CN1978650B - 新的产黄青霉苯乙酰辅酶a连接酶基因及提高青霉素产量的方法 - Google Patents

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CN1978650B CN 200510126156 CN200510126156A CN1978650B CN 1978650 B CN1978650 B CN 1978650B CN 200510126156 CN200510126156 CN 200510126156 CN 200510126156 A CN200510126156 A CN 200510126156A CN 1978650 B CN1978650 B CN 1978650B
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Abstract

本发明涉及分离的来自产黄青霉的新的苯乙酰辅酶A连接酶基因(pclB)、其氨基酸序列和表达载体，并证明了该基因的表达受苯乙酸的诱导，进而构建了含有本发明新基因的表达载体和产黄青霉工程菌菌株，该转基因菌株的青霉素产量明显提高，本发明对于青霉素的生产具有重要意义。

Description

新的产黄青霉苯乙酰辅酶A连接酶基因及提高青霉素产量的方法
技术领域
本发明涉及新的分离的核苷酸序列，具体地说涉及来自产黄青霉的新的苯乙酰辅酶A连接酶基因(pclB)。
本发明还涉及该基因编码的氨基酸序列。
本发明还涉及含有该基因的表达载体。
本发明还涉及一种提高产黄青霉的青霉素产量的方法。
背景技术
以青霉素和头孢菌素为代表的β-内酰胺类抗生素作为最重要的抗菌药物，占据了世界抗感染药物市场的2/3，是目前已知的抗生素中毒性最低，品种最多，临床应用最广的一类抗生素。
青霉素由丝状真菌产黄青霉(Penicillium chrysogenum)生产，由于广大的市场需求，人们对青霉素生产菌的改良投入了巨大的精力。基于传统的诱变筛选技术，现在的工业生产菌株的生产水平达到了相当高的水平。而分子生物学技术的发展为我们揭示β-内酰胺类抗生素的生物合成机制提供了帮助。
研究表明，青霉素的生物合成步骤由三个前体氨基酸，α-氨基己二酸、半胱氨酸、缬氨酸开始，经三肽合成酶(ACVS)催化缩合成LLD-ACV三肽，在异青霉素N合成酶作用下环化形成异青霉素N，最终在乙酰辅酶A：6-氨基青霉烷酸酰基转移酶(AAT)催化下侧链交换得到青霉素。其中前2步反应在细胞质中完成，最后一步侧链交换是在微体中完成的，催化该步反应的AAT具有保守的微体定位信号序列ARL(Muller et al.EMBO J 10：489-495，1991)，为其功能所必需，生物合成相关的三个关键酶的编码基因都已克隆(Ingolia&Queener，Med.Res.Rev.9：245-264，1989；Aharonowitz，etal.，Ann.Rev.Microbiol.46：461-495，1992)。
在青霉素的工业生产中，苯乙酸(Phenylacetic acid，PA)被用来作为青霉素G的侧链前体。在发酵过程中，苯乙酸首先被活化为辅酶A硫脂，再在AAT作用下经转酰基作用，替代异青霉素N的L-α-氨基己二酰侧链，形成青霉素G。由于AAT具有较宽的底物范围，因此在发酵过程中添加苯乙酸可以促进青霉素G的生物合成。作为青霉素G的侧链前体，其利用效率很大程度上取决于它的毒性以及青霉菌对其的氧化能力。苯乙酸在生产成本中占有相当的比重，提高苯乙酸的利用效率是青霉素菌种改良过程中非常重要的内容。
苯乙酸的活化由苯乙酰辅酶A连接酶完成。国际专利WO97/02349公开了一个产黄青霉的苯乙酰连接酶及其编码序列pclA。该酶由578个氨基酸组成，分子量约63kDa。其最后3个氨基酸为S-K-I，是保守的微体定位信号序列，为蛋白定位于微体所必需。这说明该连接酶要定位在微体起作用。这与青霉素生物合成的最后一步侧链交换是在微体中完成的研究结果一致。
另外，Minambres等从假单胞菌(Pseudomonas putida U)中克隆了一个苯乙酰辅酶A连接酶基因pcl，将其与三肽合成酶基因pcbAB的启动子融合转化产黄青霉Wis54-1255，使青霉素产量提高了1.8～2.2倍。
发明内容
本发明的一个目的在于提供新的产黄青霉苯乙酰辅酶A连接酶基因，定名为pclB。
本发明的另一个目的在于提供上述基因编码的氨基酸序列。
本发明的再一个目的在于提供含有上述基因序列的表达载体。
本发明的又一个目的在于提供新的产黄青霉工程菌株和提高青霉素产量的方法。
根据本发明的一方面，新的产黄青霉苯乙酰辅酶A连接酶基因pclB是从产黄青霉(Penicillium chrysogenum)中鉴别、克隆的，该基因的表达明显受到苯乙酸的诱导，其编码的蛋白质由562个氨基酸组成，推测的分子量为62.6kDa，最后3个氨基酸为微体定位信号序列A-K-L，表明该酶同样定位于微体中。PclB与PclA氨基酸序列的一致性为35％。在187～198位是保守的AMP结合域-LVYSSGTTGvPK-(PROSITE database entry PS00455[LIVMFY]-{E}-{VES}-[STG]-[STAG]-G-[ST]-[STEI]-[SG]-x-[PASLIVM]-[KR])，其开放阅读框架(Open Reading Frame，ORF)为自5’端的第59到第1744位碱基，长度为1686bp。具体地说本发明提供了含有SEQID NO.1所示序列的分离的多核苷酸。
上述涉及的多核苷酸还包括取代、缺失、和插入变体以及等位变体、剪接变体、片段、衍生物等，其中可以通过取代、缺失、插入或衍生一个或多个核苷酸。优选的这些多核苷酸是那些编码具有生物学活性的苯乙酰辅酶A连接酶的多核苷酸。
在本发明的优选实施方案中，分离的多核苷酸包括苯乙酰辅酶A连接酶基因的全部编码序列。在特别优选的实施方案中，多核苷酸包括如SEQ ID NO：1的第59位～1744位核苷酸所示的序列。这种分离的多核苷酸包含1686个核苷酸的苯乙酰辅酶A连接酶的开放阅读框架，并且编码562个氨基酸的多肽，如上所述。
