CN207294757U - 一种人egfr基因四重多位点突变检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

一种人EGFR基因四重突变检测试剂盒由盒体A和盒体B组成。盒体A包括：1个带关门式磁扣盒盖的盒体、1个海绵衬底、1个装有无核酸酶的超纯去离子水的1.5mL离心管、1个装有T790M检测引物及探针混合物的1.5mL离心管、1个装有L858R检测引物及探针混合物的1.5mL离心管、1个装有19外显子缺失检测引物及探针混合物的1.5mL离心管、1个装有阳性质控物的1.5mL离心管、1个装有阴性质控物的1.5mL离心管、12个装有相同体积数字PCR反应预混液并带独立管盖的八连管。盒体B包括：1个带有盒盖的盒体、1张光滑玻璃纸衬底、1个卡槽隔盒、1个光盘卡槽、1张光盘、1套包括3组数字PCR芯片的组件。本实用新型试剂盒完全基于一种新的实验方法而设计，使得检测更加精确、方便、快捷。

Description

一种人EGFR基因四重多位点突变检测试剂盒

技术领域

本实用新型涉及一种EGFR基因四重多位点突变检测试剂盒，属于生物医学核酸检测试剂盒技术领域。

背景技术

近年来针对EGFR基因为分子靶点的癌症治疗的地位越来越受到国内外的重视。许多研究显示EGFR基因突变与TKI药物的疗效密切相关。EGFR基因突变已成为癌症患者是否对TKI药物敏感的强预测因子。其中，EGFR基因突变包括四种情况，EGFR基因的20外显子第790位点蛋氨酸(M)替代苏氨酸(T)的T790M突变、外显子21上的替代突变(L858R和L861Q)以及外显子19缺失突变的。美国FDA以及NCCN指南已规定TKI药物的治疗必须依据EGFR基因检测结果选择治疗对象，筛选最合适的患者进行有针对性的靶向治疗，以提高药物疗效。因此，检测EGFR基因的突变状态是决定患者是否能够应用EGFR-TKI药物治疗的先决条件。目前，基因突变检测方法主要有一代测序法和基于实时定量PCR的ARMS两种方法。一代测序又被称为Sanger测序，其检测周期长(需要1-2天)，且灵敏度低，仅能检测到10％以上的突变。ARMS法又称为扩增阻碍突变系统(Amplification Refractory Mutation System，ARMS)。由于其检测方便快速，ARMS法已成为基因突变检测最常用的方法，但其灵敏度仅为1％。但是肿瘤组织样本获取难度较高，难以满足动态监测的需要，因此，基于血液样本的液态活检技术成为肿瘤组织检测的重要补充样本。血液检测除了可用于筛选EGFR-TKIs的适治患者，还可以动态监测靶向治疗过程中肿瘤标志物的变化，特别是可用于发现新出现的耐药相关基因的变异。与肿瘤组织相比，血液检测EGFR基因突变具有高度的特异性(IPASS、IFUM和IGNITE研究中特异性分别是100％、99.8％和97.2％)，但敏感性都较低(IPASS、IFUM和IGNITE研究中敏感性分别是43.1％、65.7％和49.6％)。因此，利用血液进行液态活检，在具有高度检测特异性的同时，提高灵敏度的检测技术对于EGFR基因耐药突变检测尤为重要。

目前市场上还没有一种完全适用于临床需求的能够快速简便以及灵敏准确同时检测EGFR基因T790M、L858R、L861Q、19缺失四种突变的试剂盒。为了有效提高EGFR基因突变检测灵敏度，非常有必要提供一种基于液态活检的EGFR基因多突变的高灵敏检测方法，以满足越来越细化的临床精准医疗的迫切需求。

实用新型内容

针对现有EGFR检测试剂盒的不足，本实用新型提供了一种能够简单快速高灵敏度检测EGFR基 因四重22个突变位点的试剂盒。

为了实现上述目的，本实用新型所采用的技术解决方案：

一种人EGFR基因四重多位点突变检测试剂盒，其特征在于，包括两个盒体，盒体A包括：1个带有关门式磁扣盒盖的盒体、1个固定海绵衬底、1个装有无核酸酶的超纯去离子水的1.5mL离心管、1个装有T790M检测引物及探针混合物的1.5mL离心管、1个装有L858R和L861Q检测引物及探针混合物的1.5mL离心管、1个装有19外显子缺失检测引物及探针混合物的1.5mL离心管、1个装有阳性质控物的1.5mL离心管、1个装有阴性质控物的1.5mL离心管、12个八连管；所述的八连管，为每个管带有独立的管盖，并分别装有相同体积的数字PCR反应预混液。盒体B包括：1个带盒盖的盒体、1个光滑玻璃纸衬底、1个卡槽隔盒、1张光盘、1套数字PCR芯片。

