CN1997373B - 藻毒素及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于干扰神经元传递的药物组合物，该组合物包含有效量的至少一种三环3，4-propino全氢化嘌呤和至少一种另外的化合物。还提供了用于局部应用的制剂，包含有效量的本发明的组合物和药理学可接受的载体。本发明提供干扰神经元传递的方法，其包括局部应用有效量的至少一种三环3，4-propino全氢化嘌呤，该方法用于治疗涉及肌肉松弛、麻醉、肌肉痉挛和类似原因的多种适应症。

Description

藻毒素及其用途
技术领域
本发明涉及治疗肌肉疾病的方法并涉及可用于该方法的、以及用于其它目的的包含杂环胍型化合物的药物组合物。
背景技术
麻痹性贝类中毒(PSP)由可逆结合于受体位点的藻毒素的混合物导致，所述的受体位点位于在可兴奋细胞中发现的电压门控性钠通道上。主要临床症状为急性麻痹病。藻毒素或藻的毒素由显微镜可见的浮游藻类产生。这些毒素在滤食动物例如双壳类上积聚。藻毒素污染的贝类的食用在人身上导致六种疾病：PSP、记忆缺失性贝类中毒(ASP)、腹泻性贝类中毒(DSP)、神经毒性贝毒类中毒(NSP)、雪卡毒素中毒(CP)和兰细菌中毒(CNP)。
产生PSP的藻毒素具有相同的结构：3，4，6-三烷基四氢嘌呤(3，4，6-trialquil-tetrahidropurine)。26个天然存在的PSP已有描述。这些藻毒素都是非蛋白的、具有289至450道尔顿的低分子量化合物。
膝沟藻毒素(gonyautoxin)(GTX)是在贝类提取物中丰度最大的PSP毒素，其占总毒素含量的80％以上。所述PSP毒素的高毒性是由于对位于可兴奋细胞上的电压门控性钠通道上的受体位点的可逆结合造成的，因此阻断钠离子的流入并阻止神经和肌肉细胞产生动作电位，因此阻断神经元传递并经由呼吸停止和心源性休克导致哺乳动物死亡。少量的PSP毒素的应用产生横纹肌松弛性麻痹，持续时间依赖于剂量。
本发明的膝沟藻毒素通过注射液体制剂或作为施用到哺乳动物皮肤的局部麻醉剂，提供在哺乳动物中应用的局部麻醉作用。
本发明的膝沟藻毒素还在治疗可由肌肉疾病、肌肉痉挛或肌肉活动导致或恶化的多种疾病方面提供令人惊奇的有益的结果。
持续需要的是起快速作用的和长效局部用麻醉剂，其不会伤害皮肤或导致皮疹、刺痛、致敏或其它不适。另外持续需要的是用于多种疾病的更有效的、较小侵入性的治疗。
发明内容
在本发明的第一个方面，提供治疗多种疾病的方法，其包括：给药有效量的包含一种或多种膝沟藻毒素的药物组合物的步骤。在该方法中，采用肌肉松弛和/或麻醉作用用于提供可能涉及肌肉疾病、肌肉痉挛、或者可能由肌肉活动导致或恶化的多种疾病的有益的治疗。
在本发明的另一个方面中，提供用于干扰神经元传递的药物组合物，其包含有效量的至少一种三环3，4-propino全氢化嘌呤和至少一种其它的活性成分。
在本发明的另一个方面中，提供用于面部年轻化的制剂，其包含有效量的本发明的组合物和面霜。
发明详述
下文中的说明用于描述本发明。
如本文中所用的，“有效量”指这样的量，其通过在神经肌肉板中阻断至少一些神经递质乙酰胆碱的突触前释放而足够干扰神经元传递，因此干扰传递、麻痹所述肌肉及防止其收缩，或使收缩的肌肉松弛。
量以活性单位给出。一个活性单位相当于本发明的组合物的这样的量，其须使20克CF1白化体或BALB-C种系小鼠腿部的股二头肌(crural biceps)肌肉收缩阻断1.5至2小时。将所述的毒素以0.5ml的体积肌内注射到小鼠右腿的股二头肌中。左腿用作对照。
为了测量用于每剂量中的毒素的量，高效液相色谱(HPLC)分析联用荧光检测(HPLC-FLD)进行。该方法可以测量在所有混合物、提取物或药物制剂中的每种毒素的量。
必须指出的是，如在本说明书中和所附权利要求中所用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括所指物的复数，除非上下文中另外明确指出。因此，例如，提到“一种药理学活性剂”，其包括两种和更多种活性剂的混合物，提到“一种促进剂”，其包括两种和更多种促进剂的混合物，等。
在描述本发明和提出本发明的权利要求中，下述的专有名词将根据如下所阐明的定义使用。
本文中所用的术语“处理”和“治疗”指减少症状的严重性和/或频率，消除症状和/或潜在起因，防止症状和/或它们的潜在起因的出现，以及改善或补救伤害。因此作为本文中使用的术语，本发明“治疗”哺乳动物的方法，既包含在易感个体中的疾病的预防，还包含在显示临床症状个体中疾病的治疗。
本文中可互换使用的术语“活性剂”、“药物”和“药理学活性剂”指可引起所希望的效果的化学物质或化合物，并包括治疗有效的、预防有效的或美容有效的药剂。还包括所提及的，也可引起所希望的效果的那些化合物或化合物类的衍生物和类似物。
“通过治疗有效”的量指提供所希望治疗作用的活性剂的无毒的但足够的量。
通过“经皮”给药指向个体的皮肤表面给药，使得药物穿过皮肤组织并进入到个体的血液流中，因此产生全身作用。术语“经皮”意于包括“经粘膜”给药，即，向个体的粘膜(例如舌下、颊、阴道、直肠)表面的给药，使得药物穿过粘膜组织并进入到个体的血液流中。
术语“局部给药”以其常规的含义使用，意思是向皮肤或粘膜递送药理活性剂的局部用药物，如在，例如，各种皮肤疾病的治疗中。局部给药，与经皮给药相反，提供局部的而不是全身的作用。除非另外指出或暗示，术语“局部给药”和“经皮给药”可互换使用。
术语“身体表面”用于指皮肤或粘膜组织。
通过皮肤或粘膜组织的“预先确定的面积”指皮肤或粘膜组织的面积，通过它递送活性剂，并意于定义完整的未损伤的活的皮肤或粘膜组织的面积。所述面积通常为约5cm2至约200cm2，更通常为约5cm2至约100cm2，优选为约20cm2至约60cm2。然而，药物递送领域的那些技术人员应当理解的是，皮肤或粘膜组织的给药面积可有显著不同，取决于因素例如所希望的治疗、是否使用递送装置、剂量和治疗面积的大小以及其它因素等。
如本文中所用的“透过增强”或“渗透增强”指相对于相同活性剂当单独应用时的透过性(即，所述试剂穿过身体表面的“流量”)，所述活性剂渗透穿过皮肤或粘膜的速率增加。通过使用这种促进剂而产生的增强的渗透效果可通过利用例如本领域已知的Franz扩散装置，测量药物穿过动物或人皮肤的扩散速率而观察到。
“有效量的促渗剂”指促进剂或透过增强处理的无毒的数量或量，其提供足够的所希望的透过速率方面的增加。促渗剂还可影响透过深度、给药速率和递送药物的量。
本文中所用的“载体”或“媒介物”指适合于经皮或局部给药的载体材料。可用于本文中的载体和媒介物包括在本领域中已知的任何这样的材料，其在所使用的量中是无毒的，并且不与所述组合物中的其它组分以有害的方式相互作用。
术语“水性”指制剂或药物递送体系包含水或在给药到皮肤或粘膜组织后变为含水的。
已经令人惊奇地发现，本发明的某些方法不仅提供实际上即刻的麻醉作用和肌肉松弛效果，还在出乎意料的在长时间内提供有益的肌肉松弛效应。结果，本发明的某些方法特别很好地适合于治疗与痉挛肌肉相关的神经肌肉疾病、交感神经疾病例如汗腺活动过度，适合于减轻炎症或由于炎症的疼痛，适合于治疗睑痉挛、肛裂和弛缓不能、斜视、局限性肌张力障碍、多汗症、由例如膀胱松弛导致的泌尿道疾病，肌肉痉挛相关的疼痛处理、肌肉痉挛、伤口治疗包括伤口缝合和包扎、活组织切片检查、面部皱纹减少或清除、腕管综合征、纤维肌痛(fibromyalgia)、关节红肿(joint flare)、关节疼痛，手术后疼痛的处理、关节炎、坐骨神经痛、腱炎、颈痛或颈损伤、背痛、偏侧面肌痉挛、喉功能亢进(hyperfunctional larynx)、小儿脑性瘫痪、痉挛、头痛包括偏头痛、书写痉挛、一侧面部(miofacial)疼痛、震颤、抽动症、磨牙症、颞下颌关节疼痛、颈部肌张力障碍、口嘴下颌肌张力障碍、牙齿麻醉，牙齿疼痛的治疗、头发生长、胃肠疾病、功能亢进性皱纹(hyperfunctional facial lines)、美容疾病、肩痛、肩袖损伤、外周神经功能障碍、偏头痛或紧张性头痛、上食管和下食管括约肌疾病、胃轻瘫、肥厚性幽门狭窄、痔疮、痉挛性肛部痛、肠易激综合征、肌肉痉挛、血管痉挛病、涉及子宫的疾病或膀胱痉挛、Oddi括约肌功能障碍和短节段先天性巨结肠、中风和具有运动控制的问题以及降低或消除与注射(引起疼痛的注射)以及静脉注射针插入相关的疼痛。GTX化合物的没有预料到的长期肌肉松弛效应已经发现使愈合过程便利。
