CN1993313A - 抗菌化合物 - Google Patents

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Abstract

用真细菌链霉菌发酵营养培养基来产生结构通式(I)的新抗菌化合物。

Description

抗菌化合物
本申请享有2004年5月24日提交的U.S.临时申请60/573,899的优先权。
发明背景
本发明涉及具有抗菌活性的新天然产物。
由细菌引起的感染是增长中的医学问题，因为这些病原体中的许多对各种常见的抗生素是抗性的。这样的微生物包括金黄色葡萄球菌(Staphylcoccus aureus)，表皮葡萄球菌(Staphylcoccus epidermidis)，溶血葡萄球菌(Staphylococcus hemolyticus)，酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)，肺炎链球菌(Streptcccus pneumoniae)，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，屎肠球菌(Entercccus faecium)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，Actinobacter calcaeticus，大肠杆菌(Escherichia coli)和嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)。本发明的抗生素包括对治疗的重要贡献，该治疗用于治疗对各种已知抗生素抗性的传染。对于综述，参见：F.D.Lowy TheJournal of Clinical Investigation 2003，111(9)，1265。
本发明中，描述了从链霉菌属(Streptomyces)真细菌发酵分离的新天然产物。该化合物呈现了对抗各种病原菌的抗菌活性，已经证明其中许多病原菌对目前可获得的抗生素是抗性的。
发明概述
本发明描述了通式I所示的新天然产物或其药物学上可接受的盐，及其作为抗菌剂的用途：
所述化合物可有效治疗细菌感染。
本发明还涉及通过用真细菌，链霉菌发酵来制备化合物I的方法。本发明还涉及从发酵液中分离通式I化合物的方法。
附图简述
图1是化合物I在C5D5N中的13C NMR光谱。
图2是化合物I在C5D5N中的1H NMR光谱。
发明详述
本发明描述了结构通式I的化合物：
或其药物学上可接受的盐。
本发明化合物药物学上可接受的盐包括常规的无毒盐，如从无毒的无机或有机碱所形成的。例如，这样的常规无毒盐包括那些从无机碱如碱或碱土金属氢氧化物产生的盐，例如，钾盐、钠盐、锂盐、钙盐或镁盐等；和从有机碱制备的盐，所述有机碱是例如胺，例如二苄基乙二胺、三甲基胺、哌啶、吡咯烷、苄胺等，或氢氧化季铵如氢氧化四甲胺等。
可以从本发明化合物通过常规化学方法来合成药物学上可接受的盐。通常，通过在合适的溶剂或各种溶剂组合中游离酸与化学计量或与过量的所需成盐无机或有机碱反应来制得盐。
本发明的化合物I呈现了用于治疗细菌感染的抗菌活性。证明了对抗金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、枯草芽胞杆菌和大肠杆菌各种菌株的抗菌活性，包括对许多已知抗生素抗性的菌种，如二甲氧基苯青霉素抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)，万古霉素抗性的肠球菌(VRE)，多重药物抗性的屎肠球菌，大环内酯抗性的金黄色葡萄球菌和表皮金黄色葡萄球菌，和linezolide抗性的金黄色葡萄球菌和屎肠球菌。
本发明化合物可以配制成药物组合物，通过将化合物I与药物学上可接受的载体混合。以下列出了这样载体的实例。
可以以粉末或晶体形式，液体溶液，或悬浮液来使用化合物。可以通过各种方法来给药；那些主要的兴趣包括局部、口服和通过注射(静脉内或肌内)非肠道。
用于注射(一种传送途径)的化合物，可以制成安瓿的单位计量形式，或配制于多剂量容器内。可注射的组合物可以采用这样的形式，如悬浮液、溶液或油性或水性载体中的乳浊液，并可以含有各种配制剂。或者，活性成分可以是粉末(冻干或非冻干)形式，用于在传送时用合适的载体如无菌水重建。可注射的组合物中，载体通常包括无菌水、盐水或另一种可注射液体，例如，用于肌内注射的花生油。此外，可以包括各种缓冲剂，防腐剂等。
