CN1934143A - 丙酸封端聚合物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了含丙酸端基的聚合物的制备方法。该方法首先涉及在催化剂存在条件下，使含有至少一个羟基的水溶性非肽类聚合物与丙烯酸叔烷基酯发生反应，以形成该聚合物的丙酸酯，其中该聚合物的重均分子量至少为约10,000Da；然后再用强酸处理该聚合物的丙酸酯，以形成该聚合物的丙酸。

Description

丙酸封端聚合物的制备方法
技术领域
本发明涉及含取代或未取代丙酸官能团的水溶性非肽类聚合物，尤其是丙酸封端聚乙二醇类聚合物的制备方法。
背景技术
用亲电子基活化的聚乙二醇(PEG)衍生物可用于与生物活性分子(如蛋白)的氨基连接。尤其是，PEG羧酸衍生物的活性酯业已用于将PEG与含氨基蛋白连接。
美国第5,672,662号专利公开了含有链端丙酸部分或链端丁酸部分的PEG衍生物。该衍生物可用于制备适合与蛋白或其它含氨基分子发生结合的活性酯。该专利所述的用丙酸取代的PEG的合成方法涉及聚乙二醇与丙烯腈的迈克尔加成反应(Michael addition)，随后再进行腈的水解以形成羧基。腈水解所需的反应条件很苛刻，例如需用浓硫酸在95℃或更高温度下处理。PEG的醚键对这样的条件很敏感，故此过程可导致严重的链断裂和产率下降，尤其是当涉及分子量较高的聚合物如分子量高于约10,000的聚合物时。
授予Sanders等人的美国第5,523,479号专利公开了在催化剂如氢氧化钾存在的条件下，使分子量为32至6,000Da的醇与α，β-不饱和羧酸的叔烷基酯发生反应，然后再进行酸性水解以制备醚羧酸的方法。Sanders等人的这一专利未涉及使用分子量较高的聚合物试剂，例如分子量为约10,000Da或更高的PEG聚合物。
本技术领域需要某些替代性方法，用于以高产率制备丙酸封端聚合物，尤其是高分子量聚合物，而不必采用可导致聚合物主链(如在聚合物主链末端的甲氧基处)发生链断裂的苛刻反应条件。
发明内容
本方法避免了作为丙酸封端聚合物常规生产方法的特征的苛刻水解条件。相反，本发明的方法首先涉及丙烯酸叔烷基酯与至少以一个羟基实现官能化的聚合物之间的迈克尔加成反应，然后采用相对较温和的条件，例如用三氟乙酸于约50℃温度进行处理，从链端的酯上脱除叔烷基而形成羧基。
在本发明的一个方面，提供了至少以一个丙酸基实现官能化的水溶性非肽类聚合物的制备方法，该方法包括：
i)在催化剂存在的条件下，使含至少一个羟基的水溶性非肽类聚合物与丙烯酸叔烷基酯或取代的丙烯酸叔烷基酯发生反应，以形成该聚合物的取代的或未取代的丙酸酯，其中该聚合物的重均(或数均)分子量至少为约10,000Da；以及
ii)用强酸，例如三氟乙酸、三氟甲磺酸、甲酸、盐酸，或对甲苯磺酸，处理该聚合物的取代的或未取代的丙酸酯，以形成该聚合物的丙酸或取代丙酸。
该丙烯酸叔烷基酯可以是α-位或β-位取代的，示例性的取代基包括卤原子、羟基、硫羟基、烷硫基、酰基、酰氧基、硝基、氰基、叠氮基、三卤代甲基、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、取代的芳基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基以及取代的杂芳基。在一项优选的实施方案中，该丙烯酸叔烷基酯是以甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基或苯基在α-位或β-位取代的，优选在α-位取代。该丙烯酸叔烷基酯中优选的叔烷基包括叔丁基、叔戊基、α，α′-二甲基苯基、三苯甲基、1-金刚烷基、以及2-甲基-2-金刚烷基。
在一项或多项实施方案中，该丙烯酸叔烷基酯具有以下结构：
(结构式I)
其中：
R1和R2各自独立地选自下列基团：氢、卤原子、羟基、硫羟基、烷硫基、酰基、酰氧基、硝基、氰基、叠氮基、三卤代甲基、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、取代的芳基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基和取代的杂芳基；以及
R3-R5(即R3、R4和R5中的每一个)各自独立地是烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基。
优选，R3、R4和R5分别是甲基、乙基，或苯基；R1和R2都是氢，或者R1是氢且R2是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基，或苄基。
用于迈克尔加成反应的催化剂优选是氢氧化季铵，例如四烷基卤化铵或四烷基氢氧化铵(例如四甲基氢氧化铵、四乙基氢氧化铵、四丙基氢氧化铵，或四丁基氢氧化铵，及其对应的卤化物)。在一项或多项实施方案中，氢氧化季铵具有以下结构：
Figure A20058000899400082
(结构式II)
其中每个R各自独立地是烷基或取代的烷基(例如C1-C8烷基)。此外，-OH抗衡离子可被卤原子取代，其中卤原子表示氟、氯、溴和碘。
反应步骤i)和处理步骤ii)均可在有机溶液存在的条件下进行，有机溶剂为例如二氯甲烷(DCM)、四氢呋喃(THF)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、乙腈、甲苯、苯、二甲苯、苯乙腈、硝基苯、四氯乙烯、苯甲醚、氯苯以及叔丁醇。
含有至少一个羟基的聚合物优选是聚乙二醇，但也可以是任何其它水溶性非肽类聚合物，例如其它聚烷撑二醇、聚烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚羟烷基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸羟烷基酯、多糖、聚α-羟基乙酸、聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚磷腈、聚_唑啉、聚N-丙烯酰吗啉，以及二元共聚物或三元共聚物。优选该聚合物的重均(或数均)分子量为约10,000至约100,000Da，更优选是约10,000至约40,000Da。
PEG聚合物或其它聚合物可以具有各种不同结构和几何构型中的任何一种，例如单官能PEG、双官能PEG和支化PEG。
在形成羧酸基以后，该丙酸官能化聚合物可衍生为酸的衍生物，例如酰卤、酰拟卤(pseudohalide)、酯、酐、酰胺、酰亚胺，或酰肼。此外，该酸或某些官能化聚合物，例如活性酯，可作为中间体与适宜的试剂或其它小分子或短链聚合物反应，以形成其它反应性衍生物，例如马来酰亚胺、硫醇类、反应性二硫化物、缩醛、醛等等。在一项实施方案中，丙酸官能化聚合物衍生为活性酯。典型的活性酯基包括N-羟基琥珀酰亚胺酯、邻、间或对硝基苯酯、1-羟基苯并三唑基酯、咪唑基酯，以及N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯。
在本发明的一项优选实施方案中，被至少一个丙酸基官能化的聚乙二醇(PEG)聚合物的制备方法包括以下步骤：
i)在氢氧化季铵存在的条件下，使PEG聚合物与丙烯酸叔烷基酯或取代的丙烯酸叔烷基酯反应，以形成PEG的丙酸酯或取代的丙酸酯，其中该PEG聚合物是单官能PEG、双官能PEG或支化PEG分子，含有1至约25个羟基且其数均分子量至少为约10,000Da；
