CN1951962A - 用于制备抗肿瘤抗体的多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种可用于制备抗肿瘤抗体的多肽，以及编码该多肽的核苷酸序列。本发明还涉及通过使用该多肽免疫动物制备抗体的方法，也涉及通过使用这一方法制备的单克隆抗体在生产治疗各种相关肿瘤的各种生物制剂中的应用、或与其他种类药物的联合应用。

Description

用于制备抗肿瘤抗体的多肽及其应用

技术领域

本发明涉及一种可用于制备抗肿瘤抗体的多肽，以及编码该多肽的核苷酸序列。本发明还涉及通过使用该多肽免疫动物制备抗体的方法，也涉及通过使用这一方法制备的单克隆抗体在生产治疗各种相关肿瘤的各种生物制剂中的应用、或与其他种类药物的联合应用。确切的说，本发明涉及一种位于肿瘤细胞表面的膜蛋白及其胞外区的多肽序列，通过该多肽制备的单克隆抗体可以抑制该蛋白的功能，应用这种单克隆抗体作为治疗剂或一种含有该抗体的药物组合能够在体内抑制肿瘤的生长，达到治疗肿瘤的效果。

背景技术

肿瘤是人类最常见的疾病之一，其死亡率在世界和我国的各种疾病中分别排在第二位和第三位，严重影响着人类的健康。在我国随着社会的发展，肿瘤的发病率还在逐年上升。我国目前有癌症患者约450万人，死亡率在30％以上，而且每年新增的患者人数高达200万人以上。有效地医治癌症已是科学研究中的当务之急。临床治疗癌症的方法主要是手术切除和放、化疗，但是，放、化疗在杀死癌细胞的同时，给人体正常细胞也带来了严重的损伤。前治疗恶性肿瘤的手术，放疗，化疗三大常规治疗手段并没有明显的降低肿瘤的死亡率，其5年生存率仅达10-30％，因此全世界各国均在始终不懈的探索，力图寻找出更有效的治疗手段。随着对肿瘤研究的不断深入，人们开始尝试采用生物方法针对肿瘤发展进程中的不同层面进行治疗并且已经取得了令人欣喜的效果，肿瘤的生物靶向治疗必将成为最有前景和最活跃的领域。

癌症的靶向治疗很重要，“靶向”是癌症治疗中必须遵守的原则，高效、准确地命中癌症这个“靶”，实现有的放矢是癌症治疗的关键所在。因此，找到高效、特异的靶点是肿瘤生物靶向治疗的关键。蛋白质是生命活动的载体，临床上使用的各种药物中有80％是针对蛋白质的。当前，寻找肿瘤靶向治疗的靶点的研究主要集中在各种在肿瘤中异常表达的蛋白上。一般认为这种白蛋须具有以下一些特性：1)在肿瘤组织中特异表达。即该蛋白在肿瘤组织中表达明显高于正常组织；或该蛋白在肿瘤中的细胞学定位明显异于正常组织，而这一异常定位使得相关药物能较容易到达。2)该蛋白在肿瘤细胞中具有功能，药物与蛋白作用后能明显抑制肿瘤的临床进展，而对正常的组织没有明显的毒副作用。3)目前，在各种生物治疗手段中，最成功的是抗体类药物，由于抗体本身的特性，要求抗体靶向的靶点必须是膜蛋白。近年来，治疗肿瘤的抗体药物的研究开发取得了突破性进展。Rituxan是1997年第一个获FDA批准上市的抗肿瘤抗体药物，用于治疗B细胞性非何杰金淋巴瘤。Herceptin于1998年获批准，主要用于HER-2/neu阳性的乳腺癌。Mylotarg(2000)用于治疗急性复发性髓性白血病。近年来，先后获批准用于治疗肿瘤的抗体药物还有Campath-1H、Zevalin、Bexxer、Erbitux和Avastin等。目前，为数众多的治疗肿瘤的抗体药物正在进行临床前与临床研究。

