均达到要求以保证结果的准确司靠，而相应的难点是如何将浓度差高达10000倍的各检测指标整合到一个孔里来检测。经过深入而广泛的研究，本实用新型采用两种不同的反应方式进行检测，并对检测反应板作了改进，同时本实用新型采用的微点阵检测技术，酶免疫夹心法和化学发光检测技术，大大提高了检测的灵敏度和特异性，从而解决了上述问题。

具体而言，为提高乙丙型肝炎、肝硬化与肝癌六项或六种以上指标(HBsAg，HCVAb，AFU，AFP，MAO和HA)的检测效率，本实用新型应用微点阵检测技术，结合酶免疫夹心法和化学发光检测技术设计了一种乙丙型肝炎、肝硬化与肝癌六项指标集成检测反应板，反应孔板包括基板和位于基板上的反应孔，所述的反应孔包括2-384个样本孔，1-300个标准品孔，其中，其特征在于：每一反应孔的底部平面上有固相载体，且在固相载体上包被着抗HBsAg，HCVAg，抗AFP，抗AFU，抗MAO，抗HA等六种或以上抗原或抗体的微点阵。

各反应孔的数量没有特别限制，通常样本孔为2-384个，较佳地2-50个。标准品孔1-300个，较佳地2-8个。

在本实用新型中，反应孔的形状和大小没有特别限制，可以是圆形、方形、六角形、椭圆形、或其他形状。大小通常为直径0.1nm-8cm，深度为0.1nm-4cm。

在本实用新型中，反应板基板的材料可以选用本领域常用的各种材料，较佳的基板材料包括玻璃、塑料、陶瓷等。

在本实用新型中，包被乙丙型肝炎、肝硬化与肝癌抗原或抗体的固相载体可以选用本领域常用的各种固相载体，包括(但并不限于)：玻璃片、塑料、硝酸纤维(NC)膜、PDVF膜等，较佳的固相载体包括NC膜、PDVF膜。

在固相载体上，各有抗HBsAg，HCVAg，抗AFP，抗AFU，抗MAO，抗HA等六种抗原或抗体2-8个点样点，较佳地2-5个点样点。此外，较佳地在固相载体上还包括一个定位点(见图1)。各点样点之间的距离通常为0.1nm-20mm。

另一方面，本实用新型还提供了一种乙丙型肝炎、肝硬化与肝癌六项或以上指标集成检测蛋白芯片试剂盒，该试剂盒可实现多指标并行化、微型化、高通量检测。它包括本实用新型的反应孔板、洗涤液、酶标工作液、检测液(A、B)、标准品等。其中，酶标工作液由HRP标记的相应抗原或单克隆抗体组成，检测液由发光物和过氧化氢二种试剂组成，发光物为鲁米诺、异鲁米诺或其衍生物，使用前混合。

在本实用新型中，各指标的检测采用酶免夹心法或竞争法，检测原理如图2所示。详细叙述如下：

1)将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。封闭，除去未结合的位点。

2)加受检血清和酶标溶液，酶标溶液包含六项检测指标的相应的酶标抗体(夹心法)。采用夹心法检测的指标，特异的酶标抗体与血清中的抗原形成复合物，并进一步与固相抗体形成双抗夹心复合物。

3)洗涤除去未结合的抗体，抗原及杂质。

4)加底物：固相上的酶催化底物，化学发光，CCD检测，光强度与标本中受检抗原的量呈正相关。

本实用新型巧妙地综合利用了蛋白质微点阵检测技术，酶免疫夹心法和竞争法，以及化学发光检测技术，实现了乙丙型肝炎、肝硬化与肝癌六项指标的同时检测。

下面结合具体实施例，进一步阐述本实用新型。应理解，这些实施例仅用于说明本实用新型而不用于限制本实用新型的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

检测反应板的制备

取96孔板，设置42-84个样本孔，1-8个标准品孔。在每个反应孔的底部放置一固相载体(NC膜或PDVF膜)，且在固相载体上包被着抗HBsAg，HCVAg，抗AFP，抗AFU，抗MAO，抗HA等六种抗原或抗体的蛋白质微列阵(图1)。

实施例2

试剂盒制备

制备含一乙丙型肝炎、肝硬化与肝癌六项指标集成检测的试剂盒，它含有实施例1的反应孔板一块(8-200人份)，洗涤浓缩液1瓶，酶标工作液1瓶，检测液A一瓶，检测液B一瓶，标准品瓶。

洗涤浓缩液、酶标工作液、检测液A、检测液B

实施例3

乙丙型肝炎、肝硬化与肝癌六项指标集成检测

按以下方法对各测试血请样品进行检测：

1.加检测血请或标准品于相应反应孔内，100ul/孔。

2.加酶标工作液，75ul/孔。

3.30℃保温振荡反应60分钟。

4.用洗液洗涤4-6次，每次5分钟，振动。

5.加检测液40ul/孔，使检测液均匀分布于孔的底部。

6.CCD检测，视发光信号强度曝光3-20秒。

结果判定：

依据不同指标的CutOff值，参考标准品梯度曲线，判定样品血清的阴阳性。

与此同时，用常规方法对测试的血清样品进行常规检测。结果表明，用本实用新型的试剂盒得出的测试结果与常规方法相同。

在本实用新型提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本实用新型的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本实用新型作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权力要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.一种肝炎、肝硬化与肝癌的诊断和预测六项指标集成检测反应板，其特征在于，反应孔板包括基板和位于基板上的反应孔，所述的反应孔包括2-384个样本孔，1-300个标准品孔，其中，其特征在于：每一反应孔的底部有固相载体，且在固相载体上包被着抗HBsAg，HCVAg，抗AFU，抗AFP，抗MAO，抗HA等六种或以上抗原或抗体的微点阵，在每一反应孔内还设有一定位基准点。

2.如权利要求1所述的反应板，其特征在于，所述的固相载体是NC膜、或PDVF膜。

3.如权利要求1所述的反应板，其特征在于，所述样本孔的数量为1-300个。

4.如权利要求1所述的反应板，其特征在于，所述的抗HBsAg，HCVAg，抗AFU，抗AFP，抗MAO，抗HA等抗原或抗体在固相载体上各有2-8个点样点。

5.如权利要求1所述的反应板，其特征在于，在每一反应孔内还设有一定位基准点。

6.一种肝炎、肝硬化与肝癌的诊断六项集成检测蛋白芯片试剂盒，其特征在于，它包括权利要求1所述的肝炎、肝硬化与肝癌的诊断和预测六项指标集成检测反应板。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包括：酶标工作液，检测液和标准品。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的酶标工作液由HRP标记的相应抗原或单克隆抗体组成，所述的检测液由发光物和过氧化氢二种试剂组成。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的发光物为鲁米诺、异鲁米诺或其衍生物。

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