ii)用强酸处理该PEG的丙酸酯或取代的丙酸酯，强酸为例如三氟乙酸、三氟甲磺酸、甲酸、盐酸或对甲苯磺酸，以形成以至少一个丙酸基或取代丙酸基实现官能化的PEG类聚合物；
iii)任选地，以色谱法纯化上述被至少一个丙酸基官能化的PEG聚合物；
iv)任选地，使上述以丙酸或取代丙酸实现官能化的PEG衍生为活性酯，例如，选自N-羟基琥珀酰亚胺酯，邻、间、或对硝基苯酯、1-羟基苯并三唑基酯、咪唑基酯以及N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯的活性酯；以及
v)任选地，以色谱法纯化该PEG的活性酯。
发明的详述
以下将对本发明更充分地加以说明。但是，本发明可以许多不同形式加以实施，不应被解释为局限于本文所述的各项实施方案；相反，提供这些实施方案正是为了使本公开书更加彻底和完整，并向本技术领域的技术人员充分地表明本发明的范围。
I.定义
在详细叙述本发明之前，应该理解，本发明不限于特定的聚合物、合成技术、活性剂，等等，因为这些都可以改变。还应该理解，本文所用的专门术语只是为了叙述特定的实施方案，而不是为了加以限制。
必须指出，如本说明书中所述，单数形式的“一(a)”、“一个(an)”和“该”包括复数形式，除非上下文中另行明确说明。例如，“聚合物”的提法包括单一聚合物以及两种或两种以上相同或不同的聚合物，“结合物(conjugate)”的提法是指单一结合物以及两种或两种以上相同或不同的结合物，“赋形剂”的提法包括单一赋形剂以及两种或两种以上相同或不同的赋形剂，以此类推。
在叙述本发明和权利要求范围时，将按照下述定义使用以下术语。
本文所用的“PEG”或“聚乙二醇”意为包括任何水溶性聚(环氧乙烷)。通常，用于本发明的PEG将含有以下两种结构之一：“-O(CH2CH2O)m-”或“-CH2CHO(CH2CH2O)m-CH2CH2-”，其中m为3至3000，其端基乃至整个PEG的结构都可以变化。“PEG”意为“-CH2CH2O-”亚单位占大多数(即多于50％)的聚合物。一种常用的PEG是封端PEG。当PEG被定义为“-O(CH2CH2O)m-”时，其封端基团一般是含碳的基团，通常含有1-20个碳原子，优选烷基(如甲基、乙基或苄基)，虽然也可以考虑其饱和及不饱和的形式，以及芳基、杂芳基、环基、杂环基，包括任何这些基团的取代形式。当PEG被定义为“-CH2CH2O(CH2CH2O)m-CH2CH2-”时，其封端基团一般是含碳的基团，通常含有1-20个碳原子，以及与该基团以共价键连接、并可以共价键与该PEG的一个端基连接的氧原子。在这种情况下，该基团通常是烷氧基(如甲氧基、乙氧基或苄氧基)，而且该含碳基团可以任选是饱和及不饱和的形式，以及芳基、杂芳基、环基、杂环基，包括任何这些基团的取代形式。当PEG被定义为“-CH2CH2O(CH2CH2O)m-CH2CH2-”时，另一个(“未封端的”)端基通常是羟基、胺基或可进一步进行化学改性的活化基团。此外，该封端基团还可以是硅烷基。用于本发明的具体的PEG形式包括具有不同分子量、结构或几何构型的PEG(例如支化的、线型的、分叉的PEG、多官能的，等等)，将在下文中详细叙述。
有利地是，该封端基团还可含有可检测的标记物。当聚合物具有含可检测标记物的封端基团时，聚合物的量或位置和/或与该聚合物连接的部分(例如活性剂)，可使用适当的检测器来测定。这类标记物包括但不限于荧光剂、化学发光剂、用于酶标记中的基团，比色剂(例如染料)、金属离子、放射性部分等。
就本发明的水溶性非肽类聚合物例如PEG而论，“分子质量”是指聚合物的重均分子量，通常是以体积排阻色谱法、光散射技术或在有机溶剂如1，2，4-三氯苯中以固有粘度测定法测定的。本发明的聚合物通常是多分散性的，具有低于约1.05的较低的多分散性值。
“活化羧酸”意为比其母体羧酸更具反应性的羧酸功能衍生物，尤其是在亲核的酰基取代方面。活化羧酸包括但不限于酰基卤(例如酰氯)、酐、酰胺以及酯。
“反应性”或“活性”这一术语，当与某种特定的官能团一起使用时，是指易与另一分子的亲电子体或亲核体发生反应的反应性官能团。这与那些需要强催化剂或非常不切实际的反应条件才能发生反应的基团(即“非反应性”或“惰性”基团)的意思恰恰相反。
术语“被保护基团”或“保护基”或“保护性基团”是指某部分(即保护基)的存在，它能在某些反应条件下，防止或阻断分子中特定的化学反应性官能团发生反应。取决于被保护化学反应性基团的类型、所使用的反应条件以及分子中是否存在其它反应基或保护基，保护基将随之改变。关于本技术领域内已知的保护基可参阅Greene，T.W.，et al.，PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS，3rd ed.，John Wiley & Sons，New York，NY(1999)。
本文所用的“官能团”这一术语或其任何同义词均意为包括其被保护的形式。
本文所用的“间隔基”或“间隔部分”这一术语是指任选地用于将互连部分(例如水溶聚合物部分的端基和一个亲电子体)连接的原子或原子集合。本发明的间隔部分可以是具有水解稳定性的基团，或可含有在生理条件下可水解的或可酶促降解的键。
“烷基”是指通常长度为约1至20个原子的烃链。这样的烃链优选但并非必须是饱和的，而且可以是支链或直链，但通常直链是优选的。典型的烷基包括乙基、丙基、丁基、戊基、2-甲基丁基、2-甲基丙基(异丁基)、3-甲基戊基等等。当提及3个或更多的碳原子时，本文中所用的“烷基”包括环烷基或环烯基。
“低级烷基”是指含有1至6个碳原子的烷基，且可以是直链或支链，其例子有甲基、乙基、正丁基、异丁基和叔丁基。
“环烷基”是指饱和或不饱和的环状烃链，包括桥接的、稠合的或螺环化合物，优选含有3至约12个碳原子，更优选含有3至约8个碳原子。
本文中所用的“烯基”是指长度为1至15个原子、支化或非支化的、含有至少一个双键的烃基，例如乙烯基、正丙烯基、异丙烯基、正丁烯基、异丁烯基、辛烯基、癸烯基、十四烯基等等。
本文中所用的“炔基”这一术语是指长度为2至15个原子、支化或非支化的、含有至少一个三键的烃基，例如乙炔基、正丙炔基、异丙炔基、异戊炔基、正丁炔基，辛炔基、癸炔基等等。
“烷氧基”是指-O-R基，其中R是烷基或取代的烷基，优选C1-C20烷基(例如甲基、乙基、丙基、苄基等)，优选C1-C8。
“非干扰性取代基”是指分子中存在的通常不与该分子内所含的其它官能团反应的那些基团。
如在“取代的烷基”中所用的“取代的”这一术语，是指被一个或多个非干扰性取代基取代的部分(例如烷基)，包括但不限于：C3-C8环烷基，如环丙基、环丁基等；卤原子，如氟、氯、溴和碘；氰基；烷氧基；苯基；取代的苯基等。
“芳基”意为一种或多种芳环，每个含有5个或6个环碳原子。芳基包括可稠合的多个芳环，如萘基；或未稠合的多个芳环，如联苯基。芳环也可含有一个或多个稠合或未稠合的环烃、杂芳基，或杂环。本文中所用的“芳基”包括杂芳基。
“取代的芳基”是指含有一个或多个非干扰性取代基的芳基。对于苯环上的多个取代基而言，各取代基可在任意位置(即邻位、间位或对位)。
“杂环”或“杂环的”意为一种或多种含5-12个原子、优选含5-7个原子的环，具有或不具有不饱和或芳香的特点，并含有至少一个非碳的环原子。优选的杂原子包括硫、氧和氮。