目前，已经公开报道的抗体内药物针对的肿瘤治疗靶点主要有以下一些。它们或者参与了肿瘤的生长过程，或者在肿瘤的转、耐药性的诱导的过程中发挥作用。已经上市的抗体类药物的靶点包括：CD20，用于治疗B细胞性非何杰金淋巴瘤；Her2-neo，用于治疗乳腺癌和肺癌等；CD33，用于治疗急性复发性髓性白血病；CD52，B细胞性慢性淋巴细胞性白血病；EGRFR，用于治疗晚期直、结肠癌；VEGF，用于治疗治疗晚期结、直肠癌；CD25，用于治疗白血病；C017-1A，用于治疗结肠癌等。其他的抗体类药物的靶点还包括：CEA、CD22、GD2、EGFR、IGN-101、EGF、1D10、CD6、CD11a、huJ591、ACA-125等。(Grillo-LopezAJ.抗CD20的单抗：白血病的治疗的策略和结果.抗肿瘤治疗经验综述.2002；2：323-329；(Grillo-Lopez AJ.AntiCD20 mAbs：modifyingtherapeutic strategies and outcomes in the treatment of lymphomapatient s.Expert Rev Anticancer Ther.2002；2：323-329.)Stadtmauer EA.使用Mylotarg联合化疗的方法治疗急性髓性白血病.临床淋巴瘤.2002；2 suppl 1：S24-S28.(Stadtmauer EA.Trials withgemtuzumab ozogamicin(Mylotarg)combined with chemotherapyregimens in acute myeloid leukemia.Clin Lymphoma.2002；2 suppl1：S24-S28.)Pangalis GA，Dimopoulou MN，Angelopoulou MK，等.应用Campath-1H(抗CD52)单抗治疗淋巴细胞增生疾病.抗肿瘤医学.2001；18：99-107.(Pangalis GA，Dimopoulou MN，Angelopoulou MK，et al.Campath-1H(anti-CD52)monoclonal antibody therapy inlymphoproliferative disorders.Med Oncol.2001；18：99-107.)Leonard JP，Link BK.使用HLL2(epratuzumab，一种抗CD22单抗)和人1D10(apolizumab)治疗非何杰金氏淋巴瘤.抗肿瘤研究.2002；29(1 suppl 2)：81-86.(Leonard JP，Link BK.Immunotherapyof non-Hodgkin’s lymphoma with hLL2(epratuzumab，an anti-CD22monoclonal antibody)and Hu1D10(apolizumab).Semin Oncol.2002；29(1 suppl 2)：81-86.)Slamon DJ，Clark GM，Wong SG，等人乳腺癌的复发与预后与HER-2/neu癌基因扩增的相关性.科学.1987；235：177-182.(Slamon DJ，Clark GM，Wong SG，et al.Humanbreast cancer：correlation of relapse and survival withamplification of the HER-2/neu oncogene.Science.1987；235：177-182.)Mendelsohn J，Baselga J.EGF受体家族作为肿瘤靶向治疗的靶点.癌基因.2000；19：6550-6565.(The EGF receptorfamily as targets for cancer therapy.Oncogene.2000；19：6550-6565.)Rosen LS.应用血管生成抑制因子的临床经验：聚焦血管内皮细胞生长因子.肿瘤控制.2002；9(2 suppl)：36-44.(Rosen LS.Clinical experience with angiogenesis signalinginhibitors：focus on vascular endothelial growth factor(VEGF)blockers.Cancer Control.2002；9(2 suppl)：36-44.)SchwartzbergLS.Edrecolomab的临床经验：一种治疗结肠癌的单抗.抗肿瘤血液学的综述.2001；40：17-24.(Schwartzberg LS.Clinical experiencewith edrecolomab：a monoclonal antibody therapy for colorectalcarcinoma.Crit Rev Oncol Hematol.2001；40：17-24.)Foon KA，Lutzky J，Baral RN，等用抗独特型抗体模拟CD2抗原作为疫苗免疫进展性黑色素瘤的临床和免疫反应。临床抗肿瘤杂志.2000；18：376-384.(Foon KA，Lutzky J，Baral RN，et al.Clinicaland immune responses in advanced melanoma patients immunizedwith an anti-idiotype antibody mimicking disialoganglioside GD2.J Clin Oncol.2000；18：376-384.))

尽管已经有了几十种针对不同的蛋白靶点的抗肿瘤单抗药物，对临床的需要来说仍然是远远不够的，仍然需要发展更多的抗体类抗肿瘤药物。这主要是由于肿瘤发生发展是一个多因素，多基因突变的过程，仅仅一两种针对各别信号通路的抗体并不能阻止肿瘤的进展，而只能延缓这一过程；另外不同的肿瘤有不同的发病机理，需要有不同的治疗药物。