本领域技术人员可以理解的是，上述的分离的多核苷酸也包括那些与SEQID NO.1所示序列或SEQ ID NO：1的第59位～1744位核苷酸所示的序列具有较高同源性的序列，例如同源性大于90％、甚至95％、甚至98％的序列；还包括那些在严谨条件下可与SEQ ID NO.1所示序列或SEQ ID NO：1的第59位～1744位核苷酸所示的序列杂交的序列。
根据本发明的另一方面，提供新的多肽序列，其含有上述核苷酸序列所编码的氨基酸序列，即含有SEQ ID NO.2所示的序列，表达的苯乙酰辅酶A连接酶的推测分子量为62.6kDa，最后3个氨基酸为微体定位信号序列A-K-L，表明该酶同样定位于微体中。PclB与PclA氨基酸序列的一致性为35％。在187-198位是保守的AMP结合域-LVYSSGTTGvPK-(PROSITE databaseentry PS00455[LIVMFY]-{E}-{VES}-[STG]-[STAG]-G-[ST]-[STEI]-[SG]-x-[PASLIVM]-[KR])。
同样地，本领域技术人员可以理解的是，上述的多肽序列也包括取代、缺失及插入变体，以及其等位突变体、拼接变体、片段、衍生物或同系物。优选的多肽或多肽片段包括那些具有苯乙酰辅酶A连接酶生物活性的多肽及片段。取代、缺失及插入变体是指与SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列相比，所述氨基酸序列中包含一处或多处氨基酸序列的取代、缺失和/或添加。
根据本发明的另一方面，本发明亦提供包括一种或多种上述多核苷酸的重组载体，以及包含上述多核苷酸的载体的基因工程宿主细胞。在优选的实施方案中，这种重组载体包括上述的多核苷酸，它编码含SEQ ID NO：2的多肽，其含SEQ ID NO：1的序列所示的多核苷酸，或含SEQ ID NO：1序列中59～1744的多核苷酸。在本发明的一个具体实施方案中，构建了含本发明多核苷酸的原核表达载体。
本发明也涉及到包括任何一种上述重组载体的宿主细胞。在已经构建载体之后，可以插入全部或部分载体至适合的宿主细胞，以便扩增和/或多肽表达。宿主细胞可以是原核生物宿主细胞(例如E.coli)或者真核生物宿主细胞(例如丝状真菌细胞、酵母细胞，昆虫细胞，或脊椎动物细胞)。
根据本发明的又一方面，提供了用基因工程手段构建的新的产黄青霉工程菌菌株，使用含有本发明多核苷酸的产黄青霉转化载体转化产黄青霉，筛选阳性菌株后获得本发明的产黄青霉工程菌菌株，与原始菌株相比，转基因菌株的青霉素产量明显提高，最高提高幅度超过了23％。
因此，本发明也提供了提高产黄青霉青霉素产量的方法，即构建含有本发明多核苷酸的产黄青霉工程菌，将构建的工程菌株发酵培养获得青霉素。
本发明从产黄青霉中成功地分离获得了编码新的产黄青霉苯乙酰辅酶A连接酶的基因，并证明了该基因的表达受苯乙酸的诱导，进而构建了含有本发明新基因的表达载体和产黄青霉工程菌菌株，该转基因菌株的青霉素产量明显提高，本发明对于青霉素的生产具有重要意义。
附图的简要说明
图1为pclA基因与pclB基因序列比较图；
图2为苯乙酸诱导的pclA基因和pclB基因的表达对照图，
其中54-PAA为不添加苯乙酸Wis54-1255菌株RNA样品，54+PAA为添加苯乙酸Wis54-1255菌株RNA样品；
图3为重组pclB蛋白的SDS-PAGE电泳分析图，
其中：泳道1为蛋白分子量标准，2为含空载体的对照菌，3-10分别为诱导0小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时的菌体。
发明的具体实施方式
下面结合附图，通过对本发明较佳实施例的描述，详细说明本发明。
在下面使用的试剂材料如无特别说明，均为市售购买。
【实施例1】pclB基因克隆
将产黄青霉菌Wis54-1255(ATCC28089)在YPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)培养基中培养24h，过滤收菌丝，取0.1g湿菌丝液N2研磨，加1ml Trizol试剂(Invitrogen公司，15596-026)抽提产黄青霉总RNA，将所得产黄青霉总RNA溶解于DEPC水中，-70℃下保存备用。
为去除可能的DNA污染，取产黄青霉总RNA 5μg，在100μl反应体系内，加入5μl RQ1 RNase-Free DNase(Promega公司，M6101)，10μl RQ1 RNase-FreeDNase反应缓冲液(10×)，37℃保温30分，用酚：氯仿抽提，乙醇沉淀，溶于10μl DEPC水。取5μl去除DNA的RNA样品，用随机引物(RandomHexamers，Promega公司，C1181)进行反转录，得到cDNA，所用反转录酶为SuperScriptTM II RNase H-(Invitrogen公司，18064-022)。
以T220-1：5’-TCCCTTTGAGCCTCTATTCACATTC-3’和T220-2：5’-TATCAATATCAACATGGACAGGTC-3’为引物，以cDNA为模板进行PCR扩增，PCR条件为：94℃，5分；94℃ 1分，60℃ 1分，72℃ 2分-40循环；72℃ 7分；4℃保存。将RT-PCR产物按常规方法克隆测序，测序结果表明RT-PCR产物具有序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列，长度为1808bp。通过序列分析和GenBank数据库检索，表明该序列的开放阅读框架(OpenReading Frame，ORF)为自5’端的第59到第1744位碱基，长度为1686bp。在ORF起始密码子ATG前18bp处，同相位有终止密码子TAG，由此说明我们得到了该基因的全长序列，定名为pclB。
该基因ORF片段的读码框编码562个氨基酸，推测分子量为62.6kDa，如序列表中SEQ ID NO.2所示。最后3个氨基酸为微体定位信号序列A-K-L，表明该酶同样定位于微体中。PclB与PclA氨基酸序列的一致性为35％。在187-198位是保守的AMP结合域-LVYSSGTTGvPK-(PROSITE database entry PS00455[LIVMFY]-{E}-{VES}-[STG]-[STAG]-G-[ST]-[STEI]-[SG]-x-[PASLIVM]-[KR])