局部施加可以配置于载体中如疏水性或亲水性基料来形成膏剂、霜剂、洗剂，配制于含水的、油质或醇液体中来形成涂抹料，或配制于干稀释剂中来形成粉末。
口服组合物可以采用这样的形式如片剂、胶囊、口服悬浮液和口服溶液。口服组合物可以使用载体如常规配制剂，并可以包括持续释放特性以及快速释放形式。
待给药的剂型很大程度上取决于待治疗患者的情况和大小，给药的途径和频率，病原菌对化合物的敏感度，感染的毒力和其他因素。然而，将这样的事情留给医师根据抗菌领域公知的治疗原理来常规处理。
给药于人的组合物，不管是液体或固体，每单位剂量可以含有约0.01％至高约99％的化合物I，一实施方案的范围为约10-60％。组合物通常含有约15mg至约2.5g的化合物I，一实施方案的该范围为约250mg至1000mg。非肠道给药中，单位剂量通常包括无菌水溶液中的纯化合物I或用于溶液的可溶粉末形式，可以将其调节至中性pH和等渗。
在此所述的本发明还包括治疗需要这样治疗的哺乳动物细菌感染的方法，所述方法包括将治疗感染有效量的化合物I给药于哺乳动物。
给药化合物I方法的一实施方案包括口服和非肠道方法，例如，i.v.灌输，i.v.快速浓注和i.m.注射。
对于成人，优选每天给药一至四次每kg体重约5-50mg化合物I。优选剂量是250mg至1000mg抗菌剂，每天给予一至四次。更具体地，对于轻微感染，推荐每天两至三次约250mg的剂量。对于中度感染，对抗高度敏感革兰氏阳性微生物，推荐每天三至四次约500mg的剂量。对于严重的、致命的感染，对抗抗生素敏感度上限的微生物，推荐每天三至四次约1000-2000mg的剂量。
对于儿童，优选每天给予2，3或4次约5-25mg/kg体重的剂量；通常推荐10mg/kg的剂量。
本发明的另一方面是生产化合物I的方法，其包括在合适的营养培养基中培养链霉菌属的微生物，然后从发酵液中回收本发明的化合物。链霉菌属的微生物，ATCC#PTA-5942，使用以下分类学研究鉴定为真细菌链霉菌属，以MA7339保藏于Merck保藏中心。
随后将生物体置于美国典型培养物保藏中心(ATCC)永久保藏，12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland，20852，并已经指定保藏号为ATCC#PTA-5942(Merck#MA7339)。
在专利颁布时将不能取消地消除任何关于公众获得微生物的限制。尽管，结合本发明描述了这些特定物种的使用，存在能够产生化合物I的其他物种和上述生物体的突变体，及其用途涉及实施本发明的方法。
通过合适培养基在受控条件下的需氧发酵来产生结构通式I的化合物，通过接种真细菌链霉菌的培养物。合适培养基优选是含水的并含有可同化碳、氮和无机盐的来源。
用于链霉菌发酵的培养基主要是公知的Difco胰胨豆胨培养液，单独或与本领域技术人员常用的添加营养素一起。
应当注意到在此所述的营养培养基仅仅是可以使用的多种培养基的说明，且不是以任何方式来限制本发明的范围。
在约10至约40℃的温度范围内进行发酵；然而，为了最佳结果，优选在约28℃进行发酵。在发酵过程中营养培养基的pH为约5.5至约7.5。
可以理解对于本发明化合物的发酵生产，本发明不限于使用ATCC保藏号为ATCC# PTA-5942(Merck# MA7339)的特定链霉菌。特别理想和确定的是使用从所述培养物产生或衍生的其他天然或人工突变体，或链霉菌属的其他变种或物种包括于本发明范围内，只要它们可以产生本发明的化合物。从ATCC# PTA-5942(Merck# MA7339)人工生产链霉菌的突变物种或菌株可以通过常规物理或化学突变来实现，例如，所需培养物的紫外线照射，或亚硝基胍处理等。还证明了重组DNA技术如原生质体融合，质粒引入，染色体片段引入等也是有用的。
                    实施例1
种子培养基组成：
    成分     g/L
    可溶性淀粉     20
    葡萄糖     10
    E型NZ胺     5
    Difco牛肉提取物     3
    Bacto(Difco)蛋白胨     5
    Difco酵母提取物     5
