CN1971276A - 组织性质诊断用试剂盒 - Google Patents

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CN1971276A CNA2006101410615A CN200610141061A CN1971276A CN 1971276 A CN1971276 A CN 1971276A CN A2006101410615 A CNA2006101410615 A CN A2006101410615A CN 200610141061 A CN200610141061 A CN 200610141061A CN 1971276 A CN1971276 A CN 1971276A
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Abstract

本发明提供一种用于诊断从患者身上采集的组织的性质的试剂盒，包括：用于测定所述组织中周期素依赖性激酶的表达量的表达量测定试剂；及用于测定所述组织中周期素依赖性激酶活性值的活性测定试剂；所述表达量测定试剂和活性测定试剂中在第一保存条件下保存的试剂构成第一试剂组；所述表达量测定试剂和活性测定试剂中在不同于第一保存条件的第二保存条件下保存的试剂构成第二试剂组。

Description

组织性质诊断用试剂盒
技术领域：
本发明涉及一种试剂盒，特别是用于测定从患者身上采集的组织中的周期素依赖性激酶的表达量和活性值，根据取得的表达量和活性值诊断组织性质的试剂盒。
背景技术：
作为主管生物细胞增殖的细胞周期调节因子，有正调节因子--周期素依赖性激酶(以下简称CDK)。CDK一旦被磷酸化等激活，就会和周期素结合，形成CDK与周期素的复合物(以下有时简称为活化CDK)。CDK因此被激活，这样，CDK在相应的细胞周期的特定阶段显示活性。众所周知，负调节因子--周期素依赖性激酶抑制剂(以下简称CDK抑制剂)会结合到CDK和/或CDK·周期素的复合物中阻碍CDK的活性。
细胞周期调节因子的表达量和活性值的数据可以作为判断有关细胞周期控制的诸如疾患种类和恶性程度等从患者身上采集的组织性质的良好指标。比如：大家都知道：CDK一般在细胞内也能表现出一定量，但在被增殖因子诱导增殖的细胞中其表达量更高。然而，如上所述，激活CDK是CDK、周期素与CDK抑制剂密切相关的非常复杂的过程。因此，无论单凭CDK、周期素和CDK抑制剂的表达量的数据，还是仅凭CDK的活性值的数据作为判断组织性质的指标都是不充分的。
在此，表达量是指用组织配制的组织液测得的目标蛋白质量(对应于分子个数的单位)。表达量用周知的从蛋白质混合物测定目标蛋白质量的方法也可以测定。比如：表达量用ELISA法、蛋白质转移吸印技术westernblot法以及日本专利申请公告第2003-130871号上公开的方法等都可测定。目标蛋白质可以用特异抗体捕捉到。比如：捕捉CDK1时，使用抗CDK1抗体可以捕捉到上述组织溶液中的全部CDK1(含CDK1单体、CDK1和周期素及/或CDK抑制剂的复合物、CDK1和其他化合物的复合物)。
所谓CDK活性值是指CDK与特定的周期素结合后有多少基质磷酸化这一激酶活性水平，其单位用U(单元)表示。例如：通过检测活化CDK1或活化CDK2使多少组朊H1磷酸化，即可以测定CDK1或CDK2的活性值。通过检测活化CDK4或活化CDK6使多少成视网膜细胞瘤蛋白(Rb；Retinoblastoma protein)磷酸化即可以测定CDK4或CDK6的活性值。CDK活性值可以用众所周知的以放射性物质为标记的酶活性测定法来测定。具体来说，使用32P标记腺甙5’-O-(3-磷酸三甲酚酯)(γ-〔32P〕-ATP)的测定法。用此方法，在CDK的作用下，来自于32P标记ATP的一元磷酸基进入该基质。通过用放射自显影术或闪烁计数管检测该基质中的32P即可测定磷酸化后的该基质的量，从该基质的量来计算出CDK的活性。另外，在美国专利申请公告第2002-0164673号当中公开了不以放射性物质为标记的CDK活性值测定法。根据此方法，让腺甙5’-O-(3-硫代磷酸三甲酚酯)(ATP-γS)与基质反应，并让标记物质与加入基质中的含有一元硫代磷酸基的硫磺原子结合，测定标记量。例如：用标记荧光物质作为标记物时，测定荧光量作为标记量。
现在，诊断从患者身上采集的组织的性质在临床上担负着诊断癌症恶性度的重要任务。在此，所谓癌症恶性度包括转移的机率、复发的机率和预后不良的程度等。比如：用通过测定肿瘤标记、生检作出的组织诊断和细胞诊断、TNM(T：原发肿瘤的大小；N：淋巴节转移水平；M：远距离转移)分类和荧光显示式细胞分离机测定DNA含量等方法得到的信息，诊断癌症。但是，在各种方法中存在以下问题：
·诊断敏感度低；
·最终诊断要凭观察者自己的经验，故诊断难；
·诊断时的病态虽然能够把握，但不能正确预测预后；
·需要有娴熟的技术。
 这些问题表现出在癌症的恶性度诊断中各人判断的不同和医疗机关诊断方法的各异，从而成为癌症恶性度诊断出现偏差的重要原因。
在决定癌症的治疗方针时，调查组织中所含细胞对抗癌药等药物的敏感性与诊断恶性度同样重要。作为调查敏感性的方法有体外进行肿瘤细胞抗癌药敏感性试验的方法，如周知的MTT法(四氮唑盐法，3-(4，5-dimcthylthioazol-2-yl)-2，5-diphenyl-tetrazolium bromide)和DISC法(区别染色细胞毒法，differential staining cytotoxicity)。然而，无论哪种方法其阳性预测率都不到70％，作为是否进行抗癌药物治疗的判断指标是不够的。(Weisenthal，L.M.and Nygren.P(2002)Current status of cell culturedrug resistance testing(CCDRT)、http://weisenthal.org/)。
如上所述，从患者身上采集的组织中测定CDK的表达量的方法在日本专利申请公告第2003-130871号上有记载，CDK活性值的测定方法在美国专利申请公告第2002-0164673号上也有公开。但是，根据CDK的表达量和活性值诊断组织性质的试剂盒尚未开发。而且，测定CDK表达量和CDK活性值分别需要用很多试剂，这些试剂保存条件各异，放在一起保存非常烦杂。
发明内容：
本发明目的是提供易于保存各种试剂的，对从患者身上采集的组织性质进行诊断的试剂盒。
本发明提供以下试剂盒：
一种用于诊断从患者身上采集的组织的性质的试剂盒，包括
用于测定所述组织中周期素依赖性激酶(CDK)的表达量的表达量测定试剂；及
用于测定所述组织中CDK的活性值的活性测定试剂。
所述表达量测定试剂和活性测定试剂中在第一保存条件下保存的试剂构成第一试剂组；
所述表达量测定试剂和活性测定试剂中在不同于第一保存条件的第二保存条件下保存的试剂构成第二试剂组。
其中所述第一保存条件为冷藏保存，所述第二保存条件为冷冻保存。
其中所述第一试剂组包含被标记的CDK抗体(标记CDK抗体)、固定CDK抗体的载体、所述CDK的基质、三磷酸腺苷(ATP)；
所述第二试剂组包含能与ATP和所述基质在所述CDK作用下反应生成的产物结合的标记物。
其中所述第一试剂组包括含有固定所述CDK抗体的载体的柱。所述第二试剂组包括已知浓度的CDK。
其中所述试剂盒用于组织性质诊断装置，所述组织性质诊断装置测定所述组织中的CDK表达量和活性值，并根据获得的CDK表达量和活性值的数据诊断所述组织的性质。其中所述组织性质诊断装置包括获取反映所述组织中CDK表达量的第一数据的第一数据获取手段、获取反映所述组织中CDK活性值的第二数据的第二数据获取手段以及根据所述第一数据和第二数据得出的值获取所述组织性质的有关信息的解析手段。
本发明还提供一种诊断从患者身上采集的组织的性质的试剂盒，包括：用于测定所述组织中第一周期素依赖性激酶(CDK)表达量的第一表达量测定试剂、用于测定第一CDK活性值的第一活性测定试剂、用于测定第二CDK表达量的第二表达量测定试剂及用于第二CDK活性值的第二活性测定试剂；所述表达量测定试剂和活性测定试剂中在第一保存条件下保存的试剂构成第一试剂组，所述表达量测定试剂和活性测定试剂中在与第一保存条件不同的第二保存条件下保存的试剂构成第二试剂组。
其中所述第一保存条件为冷藏保存，所述第二保存条件为冷冻保存。
其中所述第一试剂组包含被第一标记物标记的第一CDK抗体(第一标记CDK抗体)、被第二标记物标记的第二CDK抗体(第二标记CDK抗体)、固定第一CDK抗体的第一载体、固定第二CDK抗体的第二载体、所述第一CDK及第二CDK的基质以及三磷酸腺苷(ATP)；所述第二试剂组包含能与ATP和所述基质在所述CDK作用下反应生成的产物结合的第三标记物。
其中所述第一试剂组包括含有所述第一载体的第一柱和含有所述第二载体的第二柱。
其中所述第二试剂组包含已知浓度的第一和已知浓度的第二CDK。
其中所述试剂盒用于组织性质诊断装置，所述组织性质诊断装置测定所述组织中的第一CDK和第二CDK的表达量和活性值，根据所得到的第一CDK及第二CDK表达量和活性值的数据，诊断哺乳动物组织的性质。
其中所述组织性质诊断装置包括获取所述第一CDK表达量的第一表达获取手段、获取所述第二CDK表达量的第二表达获取手段、获取所述第一CDK活性值的第一活性值获取手段、获取所述第二CDK活性值的第二活性值获取手段以及根据所述第一表达量、第二表达量、第三活性值和第四活性值获取所述组织性质的有关信息的解析手段。
其中所述第二试剂组含有已知浓度的蛋白质，该蛋白质被管家基因标记，所述第一试剂组含有所述蛋白质的已标记抗体。
其中所述第二试剂组有已知浓度的含哺乳动物细胞的细胞质与核内蛋白质的溶液。
其中所述第二试剂组配有组织增溶剂，用于增溶所述组织，配制组织液。所述第二试剂组含有已知浓度的周期素依赖性激酶抑制剂，所述第一试剂组含有所述周期素依赖性激酶抑制剂的抗体。