在本发明的方法和组合物中采用的藻毒素是非蛋白的、289至450道尔顿的低分子量化合物。这提供了优于用于类似目的的现有技术的组合物的几个优点。首先，因为所述的藻毒素是非蛋白的，对该藻毒素的过敏反应的可能性是非常低的。其次，所述藻毒素的小尺寸使它们成为用于经皮给药的出色候选药物。同样，本发明的藻毒素相对于例如肉毒杆菌A型毒素是非常有效的，并因此使用较少的量就可达到较长的持续作用。另外，本发明的藻毒素与肉毒杆菌A型毒素相比，经常在更短时间周期内实现它们的作用。同样，所述藻毒素的小尺寸可使它们相对快速地排出体外，因此降低了有害的副作用的风险或减少了在体内毒素的累积。
用于本发明方法的组合物包含有效量的至少一种藻毒素。更优选地，本发明的组合物包含有效量的至少一种由如下所示的式1表示的化合物和药理学可接受的局部用载体：
Figure S05822769220070109D000061
式I
其中R1和R5独立地选自-H和-OH；R2和R3独立地选自-H和-SO3；并且R4选自-H、-OH、-COONH2、-COONHSO- 3和-COOCH3，附带条件是R2和R3中任一个必须为-OSO- 3，或者R4必须为-COONHSO- 3。
根据本发明优选的三环3，4-propino全氢化嘌呤为如在下表中阐明的式I的膝沟藻毒素(下文中用“GTX”代指)。
表1-GTX化合物
  化合物   R<sub>1</sub>   R<sub>2</sub>   R<sub>3</sub>   R<sub>4</sub>   R<sub>5</sub>
  膝沟藻毒素1   -OH   -H   -OSO<sup>-</sup><sub>3</sub>   -COONH<sub>2</sub>   -OH
  膝沟藻毒素2   -H   -H   -OSO<sup>-</sup><sub>3</sub>   -COONH<sub>2</sub>   -OH
  膝沟藻毒素3   -H   -OSO<sup>-</sup><sub>3</sub>   -H   -COONH<sub>2</sub>   -OH
  膝沟藻毒素4   -OH   -OSO<sup>-</sup><sub>3</sub>   -H   -COONH<sub>2</sub>   -OH
  膝沟藻毒素5   -H   -H   -H   -COONHSO<sup>-</sup><sub>3</sub>   -OH
本发明的方法和制剂可通过藻毒素的注射、局部和经皮给药，治疗对给药藻毒素可有响应的所有病症、疾病或紊乱。通常，本发明的制剂和给药体系用于把藻毒素作为麻醉剂(即用于缓解疼痛)给药，以松弛肌肉和/或减少肌肉收缩。最普遍地，所述化合物用作肌肉松弛剂或用于减少肌肉收缩。
每个剂量可包括1至约5000个活性单位的藻毒素。更优选的，每个剂量包括大于32个活性单位至最高约5000个活性单位的藻毒素。甚至更优选每个剂量包括大于32至约1000个活性单位的藻毒素，更优选地，大于40至约1000个活性单位的藻毒素，和甚至更优选地，约50至约500个活性单位的藻毒素。最优选地，每个剂量包括约75至约200个活性单位的藻毒素。给药可以如所需的一次次重复以使肌肉松弛作用持续直至获得所需的效应。
根据本发明的一个方法，通过将本发明的组合物直接的、局部注射到肌肉中或肌肉的周围而治疗动物或人。在一些实施方案中，在注射位置的肌肉显示出升高的紧张性或痉挛，尽管对于所有治疗的有效性而言这并不是必然的。每次注射可被限制到不超过2毫升的组合物，包括溶剂、佐剂和/或载体材料。给药可通过例如采用1毫升带有27至30号针头的结核菌素型一次性注射器而完成。或者，对于一些方法，希望利用内腔镜给药所述剂量，所述内腔镜例如描述于美国专利5,674,205中，其公开内容通过引用并入本发明中，目的是提供适用于本发明方法的内腔镜的详细说明。在一个实施方案中，采用在0.9％氯化钠溶液中的GTX2和GTX3的混合物的可注射溶液，其任选包含GTX1和GTX4中的一种或两种。该可注射溶液可具有任何适当的浓度，但优选包含每毫升大于40至最高约1000个单位。在一个实施方案中，在所述可注射溶液中的GTX2对GTX3的比例为约2∶1。
或者，本发明的药物组合物可以以局部用制剂的形式局部应用。为了形成局部用制剂，将有效量的本发明的药物组合物加入到药理学可接受的局部用载体中。当局部应用时，所述组合物可以是适合于施用到身体表面的任何形式，并且可以包含，例如霜剂、洗剂、溶液剂、凝胶剂、软膏剂、糊剂等，和/或可以被制备成包含脂质体、胶束和/或微球体。所述局部用制剂可包含基于制剂的重量的约0.0001重量％至约0.01重量％的GTX化合物。或者，所述的局部用制剂可包含基于制剂的重量的约O.001重量％至约0.01重量％的GTX化合物。
在本发明的方法中，所述的药物组合物可直接施用到身体表面或者可以涉及给药装置的使用。因此，制剂或药物储库可以是水性的，即包含水，或者可以是非水性的并与隔绝性的覆盖层组合使用以使得从身体表面蒸发的水汽在给药过程中保留在所述制剂或经皮系统中。然而，在一些情况下，例如用隔绝性的凝胶，非水性制剂可与隔绝性的层一起或不一起使用。
已经发现，例如在缓解疼痛的应用中，例如在紧张性头痛和纤维肌痛的治疗中，给药一个剂量提供持续至少4周和有时显著更长的作用。没有预计到GTX毒素的给药可提供这么长时间的缓解作用。另外，已经发现GTX毒素的给药可治疗对其它毒素，例如肉毒杆菌A型毒素有抗性的适应症。这也是GTX毒素没有预计到的优点。
本领域技术人员应当理解的是，在本发明的方法中，所述的藻毒素或藻毒素的组合可与另外的一种或多种化合物一起或不一起给药，并且如果与另外的一种或多种化合物一起给药，则所述的藻毒素可以在所述的另外的一种或多种化合物给药之前、同时或之后给药。另外，用于所述藻毒素和另外的一种或多种化合物的给药方法也可以是不同的，例如可以在引起疼痛的注射给药之前通过经皮施用而给予所述的藻毒素。
本发明的另一个方面涉及组合物，其包含某些藻毒素与至少一种其它的化合物组合。这种组合物适用于多种应用并能用于例如许多美容和临床应用，以可能避免外科手术，可能减少副作用并使过敏性、免疫排斥或血肿最小化。还发现某些藻毒素可用于美容和治疗方法，并具有有利的结果，特别是当肌肉疾病、肌肉痉挛或肌肉活动是待解决的症状的原因或起作用因素时。
本发明的组合物包含有效量的至少一种藻毒素。更优选地，本发明的组合物包含有效量的至少一种由如下表示的式I表示的化合物及药理学可接受的局部用载体：
式I
其中R1和R5独立地选自-H和-OH；R2和R3独立地选自-H和-SO3；并且R4选自-H、-OH、-COONH2、-COONHSO- 3和-COOCH3，附带条件是R2和R3中任一个必须为-OSO- 3，或者R4必须为-COONHSO- 3。
根据本发明优选的三环3，4-propino全氢化嘌呤为如在下表中阐明的式I的膝沟藻毒素(下文中用“GTX”代指)。
表1-GTX化合物
化合物   R<sub>1</sub>   R<sub>2</sub>   R<sub>3</sub>   R<sub>4</sub>   R<sub>5</sub>
膝沟藻毒素1   -OH   -H   -OSO<sup>-</sup><sub>3</sub>   -COONH<sub>2</sub>   -OH
膝沟藻毒素2   -H   -H   -OSO<sup>-</sup><sub>3</sub>   -COONH<sub>2</sub>   -OH
膝沟藻毒素3   -H   -OSO<sup>-</sup><sub>3</sub>   -H   -COONH<sub>2</sub>   -OH