“取代的杂环”是含有一个或多个由非干扰性取代基形成的侧链上的杂环。
“杂芳基”是含有1至4个杂原子、优选是N、O或S原子或其组合的芳基。杂芳基环也可与一个或多个环烃、杂环、芳基或杂芳基环稠合。
“取代的杂芳基”是含有一个或多个非干扰性取代基的杂芳基。
“亲电子体”是指含亲电子中心的离子或原子，或由多个原子组成的中性或离子性集合，即寻求亲电体或能与亲核体起反应的中心。
“亲核体”是指含亲核中心的离子或原子，或由多个原子组成的中性或离子性集合，即寻求亲电子中心或能与亲电子体起反应的中心。
“在生理条件下可解离的”或“可水解的”或“可降解的”键是一种相对较弱且在生理条件下能与水反应(即水解)的键。键在水中发生水解的倾向将不仅取决于连接两个中心原子的键的一般类型，还取决于与这些中心原子连接的取代基。适宜的不稳定而易水解的键或弱键包括但不限于：羧酸酯、磷酸酯、酸酐、缩醛、缩酮、酰氧烷基醚、亚胺、原酸酯以及低聚核苷酸。
“可酶促降解的键”意为可被一种或多种酶降解的键。
“稳定而不易水解的”键合或键是指一种化学键，通常是一种共价键。它在水中基本上是稳定的，即在生理条件下在一段延长时间内不会水解至任何可察觉的程度。稳定而不易水解的键的例子包括但不限于：碳-碳键(例如在脂肪烃链中)、醚、酰胺、氨基甲酸酯等。通常，稳定而不易水解的键在生理条件下的水解率按每天计低于约1-2％。典型化学键的水解率可在大多数标准的化学教科书中查到。
“药学上可接受的赋形剂”或“药学上可接受的载体”是指可包含在本发明的组合物中，且不会对患者产生显著不良毒理学效应的赋形剂。
“药理有效量”、“生理有效量”以及“疗效量”在本文中互换使用，是指为了在血流或靶组织内提供理想水平的活性剂和/或结合物，医药制剂内所需的PEG-活性剂结合物的含量。确切的量将取决于许多因素，例如具体的活性剂、医药制剂的组分和物理特性、目标患者群、患者自己的考虑等，并可由本技术领域的技术人员根据本文及有关文献中所提供的信息来决定。
就本发明的聚合物而言，“多官能团的”意为含有3个或3个以上官能团的聚合物，这些官能团可相同或不同。本发明的多官能团聚合物在其主链上通常含有约3-100个官能团，或3-50个官能团，或3-25个官能团，或3-15个官能团，或3-10个官能团，或含有3、4、5、6、7、8、9或10个官能团。
“双官能团的”聚合物意为含有两个官能团的聚合物，它们可为相同(即均双官能团的)或不同(即杂双官能团的)。
本文中所述的碱性或酸性反应剂包括中性、带电的反应剂，及其任何对应的盐。
“患者”这一术语是指活有机体，包括人和动物。该活有机体患有或易患可通过给用某种结合物来预防或治疗的某种疾病。
“任选的”和“任选地”意为随后所述的情况也许发生或也许不发生，因此该术语包括所述情况将发生的场合以及所述情况将不发生的场合。
除非另行说明，本文中分子量以数均分子量(Mn)表达，其定义为
Figure A20058000899400161
式中Ni是分子量为Mi的聚合物分子的数目(或那些分子的摩尔数)。
如本文中所用，“非肽类”是指基本上不含肽键的聚合物主链。但是，聚合物主链也可包括沿主链长度间隔分布的少量肽键，例如，每约50个单体单元含不超过约1个肽键。
II.制备丙酸官能化聚合物的方法
本发明的方法提供了形成水溶性非肽类聚合物的合成路线，该聚合物以至少一个丙酸基实现官能化。该方法涉及使含至少一个羟基的聚合物(如单官能团、双官能团或多官能团PEG分子)与丙烯酸叔烷基酯试剂发生迈克尔加成反应，生成被至少一个丙酸叔烷基酯取代的聚合物。然后，该酯在比腈基水解条件相对温和的条件下水解。本发明的方法中所采用的水解条件不会造成使产率降低的聚合物主链的降解和断链，从而使这种方法尤其适合于分子量较高的聚合物，例如分子量为大于约10,000Da的聚合物。
在一项优选的实施方案中，使用催化剂来促进迈克尔加成反应。催化剂的选择对于分子量较高的聚合物起始材料尤为重要，因为本技术领域内有某些催化剂不能在任何明显的程度上促进迈克尔加成反应，如比较例1所示。优选的催化剂含有氢氧化季铵。典型的氢氧化季铵包括四甲基氢氧化铵、四乙基氢氧化铵、四丙基氢氧化铵和四丁基氢氧化铵。氢氧化季铵可直接使用，或从相应的季铵盐(优选卤化季胺盐)原地配制。如果使用卤化季铵盐，则必须加入KOH或NaOH等碱金属或碱土金属氢氧化物来活化该铵盐，如实施例1和实施例3所示。可将该催化剂与反应试剂溶于相同的有机溶剂，或以水溶液的形式加入。
在一项实施方案中，氢氧化季铵具有以下结构：
(结构式II)
其中，每个R各自独立地是烷基或取代烷基，优选是取代或非取代的C1-8烷基。
叔烷基酯基团的水解可通过以任何强酸处理来实现，例如各种无机酸溶液(如氢卤酸、硫酸、亚磷酸等)或有机酸溶液。优选的一种酸是三氟乙酸(TFA)。其它适宜的酸的例子包括甲酸、盐酸、对甲苯磺酸和三氟甲基磺酸。
迈克尔加成步骤和其后水解步骤中所用的试剂优选都溶解在适宜的有机溶剂中。典型的有机溶剂包括二氯甲烷(DCM)、四氢呋喃(THF)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、乙腈、甲苯、苯、二甲苯、苯乙腈、硝基苯、四氯乙烯、苯甲醚、氯苯、叔丁醇等等。
凡是能使聚合物起始材料(即聚合醇)维持液态的任何温度，均适合于迈克尔加成反应的进行。优选的温度范围是约20℃至约120℃，优选约20℃至约60℃。上述温度比通常推荐的温度为低，代表了相对较温和的反应条件，尤其是在碱性催化剂存在的条件下，从而在实际上消除了聚合物主链的降解和断裂现象。迈克尔加成反应的时间通常是约6小时至约24小时。通常在聚合物与丙烯酸叔烷基酯反应时使用过量的丙烯酸酯试剂(例如过量摩尔数最高达约30倍)，以促使聚合醇实质上的完全转化。所存在催化剂的量通常为聚合物起始材料重量的约0.05％至约20％。
酸促水解步骤通常包括用强酸(优选有机酸)在约20℃至约100℃的温度范围内(优选为该范围的较低端值)处理聚合物的丙酸酯，历时约0.5小时至约6小时。在相对较低温度下使用有机酸，代表了比腈类水解所需条件(如美国第5,672,662号专利中所指出的条件)较温和的水解条件，结果是实际上消除了聚合物主链的降解和断裂现象。将该酯转化为所需的酸后，可通过蒸馏除去任何存在的有机溶剂或酸，例如三氟乙酸。然后，优选将所需产物溶解于去离子水，并用强碱处理，使任何残留的聚合醇(例如PEG-OH)和酸(例如三氟乙酸)所形成的酯发生水解，随后用强无机酸处理(调节pH值)，使所得聚合物-丙酸(例如PEG-丙酸)的盐转化为游离酸形式。再用二氯甲烷等氯化溶剂来提取产物并加以浓缩。然后可使用本技术领域内适用于这类聚合物的已知方法来纯化所需产物。
采用本发明的方法，可以很高的产率生成聚合物取代率很高的丙酸官能化聚合物。通常，取代到聚合醇上的丙酸酯的聚合物取代百分率至少为约70％，优选至少为约80％，最优选至少为约90％。产物的产率通常至少为约60％，优选至少为约70％，最优选至少为约80％。
本发明的总反应示意图如以下“反应示意图I”所示。如图所示及下文进一步的详述，mPEG-OH分子与在α-碳位取代的丙烯酸叔丁酯分子反应。使用以KOH活化的卤化季铵作为迈克尔加成步骤的催化剂。在酸促水解步骤中，使用三氟乙酸(“TFA”)来脱除叔丁基保护基团。在反应示意图I中，“Me”代表甲基，“n”代表重复的乙撑氧单体的数目，“t-Bu”代表叔丁基，R2的定义如II.B部分所述：