其中所述第一试剂组有用于减低背景的含蛋白质试剂。所述组织的性质指组织中所含细胞的增殖能、细胞对抗癌药的敏感性或组织的恶性度。
其中所述表达量测定试剂和活性测定试剂中在不同于第一和第二保存条件的第三保存条件下保存的试剂构成第三试剂组。
其中所述第三保存条件是常温保存。
附图说明：
图1为本发明实施方式的试剂盒的示意图。
图2为细胞周期的示意图。
图3为搭载本发明实施方式中的试剂盒诊断组织性质的诊断装置的一例斜视示意图。
图4为图3所示诊断装置中的试片安放器的俯视图。
图5为图4的从A到A的剖视图。
图6为安放在图3所示诊断装置中的试片安放器的蛋白固相用试片的上夹板的俯视图。
图7为图6从B到B的剖视图。
图8为为安装在图3所示诊断装置中的试片安放器的蛋白固相用的下夹板的俯视图。
图9为图9的从C到C的剖视图。
图10为图6的上夹板与图8的下夹板的组合截面图。
图11为图3所示诊断装置中的活性测定单元的试样配制器的纵截面示意图。
图12为图3所示诊断装置中的活性测定单元的试样配制器的斜视图。
图13为图12所示试样配制器的流体集流腔的俯视图。
图14为图13从D到D的剖视图。
图15为图12所示试样配制器的流体线路图。
图16为控制手段的硬件结构的框图。
图17为控制诊断装置的控制器的框图。
图18为诊断装置处理的全流程图。
图19为表达量测定用试样配制处理的流程图。
图20为活性测定用试样配制处理的流程图。
图21为活性测定用试样的使用例示意图。
图22为诊断装置解析处理一例的全流程图。
图23为诊断装置解析处理其他例的全流程图。
图24为测定得出的诊断结果的使用例显示图。
图25为关于敏感性解析的其他流程的显示图。
图26为关于敏感性解析的其他诊断结果的显示图。
图27为关于敏感性解析的另一部分诊断结果的显示图。
图28为诊断装置解析处理的其他实例的全流程图。
图29为诊断装置解析处理其他实例的全流程图。
具体实施方式：
一种用于诊断从患者身上采集的组织的性质的试剂盒，其包括用于测定组织中周期素依赖性激酶(CDK)表达量的表达量测定试剂和用于测定组织中CDK活性的活性测定试剂。并且，表达量测定试剂和活性测定试剂中在第一保存条件下保存的试剂构成第一试剂组，多种试剂中在与第一保存条件不同的第二保存条件下保存的试剂构成第二试剂组。此种分类易于在各个不同的保存条件下识别、保存用于诊断从患者身上采集的组织性质的多种试剂。
在此，所谓从患者身上采集的组织的性质指组织中所含细胞的增殖能和组织中所含细胞对抗癌药等药物的敏感性以及组织中癌的恶性度。所谓组织中癌的恶性度是指癌的转移机率、复发机率和预后的不良程度。通过诊断这些性质，可以诊断癌症的预后情况及做耐药性试验。
下面就试剂盒的实施方式作一说明。不过本发明并不限于此实施方式。
本实施方式的试剂盒具有以下用于测定CDK表达量的各种试剂和用于测定CDK活性值的各种试剂。
表达量测定试剂群
表达量测定试剂群有待测定CDK的经标记的CDK抗体(以下简称为标记CDK抗体)。标记CDK抗体可以从由CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、周期素A依赖性激酶、周期素B依赖性激酶、周期素D依赖性激酶及周期素E依赖性激酶构成的组群当中选出的周期素依赖性激酶的抗体选择。作为标记CDK抗体的标准品可以使用荧光物、酶、或放射性同位素。
作为上述荧光物质，有荧光素、香豆素、曙红、菲绕啉、芘、若丹明等，其中优选荧光素。作为标记酶，有β半乳糖酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶等，其中，优选过氧化物酶。作为放射性同位素有32P。
另外，表达量测定试剂群最好包含以下物质：已知浓度的CDK、用管家基因标记的已知浓度的蛋白质、针对该蛋白质的标记抗体和针对所述CDK的已知浓度的周期素依赖性激酶抑制剂(CDK抑制剂)以及针对该CDK抑制剂的抗体。
此外，表达量测定试剂最好有防止标记CDK抗体以外的化学物质结合到该CDK中的阻断液。
上述已知浓度的CDK、用管家基因标记的已知浓度的蛋白质、已知浓度的CDK抑制剂用于求各自表达量所需的标准曲线。为此，表达量测定试剂最好备有诸如第一浓度CDK和不同于第一浓度的第二浓度CDK的不同浓度的试剂各两种以上。
管家基因是正常细胞生存不可或缺的，可以从在几乎所有细胞中都有表达的基因群中选择。比如：GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)和β-actin等。
CDK抑制剂可根据待测定CDK适当选择。比如：如果待测定CDK是CDK1，则可选p21，测定对象是CDK2，则选p21或p27，测定对象是CDK4及/或CDK6，则选p16或p27。
阻断液可使用Block Ace(将Block Ace粉溶解在蒸馏水中而成)(大日本制药社)、TBS-T(Tris Buffered Saline Tween)、BSA(牛血清白朊；Bovine Serum Albumin)等，蛋白质除白朊外，也可使用酪朊。
表达量测定试剂群因为要进行背景补正，最好有CDK以外的已知浓度的蛋白质溶液。BSA即可作为这种蛋白质的一例。
活性值测定试剂群
活性值测定试剂群包含固定了CDK抗体(以下简称固定CDK抗体)的载体、能被该载体捕捉到的与周期素生成复合物的CDK(活化CDK)磷酸化的基质、能与这一基质反应的三磷酸腺苷(ATP)以及能结合到在活化CDK的作用下ATP和基质反应的产物中的标记物质。
固定CDK抗体可以选自CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、周期素A依赖性激酶、周期素B依赖性激酶、周期素D依赖性激酶和周期素E依赖性激酶等周期素依赖性激酶的抗体。
固定固定CDK抗体的载体，可以是单硅胶、或名称为“朊Aセファロ一ズビ一ズ”、“朊Gセファロ一ズビ一ズ”的载体。
能被固定在载体上的CDK抗体捕捉到的活化CDK磷酸化的基质可根据待测定CDK适当选择。具体地说，如果CDK是CDK1和/或CDK2，则优选组朊H1；如果上述CDK是CDK4和/或CDK6，以成视网膜细胞瘤蛋白为好。
标记物和ATP可适当选择。比如，如果标记物是放射性同位素可选择32P标记的三磷酸腺苷(γ-〔32P〕-ATP)。若标记物是荧光物质或酶，可选择硫代三磷酸腺苷(ATP-γS)。
活性测定试剂群优选有以下试剂：含固定CDK抗体之载体的柱管、含没有固定CDK抗体之载体的柱管(空柱)、使从患者身上采集的组织配制的组织溶液中所含CDK与固定在该载体的CDK抗体能很好反应的缓冲剂、用于冲洗没有被载体捕捉到的非吸附物的2种柱用洗涤剂、含已知浓度的哺乳动物细胞的细胞质和核内蛋白质的溶液以及含有减灭背景用蛋白质的溶液。
上述柱管最好有支持载体的部分和储存溶液的部分。空柱可用于对活性测定结果进行背景补正。
改善固定在载体的CDK抗体与组织溶液中CDK反应的缓冲剂可使用Nonidet-P40等表面活性剂和含有Tris-HCl pH7.4的溶液。
冲洗非吸附物的2种柱用洗涤剂使用1)Nonidet-P40等表面活性剂、含Tris-HCl pH7.4和NaCl的溶液；2)Tris-HCl pH7.4等。最好让载体捕捉CDK后，用1)冲洗1次，再用2)冲洗1次。
已知浓度的含有哺乳动物细胞的细胞质和核内蛋白质的溶液最好含有待测定CDK。并且此CDK不仅有与CDK抗体的结合部位，还由所有能排入的氨基酸序列组成，且形成应有的三维结构(构造)。
含有用于减灭背景的蛋白质的溶液可以使用与表达量测定试剂群所含阻断液同样成份的东西。具体地说，可使用50％Block Ace(将Block Ace粉溶于蒸馏水)(大日本制药社)、TBS-T(Tris Buffered Saline Tween)、4％BSA(牛血清白朊；Bovine Serum Albumin)等。蛋白质除白朊外，还可使用酪朊。
另外，本试剂盒最好还有增溶剂、测定用试片和洗涤剂作为表达量测定和活性值测定通用试剂。增溶剂用于溶解从患者身上采集的组织调制组织液。测定用试片有可吸附组织液中所含蛋白质的膜，用于测定表达量和活性值。洗涤剂用于清洗测定用试片的膜等。
增溶剂最好是含有表面活性剂、蛋白质分解酶阻断剂及脱磷酸化酶组断剂的缓冲液。
表面活性剂用于破坏细胞膜和核膜，提取细胞内物质，但要使用表面活性不致于活化CDK分解的东西。比如：Nonidet-P40、Triton X-100、脱氧胆酸、CHAPS等。最好表面活性剂浓度在1w/v％以下。
蛋白质分解酶阻断剂用于防止细胞膜和核膜被打破后，混有细胞内物质时，作为蛋白质的CDK和周期素被分解酶破坏。比如，可以使用EDTA和EGTA等金属蛋白酶阻断剂、诸如PMSF、胰蛋白酶抑制剂和糜蛋白酶那样的丝氨酸蛋白酶阻断剂及/或碘乙酰胺和E-64那种胱氨酸蛋白酶阻断剂混合物、SIGMA公司的蛋白酶阻断剂混合物等预先混入蛋白质分解酶阻断剂的市场贩卖品。
脱磷酸化酶阻断剂用于防止蛋白质--活化CDK自身的磷酸基加水分解后活性发生变化。作为丝氨酸/苏氨酸脱磷酸化酶阻断剂，有氟化钠，作为酪氨酸脱磷酸化酶阻断剂有正钒酸钠。
测定用试片最好有1个以上的小池。设1个以上，既可以一次测定不同的试样，又可以以不同的浓度测定同一试样。
池底部的膜最好为疏水性多孔膜，疏水性多孔膜可以与蛋白质疏水结合，具体地说，有以下几种：PVDF(磺化聚二氟乙烯)疏水性膜、尼龙(已经电荷处理)膜、硝化纤维素等。疏水性多孔膜的孔为0.1～10μm，优选0.1～0.5μm。另，疏水性多孔膜最好经甲醇渗透等初始化处理。
以上所述各试剂的具体案例及其保存条件，如表1～6所示。表1～3为表达量测定试剂群，表4～5为活性值测定试剂群，表6为表达量测定和活性值测定通用的试剂群。对溶媒没有特别记载的表示以蒸馏水作为溶媒使用。
表1
表达量测定试剂群
 试剂号    试剂名       材料     终浓度  总量(ml)  保存条件  容器名   备注