本发明公开的多肽是细胞膜蛋白derlin 1的胞外区。现有技术公开的治疗中显示derlin 1是位于细胞内质网膜上的蛋白，它参与了内质网内部错误折叠蛋白向胞浆中转运的过程(Yihong Yel，YokoShibatal，Chi Yun2，David Ron2 & Tom A.Rapoportl.一个参与介导蛋白从内质网到胞浆易位转运的膜蛋白复合物.自然.2004；(429)：841-847(Yihong Yel，Yoko Shibatal，Chi Yun2，David Ron2 & TomA.Rapoportl.A membrane protein complex mediatesretro-translocation from the ER lumen into the cytosol NATURE.2004；(429)：841-847))。由于位于内质网膜，是不能用来作为抗体治疗的靶点。而本发明人的研究表明derlin 1同时还位于肿瘤的细胞膜上，并且参与了肿瘤的生长过程。

发明内容

本发明的解决的第一个技术问题是在于提供一种新的能够用来制备抗肿瘤单克隆抗体的人肿瘤细胞抗原及其多肽序列，该抗原是位于人肿瘤细胞膜上的蛋白Derlin 1的胞外区部分。

本发明要解决的另一个技术问题在于提供一种制备抗瘤单克隆抗体的方法，通过这一方法制备的抗体可以在体内与抗原结合，抑制肿瘤细胞的生长。

本发明要解决的再一个技术问题在于提供本发明抗体或含有该抗体的药物组合物，该药物组合物能够在人肿瘤治疗中应用。

由此可见，本发明提供一种具有序列号1所示的氨基酸序列的多肽。所述的多肽是人肿瘤细胞抗原。所述的多肽是化学合成的多肽。所述的多肽，作为抗原位于肿瘤细胞的靶外区，其具有免疫原性。其特征在于该抗原位于肿瘤细胞膜外。

本发明还提供一种以具有序列号1所示的氨基酸序列的多肽制得的单克隆抗体。该单克隆抗体是抗肿瘤抗体。该单克隆抗体可以是小鼠单克隆抗体。

本发明还提供含有如序列号1所述的氨基酸序列的蛋白或者融合蛋白。

本发明还提供一种制备单克隆抗体的方法，包括使用本发明的多肽免疫动物制备单克隆抗体。

本发明进一步提供一种由所述的单克隆抗体衍生而来的抗体衍生物，该衍生物为核素-抗体偶联物、化学药物-抗体偶联物、毒素-抗体偶联物、前体药物酶-抗体偶联物、纳米颗粒-抗体偶联物。

本发明还提供所述的抗体在制备治疗肿瘤及抑制肿瘤复发、转移的药物中的应用。

本发明再提供一种药物组合物，其特征在于包括本发明的单克隆抗体或者本发明的抗体衍生物的肿瘤化疗药物。

换言之，根据本发明的第一个方面，本发明提供了一种新的人肿瘤细胞抗原及其多肽序列，所述抗原多肽具有以下氨基酸残基序列：(序列号1)

H2N-Arg-His-Asn-Trp-Gly-Gln-Gly-Phe-Arg-Leu-Gly-Asp-Gln-COOH

包含该抗原的蛋白Derlin 1在肿瘤细胞的细胞膜表达，抑制该抗原的功能就能够抑制肿瘤细胞在体内的生长。因此，该抗原可作为抗人肿瘤免疫导向治疗的靶位。

本发明还涉及一种编码如上述抗原的氨基酸残基序列的DNA序列。

在本发明中，所述的抗原是指包含上述氨基酸残基序列的任何蛋白质或融合蛋白质；编码该抗原的DNA是指任何根据公认的三联密码子翻译后编码含有上述氨基酸残基序列。

本发明所述的抗原是通过使用Derlin 1蛋白的多克隆抗体作免疫组织化学和免疫细胞荧光时发现该蛋白表达于肿瘤细胞膜上，对该蛋白的跨细胞膜折叠模型进行分析后得出：该含有上述氨基酸序列的抗原位于细胞的靶外区，并具有免疫原性。而现有技术中均未标明该抗原位于细胞膜外。

本发明第二个方面涉及一种制备抗肿瘤的单克隆抗体的方法。

根据本发明提供的新的抗肿瘤抗原，采用本领域技术人员公知的方法和技术很容易获得其相应的单克隆抗体及衍生物。采用该抗原免疫小鼠，在检测鼠血清中相应的特异抗体的含量后，处死动物获得脾细胞，经过与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，再经抗原特异性试验筛选，即可获得鼠单克隆抗体。将鼠单克隆抗体的可变区基因克隆，并与相应的人恒定区正确连接后，再次克隆入真核表达载体并导入真核细胞表达，即可获得人-鼠嵌合抗体。采用该抗原筛选人噬菌体抗体库，或采用人外周血单核细胞嵌合小鼠技术，可获得相应的全人抗体。