膝沟藻毒素4   -OH   -OSO<sup>-</sup><sub>3</sub>   -H   -COONH<sub>2</sub>   -OH
膝沟藻毒素5   -H   -H   -H   -COONHSO<sup>-</sup><sub>3</sub>   -OH
在本发明的一个方面，所述的药物组合物包含至少一种藻毒素与至少一种另外的化合物的组合。在更优选的方面中，本发明的组合物包含至少一种选自GTX1、GTX2、GTX3、GTX4和GTX5的GTX化合物，至少一种局部用麻醉剂，其选自β-优卡因-LA、丁卡因、马比佛卡因、丙胺卡因、依替卡因、布比卡因、利多卡因、吗啡、TAC(丁卡因、肾上腺素和可卡因)、LET(利多卡因、肾上腺素和丁卡因)、topicaine、吗啡或类似的局部用麻醉剂及其组合和药理学可接受的载体。可使用任何药理学可接受的载体，包括但不限于水。本发明的化合物通常稀释于乙酸溶液或0.09％氯化钠溶液中。
表2总结了一些局部用麻醉剂，其特别好地适用于本发明。
表2：局部用麻醉剂a
Figure S05822769220070109D000101
a根据Friedman等人“Topical Anesthetics Update”Dermatol.Surg.27：1019-1025(2001)改写
bA＝成人；C＝儿童
c化合物。有专利权的麻醉剂
ELA-Max和ELA-Max5包含4％或5％利多卡因的脂质体给药系统。这个给药系统含有多层状脂质体，其包含分散于水相介质中的数个脂质双层。脂质体促进麻醉剂进入皮肤并且还提供缓释作用。
S-caineTM贴片的给药系统利用氧活化的加热体系以增加麻醉剂的递送速率。这个贴片可用于本发明的方法中或者可将本发明的藻毒素组合物配制到这种贴片中。市售的S-caineTM贴片包含1∶1的利多卡因和丁卡因的低共熔混合物，以及一次性加热元件，其产生可控加热程度(39-41℃)2小时。该S-贴片有效减轻与活组织切片检查和静脉穿刺有关的疼痛。相关的局部性是S-caine局部用麻醉剂揭片。所述揭片为霜剂，干燥后成为弹性膜，其易于移除。在身体的轮廓区域例如面部，它是最有效的。
如从表2中可见，这些局部给药通常需要在开始任何步骤前至少30分钟给药局部用制剂。藻毒素的加入通过除了由麻醉剂化合物提供较晚的益处外，还提供充分的即刻益处，从而显著降低了等待时间。
在本发明的另一个方面，本发明的组合物包括与一种或多种化合物例如止痛剂、非甾体抗炎剂(NSAIDS)组合的至少一种GTX化合物；抗生素，包括抗阿米巴药、广谱和中谱抗生素、抗真菌药物、单环β-内酰胺和抗病毒剂；中枢神经系统药物；无机物；免疫调节剂、免疫抑制剂；甲状腺制剂；类固醇和激素；玻尿酸(restalin)
Figure S05822769220070109D000121
和其它引起疼痛的注射剂例如过敏药注射剂，以及选自水溶性维生素例如B复合物、维生素C、维生素B12以及叶酸的维生素，和兽医用制剂。
在本发明更优选的方面中，止痛剂包括扑热息痛、布洛芬、氟比洛芬(fluriprofen)、酮洛芬、扶他林(美国专利3,652,762)、非那西汀和水杨酰胺。NSAIDS包括萘普生、扑热息痛、布洛芬、氟比洛芬(fluriprofen)、酮洛芬、非那西汀、水杨酰胺和消炎痛。抗生素包括杀抗阿米巴药、广谱和中谱抗生素、抗真菌药物、抗过敏药物、单环β-内酰胺和抗病毒剂，并且特别包括这样的材料例如红霉素、青霉素和先锋霉素及它们的衍生物；中枢神经系统药物例如甲硫哒嗪、安定、敏克静、甲磺酸二氢麦角碱、氯丙嗪、卡比多巴和左旋多巴。金属盐包括氯化钾和碳酸锂。无机物包括铁、铬、钼和钾。甲状腺制剂包括合成甲状腺激素和甲状腺素钠。类固醇和激素包括ACTH、合成代谢物、雄激素和雌激素的组合、雄激素、类皮质激素和止痛剂、雌激素、糖皮质激素、促性腺激素、促性腺激素释放激素、人生长激素、降钙素、尿促性素、副甲状腺素、孕酮、孕激素、孕激素和雌激素的组合、somatostatis样化合物、尿促卵泡素、加压素等；维生素包括水溶性维生素例如B复合物、维生素C、维生素B12以及叶酸和兽医用制剂。本领域技术人员应当明白的是，接受了关于上述式I的阐明的情况，三环3，4-propino全氢化嘌呤与上文所述的化合物的其它混合物和组合也落入到本发明的范围中。
玻尿酸(Restalin)或
Figure S05822769220070109D000131
是晶莹清澈的、生物可降解的NASHA(非动物的稳定的透明质酸)凝胶，将其注射到皮肤中以增加嘴唇的体积并撑开皱纹和褶皱。玻尿酸(Restalin)被认为比胶原蛋白注射剂更安全，例如使嘴唇显得更丰满。FDA最近已经批准
Figure S05822769220070109D000132
作为注射剂用于适度校正严重的面部皱纹和褶皱，例如鼻唇的褶皱，在鼻和嘴之间的皱纹。然而，这种注射剂倾向于造成疼痛，因为它们经常被注射到包含许多神经末梢的区域。本发明的组合物帮助降低这种注射产生的疼痛。
类似地，静脉穿刺和留置静脉注射针头也导致疼痛。由于本发明组合物快速和安全的作用，介于应用该组合物和有效的麻木之间的等待时间显著降低。
或者，本发明的药物组合物包含选自蛤蚌毒素(STX)、新蛤蚌毒素(neosaxitoxin)、脱氨甲酰基蛤蚌毒素(decarbamoylsaxitoxin)和肉毒杆菌A型毒素中的至少一种化合物，伴随至少一种GTX化合物，和任选的两种或更多种GTX化合物以及至少一种其它化合物。
本发明包括由如下方式获得或加工的毒素和通过重组而制备毒素的衍生物或片段的应用，所述方式为细菌培养，毒素提取、浓缩、保存、冻干和/或重新构成，以及修饰或重组毒素。
不束缚于理论，当局部应用时，这些化合物显示出通过阻断神经冲动的扩展或神经元的传递实现它们的麻醉作用，这通过可逆结合于存在于所有神经元和可激动细胞中的单独的生物分子受体，即电压门控钠通道进行。通过结合于这些通道，没有了钠进入神经元细胞；去极化作用不能发生并且因此停止了冲动的传播。这种作用机理阻断了在神经肌肉板中至少一些神经递质乙酰胆碱突触前的释放，因此干扰了神经肌肉的传递，麻痹了所述肌肉并防止其收缩，或使病理问题导致的肌肉收缩松弛。这种机理对于美容目的特别有效，因为它不会使一些面部肌肉收缩，所有这些收缩与皱纹的形成相关并且是形成皱纹的原因，因此产生了面部年轻化所追求的效果。
在所述制剂中的活性剂的浓度可以有很大变化，并将依赖于多种因素，包括待治疗的症状、希望的效果、活性剂到达其目标靶点的能力和速度，以及在患者和医生具体知识中的其它因素。优选的制剂通常包含足够量的活性剂以向治疗位点递送约1-1000个单位的活性剂的剂量。更优选地，所述的递送的剂量为约20-500个单位的活性剂。甚至更优选地，所述的递送剂量为大于32个单位至最多约1000个单位的活性剂，并且最优选地，所述的递送剂量为大于40个单位至最多约1000个单位的活性剂，约50-1000个单位的活性剂，约50-500个单位的活性剂，或约75-200个单位的活性剂。
将本发明的药物制剂给药到待被麻痹或防止收缩的肌肉或神经元周围。本发明不受限于特定的给药系统、装置结构、促进剂或载体，同样可以变化。还应理解的是，本文中所用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并不意于是限制性的。
本发明还涉及用于通过注射给药的组合物。该组合物可以是任何适合于注射的形式。本发明的组合物包含至少一种藻毒素，至少一种另外的化合物和药学可接受的载体。在更优选的方面中，本发明的组合物包含两种或更多种的藻毒素，其伴随着至少一种另外的化合物和药学可接受的载体。通过注射给药的量，在所述肌肉周围不同位置，特别是在最多神经分布的区域周围应当不大于两毫升。当注射时，其效果基本是即刻的。
本发明组合物和方法的经皮效果是即刻显现的，通常发生在活性化合物透过皮肤后最长30秒至5分钟内。最大效应通常在在活性化合物透过皮肤后15分钟内达到。其有效持续时间依赖于给药的剂量，有问题的肌肉，以及给药的量和给药的具体组合物。这是用于所有临床应用和病理学的模式。