    CaCO3     1
pH7.0
YME.TE(生产培养基，g/l)
    培养基成分     g/L
   *Difco酵母提取物     6
   *麦芽提取物     15
   *葡萄糖     6
    微量元素     5ml
    MOPS     20
pH＝7.0
将链霉菌ATCC# PTA-5942(Merck# MA7339)的冷冻培养物(1.3mL)接种于含有50mL种子培养基的250mL烧瓶中。将烧瓶在28.0℃以220RPM振荡培养48小时。通过将第一代种子的3％接种物转移至含有50mL种子培养基的250mL摇瓶中来产生二代种子。将烧瓶在28.0℃以220RPM振荡培养48小时。将二代种子的5％接种物转移250ml中的至30ml YME-TE中，并在32.0℃以220RPM振荡培养12天。
化合物I的分离
向两升发酵液中，加入两升丙酮并在振荡器上振荡两小时并过滤。将滤过物在减压下浓缩来除去大部分丙酮并装载于75mLamberchrome(CG161s)柱上。用90％水至100％甲醇的梯度来洗脱柱子，将化合物洗脱于宽的区域中，然后将其浓缩并冻干，获得170mg半纯化级分。将该级分的80mg部分通过制备性HPLC(Zorbax Rx C821.4×250mm)来纯化，使用20-98％含有1％三氯醋酸的含水乙腈梯度来产生1.1mg的化合物I。通过光谱分析来阐明结构(参见以下的)。
化合物I的物理数据：
Figure A20058001661900091
MW 425
MF C24H27NO6
HEESIFTMS 实测值：426.1911；计算值M+H：426.1911
[α]23 D +2.1°(c0.96，CH3OH)
UV(CH3OH)λmax 226(ε16,837)296(2,663)nm
表：化合物I在500MHz的1H和13C NMR值
  C5D5N   C5D5N
#  13C 类型  1H
1   175.2 C°
2   32.2 CH2   2.70，m
3   31.8 CH2   2.53，m1.92，m
4   48.1 C°
5   204.1 C°
6   126.8 CH   5.92，d，10.0
7   154.9 CH   6.36，d，10.0
8   36.7 C°
9   40.4 CH   2.00，t，10.2
10   27.1 CH2   1.60，m1.36，brt，10.2
11   36.6 CH   2.26，m
12   26.5 CH2   1.78，m1.56，m
13   28.5 CH2   1.56，t，7.81.80，m
14   44.9 CH   1.93，d，10.22.15，d，10.2
15   149.8 C°
16   107.8 CH2   4.71，brs4.87，brs
17   21.5 CH3   1.09，s
1’   175.2 C°
2’   107.6 C°
3’   158.8 C°
4’   115.8 C°
5’   158.3 C°
6’   110.4 CH   6.88，d，8.4
7’   129.8 CH   8.12，d，8.4
8’ NH   10.50，s
3’-OH
5’-OH
培养物的特征
描述了化合物生产者培养物MA-7339的一般描述。
根据Shirling和Gottlieb(Int.J.Syst.Bacteriol.(1996)16：313-340)的方法来观察生长、一般培养特征和碳源利用的观察。通过与颜色Methuen手册(A.Komerup和J.H.Wauscher，第三版，1978)中所包含的颜色标准相比较来测定培养物的显色。
使用Lechevalier和Lachevalier(1980)的方法来测定细胞的化学组成。
使用改进的样品制备(Sasser，1990)来测定脂肪酸组成。通过毛细管气相色谱使用装有苯基甲基硅酮柱(0.2mm×25m)的HewlettPackard Model 6890N气相色谱/微生物鉴定系统软件(MIDI，Inc.，Newark，Del)了来进行脂肪酸甲酯(FAME)的分析。通过微生物鉴定系统软件来测定单个脂肪酸鉴定。