 1001  荧光标记CDK1抗体溶液  Anti-CDK1Pluorid-orangeBlock Ace  4μg/ml80％  0.3  冷藏  螺旋盖试管   BlockAce是Block Ace粉(UK-B80：大日本制药)4克溶解到100ml蒸馏水中制成。Pluorid-orange：株式会社IST
 1002  荧光标记CDK2抗体溶液  Anti-CDK2Block Ace  4μg/ml80％  0.3  冷藏  螺旋盖试管
1003 荧光标记p21抗体溶液 Anti-p21Pluorid-orangeTris-HClpH7.4NaClBSA 1μg/ml25mM150mM1％ 0.3 冷藏 螺旋盖试管
 1004  荧光标记GAPDH抗体溶液  Anti-GAPDHPluo rid-orangeTris-HClpH7.4NaClBSA  1μg/ml25mM150mM1％  0.3  冷藏  螺旋盖试管
 1005    CDK1抗原溶液1  重组CDK1诺乃洗涤剂-P40Tris-HClpH7.4NaCl  0.01μg/ml0.005％25mM150mM  0.1  冷冻  螺旋盖试管
表2表达量测定试剂群
  试剂号   试剂名     材料   终浓度   总量(ml)   保存条件   容器   备注
1006 CDK1抗原溶液2   重组CDK1诺乃洗涤剂-P40Tris-HClpH7.4NaCl 0.1μg/ml0.005％25mM150mM 0.1 冷冻 螺旋盖试管
1007 CDK2抗原溶液1   重组CDK2诺乃洗涤剂-P40Tris-HClpH7.4NaCl 0.01μg/ml0.005％25mM150mM 0.1 冷冻 螺旋盖试管
1008 CDK2抗原溶液2   重组CDK2诺乃洗涤剂-P40Tris-HClpH7.4NaCl 0.1μg/ml0.005％25mM150mM 0.1 冷冻 螺旋盖试管
1009 P21抗原溶液1   重组P21诺乃洗涤剂-P40Tris-HClpH7.4NaCl 0.01μg/ml0.005％25mM150mM 0.1 冷冻 螺旋盖试管
1010 P21抗原溶液2   重组P21诺乃洗涤剂-P40Tris-HClpH7.4NaCl 0.1μg/ml0.005％25mM150mM 0.1 冷冻 螺旋盖试管
表3表达量测定试剂群
 试剂号    试剂名     材料   终浓度  总量(ml)  保存条件  容器     备注
1011 GAPDH抗原溶液1  GAPDH诺乃洗涤剂-P40Tris-HClpH7.4NaCl  0.01μg/ml0.005％25mM150mM 0.1 冷冻 螺旋盖试管 GAPDH：SIGMAG6019
1012 GAPDH抗原溶液2  GAPDH诺乃洗涤剂-P40Tris-HClpH7.4  0.1μg/ml0.005％25mM 0.1 冷冻 螺旋盖试管
      NaCl   150mM
1013 背景溶液   TBS诺乃洗涤剂-P40BSA 50μg/ml0.005％4％ 0.1 冷藏 螺旋盖试管
1014 阻断液1   Tris-HClpH7.4NaClBSA   25mM150mM4％ 5.0 冷藏 可二连动容器
表4活性值测定试剂群
 试剂号     试剂名     材料   终浓度  总量(ml)  保存条件     容器     备注
2001 CDK1柱 Anti-CDK1单硅胶柱 4μg/tube 冷藏 所用柱的形态如图10所示含20％乙醇作为保存液
2002 CDK2柱 Anti-CDK2单硅胶柱 4μg/tube 冷藏
2003 空柱 单硅胶柱 冷藏
2004 免疫沉降缓冲剂 诺乃洗涤剂-P40Tris-HClpH7.4 0.1％50mM 1.0 冷藏   2ml艾本德管
2005 反应前缓冲剂1 诺乃洗涤剂-P40Tris-HCIpH7.4NaCl 0.1％50mM300mM 2.0 冷藏 可二连动容器
2006 反应前缓冲剂2 Tris-HClpH7.4 50mM 2.0 冷藏   可二连动容器
2007 基液 Tris-HClpH7.4TritonX-100MgCl2ATP-rS·4Li组蛋白Hl 40mM0.1％20mM2mM10μg 1.0 冷藏 2ml艾本德管
表5活性值测定试剂群
 试剂号   试剂名   材料   终浓度   总量(ml)   保存条件   容器   备注
2008 荧光标记液  5-lodoacetamide荧光素(5-1AF)Tris-HClpH7.4EDTA-2Na二甲基亚砜(DMSO) 1.2mM150mM5mM 0.4 冷冻 螺旋盖试管 以DMSO为溶剂
2009 荧光增强试剂  Tris-HClpH7.4NaCl150mMBSA 4％  25mM150mM4％ 2.0 冷藏 可二连动容器
2010 反应停止液  2-mercaptoethanol(ME)Tris-HClpH7.4NaCl150mM  5％25mM150mM 1.7 冷藏 2ml艾本德管
 2011  活性用校准器  K562增溶液缓冲剂  1μg/μl  0.2     冷冻  螺旋盖试管
表6表达量·活性值测定通用试剂群
 试剂号  试剂名  材料  终浓度  总量(ml)  保存条件  容器  备注
3001 组织增溶液 诺 乃 洗 涤 剂-P40Tris-HClpH7.4乙二胺四醋酸(EDTA)-2Na氟化钠(NaF)原 钒 酸 钠(Na3VO4)蛋白酶抑制剂 0.1％50mM5mM50mM1mM0.2％ 0.4 冷冻 试管18mL 蛋白酶抑制剂：SIGMA蛋白酶抑制剂混合物
3002 洗涤剂 Tris-HClpH7.4NaCl 25mM150mM 25 室温  20LCUBITENER.
3003  测定用试片(疏水性多孔膜) 止动剂-FL 室温 止动剂-FL：Millipore
本试剂盒为了测定组织中所含CDK表达量和活性值如上所述含有很多种试剂。特别是关于含有抗原等蛋白质的溶液，要防止蛋白质变质存放时就要注意保存条件。为此，要根据各种试剂中所含物质来选择适当的保存条件。因此，通过分别将保存条件一样的试剂归为一组，更容易在正确的保存条件下保存，以便在稳定的状态下使用本试剂盒。各种试剂的保存条件如表1～6所示。
图1为试剂群的封装例。i)为将本试剂盒所含试剂按保存条件(冷藏保存、冷冻保存)分开包装的例子。ii)为将按保存条件分开包装的试剂再分成表达量测定试剂群和活性值测定试剂群；iii)则为保存条件相同的试剂存放在同一包装盒内，在该包装盒内分设表达量测定试剂群空间和活性值测定试剂群空间。如ii)和iii)所示，将表达量测定试剂群与活性值测定试剂群分开还可以防止在将试剂放入所述组织性质诊断装置时搞错放置位置。作为表达量测定和活性值测定通用试剂的组织增溶剂(试剂号3001)在ii)和iii)存放在冷冻保存试剂群的哪一个包装或空间都可。保存条件为常温的洗涤剂(试剂号3002)和测定用试片(试剂号3003)如iv)所示，最好另行打包。
本试剂盒虽然可以用于手工测定，但最好放在全程自动化的装置中使用。
作为这种装置有具以下功能的组织性质诊断装置：第一数据获取手段：取得的第一数据反映从患者身上采集的组织中的CDK表达量；第二数据获取手段：取得的第二数据反映从患者身上采集的组织中的CDK活性；解析手段：根据上述第一数据和第二数据得出的值，获取关于组织性质的信息。
在此，本试剂盒通过对从患者身上采集的组织测定2种以上的CDK表达量和活性值，通过根据测定数据判断组织性质来诊断组织所含细胞的增殖能、组织所含细胞对抗癌药的敏感性和组织的恶性度。
所谓增殖能是细胞的增殖活性水平，指有关是否已超出增殖的控制机理(有无癌变)、及非整倍性的信息。
所谓对抗癌药的敏感性指抗癌治疗有无效果。抗癌药，针对乳癌来说有：CMF群(环磷酰胺、氨甲喋呤、氟脲嘧啶3剂合用疗法)、多烯紫衫醇、紫杉醇等紫杉类抗癌药、CE(环磷酰胺与表阿霉素2药合用疗法)、AC(阿霉素与环磷酰胺2药合用疗法)、CAF(氟脲嘧啶、阿霉素与环磷酰胺3药合用疗法)、FEC(氟脲嘧啶、表阿霉素、环磷酰胺3药合用疗法)、曲妥珠单抗与紫杉醇2药合用疗法以及截瘤达(capecitabine)等；针对胃癌有：FAM(氟脲嘧啶、阿霉素与丝裂霉素C3药合用疗法、FAP(氟脲嘧啶、阿霉素与顺铂3药合用疗法)ECF(表阿霉素、顺铂与氟脲嘧啶3药合用疗法)、丝裂霉素C与替加氟2药合用疗法、氟脲嘧啶与卡莫司汀2药合用疗法等；针对大肠癌有：氟脲嘧啶与醛氢叶酸2药合用疗法、丝裂霉素与氟脲嘧啶2药合用疗法等；针对卵巢癌有：TP(紫杉醇与顺铂2药合用疗法)、TJ(紫杉醇与卡铂2药合用疗法)、CP(环磷酰胺与顺铂2药合用疗法)、CJ(环磷酰胺与卡铂2药合用疗法)等。
所谓恶性度指转移机率、复发机率及预后情况等。复发是指为摘除恶性肿瘤切除部分臓器后残存臓器再次出现同样恶性肿瘤的情况，以及肿瘤细胞从原发病灶分移到远处组织(远处臓器)并在那里独自增殖的情况。一般5年以内复发称为“易复发”。按期分类的话，III期为复发率50％，比II期(复发率20％)容易复发。预后指预知疾病的过程和最终结果，5年或10年后的死亡率高为预后不良，比如，III期死亡率为50％，比II期(20％)预后差。
测定2种以上的CDK的表达量和活性值，求其在各种CDK中的比(下记式子中表示的CDK活性比或其逆数)，就能诊断从患者身上采集的组织的性质。
CDK活性比＝CDK活性值/CDK表达量
上述算式算出的CDK活性比相当于细胞内存在的CDK中显示活性的CDK比例，可以说是根据被诊断组织所含细胞增殖状态得出的CDK活性水平。通过2种以上的CDK活性比、比如第1个CDK(第一CDK)的活性比与第2个CDK(第二CDK)活性比之比即可知道哪个CDK活性占优势，由此可知在细胞周期的某个时期的细胞比例为多少或哪个时期的细胞比例更活跃等。