同时以提取的Wis54-1255菌株的基因组DNA为模版进行PCR扩增，引物及反应条件同上，得到1954bp的扩增产物，将其与RT-PCR产物序列比较，确认pclB基因有2个内含子，长度分别为92bp、54bp。比较结果见图1。
【实施例2】pclB基因的表达受苯乙酸的诱导
将产黄青霉菌Wis54-1255(ATCC28089)按2×106分生孢子/ml接种到种子培养基，在26℃下培养24小时，种子培养基配方为(g/l)：葡萄糖，30；乳糖，10；棉籽饼粉，10；酵母粉，10；玉米浆，10；(NH4)2SO4，2；KH2PO4，1；CaCO3，5；pH5.8。然后将种子培养物以5％接种量接种到发酵培养基，26℃下培养。发酵培养基为(g/l)：乳糖，120；棉籽饼粉，30；玉米浆，20；(NH4)2SO4，5；KH2PO4，1；K2SO4，5；CaCO3，10；pH6.5。
实验分为2组，一组每天正常补加苯乙酸前体，另一组为对照，不加苯乙酸，72小时后收取菌体提取总RNA，提取及处理方法见实施例1。
用SYBR Green试剂作实时定量PCR检测pclB基因的表达，仪器为ABIPRISM 7000定量PCR仪。根据pclB基因的cDNA序列，利用Primer Express软件设计定量PCR引物，TS220：5′-GATGCTATTGATGATGTTGCTGTC-3′TA220：5′-TGCTTCAGAATCCGACGTAGG-3′。以产黄青霉γ-actin基因(AF056975)为内标，act1：5′-CTCGCTGAGCGTGGTTACAC-3′，act2：5′-TTGATGTCACGGACGATTTCA-3′。同时做pclA的定量PCR对照，AS013：CTGCCGATTTCCTCAAACTCTAC，AA013：CTCCGTGCCTCCTTCTCTTG。引物由上海生工合成。定量PCR试剂为
Figure G20051C6156520051206D000061
Premix Ex TagTM试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)。反应条件为：95℃，1分钟；95℃，15秒，60℃，1分钟，40循环。对定量PCR的结果CT值进行换算，采用
Figure G20051C6156520051206D000062
法(Livak K.J.and T.D.Schmittgen Methods 25：402-408，2001)。结果，苯乙酸能显著诱导pclB基因的表达，以不添加苯乙酸的表达量为1，则添加苯乙酸时pclB的表达提高了4倍。而pclA提高的幅度将近8倍。结果见图2。
【实施例3】pclB基因的原核表达
原核表达载体pET-39b(+)购自Novagen公司。
以产黄青霉Wis54-1255cDNA为模版，引物T220a
5’-CATATGCCCGTATCCTCTA ACTACC-3’/T220b5’-CTCGAGCAGCTTGGCTTTTGGTGCC-3’，扩增出pclB的编码序列，两端引入限制性内切酶位点Nde I，Xho I，连接到用同样酶切的载体pET-39b(+)，得到质粒pET39/pclB。
将构建好的质粒pET39/pclB转化表达宿主菌BL21(DE3)-RP(Stratgene公司)，挑取阳性克隆至LB培养基(酵母粉蛋白胨NaCl)37℃培养至OD6000.6，加入0.5mmol/L IPTG诱导外源基因表达，37℃ 200rpm继续培养，收集菌体，SDS-PAGE分析。
称取菌体0.4g用16ml Buffer A(50mmol/L Tris-HCl pH7.5，0.5mmol/LEDTA，50mmol/L NaCl，5％甘油)重悬，超声破碎，10,000g 4℃10min离心，分别取上清和沉淀，SDS-PAGE电泳分析，结果见图3。结果表明重组表达的PclB绝大多数为包涵体的形式存在。
【实施例4】通过增加产黄青霉中pclB的基因表达提高青霉素的产量
根据文献(Carr et al.，1986，Gene 48：257～266)，设计两对合成引物Pip1：5′TCGCGGATCCTGTCCCTAGTGCTGGGCTTGA AGTATG3′/Pip2：5′TGGAAGCATATGTGTCTAGAAAAATAATGGTGAAAACT3′，和Tip1：5′ATGGTACCAAGGGCCCATGGATGGGACCGGGGAT3′/Tip3：5′TAAGCTTGAGAGCTCGTGCCGAATCTGCTTGGC3′
以产黄青霉Wis54-1255(ATCC28089)菌株基因组DNA为模板，分别克隆了异青霉素N合成酶基因1.16kb的启动子序列Pipns(两端分别引入BamHI和NdeI酶切位点)，及640bp的终止子序列Tipns(两端分别引入Kpn I和Hind III酶切位点)。
以T220-a：5’-CATATGCCCGTATCCTCTA ACTACC-3’/T220-c：5’-GGTACCCAGCTTGGCTTTTGGTGCC-3’重新扩增出pclB的编码序列，两端酶切位点为Nde I/Kpn I。将此三段序列连接，得到可在产黄青霉中表达的pclB基因的表达盒ibt。
转化载体的制备采用申请号为200410012139.4的中国发明专利所描述的方法制备，主要步骤如下：将产黄青霉菌ATCC10003(X-1612)培养在YPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)培养基中培养24h，菌丝过滤后，加液N2磨碎，用Easy-DNA kit(Invitrogen公司，K1800-01)提取得到产黄青霉基因组DNA。
根据文献(Carr et al.，1986，Gene 48：257～266)，以pip1：5’-TCGCGGATCCTGTCCCTAGTGCTGGGCTTGAAGTATG-3’pip2：5’-TGGAAGCCATGGTGTCTAGAAAAATAATGGTGAAAACT-3’为引物，以产黄青霉ATCC10003(x-1612)菌株基因组DNA为模板，进行PCR扩增，PCR条件为：94℃，3分；94℃ 1分，60℃ 1分，72℃ 1.5分-40循环；72℃ 7分；4℃保存。将PCR产物采用常规方法克隆测序，结果表明克隆产物长度为1168bp，和文献报道基本一致，只在589位由G变为A，证明得到了Pipns序列。在克隆得到1.16kb的Pipns序列5’和3’端分别引入BamH I和NcoI酶切位点，然后用DNA连接酶与pGEM-T载体在16℃温度下连接12小时，得到质粒pGEM-T/Pipns。