所述局部或经皮组合物可以是适合于向身体表面给药的所有形式，并且可以包含例如霜剂、洗剂、溶液剂、凝胶剂、软膏剂、糊剂等，和/或制备成包含脂质体、胶束和/或微球体。所述的组合物可以直接施用到身体表面或者可以涉及给药装置的使用。因此，制剂或药物储库可以是水性的，即包含水，或者可以是非水性的并与隔绝性的覆盖层组合使用以使得从身体表面蒸发的水汽在给药过程中保留在所述制剂或经皮体系中。然而，在一些情况下，例如用隔绝性的凝胶，非水性制剂可与隔绝性的层一起或不一起使用。
软膏剂是半固体制剂，其通常基于凡士林或其它凡士林衍生物。如被本领域技术人员所认识到的，待被使用的具体的软膏剂基质将提供最佳的药物递送，并且还优选提供其它希望的特性，例如润肤(emolliency)等。因为与其它载体或赋形剂一起，软膏剂基质应当是惰性的、稳定的、非刺激性的和非致敏性的。如在Remington：TheScience and Practice of Pharmacy，第19版(Easton，Pa.：Mack PublishingCo.，1995)，第1399-1404页中所解释的，软膏剂基质可分为四类：油性基质、可乳化的基质、乳状液基质和水溶性基质。油性软膏剂基质包括例如植物油、得自动物的脂肪、得自凡士林的半固体烃。可乳化的软膏剂基质，还已知为可吸收的软膏剂基质，包含很少的水或不含水，并包括例如羟基硬脂硫酸盐、无水羊毛脂和亲水性凡士林。乳状液软膏剂基质为或者是油包水(W/O)乳状液或者是水包油(O/W)乳状液，并包括例如鲸蜡醇、单硬脂酸甘油酯、羊毛脂和硬脂酸。优选的水溶性软膏剂基质由不同分子量的聚乙二醇制备；对于更多的信息，同样参见Remington：The Science and Practice of Pharmacy。
霜剂为粘稠液体或半固体乳状液，或者是水包油或者是油包水。霜剂基质是可水洗的，并包含油相、乳化剂和水相。所述的油相，也叫做“内”相，通常由凡士林和脂肪醇例如鲸蜡醇或硬脂醇组成。所述水相的量，尽管不是必须的，但体积通常大于所述油相，并通常包含润湿剂。在霜剂配方中的乳化剂通常是非离子型、阴离子型、阳离子型或两性的表面活性剂。
凝胶剂为半固体、悬浮型体系。单相凝胶剂包含在载体液体中充分均匀分布的有机大分子，该载体液体通常为水性，而且优选包含醇和任选的油。优选的“有机大分子”，即胶凝剂，为交联的丙烯酸聚合物，例如“卡波姆(carbomer)”家族的聚合物，例如羧基聚烯烃，其以CarbopolTM商标市售。还优选亲水性聚合物，例如聚环氧乙烷、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物和聚乙烯醇；纤维素聚合物例如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素和甲基纤维素；胶质例如黄芪胶和黄原胶；藻酸钠和明胶。为了制备均匀的凝胶，可加入分散剂例如醇或甘油，或者可通过研碎、机械混合或搅拌而分散的胶凝剂，或其组合。
洗剂为不用摩擦即可应用到皮肤表面的制剂，并通常为液体或半固体制剂，其中固体颗粒，包括所述活性剂，存在于水或醇基质中。洗剂通常为固体的悬浮液，并且为了本发明的目的，优选包含水包油型液体含油乳状液。洗剂为本文中用于治疗大身体区域优选的制剂，因为施用更多的液体组合物是容易的。将洗剂中不溶的物质精细地分开通常是必须的。洗剂通常包含可产生更好的分散作用的悬浮剂，以及用于在接触皮肤中使活性剂局限和固定的化合物，例如甲基纤维素、羧甲基纤维素钠等。
糊剂为半固体剂型，其中所述的活性剂悬浮于合适的基质中。依赖于基质的性质，糊剂被分为油脂糊剂或由单相水性凝胶制备的糊剂。在油脂糊剂中的基质通常为凡士林或亲水性凡士林等。由单相水性凝胶制备的糊剂通常加入羧甲基纤维素等作为基质。
也可以将制剂制成具有脂质体、胶束和微球体。脂质体为显微可见的囊泡，其具有包含脂质双层的脂质壁，并也能用作本文中的药物递送体系。用于本发明的脂质体制剂包括阳离子(正电荷)、阴离子(负电荷)和中性的制剂。阳离子脂质体是易得的。例如N[1-2，3-二油酰基氧基]丙基]-N，N，N-三乙基铵(DOTMA)脂质体以商品名为LipofectinTM(GEBCO BRL，Grand Island，N.Y.)可得。类似地，阴离子和中性脂质体也是易得的，例如得自Avanti Polar Lipids(Birmingham，Ala.)，或利用易得的材料可易于制备。这些材料其中包括磷脂酰胆碱、胆固醇、磷脂酰胆胺、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二油酰基磷脂酰胆胺(DOPE)。这些材料还可与DOTMA以合适的比例混合。利用这些材料制备脂质体的方法是本领域公知的。
本领域已知胶束由表面活性剂分子排列组成，使其极性端基形成外球壳，而疏水的烃链朝向球的中心，形成内核。在包含足够高浓度下的表面活性剂的水溶液中形成胶束，使得胶束自然形成。用于形成胶束的表面活性剂包括但不限于：月桂酸钾、辛磺酸钠、癸烷基磺酸钠、十二烷基硫酸钠、月桂基硫酸钠、多库酯钠、溴化癸基三甲基铵、溴化十二烷基三甲基铵、溴化十四烷基三甲基铵、氯化十四烷基三甲基铵、氯化十二烷基铵、聚乙二醇8十二烷基醚、聚乙二醇12十二烷基醚、壬苯聚醇10和壬苯聚醇30。胶束制剂可通过并入到局部用或经皮给药体系的储库中，或者并入到待应用于身体表面的制剂中而合用于本发明中。
类似地，微球体可以并入到本发明的制剂和药物递送体系中。类似于脂质体和胶束，微球体主要用胶囊封装药物或含药制剂。尽管它们通常不必然由脂质形成，但优选带电荷的脂质，例如磷脂。脂质微球体的制备是在本领域中公知的并描述于相关的文本和文献中。
本领域技术人员已知的各种添加剂可包含于所述组合物中。例如，溶剂，包括相对少量的醇，可用于促进所述活性剂的溶解。其它任选的添加剂包括遮光剂、抗氧化剂、香味剂、着色剂、胶凝剂、增稠剂、稳定剂等。还可加入其它试剂，例如杀菌剂，以防止在储存过程中腐败，即抑制微生物例如酵母菌和霉菌的生长。适合的杀菌剂一般选自对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯(即尼泊金甲酯和尼泊金丙酯)、苯甲酸钠、山梨酸、咪唑烷脲及其组合。
本发明的经皮组合物可与促渗剂和/或渗透促进处理一起施加到患者身体表面的预先确定的区域。一类合适的促渗剂为化学促渗剂，例如有效量增加所述试剂穿过身体表面的流量而不会导致皮肤伤害的氢氧化物释放剂，或者与超声波处理组合。其它的适合的化学促渗剂描述于，例如W.R.Pfister和D.S.T.Hsieh，″Permeation EnhancersCompatible with Transdermal Drug Delivery Systems，第I部分：Selectionand Formulation Considerations，″Pharm.Technol，1990年9月，和W.R.Pfister和D.S.T.Hsieh，″Permeation Enhancers Compatible withTransdermal Drug Delivery Systems，第II部分：System DesignConsiderations，″Pharm.Technol，1990年10月中，其公开的内容通过引用并入本发明中以说明适合的化学促渗剂。典型的用于本发明的化学促渗剂包括但不限于：醇，胺和酰胺例如脲，氨基酸，氨基酸酯，吡咯烷酮，萜烯、脂肪酸，脂肪酸酯，大环化合物，表面活性剂，亚砜，脂质体，transferomes，卵磷脂囊泡，非那甾胺醇质体(ethosomes)，水，阴离子、阳离子和非离子表面活性剂，多羟基化合物和香精油。
本发明的GTX化合物通常为具有相对低分子量的小分子，其为水溶性的并具有该化合物所带的正电荷并因此是阳离子。利用脂溶性的具有中性电荷的小分子进行经皮渗透是理想的。因此在本发明的情况下，可能希望在某些条件下采用阴离子化学促渗剂和/或阴离子表面活性剂以改进所述GTX化合物的经皮给药。同样，由于脂溶性可以改进经皮给药，希望化学修饰所述的GTX化合物以改变它们的亲水-亲脂平衡(HLB)并使它们脂溶性更大。这种修饰的一个例子可以是向所述的GTX分子以任何合适的、常规的方式通过例如向所述的GTX分子连接上长链脂肪分子而加上亲脂的“尾巴”。