在此，CDK是与周期素结合活化的酶群的总称，根据其种类，在细胞周期的特定时期发挥作用。CDK抑制剂是结合到周期素与CDK的复合物中阻碍其活性的因子群的总称。CDK通常在细胞内作为非活性单体存在于细胞质中，CDK本身受磷酸化等活化移至核内。在核内，CDK与存在于核内的周期素分子结合变成活化CDK，在细胞周期的各个阶段调节细胞周期的运行使其正常。另一方面，CDK抑制剂通过与CDK单体或活化CDK结合，使CDK变为非活性，调节细胞周期的运行使其不正常。因此，细胞内存在CDK单体、CDK与周期素及/或CDK抑制剂的复合物(以下简称CDK群)。
本试剂盒的测定对象CDK最好选自由CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、周期素A依赖性激酶、周期素B依赖性激酶、周期素D依赖性激酶及周期素E依赖性激酶构成的群体。周期素A依赖性激酶是与周期素A结合表现出活性的CDK，现在判明的有CDK1和CDK2。周期素B依赖性激酶是与周期素B结合表现出活性的CDK，现在判明的有CDK1。周期素D依赖性激酶是与周期素D结合表现出活性的CDK，现在判明的有CDK4和CDK6。周期素E依赖性激酶是与周期素E结合表现出活性的CDK，现在判明的有CDK2。
这些CDK据现阶段所知，如表7所示，分别与相应的周期素结合构成周期素·CDK复合物(活化CDK)，活化表7所示的细胞周期的特定时期。比如：CDK1与周期素A或B、CDK2与周期素A或E、CDK4和CDK6与周期素D1、D2或D3结合成为活化CDK。另一方面，CDK活性有时受到表7所示CDKI阻碍，如p21阻碍CDK1、2，p27阻碍CDK2、4、6，p16阻碍CDK4、6。
表7
   CDK   可结合的周期素   可结合的CDK抑制剂   活化CDK的作用期
CDK4CDK6    周期素D1周期素D2周期素D3 P27P16 G1
    CDK2    周期素E     P27     G1→S
    CDK2    周期素A     P21、P27      S期
CDK1    周期素A周期素B P21 G2→M
周期素A依赖性激酶 周期素A     P21P27    CDK1：G2→MCDK2：S期
 周期素B依赖性激酶    周期素B     P21    CDK1：G2→M
周期素D依赖性激酶 周期素D     P27P16 CDK4、6：G1
 周期素E依赖性激酶    周期素E     P27     CDK2：S期
在此，从细胞开始增殖，经过DNA复制、染色体分配、核分裂、细胞质分裂等过程，分成2个子细胞再返回起点为一个周期，这一细胞周期如图2所示，分为G1期、S期、G2期、M期4个期。S期为DNA复制期，M期为分裂期。G1期指从有丝分裂结束到DNA合成开始的一段时间，是进入M期的准备检查期。一过了G1期的临界点(在动物细胞中称R点)细胞周期开始启动，通常不停顿地巡回一周。G2期指DNA合成结束到有丝分裂开始的期间。细胞周期的主要检查点是从G1期进入S期之前和从G2期到有丝分裂的入口处。特别是，G1期检查点因为是扣动S期开始的扳机，非常重要。因为一过了G1期的某个点，细胞即使增殖信号消失，也不会停止增殖，从S→G2→M→G1这样进行完细胞周期。另，停止增殖的细胞将带着G1期的DNA含量休止一段时间(休止期(GO))，处于脱离细胞周期的状态。在增殖诱导下可比细胞周期的G1期略晚一点进入S期。
一般来说，癌细胞逃脱正常的增殖控制，活跃地增殖，因此，S期、G2期的细胞比例较高。这种癌发展很快，可以说是恶性的。发生非整倍性一般也认为是在经过了异常的M期或不经M期直接从G1期进入S期的情况下，因此，存在于M期的细胞比例少也是诊断恶性度的指标。因此，作为表达量和活性值的测定对象可以选择从G2期到M期活化并起作用的CDK1作为第1个CDK，选择从G1期到S期活化并起作用的CDK2作为第2个CDK，将据测定结果所得的活性比之比通过与所定的临界值进行比较作为细胞增殖和癌的恶性度的指标。
上述活性比之比对于细胞对药物的敏感性也适用。比如：近年指出的患者遗传体质带来的抗癌药等药物的疗效不同就是起因于细胞对药物的敏感性的不同。即，细胞原有的性质包含对药物是否敏感的性质，2种以上的CDK活性比之比也与对药物的敏感性有关。从2种CDK的表达量和活性值的测定结果得出的活性比之比通过与所定临界值比较，就可诊断细胞对药物的敏感性。
关于组织性质的诊断方法和对药物(抗癌药)的敏感性的诊断方法在国际公告第WO2004/076686号、日本专利申请第2004-375639号、日本专利申请2005-158373号中有详细记载。
本试剂盒对作为测定对象的哺乳动物没有特定，但对人，特别是临床状态更具体地要求诊断癌的状态的人更有效。
本试剂盒要测定的被检组织适于诸如含有超越增殖控制机构的肿瘤细胞的组织等一切想得到病理信息的被检组织。考虑到患者的肉体和精神的损害和抗癌药治疗所需的高额费用等，希望知道是否该实施抗癌药治疗时本试剂盒也适用。作为组织，可以是乳腺、肺、肝脏、胃、大肠、胰脏、皮肤、子宫、精巢、卵巢、甲状腺、副甲状腺、淋巴系统、骨髓等。而且癌的种类可以是乳癌、胃癌、大肠癌、食道癌、前列腺癌等。
下面，用本发明的试剂盒和可搭载试剂盒的组织性质诊断装置，测定从患者身上采集的组织所含的周期素依赖性激酶(以下称CDK)的表达量和活性值，并根据所得测定结果诊断人的癌的恶性度和抗癌药的有效性(敏感性)，就其方法进行详细说明。
首先，就组织性质诊断装置进行说明。图3是可搭载本试剂盒的组织性质诊断装置A(以下简称为诊断装置A)的斜视示意图。诊断装置A主要由以下部分构成：装置主体20的前方部位的检测器4、试片放置部分1、第1试剂放置部分5和第2试剂放置部分6、装置主体20后面的活性测定单元2、收容废液的废液槽7和清洗吸管的吸管清洗槽8、根据装置主体20的信息可以将吸管向三个方向(X方向、Y方向和Z方向)移动的分装机关3、在装置主体20背后的流体部分9和电子线路板部分10、以及作为控制手段与所述检测器4和电子线路板10连接并可通信的电脑12。此外，诊断装置A还配有纯净水箱13、清洗箱14、废液箱15和空压源11。纯净水箱13储存测定结束时清洗流路用纯净水，通过管道21与流体部分9相接，清洗箱14储存清洗吸管的洗涤剂，通过管道22与吸管清洗槽8相连，收容废液的废液箱15通过管道23与废液槽7相接。诊断装置A还配有用于从组织上抽取诊断装置A可处理的测定试样的增溶装置B。
增溶装置B在诊断装置A处理前从组织中抽取制备诊断装置A可处理的液态检体，其包括筐体部分30、筐体部分30前上方的操作部分31、有一对挤压磨碎所述组织的杵34的驱动部分32和装有存放所述组织的艾本德(Eppendorf)管35的检体放置部分33。
驱动部分32可上下驱动并左右旋转杵34，注入艾本德管35内的生物试样被其挤压、磨碎。所述筐体部分30内藏有控制这些驱动部分32动作的控制器(无图示)。
操作部分31有操作键31a、运转灯31b、显示装置状态和错误信息等的显示器31c。检体放置部分33内有无图示的冷却设施，使安装在该检体放置部分33上面凹处的艾本德管里的生物试样保持一定的温度。被增溶装置B增溶、又被无图示的离心机离心处理的生物试样的上清液吸入规定的检体容器中，放置到诊断装置A的第一试剂放置部分5。
第一试剂放置部分5内与检体放置部分33同样有无图示的冷却设施，使第一试剂放置部分5上面凹处的螺旋盖试管等容器内的检体、各种荧光标记CDK抗体溶液和各种CDK抗原溶液等保持一定温度。本实施方式所用组织性质诊断装置设计为纵5列、横4列共计20个凹处，可放置最多20个螺旋盖试管等容器。
第二试剂放置部分6与第一试剂放置部分5相邻。第二试剂放置部分6与第一试剂放置部分5一样有多个凹处，这些凹处放置装入缓冲剂、基液和荧光增强试剂等溶液的艾本德管和螺旋盖试管等容器。在诊断装置A处理之前，先将测定用试片放在试片安放器1，同时将柱管放置到活性测定单元。
试片安放器1由铝块构成，如图4～5所示，为了放置测定用试片121，上面有凹部132，同时底部有吸口135。更详细地说，试片安放器1上面有长方形的第一凹部132和在此第一凹部132底部有同样长方形的第二凹部133。第一凹部132底面沿第二凹部133的边缘配有长方形框状的橡胶制弹性垫圈137。
第二凹部133其底部有十字形槽134，底部中心有吸口135，槽134的底部由第二凹部133边缘向中心倾斜，越来越深。吸口135连通与外部吸移泵相接的管接头136。后面还要详述的测定用试片121隔第一凹部132底面的橡胶垫圈137平铺在上面。当含蛋白试液注入或滴入测定用试片的各小池后，管接头136连接的无图示的吸移泵动作。从而测定用试片121夹橡胶垫圈137紧密吸附在第一凹部132的底面，同时各小池内的试液通过后述的疏水性多孔膜122吸移，测定目标蛋白呈固相吸附在该膜上。此时，也可将压固测定用试片121于第一凹部132底面的固定部件设在试片安放器1。
测定用试片121由疏水性多孔膜122和夹持疏水性多孔膜122的上夹板101和下夹板111构成(图10为截面图)。这一蛋白固相用试片121发挥着使含周期素依赖性激酶抗体的抗体溶液与检体接触的第二接触手段的功能。疏水性多孔膜122使用的是Millipore公司的止动剂-FL(PVDFmembrane、孔径0.45μm)。
上夹板101如图6～7所示。长方形的上夹板101上有呈矩阵状排列为4行10列共40个长方形的穿孔102。上夹板101的下面绕上述40个穿孔102一周有槽(凹部)104。这个槽104将长方形疏水性多孔膜设置区域103界定在其内侧。且，槽104底部有8个夹具穿孔105。
另一方面，图8～9所示长方形下夹板111在与所述上夹板101的穿孔102对应的位置分别也有矩阵状排列成4行10列共40个长圆形穿孔112。穿孔112有着与穿孔102同样的形状和截面积。
下夹板111的上面有绕40个穿孔112一周垄起的凸部114在与所述槽104对应的位置上。此凸部114将长方形疏水性多孔膜设置区域113划定在其内侧。下夹板111的周围还有6个缺口115。另，上夹板101和下夹板111可以用氯乙烯树脂材料制成。