酵母表达载体pPICZA和原核生物基因克隆载体pCR4Blunt-TOPO均购自Invitrogen公司。
利用引物：
pk15’-TGAAGCTTGTCAGCTACTGGGCTATCAGGAC-3’
pk25’-ACA GATCTAAAGTGCCACCTGTATGCGGTGTG-3’，以pCR4Blunt-TOPO质粒为模板，PCR扩增得到卡那霉素的抗性基因(kanr)，并在其5’端和3’端分别引入Hind III、Bgl II酶切位点。
pPICZA质粒用Hind III/BglII双酶切后回收2.46kb片段，与经过同样酶切的kanr片段在16℃温度下连接12小时，然后采用CaCl2转化法转化大肠杆菌DH5α，在LB培养基中筛选同时具有卡那霉素和腐草霉素抗性的阳性克隆，从中提取得到pPICZA/kan质粒。
pPICZA/kan质粒经BamH I/Nco I部分消化，回收3.1kb片段。pGEM-T/Pipns同样用BamH I/Nco I酶切，回收1.16kb小片段。将两片段在16℃温度下连接12小时，得到产黄青霉的转化载体，定名为pPIPKA。
将产黄青霉转化载体pPIPKA用Hind III和BamH I酶切后，回收大片段，与ibt表达盒连接得到载体pPCLB。按上述方法将pPCLB转化菌株Wis54-1255，筛选阳性克隆用于青霉素产量检测。检测按照标准方法(Brownlee et al，J GenMicrobiol，1949)进行。对筛选到的高单位菌株利用摇瓶发酵进行复试，方法参照Lein(Overproduction of microbial metabolites，Z.Vanek and Z Hostalekeds，pp105-139)。通过89株菌的试验结果，与出发菌株相比，转基因菌株的青霉素产量明显提高，最高提高幅度超过了23％。
以上对本发明的详细描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明做出各种改变和变形，只要未脱离本发明的精神，均应属于本发明权利要求所定义的范围。
SEQUENCE LISTING
<110>华北制药集团新药研究开发有限责任公司
<120>新的产黄青霉苯乙酰辅酶A连接酶基因及提高青霉素产量的方法
<130>05P101404
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1808
<212>DNA
<213>产黄青霉(Penicillium chrysogenum)
<220>
<221>CDS
<222>(59)..(1744)
<223>开放阅读框架
<400>1
tccctttgag cctctattca cattcgcatt accggctcca tagctttgtt tcgccgca     58
atg ccc gta tcc tct aac tac ccc ctg gtc gac atc cca gaa gtg gat    106
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            20                  25                  30
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Lys Ile Ile Tyr Gln Asp Ala Asp Thr Gln Arg His Tyr Thr Tyr Lys
        35                  40                  45
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Ser Leu Arg Asp Ala Ser Leu Asp Phe Gly Lys Gly Leu Lys Ala Leu
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Tyr Glu Trp Arg Lys Gly Asp Val Leu Ala Leu Phe Thr Pro Asn Ser
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atc gat aca ccc gtg gtg atg tgg ggc aca ctt tgg gcc ggc gga acc    346
Ile Asp Thr Pro Val Val Met Trp Gly Thr Leu Trp Ala Gly Gly Thr
                85                  90                  95
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Ile Ser Pro Ala Asn Pro Gly Tyr Thr Val Asp Glu Leu Ala Phe Gln
            100                 105                 110
ctc aag aac tcc cat gcc aag ggc ctt gta acg caa gcc tcg gtg ctg    442
Leu Lys Asn Ser His Ala Lys Gly Leu Val Thr Gln Ala Ser Val Leu
        115                 120                 125
ccc gtt gcg cgg gaa gcg gcg aag aaa gtt ggc atg cct gaa gac cgc    490
Pro Val Ala Arg Glu Ala Ala Lys Lys Val Gly Met Pro Glu Asp Arg