其中，盒体A中所述关门式磁扣盒盖为独立的左盒盖和右盒盖两个盒盖组成，两个盒盖大小相同，左盒盖的左端设有磁扣搭件，右盒盖的左端设有磁扣搭件；所述的固定海绵衬底置于盒体底部，海绵衬底上具有打好的管孔；所述的1个装有无核酸酶的超纯去离子水的1.5mL离心管、1个装有T790M检测引物及探针混合物的1.5mL离心管、1个装有L858R和L861Q检测引物及探针混合物的1.5mL离心管、1个装有19外显子缺失检测引物及探针混合物的1.5mL离心管、1个装有阳性质控物的1.5mL离心管、1个装有阴性质控物的1.5mL离心管、12个带独立管盖的八连管分别置于1个固定海绵衬底的管孔中。盒体B中所述光滑玻璃纸衬底为固定于盒体B的底部；所述的1个卡槽隔盒固定于盒体B的左侧，将盒体B分成两部分，隔盒上具有打好的卡槽，放置1张光盘；所述的光盘内存有数字PCR的校准文件；所述PCR芯片为具有1个独立透明硬塑料外壳包装，里面有3组数字PCR芯片及配件；所述3组数字PCR芯片的每个芯片底部分别贴有唯一的识别条形码。

进一步，所述盒体A中的固定海绵衬底，优选使用白色。

进一步，所述盒体B中的光滑玻璃纸衬底，优选使用无色PET材质的玻璃纸。

本实用新型试剂盒是基于一种新的检测方法而设计，设计简单合理、储存操作方便、制作合理简易；本试剂盒中设置的关门式磁扣盒盖为左右互相重叠搭在一起，能有效阻隔外界污染源的影响。所用到八连管内已装有检测用的数字PCR预混液，而且每个八连管的管盖都是独立开合的，因此可以防止配液及加样时反应管之间的交叉污染，使得检测操作更为简单方便。所用到的光滑PET玻璃纸可以有效避免数字PCR芯片包装底部与盒体底部的摩擦，减少荧光信号采集时的误差，保证了数字PCR芯片荧光信号读取时的准确性。所用到的光盘是本试剂盒非常独特的设计，是其他相关种类试剂盒所不具有的，光盘内存有数字PCR的校准文件，为检测数据的比对与归正提供了技术支持。同时，所用到的数字PCR芯片的每个芯片底部分别贴有唯一的条形码，也是本试剂盒所独有的设计，可以直接扫描条形码保存检测病人的信息及检测数据即可，使得检测更加方便快捷。

附图说明

图1是本实用新型一种人EGFR基因四重多位点突变检测试剂盒盒体A的结构示意图。

其中：1、盒体；2、固定海绵衬底；3、盒盖1；4、磁扣搭件1；5、0.2mL离心管孔；6、带独立管盖的八连管#1-#8；7、带独立管盖的八连管#9-#12；8、连接于PCR管上的独立PCR管盖；9、盒盖2；10、磁扣搭件2；11、装有无核酸酶的超纯去离子水的1.5mL离心管；12、1.5mL离心管孔；13、装有T790M检测引物及探针混合物的1.5mL离心管；14、装有L858R和L861Q检测引物及探针混合物的1.5mL离心管；15、装有19外显子缺失检测引物及探针混合物的1.5mL离心管；16、装有阳性质控物的1.5mL离心管；17、1个装有阴性质控物的1.5mL离心管。

图2是本实用新型一种人EGFR基因四重多位点突变检测试剂盒盒体B的结构示意图。

其中：18、盒体；19、光滑玻璃纸衬底；20、卡槽隔盒；21、光盘卡槽；22、光盘；23、数字PCR芯片套件。

图3是本实用新型一种人EGFR基因四重多位点突变检测试剂盒盒体B中数字PCR芯片结构示意图。

其中：23-1、透明硬塑料外壳；23-2、芯片条形码；23-3、数字PCR配件槽；23-4、数字PCR芯片。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本实用新型做进一步描述：