图10显示了测定用试片121的截面，上夹板101和下夹板111如图所示重叠在一起。凸部114压入槽104，可随时分离，各穿孔102和各穿孔112相互同轴。使用时，疏水性多孔膜设置区域103和113之间填装长方形疏水性多孔膜122，再将所述凸部114压入槽104，据此几层压缩为一体。如此，疏水性多孔膜122被各穿孔102划分各个区域，各不互相渗水。中间只有穿孔102数量的小池(储液)。
活性测定单元2如图11～14所示，由具有各自的柱201和流体集流腔213的多个试样配制器211组成，用于测定CDK活性值。图11所示柱201由氯乙烯树脂材料的圆筒构成，内有保留用于离析液体试样中的目标物的载体206的载体保留器202及将液体试样放入此载体保留器202储存的液体储存器204。柱201是使含有所定基质的基液与检体接触的第一接触手段。
柱201的液体储存器204上部有可从外部注入或抽取液体试样的开口205。载体206由固定CDK1抗体或CDK2抗体的圆柱形单硅胶构成，以捕捉液体试样中的CDK1或CDK2。此单硅胶与粒子载体不同，其结构为三维网状骨架及其空隙为一体。载体206从柱201的下方开口处插入载体保留器202，夹○形环207被固定用管208有弹性地挤压、固定。固定用管208从柱201下方开口处推入，固定用管208与○形环207的孔形成液体导入部分203。
另外，柱201下端有装填用凸缘209，以便将柱201装入试样配制器211加以固定。此为椭圆形，即将直径D的圆盘状凸缘两侧平行切屑为宽度W(W＜D)。图12是试样配制器211的斜视图，如该图所示，试样配制器211有一L字形的支撑板212，这一支撑板212固定有流体集流腔213、注射泵214和带有减速机的步进电动机215。
步进电动机215的输出轴上连接有螺旋状旋转轴216，与此螺旋状旋转轴216螺纹咬合的驱动臂217连接在注射泵214的活塞218前端。步进电动机215一带动螺旋状旋转轴216旋转，活塞218就上下运动。注射泵214和流体集流腔213之间通过连接器219、220用输液管205连接。注射泵214通过连接器220a经输液管220b与存放液体(洗涤剂)以灌满流路的流体室234(图14)相接。
如图13～14所示，流体集流腔213有接有柱201的液体导入部203的柱连接器221和接受液体试样的液体试样接受器222。流体集流腔213内部有流路223，下面还有开合液体试样接受器222与柱连接器221之间通路的电磁阀224及开合流路223与柱连接器221之间通路的电磁阀225。为连接连接器220，流体集流腔213侧面还有连接器专用螺孔226，这个螺孔226连接到流路223。
图15是试样配制器211的流体线路图，显示出注射泵214通过连接器220a连接到流体集流腔213的状态。注射泵214还通过电磁阀233连接有流体室234，加压源235将压缩空气加到流体室234。
在此，说明一下将柱201装填到流体集流腔213的方法。如图13～14所示，流体集流腔213上面有接受柱201的受柱凹部227，此凹部227的底部中心与柱连接器贯通，并在底部装有一圈○形环228。另有2张截面为L字形的压板229、230以受柱凹部227为中心、以宽于所述宽度W、窄于D的间隔平行固定在流体集流腔213的上面。
凸缘209如从压板229、230之间通过般将柱201装入受柱凹部227，再顺时针或逆时针旋转90度。这样，凸缘209的直径D部分与压板229、230咬合，同时，靠○形环228的弹性，凸缘209被压板229、230固定。拆卸柱201时，只要压着柱201向左或右转动90度即可。
为防止柱201装入试样配制器211的流体集流腔213时混入气泡，流体集流腔213的凹部227被流体充满，一旦柱201的前端插入凹部227，根据其体积，流体会溢出。为防止这些液体溢出周围，受柱凹部227周围设置了溢液储蓄凹部231，溢液储蓄凹部231的部分还留出了溢液排出凹部232，以便用吸移管吸出溢液。各种检体和试剂被具有吸移管的分装设备3注入所定部位，或从所定部位吸出。在此，就检体或试剂被注入液体试样接受器222时的运行过程作一说明。当检体或试剂被注入液体试样接受器222时，首先，电磁阀224开启(电磁阀225和233闭合)，注射泵214做吸入动作，从而，检体或试剂通过电磁阀224被抽取到注射泵214一侧。接着，关闭电磁阀224，打开电磁阀225，注射泵214做排出动作。这样，检体或试剂通过电磁阀225移送到柱201中。
分装设备3如图3所示，有朝X方向移动吸移管的支架352、朝Y方向移动吸移管的支架353和朝z方向移动吸移管的托板354。支架352有朝箭头X方向移动托板354的螺旋轴355、支撑并拉动托板354的引导杆356和旋转螺旋轴355的步进式电动机357。支架353有朝箭头Y方向移动支架352的螺旋轴358、支撑并拉动支架352的引导杆359和旋转螺旋轴358的步进式电动机361。托板354有朝箭头Z方向移动固定吸移管的旋臂368的螺旋轴367、支撑并拉动旋臂368的引导杆和旋转螺旋轴367的步进式电动机370。
本实施方式使用的组织性质诊断装置因为分装设备3具备一对吸移管362，因此可以同时向2个检体容器注入试剂等，或同时从2个检体容器抽取内容，从而更有效地进行测定处理。
装置主体20的背面如图3所示，配置有操作流体的流体部分9，上面连接了所述吸移管362、吸移管清洗槽8及各试样配制器211等。这一流体部分9如图14所示，有各试样配制器211的电磁阀224、225、从低温液室向注射器214注射液体时控制流体的电磁阀233、用吸移管362吸移液体时控制流体的电磁阀、从废液槽7的吸移管362抽取废弃的液体时控制流体的电磁阀和在吸移管清洗槽8清洗吸移管362时控制流体的电磁阀。
装置主体20背面还配有给各种试样配制器211、步进式电动机357、361、370、流体部分9等提供驱动信号的电子线路板部分10。
检测器4用于测定反映固化在测定用试片121疏水性多孔膜122上的蛋白量的荧光物数量和反映磷酸基量的荧光物数量，将励起光照射到测定用试片121，检测发出的荧光量，再将与检测的荧光强度相应大小的电信号输出到电子线路板部分10。检测器4可适当采用通用的由光源、照明系统和受光系统构成的仪器。
作为控制手段的电脑12如图16所示，有联线到所述电子线路板部分10的控制器77、向该控制器77输入数据等的输入设备78以及显示分析结果等的显示器79。控制器77构成了解析手段、用标准曲线从荧光强度获取表达量的第一(第二)表达量获取手段和用标准曲线从荧光强度获取活性值的第一(第二)活性值获取手段。
控制器77如图16所示，有CPU91a、ROM91b、RAM91c、输出入接口91d和图像输出接口91e。ROM91b中收纳有操作系统、控制装置运行的控制程序和实行控制程序所需的数据。CPU91a可将控制程序寄存到RAM91c、或从ROM91b直接运行。这样，CPU91a处理的结果数据就通过输出入接口91d传送到电子线路板部分10，CPU91a处理所需的数据从电子线路板部分10通过输出入接口91d被接收。CPU91a通过运行控制程序来实现对电子线路板的控制。CPU91a根据检测器4获得的荧光强度，取得周期素依赖性激酶(CDK)的表达量和活性值，再根据取得的值得出有关组织性质的信息。为了获取CDK的表达量和活性值，所述RAM91c存储有将荧光强度转换为表达量或活性值的转换数据--标准曲线。
图17为控制诊断装置A的控制器的框图。此控制器如该图所示，包括有驱动分装设备3各部分的驱动线路的电子线路板部分10和由以下几部分组成的电脑：控制器77：控制该电子线路板的同时，还分析检测器4检测出的结果；输入设备78：向该控制器77输入数据等；显示控制器77分析得出的分析结果等内容的显示器79。
控制器77通过控制电子线路板部分10输出以下信号：通过电子线路板部分10驱动各试样配制器211的步进式电动机215的驱动信号、调节第一试剂放置部分5的温度的驱动信号、驱动步进式电动机357、361、370的驱动信号以及驱动流体部分9里面的电磁阀的驱动信号。控制器77通过电子线路板部分10从检测器4读取检测信号。
下面，以诊断人的癌细胞的恶性度(复发风险高低)和抗癌药的有效性(敏感性)为例，就使用本试剂盒和诊断装置A诊断组织性质作一说明。另，以下使用的试剂号与表1～6所列试剂相对应。
(1)增溶装置的预处理
在诊断装置A处理前，首先用增溶装置B从癌症患者身上摘除的组织中采集液态检体，现就这一方法加以说明。首先，将从癌症患者身上采集的组织(约2mm3)用镊子放入装有组织增溶剂(试剂号3001)的试管中，将该试管安放到图3所示增溶装置B的检体放置部分33。接下来，按操作部分31的开始键，则杵34下降到所定位置，挤压试管内的组织到试管底部，在此状态下旋转杵34碾碎组织。经一定时间后，停止杵34的运动，将杵34提起后，从检体放置部分33取出试管。然后，将已增溶的试管内的物质用离心机处理，按指南抽取所得上清液作为检体。
(2)表达量测定用试样在诊断装置上的放置
将抽取的上清液装入2个检体容器，以各不相同的稀释倍率稀释后安放到第一试剂放置部分5。2个检体中，一边是表达量测定用检体，另一边是活性值测定用检体。
再将以下试剂放到第一试剂放置部分5：荧光标记CDK1抗体溶液(试剂号1001)、荧光标记CDK2抗体溶液(试剂号1002)、荧光标记p21抗体溶液(试剂号1003)、荧光标记GAPDH抗体溶液(试剂号1004)、CDK1抗原溶液1(试剂号1005)、CDK1抗原溶液2(试剂号1006)、CDK2抗原溶液1(试剂号1007)、CDK2抗原溶液2(试剂号1008)、p21抗原溶液1(试剂号1009)、p21抗原溶液2(试剂号1010)、GAPDH抗原溶液1(试剂号1011)、GAPDH抗原溶液2(试剂号1012)以及活性用校准器溶液(试剂号2011)。