    130                 135                 140
att atc ctg att ggg gac cag cgt gat ccc gat gcg cgc gtc aag cat    538
Ile Ile Leu Ile Gly Asp Gln Arg Asp Pro Asp Ala Arg Val Lys His
145                 150                 155                 160
ttc acc tct gtg cgc aat atc tct ggt gct acc cgc tac cgc aag cag    586
Phe Thr Ser Val Arg Asn Ile Ser Gly Ala Thr Arg Tyr Arg Lys Gln
                165                 170                 175
aag atc act cct gcg aag gat gtg gct ttt ttg gtt tat tct tct ggg    634
Lys Ile Thr Pro Ala Lys Asp Val Ala Phe Leu Val Tyr Ser Ser Gly
            180                 185                 190
acc acg ggt gtg cct aag ggt gtc atg ata tcg cat cgg aac atc gtt    682
Thr Thr Gly Val Pro Lys Gly Val Met Ile Ser His Arg Asn Ile Val
        195                 200                 205
gcc aat atc agg cag cag ttc att gct gag ggt gaa atg tta agc tgg    730
Ala Asn Ile Arg Gln Gln Phe Ile Ala Glu Gly Glu Met Leu Ser Trp
    210                 215                 220
aat ggt ggt cct gat gga aag ggt gat cgg gtc ctg gca ttt ttg ccg    778
Asn Gly Gly Pro Asp Gly Lys Gly Asp Arg Val Leu Ala Phe Leu Pro
225                 230                 235                 240
ttc tat cat atc tat gga ttg act tgc tta att acc cag gct tta tac    826
Phe Tyr His Ile Tyr Gly Leu Thr Cys Leu Ile Thr Gln Ala Leu Tyr
                245                 250                 255
aag ggt tat cac ttg att gtc atg tcc aaa ttc gac att gaa aag tgg    874
Lys Gly Tyr His Leu Ile Val Met Ser Lys Phe Asp Ile Glu Lys Trp
            260                 265                 270
tgc gcc cac gtg cag aac tat cgc tgc tcg ttt agt tat atc gtc cct    922
Cys Ala His Val Gln Asn Tyr Arg Cys Ser Phe Ser Tyr Ile Val Pro
        275                 280                 285
ccc gtg gtg cta ttg tta ggc aag cac ccg gtg gtc gac aaa tat gac    970
Pro Val Val Leu Leu Leu Gly Lys His Pro Val Val Asp Lys Tyr Asp
    290                 295                 300
ctt tca agt ctg cgc atg atg aac tca ggc gct gca cca ctc act caa    1018
Leu Ser Ser Leu Arg Met Met Asn Ser Gly Ala Ala Pro Leu Thr Gln
305                 310                 315                 320
gag ctg gta gaa gca gtc tac tcc cgc atc aag gtt ggc att aag cag    1066
Glu Leu Val Glu Ala Val Tyr Ser Arg Ile Lys Val Gly Ile Lys Gln
                325                 330                 335
ggc tac gga ctc agc gag acc agc ccg act aca cac tcc caa cgg tgg    1114
Gly Tyr Gly Leu Ser Glu Thr Ser Pro Thr Thr His Ser Gln Arg Trp
            340                 345                 350
gag gac tgg cgc gaa gcc atg ggt tcc gtc ggc cgc ttg atg cct aat    1162
Glu Asp Trp Arg Glu Ala Met Gly Ser Val Gly Arg Leu Met Pro Asn