因此，本发明活性剂的经皮给药方法可以变化，但必须涉及包含三环3，4-propino全氢化嘌呤的组合物向皮肤或粘膜组织预先确定的区域给药一段时间，所述时间为提供一种或多种活性成分的足够有效的血药水平或渗透水平的时间。所述方法可以包含作为软膏剂、凝胶剂、霜剂等的组合物的直接应用，或者可涉及如在本领域中教导的药物递送装置的应用，例如美国专利4,915,950、4,906,463、5,091,186或5,246,705，其公开的内容通过引用并入本发明中，目的是用于描述特定的经皮给药装置，或如下所述的。
在本发明的另一个实施方案中，物理经皮促渗方法选自离子导入、超声导入(phonoporesis)、超声-大孔法(sono-macroporation)、热调制、磁调制和机械调制，该物理经皮促渗方法可以单独采用或者与另一种物理或化学促渗剂组合使用。这些方法的大部分例子可在例如“Drug Permeation Enhancement，Theory and Applications，”D.S.T.Hsieh，编.，Marcel Dekker，New York，纽约(1994)中找到。
离子导入通过使电流通过包含含有毒素的组合物的贴片或皮肤区域，可将毒素递送到真皮下的位点。在一些实施方案中，电极可以放置于透皮贴片的外表面上或放在皮肤上，并将接地电极放置于其它地方。施加电流以使所述毒素透过皮肤。所采用的电流的量通常小于1mA/crm2，并优选0.3-0.7mA/cm2。由于很多GTX具有+1的电荷，这使得两个GTX分子渗透进入皮肤比例如也经过离子导入给药的具有+2电荷的其它分子更容易。
促渗的特别优选的方法为超声导入和超声-大孔法(sono-macroporation)。这些方法提供几个益处，包括避免在口服给药中出现的肠胃的降解和肝的首过代谢作用，由于它的无创性而使患者的依从性改善，消除可使皮肤损伤的化学促渗剂的应用需要，可用于以离子或非离子形式递送活性组分，可与水性和非水性载体一起很好地起作用，可将活性剂递送到深层皮下组织中，和这些方法可用于与其它经皮给药系统例如透皮贴片和/和促渗剂组合使用。超声导入已经用于递送局部用麻醉剂，例如在E.J.Novak，Arch.Phys.Med.Rehabil，May，231(1964)，和H.A.E.Benson，J.C.McElnay，和R.Harland，Int.J.Pharm.，44，65(1988)中。用于超声导入的适当的条件描述于“Y.Sun和J.C.Liu，”Transdermal Drug Delivery by Phonoporesis：Basics，Mechanisms，and Techniques of Application，第15章，″Drug PermeationEnhancement Theory and Applications，D.S.T.Hsieh，Ed.，Marcel Dekker，New York，纽约(1994)中，其公开内容通过引用并入到本发明中，目的是用于描述合适的超声导入条件。
如果采用超声导入，所述的组合物应当包含合适的耦合剂用于使声能从换能器的表面转移到患者上。水是优选的耦合剂，因为在水中的声阻抗和在软组织中的声阻抗间只有很小差别。或者，可以使用市售的耦合剂例如水性触变性凝胶剂、甘油和矿物油。
在进行超声导入的过程中，可以采用约10kHz至约20MHz的频率。更优选采用约1MHz至约16MHz的频率。超声可以是持续的或者是脉冲的，并且处理的强度和持续时间可由本领域技术人员根据患者和所需药物递送的希望的程度确定。通常在超声导入中采用的强度小于约2W/cm2。
或者可以采用超声-大孔法(sono-macroporation)。如果采用超声-大孔法(sono-macroporation)，所采用典型的声强为大于2W/cm2至最高约40W/cm2，与其组合的频率为约10-100kHz，更优选20-80kHz。超声波-大孔径法(sono-macroporation)用于分子量为约400-600kDa的较大分子的促渗是最有用的。
如果需要，上述组合物和递送方法可用于进行本发明的各种方法。因此，任何所描述的组合物可用于治疗描述于本文中的任何不同的疾病、肌肉疾病或其它症状。
在下述实施例中，“剂量”指患者的一个给药过程中所用毒素的量。一剂量可给药到一个或多个位点。“治疗”指向患者给药以获得希望的效果而所给的剂量的总数。由小鼠试验确定的100个单位的GTX2和GTX3的混合物，相当于通过HPLC-FLD测定的25μg的GTX2和GTX3。
实施例1
一个活性单位相当于本发明的组合物的这样的量，其须使20克CF1白化症或BALB-C种系小鼠腿部的股二头肌肌肉收缩阻断1.5至2小时。将所述的毒素以0.5ml的体积肌内注射到小鼠右腿的股二头肌中。左腿用作对照。在三只小鼠中进行上述步骤并在最初的2小时内每30分钟，以及随后每2、4、8小时和过夜测量麻痹作用。依赖于所注射的剂量，所述的麻痹作用可持续24小时或更长。该实施例证明本发明毒素作用的可逆性质并说明所述作用的持续时间可通过改变所述毒素的剂量而控制。
实施例2-纤维肌痛
毒素的每个剂量包含10至400个活性单位的膝沟藻毒素(GTX2/GTX3)混合物，并将其在根据在图1所示的2-20个肌肉点中进行肌内局部透入。每个注射点接受0.1-0.2ml(10-20个单位)的毒素溶液，每毫升溶液中包含100个活性单位的GTX2/GTX3混合物。载体为在不含防腐剂的无菌的0.9％氯化钠溶液。为了使疼痛减到最小可以重复给药，例如每四周一次，如由医师处方的那样，或者根据患者的需要。
在开放性试验中包括10名患者。这些患者需要满足特定的临床标准。根据评价和允许进入该研究，向所述患者给药如上所述的毒素。依赖于每个患者的症状和局部疼痛点，依据示于图1中总的注射点计划，由医师确定透入点的数量。所有的10位患者在每次给药后20分钟开始报告疼痛完全缓解。将这些患者在单次给药后进行3个月的随访，并且仅有2名患者在治疗后4和8周时复发疼痛症状。
实施例3-紧张性头痛(紧张性cefelea)
毒素的每个剂量包含10至400个活性单位的膝沟藻毒素(GTX2/GTX3)混合物，并将其在根据在图2所示的2-10个肌肉点中进行肌内局部透入。每个注射点接受0.1ml(10个单位)的毒素溶液，该溶液包含每毫升溶液中100个活性单位的GTX2/GTX3混合物。载体为在不含防腐剂的无菌的0.9％氯化钠溶液。可以重复给药，例如每四周一次，如由医师处方的那样，或者根据患者的需要。
在开放性试验中包括20名患者。这些患者需要满足如下临床标准：他们必须是慢性病患者，他们患有原发性非血管性的紧张性头痛，一周至少2次，并且先前用止痛剂、全身性肌肉松弛剂、局部皮质激素类透入或抗抑郁药治疗过这种症状。根据评价和允许进入该研究，由医师确定毒素注射点的数量，基本上参照图2采用如上所述的总的注射位点计划。
结果说明所有的20位患者在给药后20分钟开始报告疼痛完全缓解。将这些患者在单次给药后进行3个月的随访。结束时，仅有4名患者在治疗后4至6周时复发紧张性头痛的轻微疼痛。
实施例4-睑痉挛和偏侧面肌痉挛
毒素的每个剂量包含10至400个活性单位的膝沟藻毒素(GTX2/GTX3)混合物，并将其经过2-4个注射点在眼窝肌肉中进行肌内局部透入。在其它面部肌肉中也可采用另外的局部注射，由医师决定，和/或根据每个患者病状的严重性。每个注射点接受0.1-0.4ml(10-40个活性单位)的毒素溶液，每毫升溶液中包含100个活性单位的GTX2/GTX3混合物。载体为不含防腐剂的无菌的0.9％氯化钠溶液。每2-4周可以重复给药，由医师处方，或者根据患者的需要。
已经治疗了几名志愿者的睑痉挛和/或偏侧面肌痉挛。根据患者的症状，由医师确定注射点的数量(2至20个)。