从使用引物27f和1525r(Lane，1991)获得的1500bp PCR片段来测定完整16S rDNA序列。将PCR产物用作测序反应中的模版，使用ABI PRISMTM染色终止基因循环测序试剂盒(Perkin Elmer)。使用GCG片段装配系统(Wisconsin Package，版本8)来装配部分序列，并使用程序CLUSTALW(Intelligenetics，Ins)来进行序列比对。使用最大-节俭分析来进行比对序列的系统发生分析，使用节俭分析系统发生(PAUP)程序版本4.0.(Swofford，1993)的分支和结合(branch-and-bound)算法。
来源：
从西班牙巴利阿里群岛Mallrorca收集的土壤中获得菌株MA7339。用1％(w/v)氯胺T预处理后分离菌株，并置于补充20μg/ml萘啶酮酸的基于腐殖酸的琼脂上。在酵母麦芽提取物琼脂上纯化后，检测分离物的活性，测试时，作为FabF_SPAR_C筛子中的琼脂填充物。
一般生长特征：
菌株MA7339在各种琼脂培养基上28℃生长良好，如酵母麦芽提取物、燕麦粉、甘油天冬酰胺、无机盐淀粉和胰胨豆胨琼脂。总的菌落形态是典型的链霉菌，记录其在不同琼脂培养基中的生长特征，包括孢子团颜色，基质菌丝体着色和不同色素的产生(表1)。
-菌落形态(在酵母麦芽提取物琼脂上，ISP2)：基质菌丝体初始发白的黄色在培养21天后转变成带黄色的棕色(5D7)。初始的白色气生菌丝体持续发展，在21天培养后转变成发白的灰色(5E1/5E2)，带有褐色的湿渗出物液滴。
-微形态：通过光学显微镜在400X和1000X放大倍数下直接测定平板上的孢子链形态。在酵母麦芽提取物琼脂上培养7，14和21天后进行观察。气生菌丝体从大规模分枝的基质菌丝体长出。稀疏的分枝气生菌丝体初始分化成短的和不规则紧密螺旋的孢子链螺旋。由少于10-20个孢子形成担子体，且随着时间趋于在较老培养物的暗黑色粘性孢子团中接合。在大部分其他测试培养基中观察到相似的形态，但是接合程度不同。相反，在甘油天冬酰胺琼脂中，菌株作为无性营养菌丝体生长。
化学分类学分析
细胞壁组成的分析表明菌株MA 7339在全生物体的水解产物中含有LL-A2pm，链霉菌的一个特征，且葡萄糖和核糖作为主要的细胞壁糖。菌株富含饱和的支链以及异-和反异-脂肪酸且全细胞甲醇分解产物含有主要的脂肪酸15:0反异(12.43％)和16:0异(17.94％)，这也是链霉菌的特征。尽管如此，主要成分是脂肪酸物质15:0异(20.43％)。表2中给出了完整的脂肪酸组成。
所有这些化学分类学分析表明菌株对应于链霉菌属的成员。
生理特征：
菌株MA7339呈现了以下的碳利用模式(表3)：
蔗糖、D-木糖、D-果糖和棉子糖的充分利用；D-葡萄糖、L-肌醇和D-甘露醇的中度利用；和L-阿拉伯糖、纤维素和鼠李糖的没有利用。
16S rDNA序列和系统发生分析
对于菌株MA-7739，已经测定了完整的16S rDNA序列(图1)。将序列与Genebank的链霉菌核苷酸序列(AB045882)以及普拉特链霉菌(S.platnsis)菌株MA7327和MA7331相比对。使用最大节俭方法来建立基于这些16S rDNA的系统发生树。每组的模拟复制品用作统计学置信度的测量。认为基于95％模拟复制品建立的分组是统计学显著的。
将菌株MA7339与普拉特链霉菌菌株ATCC13865以及菌株MA7327和MA7331相联系。该密切的关系得到模拟值(97％)的高度支持并表明该分离物可以鉴定为普拉特链霉菌种的另一个菌株(图2)。
表1.链霉菌MA7339的培养特征(21天，28℃)
培养基 生长量   气生菌丝体 可溶色素   基质菌丝体
酵母提取物麦芽提取物(ISP2) 大量   发白的灰色(5E1/5E2)，大量气生菌丝体具有短而紧密的不规则孢子链，形成环和卷。担子体生长于主要和次要气生分枝中，接合 无   带黄色的棕色(5D7)
燕麦粉(ISP3) 大量   灰色(5E2/F2)，大量气生菌丝体，紧密盘绕的孢子链的接合 无   橄榄棕色(4E3)
无机盐淀粉(ISP4) 大量   带灰色的棕色(5D3/F3)，大量气生菌丝体，链的接合 无   浅黄色(4E3)
甘油天冬酰胺(ISP5) 稀疏   无 无   带灰色的橙色(5B4)，无性基质菌丝体
酪氨酸琼脂(ISP7) 大量   橙灰色(5B2)，大量气生菌丝体生长，气生菌丝中短而紧密的螺旋，在接合和结节中断裂 无   茶褐色(6F7)
表2：菌株MA7339中发现的主要脂肪酸