Figure A20058000899400191
                         反应示意图I
在以下的反应示意图II中，概括了本发明的方法，其包括在丙酸官能化聚合物纯化后生成活性NHS酯。
Figure A20058000899400195
                         反应示意图II
如以下进一步的充分解释，聚合醇起始材料可含有任何水溶性非肽类聚合物，该聚合物可具有各种不同几何构型中的任何一种构型(例如线型、支化、叉形等)。为简单起见，以上反应示意图显示了只含一个羟基的单官能团聚合物的应用。但是，该聚合物可含有一个以上的羟基，如1至约25个羟基(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多的羟基)。
如果使用甲氧基PEG-OH作为原料，如反应示意图II所示，这一过程产生了活性酯但聚合物主链未受影响。也就是说，酯的酸催化水解没有造成明显的断链现象。虽然不希望受到理论的约束，但据信之所以没有造成明显的断链现象是由于在碱处理后采用了相对较低的温度和较温和的有机酸如三氟乙酸。这种断链现象的消失，尤其是链端脱甲基化现象的消失(从而导致脱甲基化产物的消失)，使得与按照美国第5,672,662号专利所述过程制备的丙酸封端聚合物(以及对应的酯)相比，按本方法制备的聚合物具有显著的区别和优点。此外，以按照美国第US 5,672,662号专利制备的PEG-丙酸所衍生的活性试剂为原料，所制备的结合物也不如用本方法制备的结合物。
A.水溶性非肽类聚合物
该聚合物应无毒性且具有生物相容性，这意味着该聚合物能够与活组织或有机体共存而不造成伤害。当提及该聚合物时，应理解该聚合物可以是许多种水溶性非肽类聚合物中的任何一种，如本文所述适合于本发明应用的那些聚合物。这种聚合物优选是聚乙二醇(即PEG)。PEG这一术语包括具有许多不同几何构型或形式中任何一种聚乙二醇，包括线型结构(例如甲氧基-PEG-OH、苄氧基-PEG-OH或HO-PEG-OH)、支化或多臂结构(例如叉形PEG或连多元醇核心上的PEG)、侧链PEG或含有可降解键合的PEG，以下将更充分地说明。
该聚合物含有至少一个能在迈克尔加成反应中与丙烯酸叔烷基酯试剂反应的羟基。除了一个或多个的羟基外，聚合物还可含有其它不干扰迈克尔加成反应的官能团，如碳链长度为1至25个碳原子的醛(如乙醛、丙醛和丁醛)的缩醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、酰肼、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫代吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、环氧化物、乙二醛、生物素、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯和2，2，2-三氟乙磺酸酯。
该聚合物所含羟基数目和官能团的位置可有所不同。通常，该聚合物将含有1至约25个羟基，优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个羟基。线型聚合物，如PEG聚合物，通常会含有一个或两个位于该聚合物链端的羟基。如果PEG聚合物是单官能的(即mPEG)，该聚合物将含有单一的羟基。如果PEG是双官能的，该聚合物则可含有两个羟基，即聚合物每个链端各含一个羟基，或者可能只含有一个羟基而在链的另一端含有一个不同的官能团。可以理解，多臂形或支化聚合物可能含有更多的羟基。
多臂形或支化PEG分子(如美国第5,932,462号专利中所述的PEG分子)也可作为该PEG聚合物使用。一般而言，多臂形或支化聚合物分子具有两个或多个从中心分支点伸出的聚合物“臂”。例如，典型的支化PEG聚合物具有以下结构：
Figure A20058000899400211
(结构式III)
其中PEG1和PEG2是本文所述的任何构型或形状的PEG聚合物，两者可以相同，也可以不同，L’是对水解稳定的键合。典型的结构式III的支化PEG具有以下结构：
Figure A20058000899400212
(结构式IV)
其中polya和polyb是PEG主链，例如甲氧基聚乙二醇；R″是非反应性部分，如H、甲基，或PEG主链；P和Q是非反应性连接。在优选的实施方案中，支化PEG聚合物是甲氧基聚乙二醇二取代的赖氨酸。
结构式IV的支化PEG结构可连在第三个低聚物或聚合物链上，如下所示：
Figure A20058000899400221
(结构式V)
其中PEG3是第三个PEG低聚物或聚合物链，其可与PEG1和PEG2相同和不同。
在另一项具有多臂结构的实施方案中，该聚合物含有从多元醇或聚胺衍生的中央核心分子，该中央核心分子提供了许多连接位点，适合于各条聚合物臂以共价键方式与中央核心分子连接，从而形成多臂聚合物结构。典型的这类多臂聚合物具有如下结构：
R(-L″-PEG-OH)q
(结构式VI)
其中：
R是多元醇或聚胺核心分子的烃链，通常含有约3个至约150个碳原子，优选约3个至约50个碳原子，优选约3个至约10个碳原子(例如3、4、5、6、7、8、9或10个)。该烃链可任选地被一个或多个杂原子(例如O、S或N)取代。该烃链可是直链或环状的；
L″是多元醇或聚胺核心分子与聚合物臂反应而形成的连接(例如-O-或-NH-C(O)-)，可起间隔基的作用；
PEG是聚乙二醇聚合物链段；以及
q是一个3至约25的整数，优选3至约10，优选3至约8(例如3、4、5、6、7或8)。
上述具有多臂结构的实施方案中，中央核心分子衍生自提供许多连接位点的分子，该连接位点的数目等于所需水溶性非肽类聚合物臂的数目。优选，多臂聚合物结构的中央核心分子是多元醇或聚胺的残基，带有至少3个可供与聚合物连接的羟基或氨基。“多元醇”是含有多个可供利用的羟基的分子。“聚胺”是含有多个可供利用的氨基的分子。取决于所需聚合物臂的数目，多元醇或聚胺通常含有3个至约25个羟基或氨基，优选3个至约10个，优选是3个至约8个(例如3、4、5、6、7或8个)。多元醇或聚胺还可包括其它受保护或未受保护的官能团，而不违背本发明的精神。尽管羟基或氨基之间的间隔可以变化，各羟基或氨基之间通常间隔1至约20个原子(例如碳原子)，优选1至约5个。所选择的特定多元醇或聚胺将取决于与聚合物臂连接时所需羟基或氨基的数目。
在与聚合物臂反应之前，该多元醇或聚胺核心通常具有R-(OH)p或R-(NH2)p的结构，其中R是烃链，通常含有约3个至约150个碳原子，优选约3个至约50个碳原子，最优选约3个至约10个碳原子(例如3、4、5、6、7、8、9或10个)。该烃链可任选地被一个或多个杂原子(例如O、S或N)取代，该烃链可是直链或环状的；p是羟基或氨基的数目，通常是3至约25，优选3至约10，优选是3至约8(例如3、4、5、6、7或8)。