        355                 360                 365
atg caa gcc aag tac atg act atg cct gag gat ggg tcc gag cct aag    1210
Met Gln Ala Lys Tyr Met Thr Met Pro Glu Asp Gly Ser Glu Pro Lys
    370                 375                 380
gag gtt ggc gag ggc gag gtt ggc gaa ttg tac ctg aaa gga cct aac    1258
Glu Val Gly Glu Gly Glu Val Gly Glu Leu Tyr Leu Lys Gly Pro Asn
385                 390                 395                 400
gtt ttc ctg ggc tat cac gag aac cca gag gct acc aag ggc tgc ctg    1306
Val Phe Leu Gly Tyr His Glu Asn Pro Glu Ala Thr Lys Gly Cys Leu
                405                 410                 415
tct gag gat ggg tgg ttc cag act ggt gac gtt gga tac cag gac gcc    1354
Ser Glu Asp Gly Trp Phe Gln Thr Gly Asp Val Gly Tyr Gln Asp Ala
            420                 425                 430
aag ggt aat ttc tac att acc gat cgt gtc aag gaa ctt atc aag tat    1402
Lys Gly Asn Phe Tyr Ile Thr Asp Arg Val Lys Glu Leu Ile Lys Tyr
        435                 440                 445
aag ggc ttc cag gtg cct cct gct gag ttg gaa ggg tat ctg gtt gac    1450
Lys Gly Phe Gln Val Pro Pro Ala Glu Leu Glu Gly Tyr Leu Val Asp
    450                 455                 460
aac gat gct att gat gat gtt gct gtc att ggt att gag agt gag aca    1498
Ash Asp Ala Ile Asp Asp Val Ala Val Ile Gly Ile Glu Ser Glu Thr
465                 470                 475                 480
cac ggt tcc gag gtt cct atg gct tgt gtg gtt cgc agc gcg aag agc    1546
His Gly Ser Glu Val Pro Met Ala Cys Val Val Arg Ser Ala Lys Ser
                485                 490                 495
aag tct tcc gga aca agc gag aag gat gaa gca gca agg att atc aaa    1594
Lys Ser Ser Gly Thr Ser Glu Lys Asp Glu Ala Ala Arg Ile Ile Lys
            500                 505                 510
tgg ctg gat agc aag gtc gca agc cac aag cgt ctg cgc ggt ggc gtc    1642
Trp Leu Asp Ser Lys Val Ala Ser His Lys Arg Leu Arg Gly Gly Val
        515                 520                 525
cac ttt gtg gat gag atc ccc aag aat ccc agt ggg aag atc cta cgt    1690
His Phe Val Asp Glu Ile Pro Lys Asn Pro Ser Gly Lys Ile Leu Arg
    530                 535                 540
cgg att ctg aag cag aag ttc aag ggg gcg gcc gag gca cca aaa gcc    1738
Arg Ile Leu Lys Gln Lys Phe Lys Gly Ala Ala Glu Ala Pro Lys Ala
545                 550                 555                 560
aag ctg taaatgagaa cttttagata tgcacgctat atacacttaa gacctgtcca     1794
Lys Leu
tgttgatatt gata                                                    1808
<210>2
<211>562
<212>PRT
<213>产黄青霉(Penicillium chrysogenum)
<400>2
Met Pro Val Ser Ser Asn Tyr Pro Leu Val Asp Ile Pro Glu Val Asp