根据本发明的第三方面，本发明还提供了所述的抗体或衍生物在制备的药物或含有该抗体的药物组合在治疗人肿瘤中的应用。

该肿瘤抗原的相应抗体或其衍生物可以用来免疫导向治疗肿瘤。根据本领域技术人员公知的原理可以推断任何人类肿瘤，只要在此类肿瘤细胞膜上表达该蛋白，即该肿瘤抗原存在于肿瘤细胞膜上，就可以使用该肿瘤抗原的相应抗体或其衍生物进行免疫导向治疗。该抗体或其衍生物可以直接通过各种方式注入患者的体内，与位于肿瘤细胞表面的抗原，抑制肿瘤的生长。标记有核素或化疗药物的抗体可以将核素或化学药物带到肺癌组织局部，从而减少核素或化疗药物的毒性，大大增加它们杀伤肺癌细胞的作用。纳米磁性颗粒偶联的抗体将纳米磁性颗粒浓聚于肺癌病灶局部，高频交变磁场的作用下发热，杀伤周围的癌细胞，起到治疗癌症的目的。将该抗原相应抗体与效应分子融合，如毒素PE40，可以将效应分子浓聚于癌病灶，使效应分子最大程度地发挥作用，起到治疗人肿瘤的作用。

总之，利用本发明提供的前述人肿瘤抗原相应抗体，就可以方便地生产目前已知的各种衍生物用于肿瘤的治疗。

附图说明

图1是采用新的人肿瘤抗原相应抗体与核素¹³¹I的偶联物体内诊断结肠癌时肿瘤显像的图像。

它是标记¹³¹I的新的人肿瘤抗原相应单克隆抗体静脉注射荷人结肠癌裸小鼠后168小时肿瘤显像的图像，图中箭头所指红色区域表示肿瘤所在的位置。

具体实施方式

下面将参照附图结合实施例详细说明本发明所涉及的发明主题以及应用本发明中的新肿瘤抗原、其相应抗体以及各种衍生物来实施肿瘤的治疗等具体实施方式。

实施例1：

新的人肿瘤抗原的制备

按照现有技术，根据人工合成技术，将本发明所述的抗原的氨基酸序列来进行相应的多肽合成。(或者委托合成机构来完成)按要求获得一定质量的抗原多肽。同时可将合成的多肽偶联到钥孔嘁血蓝蛋白上以便将来制备抗体

得到的氨基酸序列如下：(序列号1)

H2N-Arg-His-Asn-Trp-Gly-Gln-Gly-Phe-Arg-Leu-Gly-Asp-Gln-COOH

实施例2：

新的人肿瘤抗原相应单克隆抗体的制备

(一)单克隆抗体

采用实施例1得到100μg人肿瘤抗原多肽偶联钥孔嘁血蓝蛋白形成的抗原蛋白，混合完全福氏佐剂皮下免疫BALB/C小鼠，4周后采用50μg抗原蛋白混合完全福氏佐剂腹腔加强免疫，4周后再次采用50μg抗原蛋白混合完全福氏佐剂腹腔加强免疫，总共3次加强免疫，10天后采血测效价，发现效价＞1∶10⁶，处死动物，收集脾组织，使其通过100目的筛网分离为单细胞。采用50％的PEG促融合法将500万脾细胞与100万SP2/0细胞融合，融合后采用HAT培养基进行筛选培养。培养1周后采用人肿瘤抗原蛋白包被的ELISA进行筛选，阳性克隆连续进行亚克隆，筛选稳定分泌特异抗体的克隆，获得抗新的人肿瘤抗原的鼠单克隆抗体。也可以通过类似的步骤获得兔单克隆抗体。

实施例3：

新的人肺癌抗原相应抗体衍生物的制备

(一)核素-抗体偶联物

(1)¹⁸⁸Re标记新的人肿瘤抗原相应鼠单抗

SnCl₂直接还原法标记抗体，立即快速薄层层析(ITLC)测定抗体的标记效率及放化纯度。标记后，ITLC实验表明：¹⁸⁸Re-抗体标记率为90％，放化纯度大于95％。¹⁸⁸Re-抗体比活为356MBq/mg。ELISA测得¹⁸⁸Re-抗体免疫活性为65％。标记抗体的体外稳定性实验表明，抗体在37℃孵育24hr，无论是在生理盐水还是人血清白蛋白中，放射性脱落都小于5％，示其在体外稳定。

(2)¹³¹I标记新的人肿瘤抗原相应鼠单抗

氯胺T法标记抗体，立即快速薄层层析(ITLC)测定抗体的标记效率及放化纯度。标记后，ITLC实验表明¹³¹I-抗体标记率为90％，放化纯度大于95％。¹³¹I-抗体比活为74MBq/mg，ELISA测得¹³¹I-抗体免疫活性67.3％。