适合作为聚合物核心使用的多元醇几乎有无限种。可使用含有1至约10个碳原子和1至约10个羟基的脂族多元醇，包括乙二醇、烷二醇、烷基二醇、亚烷基烷基二醇、烷基环烷基二醇、1，5-萘烷二醇、4，8-双(羟甲基)三环癸烷、亚环烷基二醇、二羟基烷、三羟基烷等等。也可使用环状脂族多元醇，包括直链或闭环的糖类和糖醇，如甘露醇、山梨醇、肌醇、木糖醇、白雀木醇、苏糖醇、阿糖醇、赤藓醇、核糖醇、半乳糖醇、岩藻糖(facose)、核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、山梨糖、甘露糖、吡喃糖、阿卓糖、塔罗糖、万寿菊糖(tagitose)、吡喃糖苷、蔗糖、乳糖、麦芽糖等。其它的脂族多元醇例子包括甘油醛、葡萄糖、核糖、甘露糖、半乳糖和相关立体异构体的衍生物。也可使用芳族多元醇，如1，1，1-三(4′-羟苯基)烷，比如1，1，1-三(4′-羟苯基)乙烷、(1，3-金刚烷二基)二苯酚、2，6-双(羟烷基)甲酚、2，2′-烷撑-双(6-叔丁基-4-烷基酚)、2，2′-烷撑-双(叔丁酚)、儿茶酚、烷基儿茶酚、邻苯三酚、fluoroglycinol、1，2，4-苯三酚、间苯二酚、烷基间苯二酚、二烷基间苯二酚、苔黑酚一水合物、3，5-二羟基戊苯(olivetol)、氢醌、烷基氢醌、1，1-二-2-萘酚、苯基氢醌、二羟基萘、4，4′-(9-亚芴基)二苯酚、3，4-二氰基蒽酚、1，8，9-蒽三酚、双(羟苯基)甲烷双苯酚、二烷基己烯雌酚、双(羟苯基)烷、双酚A及其衍生物、中己雌酚(hexesterol)、去甲二氢愈创木脂酸、杯芳烃(calixarene)及其衍生物、丹宁酸等等。其它可使用的核心多元醇包括冠醚、环糊精、糊精和其它碳水化合物(例如单糖、低聚糖和多糖、淀粉以及淀粉酶)。
优选的多元醇包括甘油、糖类(如山梨糖醇)或季戊四醇，以及甘油低聚物如六聚甘油。使用羟丙基-β-环糊精可合成21臂的聚合物，该聚合物具有可供利用的21个羟基。
典型的聚胺包括脂族聚胺，如二亚乙基三胺、N，N′，N″-三甲基二亚乙基三胺、五甲基二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、五亚乙基六胺、二亚丙基三胺、三亚丙基四胺、双(3-氨基丙基)胺、双(3-氨基丙基)甲胺，以及N，N′-二甲基-二亚丙基三胺。可用于本发明的天然聚胺包括腐胺、亚精胺和精胺。在Bacchi等人的《抗菌剂及化学疗法》(Antimicrobial Agents and Chemotherapy，January 2002，p.55-61，Vol.46，No.1)这一文献中，叙述了适用于本发明的许多五元胺、四元胺、低聚胺和戊烷脒类似物。
PEG聚合物或者可含有分叉结构的PEG。一般而言，具有分叉结构的聚合物的特点就是具有从该聚合物中的水解稳定性分支点伸出的聚合物分子链，它以共价式与两个或多个官能团连接。分叉形PEG的一个例子可表示为PEG-YCH(-L-Z)2，其中Y是连接基团，Z是用于以共价键与生物活性剂连接的活性端基。Z基通过连接基L和CH相连，L是一条具有一定长度的原子链。美国第6,362,254号专利公开了可供本发明利用的各种分叉形PEG结构。将Z官能团(例如羟基)连接到分支碳原子上的原子链L起着锚定基团的作用，它可能含有烃键、醚键、酯键、酰胺键或它们的组合。
PEG聚合物可含有侧基PEG分子，该侧基PEG分子具有沿着PEG主链的长度方向(而不是在PEG链的末端)以共价键连接的反应性基团(例如羟基)。该侧基反应性基团可直接与PEG主链连接，也可通过亚烷基等的连接基与PEG主链连接。
除了上述PEG构型之外，还可用聚合物主链上可酶促降解的键合或者一个或多个水解稳定或可降解的键合来制备聚合物(尽管并非是优选的方法)，包括上述任何聚合物。例如，可通过聚合物主链上易水解的酯键来制备PEG。如下所示，这种水解导致聚合物链断裂为分子量较低的链段：
    。
可作为聚合物主链上可降解键合的其它可以水解方式降解的键包括碳酸酯键、亚胺键(例如通过胺和醛之间的反应生成，参阅Ouchi etal.，Polymer Preprints，38(1)：582-3(1997))；磷酸酯键(例如通过醇和磷酸酯基之间的反应生成)；腙键(通常通过酰肼和醛之间的反应生成)；缩醛键(通常通过醛和醇之间的反应生成)；原酸酯键(例如通过酸衍生物和醇之间的反应生成)；以及低聚核苷酸键(例如通过聚合物末端的亚磷酰胺(phosphoramidite)基团和低聚核苷酸的5’端羟基之间的反应生成)。
本技术领域的技术人员应该理解，“聚乙二醇”或“PEG”这一术语代表或包括上述所有构型的PEG。包括其它水溶性非肽类聚合物链的任何多种其它的聚合物，也可用于本发明。该聚合物可以是线型的，也可以是上述任何构型(例如支化、分叉等等)。适宜的聚合物的例子包括但不限于其它聚烷撑二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚羟烷基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸羟烷基酯、多糖、聚α-羟基乙酸、聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚膦腈、聚_唑啉、聚(N-丙烯酰吗啉)，如美国第5,629,384号专利所述，以及它们的二元共聚物、三元共聚物或其混合物。
可将不同的聚合物结合到相同的聚合物主链上。例如，可用不同类型的聚合物代替具有结构式III-IV所示支化结构的一个或多个PEG分子。任何水溶性非肽类聚合物的组合均包括在本发明范围内。
聚合物的分子量将根据所需的应用、聚合物结构的构型、支化程度等因素而改变。一般而言，本发明中可使用的聚合物其分子量为约10000Da至约100000Da，优选约10000Da至约60000Da，优选约10000Da至约40000Da。典型的实施方案中聚合物的分子量大致为10000Da、15000Da、20000Da、25000Da、35000Da和40000Da。但是，也可使用分子量较低的聚合物而不违背本发明的精神，例如分子量低达约100Da的聚合物(例如分子量为约250Da、约500Da、约750Da、约1000Da、约1500Da、约2500Da和约5000Da的聚合物)。
典型的可用聚合物的平均分子量包括：约100Da、约200Da、约300Da、约400Da、约500Da、约600Da、约700Da、约750Da、约800Da、约900、约1000Da、约2000Da、约2500Da、约3000Da、约4000Da、约5000Da、约6000Da、约7000Da、约7500Da、约8000Da、约9000、约10000Da、约11000Da、约12000Da、约12500Da、约15000Da、约20000Da、约25000Da和约30000Da、约40000Da、约50000Da、约60000Da、约70000Da、约75000Da、约80000Da、约85000Da、约90000Da、约100000Da和约120000Da。
就单支化形式的聚合物而言，典型的可用聚合物的总分子量(基本上基于两个水溶性聚合物部分的分子量之和)范围包括：约200Da至约100000Da；约1000Da至约80000Da；约2000Da至约60000Da；约4000Da至约50000Da；以及约10000Da至约40000Da。更具体地说，本发明的单支化聚合物的总分子量对应于下列分子量之一：约400Da、约1000Da、约1500Da、约2000Da、约3000Da、约4000Da、约10000Da、约15000Da、约20000Da、约30000Da、约40000Da、约50000Da、约60000Da，或约80000Da。