1               5                   10                  15
Leu Trp Thr Phe Leu Phe Glu Arg Lys Asp Arg Ala Tyr Pro Asp Asp
            20                  25                  30
Lys Ile Ile Tyr Gln Asp Ala Asp Thr Gln Arg His Tyr Thr Tyr Lys
        35                  40                  45
Ser Leu Arg Asp Ala Ser Leu Asp Phe Gly Lys Gly Leu Lys Ala Leu
    50                  55                  60
Tyr Glu Trp Arg Lys Gly Asp Val Leu Ala Leu Phe Thr Pro Asn Ser
65                  70                  75                  80
Ile Asp Thr Pro Val Val Met Trp Gly Thr Leu Trp Ala Gly Gly Thr
                85                  90                  95
Ile Ser Pro Ala Asn Pro Gly Tyr Thr Val Asp Glu Leu Ala Phe Gln
            100                 105                 110
Leu Lys Asn Ser His Ala Lys Gly Leu Val Thr Gln Ala Ser Val Leu
        115                 120                 125
Pro Val Ala Arg Glu Ala Ala Lys Lys Val Gly Met Pro Glu Asp Arg
    130                 135                 140
Ile Ile Leu Ile Gly Asp Gln Arg Asp Pro Asp Ala Arg Val Lys His
145                 150                 155                 160
Phe Thr Ser Val Arg Asn Ile Ser Gly Ala Thr Arg Tyr Arg Lys Gln
                165                 170                 175
Lys Ile Thr Pro Ala Lys Asp Val Ala Phe Leu Val Tyr Ser Ser Gly
            180                 185                 190
Thr Thr Gly Val Pro Lys Gly Val Met Ile Ser His Arg Asn Ile Val
        195                 200                 205
Ala Asn Ile Arg Gln Gln Phe Ile Ala Glu Gly Glu Met Leu Ser Trp
    210                 215                 220
Asn Gly Gly Pro Asp Gly Lys Gly Asp Arg Val Leu Ala Phe Leu Pro
225                 230                 235                 240
Phe Tyr His Ile Tyr Gly Leu Thr Cys Leu Ile Thr Gln Ala Leu Tyr
                245                 250                 255
Lys Gly Tyr His Leu Ile Val Met Ser Lys Phe Asp Ile Glu Lys Trp
            260                 265                 270
Cys Ala His Val Gln Asn Tyr Arg Cys Ser Phe Ser Tyr Ile Val Pro
        275                 280                 285
Pro Val Val Leu Leu Leu Gly Lys His Pro Val Val Asp Lys Tyr Asp
    290                 295                 300
Leu Ser Ser Leu Arg Met Met Asn Ser Gly Ala Ala Pro Leu Thr Gln
305                 310                 315                 320
Glu Leu Val Glu Ala Val Tyr Ser Arg Ile Lys Val Gly Ile Lys Gln
                325                 330                 335
Gly Tyr Gly Leu Ser Glu Thr Ser Pro Thr Thr His Ser Gln Arg Trp
            340                 345                 350
Glu Asp Trp Arg Glu Ala Met Gly Ser Val Gly Arg Leu Met Pro Asn
        355                 360                 365