实施例1

如图1所示，一种人EGFR基因四重多位点突变检测试剂盒的盒体A包括：盒体1、1个固定海绵衬底2、带有磁扣搭件4的盒盖3、带有磁扣搭件10的盒盖9、#1-#8号带独立管盖8的八连管6、#9-#12号带独立管盖8的八连管7、1个装有无核酸酶的超纯去离子水的1.5mL离心管11、1个装有T790M检测引物及探针混合物的1.5mL离心管13、1个装有L858R和L861Q检测引物及探针混合物的1.5mL离心管14、1个装有19外显子缺失检测引物及探针混合物的1.5mL离心管15、装有阳性质控物的1.5mL离心管16、装有阴性质控物的1.5mL离心管17。

其中，所述的盒盖3、盒盖9组成关门式磁扣重叠盒盖。

其中，所述的1个固定海绵衬底2上有5个1.5mL离心管孔12。

所述的1个固定海绵衬底2上的5个1.5mL离心管孔12，离心管孔12内分别放置装有500μL无核酸酶的超纯去离子水的1.5mL离心管11、装有30μL T790M检测引物及探针混合物的1.5mL离心管13、装有40μL L858R和L861Q检测引物及探针混合物的1.5mL离心管14、装有30μL 19外显子缺失检测引物及探针混合物的1.5mL离心管15、装有20μL阳性质控物的1.5mL离心管16、装有20μL阴性质控物的1.5mL 离心管17。

所述的1个固定海绵衬底2，优选白色。

其中，所述的1个装有500μL无核酸酶的超纯去离子水的1.5mL离心管11、1个装有30μL T790M检测引物及探针混合物的1.5mL离心管13、1个装有40μL L858R和L861Q检测引物及探针混合物的1.5mL离心管14、1个装有30μL 19外显子缺失检测引物及探针混合物的1.5mL离心管15，1个装有20μL阳性质控物的1.5mL离心管16，1个装有20μL阴性质控物的1.5mL离心管17，优选地，分别选择不同颜色管盖的离心管，例如1个无色透明管盖装有500μL无核酸酶的超纯去离子水的1.5mL离心管11、1个粉色管盖装有30μL T790M检测引物及探针混合物的1.5mL离心管13、1个黄色管盖装有40μL L858R和L861Q检测引物及探针混合物的1.5mL离心管14、1个蓝色管盖装有30μL19外显子缺失检测引物及探针混合物的1.5mL离心管15、1个红色管盖装有20μL阳性质控物的1.5mL离心管16、1个绿色管盖装有20μL阴性质控物的1.5mL离心管17。

其中，所述的1个固定海绵衬底2上有12个八连管孔5。

所述的1个固定海绵衬底2上有12个八连管孔5内分别放置装有数字PCR反应预混液的带盖八连管6和带盖八连管7。

所述的带盖八连管6和带盖八连管7为每个八连管上都有独立的管盖8。

其中，所述的带盖八连管6和带盖八连管7，每个管中溶液的体积是15μL。

实施例2

如图2所示，一种人EGFR基因四重突变检测试剂盒的盒体B包括：盒体18、1张光滑玻璃纸衬底19、1个卡槽隔盒20、1个光盘卡槽21、1张光盘22、1套数字PCR芯片23。

其中，所述的盒体18底部铺有1张光滑玻璃纸衬底。

所述的1张光滑玻璃纸衬底，优选使用无色PET材质的玻璃纸。

其中，所述的1个卡槽隔盒固定于盒体的左侧，将盒体分成左右两部分。

所述的盒体左侧1个卡槽隔盒上面开有光盘卡槽，里面放置一张光盘。

所述的盒体右侧放置一套数字PCR芯片组件。

如图3所示，一种人EGFR基因四重突变检测试剂盒的数字PCR芯片组件23包括：1个透明硬塑料外壳23-1、3个芯片条形码23-2、1个数字PCR配件槽23-3、3组数字PCR芯片23-4。