至于含有重复乙撑氧基单元结构如“-(CH2CH2O)m-”或“-(OCH2CH2)m-”[如H3CO-(CH2CH2O)m-CHR1-CHR2-C(O)-Y中，其中R1、R2和Y的定义同结构式VIII]的PEG，其典型的m值包括：约3至约3000、约10至约3000、约15至约3000、约20至约3000、约25至约3000、约30至约3000、约40至约3000、约50至约3000、约55至约3000、约75至约3000、约100至约3000以及约225至约3000。
B.丙烯酸叔烷基酯试剂
丙烯酸叔烷基酯可以是α-位或β-位取代的。典型的取代基包括卤原子、烷硫基、酰基、酰氧基、硝基、氰基、叠氮基、三卤代甲基、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、取代的芳基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基以及取代的杂芳基。丙烯酸叔烷基酯的β-位碳原子优选是未取代的。丙烯酸酯试剂优选是在α-位碳原子上带有烷基或芳基取代基，从而对最末端的羧酸基形成立体位阻。如美国第6,495,659号专利中所述，α-位碳原子上侧链的立体位阻效应，对于使用聚合物羧酸形成的药物结合物的水解稳定性可造成有利的影响。在一项优选的实施方案中，丙烯酸叔烷基酯是α-位或β-位取代的，优选是α-位取代的，取代基为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基或苄基。
在一项实施方案中，丙烯酸叔烷基酯具有以下结构：
(结构式I)
其中：
R1和R2各自独立地选自下列基团：氢、卤原子、烷硫基、酰基、酰氧基、硝基、氰基、叠氮基、三卤代甲基、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、烷氧基、芳基、取代的芳基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基以及取代的杂芳基。
R3-R5各自独立地是烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基。
优选，R3、R4和R5各自是甲基、乙基或苯基，R1和R2是氢，或者R1是氢而R2是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基或苄基。在一项优选的实施方案中，叔烷基是叔丁基(即R3-R5各自都是甲基)。其它典型的叔烷基包括叔戊基、α，α’-二甲基苄基、三苯甲基、1-金刚烷基(adamantyl)和2-甲基-2-金刚烷基。
优选的丙烯酸叔烷基酯包括丙烯酸叔丁酯和甲基丙烯酸叔丁酯，可购自密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich公司。其它典型的丙烯酸叔烷基酯包括巴豆酸或异巴豆酸的叔丁酯。此外，丙烯酸或甲基丙烯酸的其它叔烷基或三级环烷基酯也适合用于本发明。
C.含有至少一个丙酸基的聚合物
按照本文所述的方法，水溶性非肽类聚合物将含有至少一个丙酸端基。典型的聚合物将对应于以下结构：
POLY-CHR1-CHR2-COOH
(结构式VII)
其中POLY是水溶性非肽类聚合物的剩余部分(如PEG)，R1和R2(如以上II.B部分所述)各自独立地选自下列基团：氢、卤原子、烷硫基、酰基、酰氧基、硝基、氰基、叠氮基、三卤代甲基、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、烷氧基、芳基、取代的芳基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基和取代的杂芳基。至于POLY，对应的水溶性非肽类聚合物如以上II.A部分所述。PEG[例如“-(CH2CH2O)m-”或“-(OCH2CH2)m-”]是尤其优选的POLY，如以上II.A部分所述。在一项或多项实施方案中，支化聚合物是优选的。
如果需要，可利用本技术领域内已知的方法，进一步修饰丙酸官能化聚合物，以形成有用的反应性羧酸衍生物。因此，本发明包括从所述丙酸官能化聚合物可得到的和/或已得到的聚合物。例如，该羧酸可进一步衍生为酰卤、酰拟卤(如酰腈、酰基异氰酸酯(acyl isocyanate)和酰叠氮)、中性盐(如碱金属或碱土金属的盐，例如钙、钠或钡的盐)、酯、酐、酰胺、酰亚胺、酰肼等等。此外，还可将羧酸还原为醛，既可使用适宜的还原剂直接还原，也可使用适宜的还原剂经由酰胺、腈或酯的途径间接还原。还可将该羧酸或某些其它官能化聚合物(例如活性酯)作为中间体，与适宜的试剂或其它小分子或短链聚合物反应，以生成其它反应性衍生物，如马来酰亚胺、硫醇、反应性二硫化物、缩醛、醛等。
在一项优选的实施方案中，丙酸被酯化形成活性酯，如N-羟基琥珀酰亚胺基酯、邻、间或对硝基苯酯、1-羟基苯并三唑基酯、咪唑基酯，或N-羟基磺基琥珀酰亚胺基酯。连接在聚合物上的丙酸或其反应性衍生物优选具有以下结构：
-CHR1-CHR2-C(O)-Y
(结构式VIII)
其中R1和R2(如以上II.B部分所述)各自独立地选自下列基团：氢、卤原子、烷硫基、酰基、酰氧基、硝基、氰基、叠氮基、三卤代甲基、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、烷氧基、芳基、取代的芳基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基和取代的杂芳基。Y选自：氢、卤原子、羟基、氨基、取代的氨基、-NCO、-NCS、N3、-CN以及-O-R′，其中R′是N-琥珀酰亚胺基、硝基苯基、苯并三唑基、咪唑基、N-磺基琥珀酰亚胺基、N-邻苯二甲酰亚胺基、N-戊二酰亚胺基、N-四氢邻苯二甲酰亚胺基、N-降冰片烯-2，3-二羧酰亚胺基以及羟基-7-氮杂苯并三唑基。
在一项实施方案中，Y是具有-NHR6结构的取代氨基，其中R6是任何可能含有其它反应性官能团(例如醛、马来酰亚胺、巯基等等)的有机基团，且其中的一个或多个其它官能团通过亚烷基链(例如C1-6亚烷基链)与羰基碳原子隔开；任选地，亚烷基链可任选含有其它的连接体，如短PEG链和其它亚烷基链(例如亚烷基-PEG-亚烷基)。
可通过所述丙酸官能化聚合物制备的典型聚合物包括以下各种：
Figure A20058000899400301
Figure A20058000899400311
其中，m的定义如以上II.A部分所述，EC是选自以下部分的残基：荧光素、生物素、丙烯酸酯、乙烯基砜、马来酰亚胺、叔丁基羰基(t-Boc)以及9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)。
在某些情况下，带有丙酸的聚合物优选不是重均分子量为约20000Da的甲氧基PEG丙酸[即H3CO-(CH2CH2O)m-CH2-CH2-COOH，其中m不会导致重均分子量为约20,000Da]，也不是重均分子量为约30,000Da的甲氧基PEG丙酸[即H3CO-(CH2CH2O)m-CH2-CH2-COOH，其中m不会导致重均分子量为约30,000Da]。此外，在某些情况下，优选带有丙酸的聚合物不是重均分子量为约17,500Da至约22,500Da的甲氧基PEG丙酸(或其它聚合物)，也不是重均分子量为约27,500Da至约32,500Da的甲氧基PEG丙酸。在某些其它情况下，甲氧基PEG丙酸的重均分子量优选大于35,000Da。优选的带丙酸的聚合物包括前面所述的支化(即单支化或多支化)结构。