图3A和3B显示在睑痉挛患者中局部注射GTX毒素的效果。在图3A中，患者眼睑收缩并且闭眼，具有睑痉挛的病理学特征。在注射后2分钟，患者可以睁开眼睛，并且所述的痉挛松弛(图3B)。这个效应持续2周。
图4A显示患有对肉毒杆菌A型毒素抗性的永久性偏侧面肌痉挛的患者。如上所述给药GTX毒素。在注射后2分钟后，如图4B所示，其面部肌肉松弛。这个效应持续1周。
实施例5美容用凝胶剂用于治疗皱纹
乙氧基二甘醇    6.500％w/w
Laureth-7       1.000％w/w
尿素醛          0.300％w/w
尼泊金甲酯      0.150％w/w
尼泊金丙酯      0.050％w/w
羟乙基纤维素    1.500％w/w
毒素GTX2/GTX3   0.01-0.0001％w/w
水              调至100％w/w
组分的用途：
乙氧基二甘醇：促渗剂(有机溶剂)
Laureth-7：促渗剂(表面活性剂)
尿素醛、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯：防腐剂
羟乙基纤维素：增稠剂
混合过程：
除了羟乙基纤维素，将所有组分溶解在水中并将其混合制成澄清、均匀的溶液。将羟乙基纤维素聚合物利用涡旋混合分散，并不用涡旋继续混合直至形成平滑的、澄清的凝胶形式。
实施例6-8-用于局部给药的霜剂
Figure S05822769220070109D000241
Figure S05822769220070109D000252
Figure S05822769220070109D000261
实施例9-软膏剂
凡士林                   75.000％w/w
倍半油酸失水山梨醇酯     10.000％w/w
白蜡                     10.000％w/w
毒素GTX2/GTX3            0.01-0.0001％w/w
水                       调至100％w/w
组分的用途：
凡士林：润肤的软膏剂基质
倍半油酸失水山梨醇酯：乳化剂、促渗剂
白蜡：增稠剂、稳定剂
混合过程：
将凡士林、倍半油酸失水山梨醇酯和白蜡在60℃熔融，并混合至均匀。缓慢加入毒素的水溶液并继续混合直至该软膏剂凝结。
实施例10
将包含GTX2/GTX3混合物的霜剂应用到健康成人志愿者的前额(眉间或皱眉皱纹)和眼睛周围(鸦足皱纹)。给药后，该区域用手持超声器(Beauty Care System，Model JS-2000，Annapolis，MD.USA)处理30秒钟以加速透皮吸收。该霜剂的给药使皱纹减少，持续时间超过24小时。
实施例11
剂量为200个单位至最高5,000个单位的GTX2和GTX3混合物，如在实施例2中所采用的，在正常志愿者身上通过注射给药到肛内括约肌中。这些剂量被很好地耐受，没有不良的或负面的副作用。在局部注射这些相对大量的毒素过程之中和之后，这些志愿者保持健康。
实施例12
对10名健康成年男性，24至48岁，具有正常的括约肌张力(通过肛门直肠压力测定确定其静息压力小于72mmHg)进行研究。这些测试对象没有肛门直肠病状，例如痔疮、瘘或脓肿。在治疗前，进行测试，包括肛门直肠压力测定、肌电图、血象、基础代谢生化检验和尿液分析。
100个活性单位剂量的GTX-2和GTX-3组合，其比例为约2∶1，总体积为1.0m1，将其用胰岛素注射器(25号)局部透入到肛内括约肌的两侧(每边0.5m1)。所述的GTX-2和GTX-3混合物收集自智利Patagonia海湾发现的、被PSP毒素高度污染的贝类中，用标准纯化方法进行纯化。
注射后2分钟，进行肛门直肠压力测定。测量和记录静息的和自发的收缩压力并与基线测量相比较。在每个参与者中注射毒素之前和之后还测量和记录直肠-肛门(Recto-anal)和皮质-肛门(cortical-anal)的反射作用。肛管压力通过具有充水的微气球和外转换器(PVB)灌注设备的定点牵拉技术进行记录。追踪的记录和分析通过计算机系统进行(8导生理记录仪ID，Metronic Polygraph with Polygram 98版本2.2)。
肛门静息压力用定点牵拉技术以毫米汞柱的形式进行记录，并且由计算机确定其平均压力。最大的自发收缩通过评价在每个参与者中肛门括约肌的主动收缩而评定。幅度以毫米汞柱的形式表示。
在24和48小时，在一周后和在12天后对参与者进行评价。在注射后1周从每名参与者身上收集血样和尿样用于实验室分析。尿液中的毒素水平在注射后4小时测量。在每次就诊时记录脉搏和血压以及任何副作用和疼痛分值。注射疼痛分值和在注射后2分钟的疼痛通过询问该参与者确定，利用1-10的疼痛表，其中10为疼痛的最大值。
经过与参与者个人交流并通过在参与者的要求下临床检查，在中位随访值12个月后确定长期结果。
没有参与者退出该研究，并且没有人具有不良的或负面的副作用。实验室测试没有显示出任何显著的变化，并且在注射后4小时收集的尿样中没有检测到毒素。通过分析性高效液相色谱(HPLC)联用荧光检测进行毒素检测；本方法的检出限为在10ml中1微克。这也对应于这样的实际情况：一旦注射PSP毒素，其立即进入细胞外周介质，形成稀释。
表1总结了测试结果。如表1所示，所有的参与者在注射后30秒内显示出肛门括约肌松弛，用肛门直肠测压法通过在注射过程中和然后在两分钟后的临床肛门直肠检测确定。所有的参与者声明它们感到肛门麻木，平均时间为59.5分钟±7.12分钟(平均值±标准偏差)，并且括约肌的低张力感觉持续40.0±4.20分钟。没有参与者显示出排气失禁或短时排便失禁。
表1.症状和副作用
    健康成人志愿者     10
    在注射中疼痛(1-10标度)     5.55±0.4
    注射后2分钟疼痛     100％没有疼痛
    肛门麻木感(时间)     59.50±7.12分钟(n＝9)
    括约肌松弛感     40.0±4.20分钟(n＝9)
    排气失禁     没有
    排便失禁     没有
    临床评价     立即松弛
    副作用     没有
    其它     在24小时后全部无症状
表2总结了肛门直肠压力测量的记录。压力测量的记录显示肛门最大自发收缩压力显著降低。在注射后2分钟，该压力为所述基线值的55.2±6.2％(平均值±标准偏差)，减小44.8％。注射24小时后，肛门最大自发收缩压力的下降上升到所述基线值的53％。注射15天后，所有的肛门最大自发收缩恢复到所述基线值。在注射之前和之后记录的肌电图(EMG)记录说明该注射几乎消除了肌肉活性。在12个月的随访检查(长期随访)中，没有参与者显示任何不良的和全身性的副作用(即，肛门直肠问题)。
表2.肛门直肠压力测量法记录
    最大静息压力   66±5.8mm Hg(n＝10)
    最大自发收缩压力(MVCP)
    注射前   126±11.5mm Hg(n＝10)
    注射后2分钟   69.5±5.8mm Hg(n＝10)
    注射后24小时   59.2±7.2mm Hg(n＝5)
    注射后2分钟的MVCP百分数   55.2±6.2％(n＝9)
    注射后24小时的MVCP百分数   47.0±6.8％(n＝5)
    直肠-肛门反射(在60cc之后)   100％保持
    皮质-肛门反射   100％保持
从表2中可见，在给药GTX-2和GTX-3的混合物之后，在100％的参与者中立即达到完全肛门括约肌松弛。这表明这些毒素的局部注射在所述括约肌中产生局部麻痹。这种松弛作用通过如由结肠直肠病学家在注射过程中所进行的肛门临床评价而证实。毒素的注射没有产生任何长期持续的副作用，例如排气失禁或排便失禁，并且所述的直肠-肛门和皮质-肛门的反射保持正常。所注射的毒素水平阻断了所述肌肉的额外的收缩，但保留了足够的强度以提供正常的性能。
毒素的局部外周给药干扰了神经肌肉传递，改变了导致所述括约肌临时性麻痹的动作电位。GTX的作用方式是直接影响所注射的肌肉，而使在该区域的其它肌肉不受影响。所述的局部麻痹作用表明所述括约肌的局部注射持续12天。因为没有副作用，局部注射该毒素的应用是安全的并且是有效的，特别是对于在肛门括约肌中的应用。正在愈合的组织的不动性是基本的治疗原则，并且利用麻痹性毒素的治疗可能有效地缓解其它与肌肉相关的病症，例如如上所述的那些。