其中，所述的3个芯片条形码分别贴于3组数字PCR芯片的底部。

其中，所述的1个数字PCR配件槽内放有14个数字PCR高盖配件。

其中，所述的3组数字PCR芯片每个芯片右上角做切角标记，以识别芯片放置于仪器内的方向。

测试步骤为：

1、数字PCR芯片检测前准备

1.1打开本实用新型一种人EGFR基因四重突变检测试剂盒盒体A，取出所述组件6、7、10、12、

13、14、15试剂在冰上融化，并涡旋混合均匀。

1.2打开本实用新型一种人EGFR基因四重多位点突变检测试剂盒盒体B，取出所述组件23-4中的数字PCR芯片，扫录条形码23-2，录入信息后置于平稳处待用。

1.3提取血浆中游离DNA采用Qiagen公司的circulating DNA extraction Kit，参照试剂盒说明书进行提取备样。

1.4核算实验反应数

1.5打开微滴生成扩增系统，设置反应程序。

2、样本微滴生成与扩增

2.1准备反应所需PCR管并标记。

2.2根据反应数于冰上配制反应液，在一种人EGFR基因四重多位点突变检测试剂盒盒体A中所述的12个带盖PCR管中6和7中分别加入表1中所列的盒体A中各组分。

表1一种人EGFR基因四重突变检测试剂盒盒体A中各组分加入量

2.3加入上述组分的带盖PCR管，涡旋混匀后瞬时离心使所有试剂离心到管底。

2.4将数字PCR芯片平稳地置于实验台上，切勿振动，轻轻旋开白盖，将25μL混合好的PCR反应液全部加入到芯片的孔井中，不要与内置油相接触，从本实用新型所述组分23-3数字PCR配件槽中取出专用数字PCR的高盖封闭孔井。

2.5打开气压泵开关，确认气压泵输出压力和微滴生成扩增系统输入压力稳定在1150+/-50mbar。

2.6将封闭好的数字芯片转移到微滴生成和扩散系统中，关闭机器盖，确保处于密封状态，确认程序无误后，运行程序。PCR反应试剂加入到数字PCR芯片后30min内要进行实验。

2.7待实验结束后，关闭气压泵，打开微滴生成和扩散系统机器盖，轻轻将检测结束的数字PCR芯片取出，准备扫描采集数据。

2.8关闭微滴生成和扩散系统。

3、检测结果的判定方法按照以下方式进行：

3.1阳性检测结果的判定方法：出现明显区别于阴性质控物反应孔或当前反应孔背景信号的荧光扩增信号，说明该反应孔为阳性结果；相反，则为阴性结果。

3.2当待检测样品反应管中(八连管#1～#10)为阳性结果时，则说明检测到靶基因成分；待测样品反应管中为阴性结果时，则说明待测样品中不含有靶基因成分。

3.3当阳性质控物反应孔中产生阳性结果以及阴性质控物反应孔中产生阴性结果时，该实验视为有效实验，否则本次检测结果无效，需要重新更换反应试剂，并重复本实用新型所述测试流程，进行数字PCR的检测。

以上对本实用新型的实施例进行了详细说明及解释，但所述内容仅为本实用新型的最佳实施例，不能被认定用于限定本实用新型的实施范围。凡依据本实用新型申请范围所作的均等变化与改进等，均应归属于本实用新型的专利涵盖范围之内。

Claims (3)

1.一种人EGFR基因四重多位点突变检测试剂盒，其特征在于，盒体由盒体A和盒体B组成，其盒体A特征在于，包括：1个带盒盖1(3)和盒盖2(9)的盒体(1)、1个海绵衬底(2)、1个装有无核酸酶的超纯去离子水的离心管(11)、1个装有T790M检测引物及探针混合物的1.5mL离心管(13)、1个装有L858R检测引物及探针混合物的1.5mL离心管(14)、1个装有19外显子缺失检测引物及探针混合物的1.5mL离心管(15)、1个装有阳性质控物的1.5mL离心管(16)、1个装有阴性质控物的1.5mL离心管(17)、12个装有相同体积数字PCR反应预混液的带盖八连管1(6)和带盖八连管2(7)；其盒体B特征在于，包括：1个盒体(18)、1张光滑玻璃纸衬底(19)、1个卡槽隔盒(20)、1个光盘卡槽(21)、1张光盘(22)、1套数字PCR芯片(23)。

2.根据权利要求1所述的一种人EGFR基因四重多位点突变检测试剂盒，其特征在于，所述的盒体A的盒盖1(3)和盒体A的盒盖2(9)为关门磁扣式左右互相重叠搭在一起，盒体A的盒盖1(3)的左侧中部设置有磁扣搭件1(4)和盒体A的盒盖2(9)的左侧中部设置有磁扣搭件2(10)。

3.根据权利要求1所述的一种人EGFR基因四重多位点突变检测试剂盒，其特征在于，盒体A中所述的12个装有相同体积数字PCR反应预混液的带盖八连管1(6)和带盖八连管2(7)是每个管都带有独立管盖(8)的八连管。