C.用于结合的生物活性分子
以本发明的方法制备的丙酸封端聚合物或其反应性衍生物，可用于与生物活性分子形成结合物，尤其是与含亲核官能团如氨基的生物活性分子形成结合物。可采用已知技术，以共价键将活性聚合物(如活性PEG)与生物活性剂连接(例如可参阅 POLY(ETHYLENE GLYCOL)CHEMISTRY AND BIOLOGICAL APPLICATIONS，American Chemical Society，Washington，DC(1997))，来生成这类聚合物结合物。
至于用于结合反应的聚合物，亲电活性聚合物衍生物如活性酯可用于与蛋白质或其它生物活性分子上的氨基发生结合。带有活性羧酸酯的聚合物与生物活性分子上的氨基发生结合，在聚合物和生物活性分子之间形成稳定的酰胺键。
与以本发明的方法生成的聚合物连接的生物活性剂可以是下列任何一种或多种。例如，适宜的生物活性剂可选自：催眠药和镇静剂、精神兴奋剂、镇定药、呼吸系统用药、抗痉挛剂、肌肉松弛剂、抗帕金森氏症药(多巴胺拮抗剂)、止痛药、抗炎药、抗焦虑药、食欲抑制剂、抗偏头痛剂、抗肌肉萎缩药(muscle contractant)、抗感染药(抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂和疫苗)、抗关节炎药、抗疟疾剂、止吐剂、抗癫痫药、支气管扩张剂、细胞因子、生长因子、抗癌剂、抗血栓形成剂、抗高血压药、心血管药物、抗心律失常药、抗氧化剂、抗哮喘剂、包括避孕药在内的激素药物、拟交感神经药、利尿药、脂质调节剂、抗雄激素药、抗寄生虫药、抗凝剂、肿瘤药、抗肿瘤药、降血糖药、营养剂和增补剂、生长增补剂、抗肠炎剂、疫苗、抗体、诊断剂和造影剂。
适合于以共价键与根据本发明的方法生成的聚合物连接的生物活性剂的例子包括但不限于降钙素、促红细胞生成素(EPO)、凝血因子VIII、凝血因子IX、ceredase、cerezyme、环孢素、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、血小板生成素(TPO)、α-1蛋白酶抑制剂、依降钙素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、生长激素、人生长激素(HGH)、生长激素释放激素(GHRH)、肝素、低分子量肝素(LMWH)、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、白细胞介素-1受体、白细胞介素-2、白细胞介素-1受体拮抗体、白细胞介素-3、白细胞介素-4、白细胞介素-6、促黄体激素释放激素(LHRH)、凝血因子IX胰岛素、胰岛素原、胰岛素类似物(例如，如美国第5,922,675号专利所述的单酰化胰岛素)、胰淀素(amylin)、C-肽、生长抑素、包括奥曲肽、加压素、卵泡刺激素(FSH)在内的生长抑素类似物、胰岛素样生长因子(IGF)、胰岛素促生肽(insulintropin)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、神经生长因子(NGF)、组织生长因子、角质细胞生长因子(KGF)、神经胶质生长因子(GGF)、肿瘤坏死因子(TNF)、内皮生长因子、甲状旁腺激素(PTH)、胰高血糖素样肽胸腺素α-1、IIb/IIIa抑制剂、α-1抗胰蛋白酶、磷酸二酯酶(PDE)化合物、VLA-4抑制剂、双膦酸盐、呼吸道合胞病毒抗体、囊性纤维化跨膜调节因子(CFTR)基因、脱氧核糖核酸酶(DNA酶)、杀菌性/通透性增加蛋白(BPI)、抗CMV抗体、13-顺式视黄酸、大环内酯(如红霉素、竹桃霉素、醋竹桃霉素、罗红霉素、克拉霉素、环酯红霉素、阿奇霉素、氟红霉素、地红霉素、交沙霉素、螺旋霉素、麦迪霉素、柱晶白霉素、乙酰麦迪霉素、罗他霉素和阿奇霉素以及swinolide A)、氟喹诺酮(如环丙沙星、氧氟沙星、左氟沙星、曲伐沙星、阿拉曲伐沙星、莫西沙星、诺氟沙星、依诺沙星、格帕沙星、加替沙星、洛美沙星、司帕沙星、替马沙星、培氟沙星、氨氟沙星、氟罗沙星、托氟沙星、普卢利沙星、依洛沙星、帕珠沙星、克林沙星和西他沙星)、氨基糖苷(如庆大霉素、萘替米星、草履虫素、妥布霉素、阿米卡星、卡那霉素、新霉素和链霉素)、万古霉素、替考拉宁、雷冒拉宁、麦地拉宁、粘菌素、达托霉素、短杆菌肽、甲磺酸粘菌素、多粘菌素(如多粘菌素B、卷曲霉素、杆菌肽、青霉烯)；青霉素类，包括青霉素酶敏感药物(如青霉素G、青霉素V)、耐青霉素酶(如甲氧西林、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、萘夫西林)、格兰氏阴性微生物活性剂(如氨苄西林、阿莫西林和海他西林、西林、以及galampicillin)、抗假单胞菌青霉素(如羧苄西林、替卡西林、阿洛西林、美洛西林和哌拉西林)；头孢菌素(如头孢泊肟、头孢丙烯、头孢布烯、头孢唑肟、头孢曲松、头孢噻吩、头孢匹林、头孢氨苄、头孢西丁、头孢孟多、头孢唑啉、头孢噻啶、头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢来星、头孢呋肟、头孢雷特、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢三嗪、头孢乙腈、头孢吡肟、头孢克肟、头孢尼西、头孢哌酮、头孢替坦、头孢美唑、头孢他啶、氯碳头孢和拉氧头孢)、单环内酰胺(如氨曲南)、以及碳青霉素烯(如亚胺培南、美罗培南、喷他脒羟乙磺酸盐、硫酸沙丁胺醇、利多卡因、硫酸异丙喘宁、二丙酸倍氯米松、曲安奈德、醋酸布地奈德、氟替卡松、异丙托溴胺、氟尼缩松、色甘酸钠、酒石酸麦角胺)，以及适用的类似物、激动剂、拮抗剂、抑制剂，以及上述药物的药学上可接受的盐。至于肽和蛋白，本发明意图包括合成的、天然的、糖化的、非糖化的、PEG化的形式及其生物活性片段和类似物。
因此，本发明包括组合物，该组合物包括含丙酸封端聚合物(或其反应性衍生物)和生物活性分子的结合物，其中丙酸封端聚合物是按照本文所述的方法制备的。因此，例如该组合物中的结合物可通过使
Figure A20058000899400341
与干扰素发生反应而生成，其中m的定义如II.A部分所述。此外，该组合物中的结合物可通过使与TNFR肿瘤坏死因子受体发生反应而生成，其中m的定义如II.A部分所述。此外，该组合物中的结合物还可通过使
Figure A20058000899400351
与促红细胞生成素进行反应而生成，其中m的定义如II.A部分所述。该组合物中的结合物还可通过使
Figure A20058000899400352
与人生长激素进行反应而生成，其中m的定义如II.A部分所述。干扰素、TNFR、促红细胞生成素和人生长激素的变体和类似物可作为生物活性剂被取代进入这些结合物中。典型的结合物将含有对应于以下结构式IX的结构：
Figure A20058000899400353
(结构式IX)
其中，“活性剂”代表含胺的活性剂的残基，m的定义如II.A部分所述。