实施例13
50名成人，年龄为18至70，患有症状性肛裂，评价他们用于入选研究，所述的研究测试GTX局部透入功效在通过降低肛门紧张度以促进愈合过程的肛裂治疗中、以及消除外科手术介入的需要中的作用，并提供安全有效的软膏剂替代治疗。
对患者进行如下入选标准评价：前部、后部或两者都有的局限性溃疡，在肛门内括约肌的水平纤维的边缘和后部有硬化，患有排便后或永久性疼痛、出血或两者都有的症状。有两次肛裂史或病程过月的患者被认为是慢性的。表3包含选择用于研究的患者的详细情况。小于18岁或大于70岁的患者被排除在该研究之外，还有那些怀孕或患有的肛裂但伴有其它病症，例如痔疮、瘘或肛门脓肿的患者。
表3.肛裂患者的特征
    特征     患者(N＝50)
    性别(男/女)     17/33
    平均年龄(岁)     35.9±13.1
    自发疼痛(患者数量)     46
    便后疼痛(患者数量)     50
    出血(患者数量)     49
    平均症状持续时间(月)     24.4±39.7
    急性/慢性     17/33
    位置(后部/前部/前后部)     32/8/5
    有便秘史(患者数量)     42
    以前保守治疗(数量)     36
    以前外科手术治疗(数量)     2
该研究的治愈的标准和主要的结束点为疼痛缓解和裂缝处上皮形成。参与者被完全告知关于GTX的作用和机理，并且要患者提供书面同意书。该研究为随机双盲试验，其中所述的患者被诊断和注射GTX-2和GTX-3的混合物或0.9％氯化钠溶液安慰剂。用安慰剂治疗的15个患者，显示没有改进或者病症恶化，并且用GTX注射的患者在3个星期治疗后显示出显著的改进，之后该研究出于人道主义和伦理原因开放。
所述的试验剂量由在1.0ml体积中的100个活性单位的GTX-2和GTX-3的混合物组成，将其以等量体积局部透入到在肛门内括约肌中的肛裂的两边。所述注射用胰岛素针头(25号)完成。
如上所述进行肛门压力的测量和记录。在注射后7、14和28天后对患者进行临床评价。在注射过程中和2分钟时，通过询问患者的方式评价疼痛，以1-10标度估计它们的疼痛，其中10为最大疼痛数值。没有大便软化剂、大块轻泻剂(bulk laxative)或坐浴被处方。长期的结果在12个月随访检验中确定。
表4.在治疗后在患者中的症状和副作用
    需要的剂量数量   2.6±1.3
    平均愈合时间(天)   17.6±9.0
    在注射过程中疼痛   5.8±2.3
    注射后2分钟疼痛   1.6±1.2
    出血时程(在第一次注射后，天)   1.2±0.9
    疼痛时程(在第一次注射后，天)   2.1±0.7
    排气失禁   没有
    排便失禁   没有
    指诊(即刻括约肌松弛)   100％
    副作用   在100％患者中没有
表5.肛门直肠压力测定的记录
Figure S05822769220070109D000321
在该研究中包括的50位患者中，在试验中或试验后都没有患有不良的的或负面的副作用。如表5中所示，100％的患者显示出注射后即刻的肛门括约肌松弛，以指诊和肛门直肠压力测定。在指诊过程中，结肠直肠病学家检查到所述的肛门张力降低并且所有的患者在注射后声明他们感觉到肛门麻木。注射后7天的检查显示在所有患者中肛门张力大幅降低。没有观察到失禁并且所有的患者保持其直肠-肛门和皮质-肛门反射(参见表4)。
表5说明在所有患者中，最大静息压力(MRP)都显著降低，如通过压力测定的记录指出的那样。所述的MRP记录从108.8±24.9下降到61.1±22.8mmHg(平均值±标准偏差)，降低到MRP基线值的56.2±12.5。这表明平均降低43.8％。类似地，最大自发收缩压力(MVCP)降低至MVCP基线值的74.3±13.1，平均下降25.7％。
患有急性肛裂的患者在注射的48小时内停止流血。通过注射后第7天的检查，这些患者显示在损伤处上皮形成，并仅在排便后具有中等程度的疼痛。在注射后第14天的检查时，所有患者显示具有疤痕形成的完全上皮形成。
患有慢性肛裂的患者在注射的48小时内也停止流血。通过注射后第7天的检查，患有慢性肛裂的50％的患者显示与所述急性患者相似的上皮形成。然而，在注射后第14天的检查时，上皮形成是明显的，并且通过注射后第28天的检查，在98％的患有慢性肛裂的患者中完全上皮形成。所有的患者在排便后没有疼痛并且没有症状。
一名患者在注射后3个月复发并需要外科手术介入。这名患者是59岁的妇女，患有伴有周期性剧烈疼痛和流血的复发性肛裂有8年历史，还并患有下裂渗透和流血倾向。她的肛门直肠压力测定读数显示在基线处MRP为118mm Hg和MVCP为171mm Hg。在所述研究中其他的患者保持无症状和健康。在38个月的追踪后，只有两名患者表现出肛裂的复发，需要不同的治疗。
这些结果显示100％的患者在透入后立刻经历肛门括约肌松弛。在内部括约肌中产生局部麻痹并且同时提供肛门张力的降低。排气失禁和排便失禁都没有被观察到，并且所有的患者保持肛门的功能和皮质肛门的反射，这说明透入阻断了所述肌肉额外的收缩，但保留足够的强度用于正常的肌肉性能。重复注射没有产生任何问题或副作用。所述的局部麻痹作用持续大于1周。在12个月的检查中，没有观察到副作用。
在所述研究的50个患者中，3名急性和33名慢性患者以前曾用坐浴、大便软化剂、高纤维饮食、肠调节和局部用软膏剂保守治疗，但没有效果(未治愈)。这个研究的治愈率，对于所有患者在28天内为98％，但17名急性患者在15天内就治愈了。这些结果显示其比其它药物治疗(BoTox、硝化甘油或硝苯地平)具有更高的疗效。
这个实施例强调GTX治疗产生基本上即刻的和相对长持续时间的肌肉松弛作用，其可有利地用于治疗各种病症。GTX治疗降低了化学去神经作用诱导时间周期。当给药100个活性单位剂量的GTX，产生可逆的化学去神经作用，持续时间为12天，这与BoTox治疗相反，BoTox治疗产生不可逆化学去神经作用，持续时间为3个月或更长，同时伴随蛋白水解结构性破坏。肌肉失活持续直到新的原纤维从神经中生长，形成在肌肉细胞壁上新的区域新的连接板。
实施例14
一个活性单位相当于本发明的组合物的这样的量，其须使20克CF1白化症或BALB-C种系小鼠腿部的股二头肌肌肉收缩阻断1.5至2小时。将所述的毒素以0.5ml的体积肌内注射到小鼠右腿的股二头肌中。左腿用作对照。在三只小鼠中进行上述步骤并在最初的2小时内每30分钟，以及随后每2、4、8小时和过夜测量麻痹作用。依赖于所注射的剂量，所述的麻痹作用可持续24小时或更长。该实施例证明本发明毒素作用的可逆性质并说明所述作用的持续时间可通过改变所述毒素的剂量而控制。
实施例15-多汗症
治疗2名患者的手掌多汗症。根据症状，由医师确定毒素注射点的数量，基本上采用通常的在手指和手掌的注射计划。毒素的每个剂量包含10至400个单位的GTX2/GTX3混合物，将其在2至10个肌肉点中进行局部肌内透入。每个注射点接受0.1-0.2ml(10-20个单位)的毒素溶液，该溶液每毫升中包含100个单位的GTX2/GTX3混合物。所述溶液用0.9％氯化钠在无菌溶液中制成，不含防腐剂。
结果显示手掌出汗量的降低，其通过确定位于在所治疗的手中，在所述手的手掌下5分钟的滤纸的重量，与在没有治疗的对照手中的类似的滤纸的重量相比而测量。另外，所述毒素的作用可通过在注射毒素之前和之后对两张滤纸进行目测而确定。被治疗的手在所述毒素的给药后显示显著较少的或没有水分释放。
如上详细描述的本发明很多不同的实施方案仅用来举例说明和描述，并且不应解释为以任何方式限制本发明的范围。本领域技术人员应认识到很多修改和变化可在本发明的范围内进行。

Claims (39)