    脂肪酸     总脂肪酸的％
    14:0异     5.66
    15:0异     20.43
    15:0反异     12.43
    15:0反异2OH     8.00
    15:0     3.48
    16::0     2.52
    16:0异     17.94
    16:1异H     3.54
    16:0异2OH     1.14
    17:0反异     3.58
    17:0环     1.48
    17:0异     3.36
    17:0异C     2.28
    17:1反异C     2.28
表3：菌株MA7339的碳水化合物利用模式
碳源 生长水平
D-葡萄糖 2
L-阿拉伯糖 0
蔗糖 3
D-木糖 3
L-肌醇 2
D-甘露醇 2
D-果糖 3
鼠李糖 0
棉子糖 3
纤维素 0
在以下化合物作为唯一碳源来生长；28℃，7，14，21天进行观察；生长水平：3＝充分利用；2＝中度利用；1＝差的利用；0＝没有利用。
图1.菌株MA7339的16S rDNA
菌株MA733916S rDNA片段(从：1至：1445)
  1 CCTCCTTCGG GAGGGGATTA GCTGGCGAAC GGGTGAGTAA CACGTGGGCA
 51 ATCTGCCCTT CACTCTGGGA CAAGCCCTGG AAACGGGGTC TAATACCCGG
101 ATACGACACA CGACCGCATG GTCTGTGTGT GGAAAGCTCC GGCGGTGAAG
151 GATGAGCCCG CGGCCTATCA GCTTGTTGGT GGGGTGATGR CCTACCAAGG
201 CGACGACGGG TAGCCGGCCT GAGAGGGCGA CCGGCCACAC TGGGACTGAG
251 ACACGGCCCA GACTCCTACG GGAGGCAGCA GTGGGGAATA TTGCACAATG
301 GGCGAAAGCC TGATGCAGCG ACGCCGCGTG AGGGATGACG GCCTTCGGGT
351 TGTAAACCTC TTTCAGCAGG GAAGAAGCGA GAGTGACGGT ACCTGCAGAA
401 GAAGCGCCGG CTAACTACGT GCCAGCAGCC GCGGTAATAC GTAGGGCGCA
451 AGCGTTGTCC GGAATTATTG GGCGTAAAGA GCTCGTAGGC GGCTTGTCAC
501 GTCGGATGTG AAAGCCCGGG GCTTAACCCC GGGTCTGCAT TCGATACGGG
551 CAGGCTAGAG TTCGGTAGGG GAGATCGGAA TTCCTGGTGT AGCGGTGAAA
601 TGCGCAGATA TCAGGAGGAA CACCGGTGGC GAAGGCGGAT CTCTGGGCCG
 651 ATACTGACGC TGAGGAGCGA AAGCGTGGGG AGCGAACAGG ATTAGATACC
 701 CTGGTAGTCC ACGCCGTAAA CGTTGGGAAC TAGGTGTGGG CGACATTCCA
 751 CGTCGTCCGT GCCGCAGCTA ACGCATTAAG TTCCCCGCCT GGGGAGTACG
 801 GCCGCAAGGC TAAAACTCAA AGGAATTGAC GGGGGCCCGC ACAAGCAGCG
 851 GAGCATGTGG CTTAATTCGA CGCAACGCCA AAGAACCTTA CCAAGGCTTG
 901 ACATACACCG GAAACGTCTG GAGATCAGGC GCCCCCTTGT GTCCGGTGTA
 951 TCATGGTGGT GCATGGCTGT CGTCAGCTCG TGTCGTGAGA TGTTGGGGTT
1001 TAAKTCCCCG CAACGAGCGC AACCCTTGTT CTGTGTTGCC AGCATGCCCT
1051 TCGGGGTGAT GGGGACTCAC AGGAGACTGC CGGGGTCAAC TCGGAGGAAG