(二)纳米磁性颗粒-抗体偶联物

以纯水将直径约20-50nm的铁氧化物磁性颗粒超声分散，形成胶体状。按0.2g纳米磁性颗粒加入16mg抗体的比例加入溶于纯水的抗体，迅速搅拌混合，5min后加入终浓度为1％的BSA，离心并采用1％的BSA洗涤后备用。

实施例4：

采用实施例2得到的人肿瘤抗原相应抗体对肿瘤进行治疗，以结肠癌为例。

取荷人结肠癌裸小鼠24只，测量并计算肿瘤体积后，按肿瘤体积随机分为3组，每组8只。第一组为PBS对照组，每只腹腔注射200μlPBS；第二组为正常鼠IgG对照组，每只腹腔注射0.2mg正常鼠IgG；第三组为新肿瘤抗原相应单克隆抗体治疗组，每只腹腔注射实施例1得到的0.2mg肿瘤抗原相应单克隆抗体。每两天给药一次，治疗后10次后，处死动物，分离肿瘤，称取肿瘤重量，计算抑瘤率，抑瘤率＝(对照组瘤重量-治疗组瘤重量)/对照组瘤重量×100％。显著性检验采用t检验。

结果PBS组瘤重0.86±0.4g，正常鼠IgG对照组0.83±0.37g，新肿瘤抗原相应单克隆抗体治疗组0.36±0.15g，新肿瘤抗原相应单克隆抗体的抑瘤率为58.9％，P值小于0.01。这些结果显示新肿瘤抗原相应单克隆抗体在免疫导向治疗结肠癌中有重要的应用价值。

实施例5：

采用新的人肿瘤抗原相应抗体衍生物体内导向治疗肿瘤，以结肠癌为例。

取荷人结肠癌裸小鼠24只，测量并计算肿瘤体积后，按肿瘤体积随机分为3组，每组8只。第一组为PBS对照组，每只腹腔注射200μlPBS；第二组为正常鼠IgG对照组，每只腹腔注射9.25MBq(200μl)¹³¹I-正常鼠IgG；第三组为偶联¹³¹I的新肿瘤抗原相应单克隆抗体治疗组，每只腹腔注射9.25MBq(200μl)¹³¹I-抗体。治疗后10天，处死动物，分离肿瘤，称取肿瘤重量，计算抑瘤率，抑瘤率＝(对照组瘤重量-治疗组瘤重量)/对照组瘤重量×100％。显著性检验采用t检验。

结果PBS瘤重0.76±0.5g，人IgG对照组0.72±0.47g，标记抗体治疗组0.21±0.17g，标记抗体的抑瘤率为72.4％，P值小于0.01。这些结果显示新肿瘤抗原相应单克隆抗体偶联核素在免疫导向治疗结肠癌中有重要的应用价值。

Claims (13)

1、具有如序列号1所示的氨基酸序列的多肽。

2、含有如序列号1所述的氨基酸序列的蛋白或者融合蛋白。

3、根据权利要求1或2所述的多肽，其特征在于所述的多肽是人肿瘤细胞抗原。

4、根据权利要求1或2所述的多肽，作为抗原位于肿瘤细胞的靶外区，其具有免疫原性。其特征在于该抗原位于肿瘤细胞膜外。

5、根据权利要求1或2所述的多肽，其特征在于所述的多肽是化学合成的多肽。

6、一种以权利要求1所述的多肽制得的单克隆抗体。

7、根据权利要求6所述的单克隆抗体，其特征在于该单克隆抗体是抗肿瘤抗体。

8、根据权利要求6所述的单克隆抗体，其特征在于所述的肿瘤是结肠癌或者肺癌。

9、根据权利要求6所述的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体是小鼠单克隆抗体。

10、一种制备单克隆抗体的方法，包括使用如权利要求1所述的多肽免疫动物制备单克隆抗体。

11、一种由如权利要求6所述的单克隆抗体衍生而来的抗体衍生物，其特征在于所述的衍生物为核素-抗体偶联物、化学药物-抗体偶联物、毒素-抗体偶联物、前体药物酶-抗体偶联物、纳米颗粒-抗体偶联物。

12、如权利要求6所述的抗体在制备治疗肿瘤及抑制肿瘤复发、转移的药物中的应用。

13、一种药物组合物，其特征在于包括如权利要求6的单克隆抗体或者如权利要求11所述的抗体衍生物的肿瘤化疗药物。

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