另，将以下试剂放到第二试剂放置部分6：阻断液(试剂号1013)、免疫沉降(IP)缓冲剂(试剂号2004)、反应前缓冲剂1(试剂号2005)、反应前缓冲剂2(试剂号2006)、基液(试剂号2007)、荧光标记液(试剂号2008)、荧光增强试剂(试剂号2009)和反应停止液(试剂号2010)。
(3)诊断装置处理全程
在此，就图18所示诊断装置处理的全过程做一说明。另，在以下流程图的判断中，对「Yes」和「No」不作图示时，则下为Yes，右(左)为No。以下所述处理全部由控制器77控制。
首先，一接通电源，则接受测定注册(步骤S1)。在这一处理过程中，接受检体号等有关测定信息的输入。接着，接受选择预后预测模式(判断人的癌细胞的恶性度(复发风险的高低)模式)还是抗癌药敏感性模式(判断抗癌药的有效性(敏感性)模式)等对某一个模式的选择(步骤S2)。具体地说，电脑12显示器79上出现2种模式的输入键。操作者按希望选择的模式键。本例是以抗癌药敏感性模式判断紫衫类抗癌药的敏感性。除上述2种模式外，还可选择预后预测·抗癌药敏感性模式。
接下来，判断是否接受了开始测定的指令(步骤S3)。若为Yes则进入步骤S4，若为No则进入步骤S8。从放置在第一试剂放置部分5的检体容器中抽取检体，对抽取的检体进行一定的处理，配制成荧光检测用的试样(步骤S4)。此步骤中包括后面还要详细描述的表达量测定用试样的配制和活性值测定用试样的配制，这两个处理同时进行。
将安放了含有荧光检测用试样的测定用试片121(试剂号3004)的试片安放器1从图3所示位置移到检测器4中(步骤S5)，用励起光照射测定用试片的各小池，检测荧光检测用试样放射出的荧光(步骤S6)。
由电脑12的控制器77获取荧光强度，根据获取的荧光强度输出解析结果(步骤S7)。判断是否接到关闭诊断装置的指令(步骤S8)，若为Yes则进入步骤S9，若为No则返回步骤S1。最后，关机处理，切断电源(步骤S9)。
(4)表达量测定用试样的配制
步骤S4中的表达量测定用试样的配制过程如图19所示。首先，排出预存在测定用试片121(试剂号3003)的各小池的保存液(TBS；25mM Tris、150mM NaCl、pH7.4)，清洗各小池(步骤S11)。清洗过程是：通过分装设备3的吸移管将洗涤剂(试剂号3002)从上方注入各小池，再从测定用试片的下方通过疏水性多孔膜用真空方法将注入的洗涤剂抽出来。以后所述清洗工序也一样。
其次，用吸移管从放置在第一试剂放置部分5的检体容器中吸移配制作表达量测定之用的检体至所定池内，然后再用真空方法将这一检体从测定用试片121(试剂号3004)下方吸移。这样一来，检体中所含蛋白质就会因与疏水性多孔膜之间的疏水结合而保留并固化(步骤S12)。接下来与步骤S11一样，清洗所述所定的池，如此，蛋白质以外的成份从测定用试片的疏水性多孔膜除去(步骤S13)。
之后，用吸移管抽取放在第一试剂放置部分5的阻断液(试剂号1014)注入所定池内，放置15分钟以上(比如30分钟)后将残留在池内的阻断液排出(步骤S14)。这样可以防止接下来要注入的荧光标记CDK1抗体溶液(试剂号1001)、荧光标记CDK2抗体溶液(试剂号1002)、荧光标记p21抗体溶液(试剂号1003)和荧光标记GAPDH抗体溶液(试剂号1004)在疏水性多孔膜中没有蛋白质固化的部位固化。接着，向2个池内注入该荧光标记CDK1抗体溶液、该荧光标记CDK2抗体溶液、该荧光标记p21抗体溶液、该荧光标记GAPDH抗体溶液、以及背景溶液(试剂号1013)。经过20～30分钟，各荧光标记抗体溶液与固化在疏水性多孔膜上的蛋白质(CDK1、CDK2、p21、或GAPDH)反应结束后，排出注入的各荧光标记抗体溶液(步骤S15)。最后，与步骤S13一样清洗所定小池(步骤S16)。
此外，关于除阻断液(试剂号1014)外还收容有反应前缓冲剂1(试剂号2005)、反应前缓冲剂2(试剂号2006)和荧光增强试剂(试剂号2009)的可二连动容器，有2个液体储存器，其宽度设定为分装设备3的两个吸移管可同时吸移溶液。
(5)活性值测定用试样的配制
步骤S4中的活性值测定用试样的配制过程如图20所示。在这一活性值测定用试样的配制处理中，图3所示的活性测定用单元2使用的是有图中靠前部分的4个试样配制器211和图中靠后部分的4个试样配制器211的设备。活性测定以此活性测定单元2的各试样配制器211为(图中后排左起)第一试样配制器(Ac1)、第二试样配制器(Ac2)、第三试样配制器(Ac3)和第四试样配制器(Ac4)，和(图前排左起)第五试样配制器(Ac5)、第六试样配制器(Ac6)、第七试样配制器(Ac7)和第八试样配制器(Ac8)。
首先，将CDK1柱(试剂号2001)3根、CDK2柱(试剂号2002)3根及空柱(试剂号2003)2根共计8根柱(以下有时简称各柱)如图21所示放在第1～第8试样配制器(Ac1～Ac8)后，针对第1～第8试样配制器(Ac1～Ac8)，用分装设备3的吸移管向液体试样接受部分222注入免疫沉降缓冲剂(试剂号2004)。凭借注射泵214和电磁阀224、225如所述动作，缓冲剂输送到8根该各柱。然后，全部各柱中的免疫沉降缓冲剂又被分装设备3的吸移管抽出、废弃(步骤S21)。
接下来，进行免疫沉降(抗体与CDK反应)(步骤S22)。移送检体的顺序如图21所示。先从放在第一试剂放置部分5的一个检体容器中用分装设备3的一个吸移管抽取活性值测定用检体1，用另一个吸移管抽取活性值测定用检体2。
从检体容器抽取的活性值测定用检体1注入第一试样配制器(Ac1)的液体试样接受部分222，再凭借注射泵214和电磁阀224、225的所述动作，移送到设在第一试样配制器(Ac1)的空柱(试剂号2003)中。此时，使活塞218上下往返1.5次(排出-抽取-排出)，以此让检体1在空柱内的单硅胶载体中往返1.5次。
另一方面，从检体容器抽取的活性值测定用检体2注入第五试样配制器(Ac5)的液体试样接受部分222，与上述一样通过这一接受部分输送到安放在第五试样配制器(Ac5)的空柱(试剂号2003)中。第一试样配制器(Ac1)和第五试样配制器(Ac5)的该空柱的单硅胶载体中既无固相CDK1的抗体，也无固相CDK2的抗体。因此，在第一试样配制器(Ac1)和第五试样配制器(Ac5)CDK1和CDK2不固化，放在第一试样配制器(Ac1)的空柱中存留有含CDK1及CDK2的检体1，放在第五试样配制器(Ac5)的空柱中存有含CDK1及CDK2的检体2。
然后，存留在第一试样配制器(Ac1)的空柱中的检体1用分装设备3的吸移管抽取，注入第三试样配制器(Ac3)的液体试样接受部分222，并通过该接受部分与上述一样输送到第三试样配制器(Ac3)的CDK1柱(试剂号2001)。
存留在第五试样配制器(Ac5)的空柱内的检体2用分装设备3的吸移管抽取，注入第四试样配制器(Ac4)的液体试样接受部分222，再通过该接受部分与上述一样输送到第四试样配制器(Ac4)的CDK1柱(试剂号2001)中。CDK1抗体固定在第三试样配制器(Ac3)和第四试样配制器(Ac4)中的CDK1柱的单硅胶载体中，因此，在第三试样配制器(Ac3)和第四试样配制器(Ac4)，CDK1被固化，但CDK2却不被固化，放在第三试样配制器(Ac3)中的CDK1柱剩下不含CDK1含CDK2的检体1，第四试样配制器(Ac4)的CDK1柱剩下不含CDK1含CDK2的检体2。
接着，留在第三试样配制器(Ac3)的CDK1柱(试剂号2001)中的检体1被分装设备3的吸移管抽取出来，注入第七试样配制器(Ac7)的液体试样接受部分222，并通过该接受部分与上述一样输送到放在第七试样配制器(Ac7)的CDK2柱(试剂号2002)。
留在第四试样配制器(Ac4)的CDK柱(试剂号2001)内的检体2用分装设备3的吸移管抽取，注入第八试样配制器(Ac8)的液体试样接受部分222，并通过该接受部分与上述一样输送到第八试样配制器(Ac8)的CDK2柱(试剂号2002)中。CDK2抗体固定在第七试样配制器(Ac7)和第八试样配制器(Ac8)中的CDK2柱的单硅胶载体中，因为在第七试样配制器(Ac7)和第八试样配制器(Ac8)，CDK2被固化，所以放在第七试样配制器(Ac7)中的CDK2柱内只有不含CDK1和CDK2的检体1，第八试样配制器(Ac8)的CDK2柱内只有不含CDK1和CDK2的检体2。第七试样配制器(Ac7)和第八试样配制器(Ac8)的CDK2柱中存留的检体1和检体2分别用分装设备3的吸移管抽取出来废弃到废液槽7中。
第一试剂配制器(Ac1)和第五试样配制器(Ac5)用于测定背景活性，第三试剂配制器(Ac3)和第四试样配制器(Ac4)用于测定CDK1活性，第七试剂配制器(Ac7)和第八试样配制器(Ac8)用于测定CDK2活性。
这样，通过将柱内剩余的检体注入其他柱，实现了用少量的检体即可进行背景活性测定、CDK1活性测定及CDK2活性测定。
此外，为绘制活性值的标准曲线，按上述同样的办法测定了活性用校准液(试剂号2011)的活性值。
接下来，为清洗、去除检体中的不需要成份，将反应前缓冲剂1(试剂号2005)移送到各柱(步骤S23)。然后，因为反应前缓冲剂1(试剂号2005)会影响在步骤S25实施的酶反应，故以为这种酶反应创造条件为主要目的，将反应前缓冲剂2(试剂号2006)移送到各柱，冲洗反应前缓冲剂1(试剂号2005)的成份(步骤S24)。
接下来，将基液(试剂号2007)注入各柱，让活塞219往返5.5次(步骤S25)。从各柱下方挤出的溶液先原封不动地存放在各柱内。通过此步骤，以CDK1或CDK2为酶，将磷酸基导入基液含有的组蛋白H1中。这一磷酸基的量将受CDK1或CDK2发挥酶的作用的强弱(即活性值)所左右，因此，通过测定所述磷酸基的量即可求出CDK1或CDK2的活性值。另外，图21所示使用第一试样配制器(Ac1)和第五试样配制器(Ac5)求得的背景活性值如后所述，用于背景补正。