Met Gln Ala Lys Tyr Met Thr Met Pro Glu Asp Gly Ser Glu Pro Lys
    370                 375                 380
Glu Val Gly Glu Gly Glu Val Gly Glu Leu Tyr Leu Lys Gly Pro Asn
385                 390                 395                 400
Val Phe Leu Gly Tyr His Glu Asn Pro Glu Ala Thr Lys Gly Cys Leu
                405                 410                 415
Ser Glu Asp Gly Trp Phe Gln Thr Gly Asp Val Gly Tyr Gln Asp Ala
            420                 425                 430
Lys Gly Asn Phe Tyr Ile Thr Asp Arg Val Lys Glu Leu Ile Lys Tyr
        435                 440                 445
Lys Gly Phe Gln Val Pro Pro Ala Glu Leu Glu Gly Tyr Leu Val Asp
    450                 455                 460
Asn Asp Ala Ile Asp Asp Val Ala Val Ile Gly Ile Glu Ser Glu Thr
465                 470                 475                 480
His Gly Ser Glu Val Pro Met Ala Cys Val Val Arg Ser Ala Lys Ser
                485                 490                 495
Lys Ser Ser Gly Thr Ser Glu Lys Asp Glu Ala Ala Arg Ile Ile Lys
            500                 505                 510
Trp Leu Asp Ser Lys Val Ala Ser His Lys Arg Leu Arg Gly Gly Val
        515                 520                 525
His Phe Val Asp Glu Ile Pro Lys Asn Pro Ser Gly Lys Ile Leu Arg
    530                 535                 540
Arg Ile Leu Lys Gln Lys Phe Lys Gly Ala Ala Glu Ala Pro Lys Ala
545                 550                 555                 560
Lys Leu

Claims (9)

1.一种分离的多核苷酸，其为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或SEQ IDNO：1的第59位～1744位核苷酸所示的序列。
2.一种分离的多核苷酸，其为与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或SEQID NO：1的第59位～1744位核苷酸所示的序列完全互补的核苷酸序列。
3.由权利要求1所述的多核苷酸编码的多肽。
4.权利要求3所述的多肽，其具有SEQ ID NO.2所示的序列，编码的蛋白具有苯乙酰辅酶A连接酶活性。
5.含有权利要求1所述的多核苷酸的表达载体。
6.权利要求5所述的表达载体，其中所述的表达载体为原核表达载体。
7.含有权利要求5所述的表达载体的宿主细胞。
8.一种产黄青霉工程菌菌株，含有权利要求1所述的多核苷酸。
9.一种提高产黄青霉青霉素产量的方法，包括下述步骤：
1)将权利要求1所述的多核苷酸可操作地连接于表达载体；
2)以所述表达载体转化产黄青霉菌获得含有权利要求1所述多核苷酸的工程菌菌株；
3)发酵培养所述工程菌菌株，分离纯化获得青霉素。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Minambres B等.Molecular Cloning and Expression in Different Microbes of theDNA Encoding Pseudomonas putida U Phenylacetyl-CoALigase.J Biol Chem271 52.1996,271(52),第33531-33538页.
Minambres B等.Molecular Cloning and Expression in Different Microbes of theDNA Encoding Pseudomonas putida U Phenylacetyl-CoALigase.J Biol Chem271 52.1996,271(52),第33531-33538页. *
任志红等.产黄青霉工业生产菌种基因报告系统的构建及启动子效率的评价.菌物学报24 3.2005,24(3),第376-384页.
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王富强等.产黄青霉转化载体pPIPKA的构建及青霉素工业生产菌株的转化研究.菌物学报23 1.2004,23(1),第66-72页.
王富强等.产黄青霉转化载体pPIPKA的构建及青霉素工业生产菌株的转化研究.菌物学报23 1.2004,23(1),第66-72页. *

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