1101 GTGGGGACGA CGTCAAGTCA TCATGCCCCT TATGTCTTGG GCTGCACACG
1151 TGCTACAATG GCCGGTACAA TGAGCTGCGA TACCGCGAGG TGGAGCGAAT
1201 CTCAAAAAGC CGGTCTCAGT TCGGATTGGG GTCTGCAACT CGACCCCATG
1251 AAGTCGGAGT TGCTAGTAAT CGCAGATCAG CATTGCTGCG GTGAATACGT
1301 TCCCGGGCCT TGTACACACC GCCCGTCACG TCACGAAAGT CGGTAACACC
1351 CGAAGCCGGT GGCCCAACCC CTTGTGGGAG GGAATCGTCG AAGGTGGGAC
1401 TGGCGATTGG GACGAAGTCG TAACAAGGTA GCCGTACCGG AAGGT
以下描述了用于测定化合物I抗菌活性的实验方案。
材料：
阳离子调节的Mueller Hinton培养液(MH；BBL)
50％裂解的马血(LHB；BBL)(冷冻存储)
RPMI 1640(BioWhittaker)
人血清(Pel-Freez)
嗜血测试培养基(HTM，Remel)
胰胨豆胨培养基(TSB，5mL/管；BBL)
0.9％的氯化钠(盐水，Baxter)
胰胨豆胨+5％羊血琼脂平板(TSA；BBL)
Sabouraud葡萄糖琼脂平板(BBL)
巧克力琼脂平板(BBL)
2×脱脂乳(Remel)
Microbank珠子(Kramer Scientific)
MIC 2000微量滴定平板培养箱
2×胰胨豆胨培养液(TSB，BBL)+15％甘油/50％马血清
96-孔微量滴定平板，盖子，接种盘(Dynex Laboratories)
8-道Finn多通道吸移管管理器，0.5-10μL体积。
方法：
培养基制备
阳离子调节的Mueller Hinton培养液(BBL)：根据制造商的说明来制备(将22g溶解于1000mL水中；高压灭菌22分钟)。冷冻存储。在使用之前使用Corning 0.45Tm纤维素醋酸酯滤器无菌过滤。
50％裂解的马血：将脱纤维蛋白的马血与无菌蒸馏水1∶1稀释；冷冻，融化并再冷冻(至少7次)，然后离心。冷冻存储于-20℃。
阳离子调节的Mueller Hinton+2.5％裂解的马血：将5mL 50％裂解的马血无菌加入100mL阳离子调节的Mueller Hinton培养液中。在使用之前使用Corning 0.45Tm纤维素醋酸酯滤器无菌过滤。
阳离子调节的Mueller Hinton+50％人血清：将50mL人血清无菌加入50mL 2X阳离子调节的Mueller Hinton培养液中。在使用之前使用Corning0.45Tm纤维素醋酸酯滤器无菌过滤。
嗜血测试培养基(Remel)：接受制造商制备好的。在使用之前使用Corning 0.45Tm纤维素醋酸酯滤器无菌过滤。
0.9％氯化钠(盐水；Abbott Labs)：接受制造商制备好的。
2×脱脂乳(Remel)：接受制造商制备好的。
所有琼脂平板接受制造商制备好的。
代表菌株的条件和接种
芽胞杆菌、葡萄球菌，培养条件，35℃；在18-22小时阅读MIC；肠球菌：埃希氏菌：阳离子调节的Muller Hinton(CAMHB；BBL)；接种＝105CFU/mL
肺炎链球菌：培养条件，35℃；在22-24小时阅读MIC阳离子调节的Muller Hinton+2.5％裂解的马血(LHB)；接种＝105CFU/mL
流感嗜血菌：培养条件，35℃；在18-22小时阅读MIC嗜血测试培养基(HTM；Remel)；接种＝105CFU/mL
培养条件，35℃；在24小时阅读MIC；RPMI 1640培养基(BioWhittaker)接种＝105CFU/mL
所测试抗生素的最高浓度＝64g/mL(从50％DMSO中的1mg/mL溶液开始)
每孔DMSO的终浓度＝3.2％
分离物的选择和维持
所用的菌株是来自Merck培养中心或临床测试的分离物。流感嗜血菌的菌株是用于Merck体内测试的小鼠病原菌。大肠杆菌菌株是细胞壁可渗透的菌株。Candida albicans菌株用作对照。将这些培养物作为a)Microbank珠子；b)2×脱脂乳；或c)2×Trypticase大豆培养液+15％甘油/50％马血清(嗜血菌和肺炎链球菌)中的冷冻储液维持于-80℃。