1.至少一种选自GTX-1、GTX-2、GTX-3、GTX-4和GTX-5的三环3，4-propino全氢化嘌呤在制备用于治疗至少一种选自如下的疾病的药物组合物中的应用：睑痉挛、斜视、局限性肌张力障碍、多汗症、膀胱松弛、肌肉痉挛相关的疼痛和肌肉痉挛，所述GTX-1、GTX-2、GTX-3、GTX-4和GTX-5为如下所示的式I表示的三环3，4-propino全氢化嘌呤：
Figure FA20190651200580022769201C00011
其中GTX-1和GTX-4的R1为-OH，GTX-2，GTX-3和GTX-5的R1为-H，GTX-1，GTX-2和GTX-5的R2为-H，GTX-3和GTX-4的R2为-OSO- 3，GTX-1和GTX-2的R3为-OSO- 3，GTX-3，GTX-4和GTX-5的R3为-H，GTX-1，GTX-2，GTX-3和GTX-4的R4为-COONH2，GTX-5的R4为-COONHSO- 3，GTX-1，GTX-2，GTX-3，GTX-4和GTX-5的R5为-OH，
并且所述组合物的有效量包含40至5000个活性单位。
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述的组合物包含GTX-2和GTX-3。
3.根据权利要求1所述的应用，其中所述组合物的有效量包含40至500个活性单位。
4.根据权利要求1所述的应用，其中所述组合物的有效量包含40至1000个活性单位。
5.根据权利要求1所述的应用，其中所述组合物的有效量包含50至500个活性单位。
6.根据权利要求1所述的应用，其中所述组合物的有效量包含75至200个活性单位。
7.根据权利要求1所述的应用，其中所述的组合物进一步包含神经毒素，所述的神经毒素选自蛤蚌毒素、新蛤蚌毒素、脱氨甲酰蛤蚌毒素、破伤风毒素和肉毒杆菌A型毒素。
8.根据权利要求1所述的应用，其中所述的组合物进一步包含局部用麻醉剂。
9.根据权利要求8所述的应用，其中所述的局部用麻醉剂选自苯佐卡因、丁卡因、马比佛卡因、丙胺卡因、依替卡因、布比卡因、利多卡因。
10.根据权利要求1所述的应用，其中所述的组合物为注射用组合物。
11.根据权利要求1所述的应用，其中所述的组合物为局部用组合物。
12.根据权利要求1所述的应用，其中所述的组合物为经皮用组合物。
13.根据权利要求11所述的应用，其中所述的局部用组合物包含基于所述组合物总重计的0.0001重量％至0.01重量％的一种或多种选自GTX-1、GTX-2、GTX-3、GTX-4和GTX-5的化合物。
14.至少一种选自GTX-1、GTX-2、GTX-3、GTX-4和GTX-5的三环3，4-propino全氢化嘌呤在制备用于治疗至少一种选自如下的疾病的药物组合物中的应用：腕管综合征、纤维肌痛、关节红肿、关节疼痛、手术后疼痛、关节炎、坐骨神经痛、腱炎、颈痛、背痛、偏侧面肌痉挛、喉功能亢进、小儿脑性瘫痪、痉挛、紧张性头痛、偏头痛、书写痉挛、震颤、抽动症、上食管和下食管括约肌疾病、胃轻瘫、肥厚性幽门狭窄、痔疮、痉挛性肛部痛、肠易激综合征、肌肉痉挛、血管痉挛病、涉及子宫的疾病或膀胱痉挛、Oddi括约肌功能障碍和短节段先天性巨结肠和磨牙症，所述GTX-1、GTX-2、GTX-3、GTX-4和GTX-5为如下所示的式I表示的三环3，4-propino全氢化嘌呤：
Figure FA20190651200580022769201C00031
其中GTX-1和GTX-4的R1为-OH，GTX-2，GTX-3和GTX-5的R1为-H，GTX-1，GTX-2和GTX-5的R2为-H，GTX-3和GTXX-4的R2为-OSO- 3，GTX-1和GTX-2的R3为-OSO- 3，GTX-3，GTX-4和GT-5的R3为-H，GTX-1，GTX-2，GTX-3和GTX-4的R4为-COONH2，GTX-5的R4为-COONHSO- 3，GTX-1，GTX-2，GTX-3，GTX-4和GTX-5的R5为-OH，
并且所述组合物的有效量包含40至5000个活性单位。
15.根据权利要求14所述的应用，其中所述的组合物包含GTX-2和GTX-3。
16.根据权利要求14所述的应用，其中所述组合物的有效量包含40至500个活性单位。
17.根据权利要求14所述的应用，其中所述组合物的有效量包含40至1000个活性单位。
18.根据权利要求14所述的应用，其中所述组合物的有效量包含50至500个活性单位。
19.根据权利要求14所述的应用，其中所述组合物的有效量包含75至200个活性单位。
20.根据权利要求14所述的应用，其中所述的组合物进一步包含神经毒素，所述的神经毒素选自蛤蚌毒素、新蛤蚌毒素、脱氨甲酰蛤蚌毒素、破伤风毒素和肉毒杆菌A型毒素。
21.根据权利要求14所述的应用，其中所述的组合物进一步包含局部用麻醉剂。
22.根据权利要求21所述的应用，其中所述的局部用麻醉剂选自苯佐卡因、丁卡因、马比佛卡因、丙胺卡因、依替卡因、布比卡因、利多卡因。
23.根据权利要求14所述的应用，其中所述的组合物为注射用组合物。
24.根据权利要求14所述的应用，其中所述的组合物为局部用组合物。
25.根据权利要求14所述的应用，其中所述的组合物为经皮用组合物。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述的局部用组合物包含基于所述组合物总重计的0.0001重量％至0.01重量％的一种或多种选自GTX-1、GTX-2、GTX-3、GTX-4和GTX-5的化合物。
27.至少一种选自GTX-1、GTX-2、GTX-3、GTX-4和GTX-5的三环3，4-propino全氢化嘌呤在制备用于减少或消除皱纹的药物组合物中的应用，所述GTX-1、GTX-2、GTX-3、GTX-4和GTX-5为如下所示的式I表示的三环3，4-propino全氢化嘌呤：
Figure FA20190651200580022769201C00051
其中GTX-1和GTX-4的R1为-OH，GTX-2，GTX-3和GTX-5的R1为-H，GTX-1，GTX-2和GTX-5的R2为-H，GTX-3和GTX-4的R2为-OSO- 3，GTX-1和GTX-2的R3为-OSO- 3，GTX-3，GTX-4和GTX-5的R3为-H，GTX-1，GTX-2，GTX-3和GTX-4的R4为-COONH2，GTX-5的R4为-COONHSO- 3，GTX-1，GTX-2，GTX-3，GTX-4和GTX-5的R5为-OH，
并且所述组合物的有效量包含40至5000个活性单位。
28.根据权利要求27所述的应用，其中所述的组合物包含GTX-2和GTX-3。
29.根据权利要求27所述的应用，其中所述组合物的有效量包含40至500个活性单位。
30.根据权利要求27所述的应用，其中所述组合物的有效量包含40至1000个活性单位。
31.根据权利要求27所述的应用，其中所述组合物的有效量包含50至500个活性单位。
32.根据权利要求27所述的应用，其中所述组合物的有效量包含75至200个活性单位。
33.根据权利要求27所述的应用，其中所述的组合物进一步包含神经毒素，所述的神经毒素选自蛤蚌毒素、新蛤蚌毒素、脱氨甲酰蛤蚌毒素、破伤风毒素和肉毒杆菌A型毒素。
34.根据权利要求27所述的应用，其中所述的组合物进一步包含局部用麻醉剂。
35.根据权利要求34所述的应用，其中所述的局部用麻醉剂选自苯佐卡因、丁卡因、马比佛卡因、丙胺卡因、依替卡因、布比卡因、利多卡因。
36.根据权利要求27所述的应用，其中所述的组合物为注射用组合物。
37.根据权利要求27所述的应用，其中所述的组合物为局部用组合物。
38.根据权利要求27所述的应用，其中所述的组合物为经皮用组合物。
39.根据权利要求27所述的应用，其中所述的局部用组合物包含基于所述组合物总重计的0.0001重量％至0.01重量％的一种或多种选自GTX-1、GTX-2、GTX-3、GTX-4和GTX-5的化合物。
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