下一步，将荧光标记溶液(试剂号2008)用吸移管从各柱的上方直接分别注入各柱内，使荧光标记与被导入到HistonH1中的磷酸基结合(步骤S26)。此时，吸移管在一定时间内反复注入和抽取各柱内的液体，以此搅拌各柱内的液体。从步骤S26开始经过一定时间(比如20分钟)后，将反应停止液(试剂号2010)和荧光标记试剂一样直接分别注入各柱。然后与步骤S26同样在一定时间内反复分别注入和抽取各柱内的液体，从而搅拌各柱内的液体(步骤S27)。荧光标记的结合到此为止。
将第一试样配制器(Ac1)、第三试样配制器(Ac3)、第四试样配制器(Ac4)、第五试样配制器(Ac5)、第七试样配制器(Ac7)和第八试样配制器(Ac8)的6根柱内的液体分别注入测定用试片121(试剂号3004)的6个小池内，再从测定用试片121下方抽取(步骤S28)。以此，含有荧光标记结合的磷酸基的组蛋白H1被固化在测定用试片121的多孔膜。接下来和在所述表达量测定用试样的配制处理步骤S11同样，用洗涤剂(试剂号3002)清洗小池(步骤S29)。最后，为了活化荧光，向小池内注入、排出荧光增强剂(试剂号2009)，并反复6次(步骤S30)。
(6)解析处理
如图22所示，解析是根据检测器得出的荧光强度进行的，其结果将输出。首先，控制器77通过电子线路板部分10从检测器4的受光系统分别就CDK1的表达、CDK1的活性、CDK2的表达、CDK2的活性、p21的表达、背景的表达和背景的活性各获取2个荧光强度(步骤S31)。
其次，控制器77计算出各获取了2个的荧光强度的平均值(步骤S32)，从CDK1表达的荧光强度(平均值)减去背景表达(平均值)，同时，从CDK2表达的荧光强度(平均值)减去背景表达(平均值)，以此就CDK1表达、CDK2表达和p21表达进行背景补正。关于CDK1活性、CDK2活性和p21活性也用同样方法进行背景补正(步骤S33)。
下一步是用标准曲线就各项获取表达量和活性值(步骤S34)。此标准曲线是将荧光强度转换为表达量或活性值的依据。至于标准曲线的绘制，表达量的标准曲线是根据以下试剂的表达量测定结果绘制的：所述CDK1抗原溶液1(试剂号1005)、CDK1抗原溶液2(试剂号1006)、CDK2抗原溶液1(试剂号1007)、CDK2抗原溶液2(试剂号1008)、p21抗原溶液1(试剂号1009)、p21抗原溶液2(试剂号1010)、GAPDH抗原溶液1(试剂号1011)及GAPDH抗原溶液2(试剂号1012)。活性值的标准曲线是根据上述活性用校准器溶液(试剂号2011)的活性值测定结果绘制的。这些表达量和活性值的标准曲线被存储在控制器77的RAM91c中。根据以下公式计算CDK1活性比和CDK2活性比(步骤S35)。
CDK1活性比＝CDK1活性值/CDK1表达量
CDK2活性比＝CDK2活性值/CDK2表达量
按以下公式计算CDK1活性比和CDK2活性比之比(步骤S36)。
CDK1活性比与CDK2活性比之比＝CDK2活性比/CDK1活性比
在此，首先判断CDK2活性比是否超过第1临界值(步骤S37)，如果CDK2活性比高于第1个临界值则说明癌的复发机率很高。如果CDK2活性比低于第1临界值则看CDK1活性比与CDK2活性比之比是否超过第2临界值(步骤S38)，如果该比高于第2临界值则说明癌的复发机率高，若该比低于第2临界值则判断为癌的复发机率低。最后，显示决定复发机率大小的根据--CDK1表达量、CDK1活性值、CDK1活性比、CDK2表达量、CDK2活性值、CDK2活性比、CDK1活性比与CDK2活性比之比的同时，显示复发机率的诊断结果(步骤S39)。
在此，举例说明实际中用本试剂盒测定乳癌组织的表达量和活性值，判断复发机率的情况。本例根据从乳癌患者W、X、Y及Z4人身上分别采集的被检组织，用上述方法作出了复发机率的判断。关于4名乳癌患者的被检组织，病理医生的诊断结果(TMN分类、淋巴节转移的情况、癌组织的大小、术后5年的复发可能性及复发部位)如表8所示。4人全部为早期乳癌(LN为a)，被检组织经冷冻保存。
表中的“LN”表示手术时的淋巴转移状态，其中“a”表示所属淋巴节没有认定转移的部分，“b”表示所属淋巴节中认定转移到1～3个的部分，“c”则表示所属淋巴节中认定转移达到4个以上的部分。“T”则表示手术时原病灶的尺寸，肿瘤直径在2cm以下的用“a”、2cm～5cm的用“b”、5cm以上的用“c”表示。
针对4名乳癌患者的被检组织用所述试剂盒和组织性质诊断装置测定CDK1活性比和CDK2活性比，判断被检组织的复发机率。从乳癌患者W、X、Y及Z身上采集的被检组织的CDK1活性比与CDK2活性比之比分别如表8所示。首先预设第1临界值为10000，与CDK2活性比进行比较。比超过第1临界值(10000)的乳癌患者X的被检组织被诊断为癌症复发率高。接着，预设第2临界值为46，与CDK1活性比和CDK2活性比之比进行比较。比超过第2临界值(46)的乳癌患者Z的被检组织被诊断为癌症复发率高，比小于第2临界值的乳癌患者W和Y的被检组织被诊断为癌症的复发率低。结果如表8所示。
表8
患者 TMN LN T   CDK2活性比/CDK1活性比 复发机率 复发 复发部位
  W   阶段I    a    a   28.86    低    无    ...
  X   阶段I    a    a   CDK2活性比≥10000    高    有    肺
  Y   阶段IIA    a    b   2.33    低    无    ...
  Z   阶段IIA    a    b   148.68    高    有    皮肤
如表8所示，即使是被认为恶性度不高的早期乳癌从用所述试剂盒和组织性质诊断装置得出的测定结果看，患者X及Z被诊断为复发率高，实际上在手术后5年内复发了。另一方面，被诊断为复发率低的患者W及Y没有复发。
图23是图22所示诊断装置解析处理其他例的全流程图。在本例中，在步骤S40诊断紫杉类抗癌药的敏感性。本实施例所示的解析处理，从步骤S31到步骤S36与图21所示的解析处理是一样的。
在此，首先判断所述CDK2活性比是否高于第1临界值(步骤S40)，若CDK2活性比高于第1临界值则对抗癌药敏感性高，即判断抗癌药有效。若CDK2活性比低于第1临界值，则看所述CDK1活性比与CDK2活性比之比是否高于第3临界值(步骤S41)，若比高于第3临界值则判断对抗癌药敏感性高，若比低于第3临界值，则判断对抗癌药敏感性低。并且作为以上各判断根据的CDK1表达量、CDK1活性值、CDK1活性比、CDK2表达量、CDK2活性值、CDK2活性比、CDK1活性比与CDK2活性比之比将显示出来，同时，抗癌药的敏感性的判断结果也显示出来(步骤S42)。
在此，说明实际应用本试剂盒测定乳癌组织表达量和活性值、判断上述紫杉类抗癌药敏感性的具体实例：针对从乳癌患者O、P、Q身上采集的被检组织用上述方法判断紫杉类抗癌药敏感性。关于3名乳癌患者的被检组织，病理医生的诊断结果(TMN分类、淋巴节转移的状态、癌组织的大小、抗癌药疗效)如表9所示。3人都是进行性癌(LN为c或b)，所用被检组织是为生检采集的。
对于没有接受过抗癌药治疗的3名乳癌患者O、P、Q的被检组织，用试剂盒和组织性质诊断装置测定CDK1活性比和CDK2活性比，判断紫杉类抗癌敏感性。从乳癌患者O、P、Q身上采集的被检组织的CDK1活性比与CDK2活性比之比分别如表9所示。在此，首先与图21一样，先设第1临界值为10000，与CDK2活性比比较，比高于第1临界值(10000)的乳癌患者P及Q的被检组织被诊断为对抗癌药的敏感性高，即抗癌药有效。接着预设第3临界值为48，比较CDK1活性比与CDK2活性比之比，该比高于第3临界值(48)的乳癌患者O的被检组织也被诊断为对抗癌药敏感性高。结果见表9。另，表中“PR”(partial response)指可计测病变总和减少50％以上及没有出现新病变。
表9
患者 TMN LN T CDK2活性比/CDK1活性比 抗癌药敏感性 抗癌药疗效
O 阶段IIIB b c 302.56 高 PR
P 阶段IIIB c b CDK2活性比≥10000 高 PR
Q 阶段IIIB b c CDK2活性比≥10000 高 PR
如表9所示，诊断为抗癌药敏感性高的被检组织被认为抗癌药疗效显著。
(7)诊断结果的利用实例
图24显示出医生是如何利用图22中的步骤S39和图23中的步骤S42所表示的诊断结果的。
对于患者，用图像诊断乳癌的可能性，通过生检的病理组织诊断或细胞诊断确诊癌症。如果病理组织诊断的结果确诊为癌症早期，则实施癌组织摘除手术，对摘除的组织用诊断装置A诊断组织性质。若诊断装置A诊断组织性质的结果为癌症属低机率群(诊断装置A显示的诊断结果为“复发机率低”)，则医生会选择治疗方案1(荷尔蒙治疗药单独使用)，若结果为癌症属高机率群(诊断装置A显示的诊断结果为“复发机率高”)，则诊断对紫杉类抗癌药的敏感性。若属于使用紫杉类抗癌药有效的紫杉敏感性群体(诊断装置A显示的诊断结果为“抗癌药敏感性高”)的话，就选择治疗方案2(荷尔蒙药剂与紫杉类抗癌药合用)。如果诊断装置A显示的诊断结果为“抗癌药敏感性低”的话，就不能断言紫杉类药物有效，就要根据医生的判断选择治疗方案2(荷尔蒙药剂与紫杉类抗癌药合用)或治疗方案3(荷尔蒙药剂与紫杉以外的化学抗癌药合用)。
另外，如果在病理组织诊断中诊断为进行性癌，则考虑到患者的生活方式和保留乳房的要求及治疗费等情况，一般医生都会与患者研究是否进行术前化疗(摘除手术前的化学抗癌药治疗)。如果进行术前化疗，则用诊断装置A对在抗癌药(紫杉类)浸泡24小时的生检样品进行抗癌药敏感性诊断。若诊断装置A显示的诊断结果为“抗癌药敏感性高”则选择治疗方案2(荷尔蒙药剂与紫杉类抗癌药合用)。若诊断装置A显示的诊断结果为“抗癌药敏感性低”，就不能断言紫杉类药物有效，就要根据医生的判断选择治疗方案2(荷尔蒙药剂与紫杉类抗癌药合用)或治疗方案3(荷尔蒙药剂与紫杉以外的化学抗癌药合用)。以这种诊断结果为指针，可以适当进行术前化疗，用抗癌药将癌组织缩小后再摘除。