接种物制备
将所选择的分离物再次培养于巧克力琼脂平板(流感嗜血菌)，胰胨豆胨+5％羊血琼脂平板(肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肠球菌、芽胞杆菌)或Sabouraud葡萄糖琼脂(假丝酵母)，并在35℃培养。将嗜血菌和肺炎链球菌在5％CO2中培养；所有其他分离物在大气中培养。在测试前将分离物再次培养2次。
从平板选择菌落并用于制备胰胨豆胨培养液中等于0.5McFarland标准的接种物。从肺炎链球菌制备等于1.0M cFarland标准密度的接种物。所有培养物的接种密度为TSB中～108CFU/mL。将该TSB接种物以1∶10稀释于无菌盐水中(4mL接种物+36mL盐水；等于～107CFU/mL)并保持于冰上直至用于接种微量滴定平板。
对随机选择的分离物进行菌落计数来证实CFU/孔(TSB接种物以10-5，10-6涂布于TSA II+5％SB或巧克力琼脂平板，培养过夜，35℃，CO2)。
平板填充
将96孔微量滴定平板(Dynex)的所有孔装满100TL培养基。制备嗜血测试培养基来测试流感嗜血菌；制备阳离子-调节的MullerHinton+5％裂解的马血平板来测试肠球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽胞杆菌。RPMI 1640用于测试假丝酵母。在阳离子调节的Mueller Hinton和阳离子调节的Mueller Hinton+50％人血清中测定对抗金黄色葡萄球菌Smith的MIC，来测定化合物是否受到血清中一些成分的灭活(通过MIC提高来表示)。将装满的平板包装于塑料袋中(以最小化蒸发)，冷冻存储并在使用前融化。
化合物的制备
以重量基础来制备化合物。在100％DMSO中制备2mg/mL的化合物，然后在1∶1稀释度的DMSO/2x CAMHB中稀释至1mg/mL(终浓度＝50％DMSO/50％CAMHB)。将化合物连续1∶1稀释于BDBiosciences Deep Well聚丙烯96孔平板中的50％DMSO/50％CAMHB中(起始浓度1mg/mL)。
微量培养液稀释测试
使用Finn自动化多道移液管，(0.5-10μL体积)，将6.4TL抗微生物溶液加入装满的微量滴定平板的孔中(第一个孔中的抗微生物剂浓度＝64g/mL；DMSO的浓度＝3.2％)。以这种方式加入抗微生物剂来保持每个孔中的DMSO量恒定(来保持化合物溶解和计算通过DMSO非特异性杀灭的可能性)。最后一列含有3.2％DMSO的生长对照。
伴随每次测试，进行对照。它们是青霉素G和氯霉素，以和化合物相同的方式来制得。对于血清蛋白结合测试包括ertapenem作为对照。
平板接种
将微量滴定平板的所有孔接种(盐水稀释的)培养物，使用MIC2000系统，一种自动化平板培养装置，其传送每孔1.5TL的接种物。将平板在大气中35℃培养。还培养了未接种平板作为无菌检测。在22-24小时培养后记录结果。阅读平板至没有生长。将MIC定义为导致22-24小时培养后没有生长的最低抗菌水平。
化合物I证明了对抗金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、枯草芽胞杆菌和大肠杆菌各种菌株的抗菌活性。化合物I还证明了对抗对许多已知抗生素抗性的各种菌种的抗菌活性，如2，6二甲氧基苯青霉素抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)，万古霉素抗性的肠球菌(VRE)，多种药物抗性的屎肠球菌，大环内酯抗性的金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌，和linezolid抗性的金黄色葡萄球菌和屎肠球菌。对于这些测试菌种，最小抑制浓度(MIC)值为0.5至32μg/mL。根据NCCLS准则获得MIC。
                           序列表
<110>Merck Sharp & Dohme
     Angela Basilio
     Olga Genilloud
     Ignacio Gonzalez
     Oscar Salazar
     Merck & Co.Inc.