如果不进行化疗，就直接进行摘除手术，对摘除的癌组织用诊断装置A进行抗癌药敏感性诊断。若诊断装置A显示的诊断结果为“抗癌药敏感性高”，则选择治疗方案2(荷尔蒙药剂与紫杉类抗癌药合用)。若诊断装置A显示的诊断结果为“抗癌药敏感性低”，则不能断言紫杉类药物有效，就要根据医生的判断选择治疗方案2(荷尔蒙药剂与紫杉类抗癌药合用)或治疗方案3(荷尔蒙药剂与紫杉以外的化学抗癌药合用)。
图25显示了关于解析敏感性的其他流程。这一流程也是对紫杉类抗癌药的敏感性进行诊断，再比较CDK2活性比与临界值“400”(步骤S50)，CDK2活性比高于400，则诊断为敏感性高型I，若CDK2活性比不到400，则比较p21表达量与临界值“8”(步骤S51)。若P21表达量超过8，则诊断为敏感性低型III，若p21表达量不到8，则诊断为敏感性中型II。另外，在本实施例中，CDK2活性比及p21表达量的各临界值可根据预先收集的患者的数据等设定。
图26显示的是关于解析敏感性的其他的诊断结果。在这一结果中，根据周期素(Cyclin)E的表达量和CDK2的活性比诊断出CE(抗癌药)的敏感性。具体地说，通过将CDK2活性比与周期素E表达量之比与所定临界值比较，判断CE的敏感性。周期素E的表达量可以通过适当改变试剂与CDK1的表达量一样测定。
图27显示了关于解析敏感性的又一诊断结果。根据这一结果，通过将CDK1活性比与所定临界值比较诊断CMF(抗癌药)的敏感性。在这一结果中，患者No.1～16摘除手术后接受CMF药物治疗，没有发现癌症复发；患者No.17～25虽然也接受了CMF药物治疗，但癌症复发了。在这种情况下，若临界值设为“90”，则CDK1活性比高于90的8例(No.1、6、9、11～15)都没有复发，说明90这一临界值是合适的。诊断中使用了摘除后经冷冻保存的组织。
图28为图22所示解析处理的又一流程示意图。此流程所示的解析处理从步骤S31到步骤S36与图22的解析处理一样。此例所示解析处理中，在步骤S43判断步骤S2选择的模式是预后预测模式还是敏感性模式，如果是预后预测模式，则看所述CDK1活性比与CDK2活性比之比是否超过第4临界值(步骤S44)，若为敏感性模式，则看CDK2活性比是否超过第5临界值(步骤S46)。在步骤S44，如果CDK1活性比与CDK2活性比之比超过第4临界值，则诊断为复发机率高，如果CDK1活性比与CDK2活性比之比低于第4临界值，则诊断为复发机率低。而且，当诊断为复发机率高时，就要看是否实施敏感性模式(步骤S45)。具体地说，电脑12的显示器79上有实施敏感性模式还是只显示复发机率的诊断结果的选择键，接受操作者输入。在步骤S45，如果判断实施敏感性模式则处理进入到步骤S46，如果判断不实施敏感性模式(只显示复发机率的诊断结果)则处理进入到步骤S49。在步骤S46，CDK2活性比如果超过第5临界值，则诊断为敏感性高、即抗癌药有效，另一方面，若CDK2活性比小于第5临界值则进行p21表达量与第6临界值的比较(步骤S47)。
当p21表达量小于第6临界值时，诊断为敏感性低，而当p21表达量高于第6临界值时，进行CDK1活性比与第7临界值的比较(步骤S48)。如果CDK1活性比小于第7临界值，则诊断为敏感性略低，如果CDK1活性比高于第7临界值，则诊断为敏感性中等。
最后显示作为以上各判断根据的CDK1表达量、活性值、活性比、CDK2表达量、活性值、活性比、CDK1活性比与CDK2活性比之比以及p21表达量，同时根据所选择的模式，显示复发机率的诊断结果或敏感性的诊断结果(步骤S49)。
作为第4至第7临界值可使用国际申请第PCT/JP2005/009847号上记载的临界值以及日本专利申请第2005-158373号上记载的临界值。而且，作为第4临界值，最好使用与所述第1临界值相同的值。
图29为图28所示解析处理的其他实施例的流程图。根据这一流程，图17中的步骤S1不含接受模式选择的处理，在步骤S61进行复发机率诊断，只对复发机率高的检体实施抗癌药敏感性诊断(步骤S62)。其他步骤同图28。
在上述流程中，诊断装置A可以诊断复发机率和抗癌药的敏感性，但本发明并不仅限于此，只能进行某一项诊断的诊断装置也适用本试剂盒。

Claims (22)

1.一种用于诊断从患者身上采集的组织的性质的试剂盒，包括：
用于测定所述组织中周期素依赖性激酶的表达量的表达量测定试剂；及
用于测定所述组织中周期素依赖性激酶活性值的活性测定试剂；
所述表达量测定试剂和活性测定试剂中在第一保存条件下保存的试剂构成第一试剂组；
所述表达量测定试剂和活性测定试剂中在不同于第一保存条件的第二保存条件下保存的试剂构成第二试剂组。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述第一保存条件为冷藏保存，所述第二保存条件为冷冻保存。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其中：
所述第一试剂组包含被标记的周期素依赖性激酶抗体、固定周期素依赖性激酶抗体的载体、所述周期素依赖性激酶的基质、三磷酸腺苷；
所述第二试剂组包含能与三磷酸腺苷和所述基质在所述周期素依赖性激酶作用下反应生成的产物结合的标记物。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其中所述第一试剂组包括含有固定所述周期素依赖性激酶抗体的载体的柱。
5.如权利要求2～4中任一所述的试剂盒，其中所述第二试剂组包括已知浓度的周期素依赖性激酶。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其中所述试剂盒用于组织性质诊断装置，所述组织性质诊断装置测定所述组织中的周期素依赖性激酶表达量和活性值，并根据获得的周期素依赖性激酶表达量和活性值的数据诊断所述组织的性质。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其中所述组织性质诊断装置包括获取反映所述组织中周期素依赖性激酶表达量的第一数据的第一数据获取手段、获取反映所述组织中周期素依赖性激酶活性值的第二数据的第二数据获取手段以及根据所述第一数据和第二数据得出的值获取所述组织性质的有关信息的解析手段。
8.一种诊断从患者身上采集的组织的性质的试剂盒，包括：
用于测定所述组织中第一周期素依赖性激酶表达量的第一表达量测定试剂；
用于测定第一周期素依赖性激酶活性值的第一活性测定试剂；
用于测定第二周期素依赖性激酶表达量的第二表达量测定试剂；及
用于第二周期素依赖性激酶活性值的第二活性测定试剂；
所述表达量测定试剂和活性测定试剂中在第一保存条件下保存的试剂构成第一试剂组；
所述表达量测定试剂和活性测定试剂中在与第一保存条件不同的第二保存条件下保存的试剂构成第二试剂组。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其中所述第一保存条件为冷藏保存，所述第二保存条件为冷冻保存。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其中：
所述第一试剂组包含被第一标记物标记的第一周期素依赖性激酶抗体、被第二标记物标记的第二周期素依赖性激酶抗体、固定第一周期素依赖性激酶抗体的第一载体、固定第二周期素依赖性激酶抗体的第二载体、所述第一周期素依赖性激酶及第二周期素依赖性激酶的基质以及三磷酸腺苷；
所述第二试剂组包含能与三磷酸腺苷和所述基质在所述周期素依赖性激酶作用下反应生成的产物结合的第三标记物。
11.如权利要求10所述的试剂盒，其中所述第一试剂组包括含有所述第一载体的第一柱和含有所述第二载体的第二柱。
12.如权利要求9～11中任一所述的试剂盒，其中所述第二试剂组包含已知浓度的第一周期素依赖性激酶和已知浓度的第二周期素依赖性激酶。
13.如权利要求12所述的试剂盒，其中所述试剂盒用于组织性质诊断装置，所述组织性质诊断装置测定所述组织中的第一周期素依赖性激酶和第二周期素依赖性激酶的表达量和活性值，根据所得到的第一周期素依赖性激酶及第二周期素依赖性激酶表达量和活性值的数据，诊断哺乳动物组织的性质。
14.如权利要求13所述的试剂盒，其中所述组织性质诊断装置包括获取所述第一周期素依赖性激酶表达量的第一表达获取手段、获取所述第二周期素依赖性激酶表达量的第二表达获取手段、获取所述第一周期素依赖性激酶活性值的第一活性值获取手段、获取所述第二周期素依赖性激酶活性值的第二活性值获取手段以及根据所述第一表达量、第二表达量、第三活性值和第四活性值获取所述组织性质的有关信息的解析手段。
15.如权利要求2或9所述的试剂盒，其中所述第二试剂组含有已知浓度的蛋白质，该蛋白质被管家基因标记，所述第一试剂组含有所述蛋白质的已标记抗体。
16.如权利要求15所述的试剂盒，其中所述第二试剂组有已知浓度的含哺乳动物细胞的细胞质与核内蛋白质的溶液。
17.如权利要求16所述的试剂盒，其中所述第二试剂组配有组织增溶剂，用于增溶所述组织，配制组织液。
18.如权利要求17所述的试剂盒，其中所述第二试剂组含有已知浓度的周期素依赖性激酶抑制剂，所述第一试剂组含有所述周期素依赖性激酶抑制剂的抗体。
19.如权利要求18所述的试剂盒，其中所述第一试剂组有用于减低背景的含蛋白质试剂。
20.如权利要求19所述的试剂盒，其中所述组织的性质指组织中所含细胞的增殖能、细胞对抗癌药的敏感性或组织的恶性度。
21.如权利要求20所述的试剂盒，其中所述表达量测定试剂和活性测定试剂中在不同于第一和第二保存条件的第三保存条件下保存的试剂构成第三试剂组。
22.如权利要求21描述的试剂盒，其中所述第三保存条件是常温保存。
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C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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