     Hiranthi Jayasuriya
     Sheo B.Singh
     Jun Wang
<120>抗菌化合物
<130>21516Y PCT
<150>60/573,899
<151>2004-05-24
<160>1
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>1445
<212>DNA
<213>微生物
<400>1
cctccttcgg gaggggatta gctggcgaac gggtgagtaa cacgtgggca atctgccctt 60
cactctggga caagccctgg aaacggggtc taatacccgg atacgacaca cgaccgcatg 120
gtctgtgtgt ggaaagctcc ggcggtgaag gatgagcccg cggcctatca gcttgttggt 180
ggggtgatgr cctaccaagg cgacgacggg tagccggcct gagagggcga ccggccacac 240
tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtggggaata ttgcacaatg 300
ggcgaaagcc tgatgcagcg acgccgcgtg agggatgacg gccttcgggt tgtaaacctc 360
tttcagcagg gaagaagcga gagtgacggt acctgcagaa gaagcgccgg ctaactacgt 420
gccagcagcc gcggtaatac gtagggcgca agcgttgtcc ggaattattg ggcgtaaaga 480
gctcgtaggc ggcttgtcac gtcggatgtg aaagcccggg gcttaacccc gggtctgcat 540
tcgatacggg caggctagag ttcggtaggg gagatcggaa ttcctggtgt agcggtgaaa 600
tgcgcagata tcaggaggaa caccggtggc gaaggcggat ctctgggccg atactgacgc 660
tgaggagcga aagcgtgggg agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa 720
cgttgggaac taggtgtggg cgacattcca cgtcgtccgt gccgcagcta acgcattaag 780
ttccccgcct ggggagtacg gccgcaaggc taaaactcaa aggaattgac gggggcccgc 840
acaagcagcg gagcatgtgg cttaattcga cgcaacgcca aagaacctta ccaaggcttg 900
acatacaccg gaaacgtctg gagatcaggc gcccccttgt gtccggtgta tcatggtggt 960
gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttggggtt taaktccccg caacgagcgc 1020
aacccttgtt ctgtgttgcc agcatgccct tcggggtgat ggggactcac aggagactgc 1080
cggggtcaac tcggaggaag gtggggacga cgtcaagtca tcatgcccct tatgtcttgg 1140
gctgcacacg tgctacaatg gccggtacaa tgagctgcga taccgcgagg tggagcgaat 1200
ctcaaaaagc cggtctcagt tcggattggg gtctgcaact cgaccccatg aagtcggagt 1260
tgctagtaat cgcagatcag cattgctgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc 1320
gcccgtcacg tcacgaaagt cggtaacacc cgaagccggt ggcccaaccc cttgtgggag 1380
ggaatcgtcg aaggtgggac tggcgattgg gacgaagtcg taacaaggta gccgtaccgg 1440
aaggt                                                             1445

Claims (7)

1.结构通式I的化合物：
Figure A2005800166190002C1
或其药物学上可接受的盐。
2.制备结构通式I化合物的方法：
Figure A2005800166190002C2
其包括在营养培养基中培养ATCC#PTA-5942(MA7338)链霉菌或其天然或人工突变体并从发酵液中回收化合物I。
3.权利要求2的方法，其中在约10至约40℃的温度进行发酵。
4.权利要求3的方法，其中在约28℃的温度进行发酵。
5.ATCC保藏号为ATCC#PTA-5942(MA7338)的链霉菌。
6.药物组合物，所述组合物包含药物学上可接受的载体和有效量的权利要求1的结构I化合物。
7.治疗需要这样治疗的宿主细菌感染的方法，所述方法包括给药有效量的权利要求1的结构I化合物。
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