因为组合物包括用本发明所述方法生成的丙酸封端聚合物(或其反应性衍生物)所制备的结合物，本发明的方法将使聚合物主链的降解和断链现象减少，所以，生成的结合物和组合物中聚合物主链的降解和断链现象同样也会减少，至少会比用另一些方法(即不同于本发明所述方法的合成丙酸封端聚合物或其反应性衍生物的方法)制备的丙酸封端聚合物(或其反应性衍生物)所生成的结合物有所减少。
尤其是，由于降解和断链现象的减少，本发明所述的方法出乎意料且有利地提供了纯度较高的丙酸封端聚合物(以及反应性衍生物和结合物)。当该丙酸封端聚合物含有带甲氧基端基的丙酸封端聚乙二醇时，这些方法尤其改善了纯度。
例如，带甲氧基端基的丙酸封端聚乙二醇[例如CH3O-(CH2CH2O)m-CH2CH2COOH]含有许多醚基，每个醚基都含有对于因亲核攻击而发生的断链相当敏感的氧原子。虽然不希望受理论的约束，但看来至少有三个原因可以说明，为什么该聚合物中最易断裂、最敏感的醚基是与甲氧基端基连接的醚基。
首先是易于接近的关系，由于与甲氧基端基相连的醚基是最暴露的，因此相对而言最容易受到导致断链的亲核攻击。第二，与甲氧基端基相连的醚基中的氧原子比与重复乙撑氧单元相连的醚基中的氧原子具有较强的碱性。之所以如此是因为与重复乙撑氧相连的醚基中的氧原子可受益于两个相邻的醚氧原子(以及其吸电子效应)，但与甲氧基端基相连的醚氧原子却只有一个相邻的醚氧原子。第三，尽管最接近羧酸基的醚基中的氧原子也只有一个相邻的醚氧原子，但是此氧原子受益于相邻的能增强稳定性的羧酸基，该羧酸基起着吸电子的作用。
以上分析可通过示意图A说明，其中左侧结构的箭头表示所连基团的给电子和吸电子效应，右侧结构则比较了质子化形式的相对稳定性。在示意图A中，m的定义如II.A部分所述。
                         示意图A
虽然不希望受到理论的约束，但据信上图右侧两种结构中，亲核体最有可能通过背侧亲核置换而攻击质子化甲氧基氧原子上的碳原子(见上图右上角结构)。这种优先次序的原因包括甲基位置较低的立体位阻程度(因此甲基更容易被置换)以及聚合物主链上较高的立体位阻程度，如示意图B所示。在示意图B中，m的定义如II.A部分所述。
Figure A20058000899400371
                         示意图B
因此，例如，如果硫酸氢根离子是将会导致断链的亲核体，则据信最有可能的断链方式就是失去甲氧基端基的甲基。见示意图C，其中m的定义如II.A部分所述。此过程将导致端羟基代替甲氧基端基(而形成“脱甲基化的聚合物”)。在美国第5,672,662号专利中所述的“以腈为基础”的方法既没有观察到也没有报道这种羟基封端的副产物杂质，这是因为这种羟基封端聚合物与对应的甲氧基封端聚合物具有基本上相同的分子量，所以两者的高效液相色谱(“HPLC”)的保留特性也基本上相同。回想一下，美国第5,672,662号专利中所述的“以腈为基础”制备丙酸封端聚合物的方法需要采用如下一种或多种较苛刻的条件：(a)使用浓的强无机酸，如硫酸或盐酸，(b)高温，以及(c)很长的反应时间(在以盐酸促进水解的情况下要超过30小时)。
Figure A20058000899400372
                         示意图C
于是，本发明所公开的组合物优选基本上不含带端羟基的副产物杂质(例如，基本不含HO-(CH2CH2O)m-CH2CH2COOH类杂质)。在这方面，基本上不含带端羟基的副产物杂质的组合物中，所含的带端羟基的副产物杂质将低于约15重量％，优选低于约10重量％，优选低于约5重量％，较优选的是低于约重量3％，更优选的是低于约2重量％，最优选的是低于约1重量％。
该副产物杂质(如结构式X中所示带端羟基)可能还会将其它不希望有的杂质带入组合物。尤其是，带端羟基的杂质(如结构式X中所示的杂质)可能(i)与另一分子的活性部分(例如用于形成聚合物衍生物的试剂的羟基)进行竞争，和/或(ii)最终导致形成一种或兆年个羟基封端结合物。
副产物杂质(如结构式X中所示的杂质)可能与其它分子反应而生成在组合物中不希望有的其它物质。例如，在形成反应性酯的酯化过程中，带端羟基的副产物杂质将会与成酯试剂N-羟基琥珀酰亚胺的羟基竞争，从而形成一类其中有两种聚合物互相连接的二元聚合物。例如，当反应混合物含有对应于结构式X的副产物杂质时，这种不希望发生的反应确实会发生，从而导致如结构式XI所示的二元聚合物的形成：
Figure A20058000899400381
                         (结构式XI)
其中m的定义如II.A部分所述。不同于单纯的脱甲基形成的杂质，该二元聚合物很容易通过凝胶渗透色谱(GPC)或HPLC观察到，因为它的分子量较高。
于是，本发明所公开的组合物优选是基本上不含对应于二元聚合物结构的物质(例如，如结构式XI中所示的羟基封端和甲氧基封端的物质)。在这方面，基本上不含二元聚合物的组合物中，所含的二元聚合物将低于约10重量％，优选低于约5重量％，优选低于约4重量％，较优选的是低于约3重量％，更优选的是低于约2重量％，最优选的是低于约1重量％。
如前所述，含羟基封端的杂质(如结构式X所示的杂质)可最终导致形成一种或多种羟基封端聚合物与活性剂的结合物。因此，例如，当用N-羟基琥珀酰亚胺进行酯化反应时，结构中含有对应于结构式X的结构的杂质可产生一类含有对应于结构式XII的结构的物质：
Figure A20058000899400391
(结构式XII)
其中m的定义如II.A部分所述。
还应指出的是，如果用于制备丙酸封端聚合物的起始原料甲氧基封端聚乙二醇遭到“二醇”类聚乙二醇(即HO-(CH2CH2O)m-H)的污染，则可能会通过酯化反应而产生一类含有对应于结构式XII的结构的物质。在这方面，优选使用“二醇”类聚乙二醇含量低于重量的2％的甲氧基封端聚乙二醇原料。
如果含有对应于结构式XII的结构的物质随后与含胺的活性剂结合，则可能形成羟基封端结合物，其中含有其结构对应于结构式XIII的物质：
Figure A20058000899400392
(结构式XIII)
其中，“活性剂”代表含胺的活性剂的残基，m的定义如II.A部分所述。其结构对应于结构式XII的物质还可能导致形成具有的结构对应于结构式XIV的结合物：
Figure A20058000899400401
(结构式XIV)
其中，“活性剂”代表含胺的活性剂的残基，m的定义如II.A部分所述。此外，其结构对应于结构式XII的物质还可能导致具有的结构对应于结构式XV的羟基封端结构的结合物：
Figure A20058000899400402
(结构式XV)
其中，“活性剂”代表含胺的活性剂的残基，m的定义如II.A部分所述。
每种其结构对应于结构式X、XII和XIII中一种结构的杂质，都含有一个端羟基(或“脱甲基”基团)。如上所指出的，对于含有较大量的一种或多种这样的物质或其它羟基封端物质的组合物，特别需要关注的是当该组合物用于结合反应时上述杂质与活性剂反应的能力。其结果可能是生成第二种、第三种和第四种结合物，例如预期的结合物(例如含有对应于结构式IX结构的物质)以及一种或多种非预期的结合物(例如一种或多种其结构对应于结构式XIII或XIV的物质)。业已发现，各种各样结合物的混合物降低了所得组合物的一致性、效能以及再现性。
该组合物优选基本上不含结构对应于结构式XIII、XIV和XV中任一种或它们的任何组合的结合物。在这方面，基本上不含结构对应于结构式XIII、XIV和XV中任一种或它们的任何组合的结合物的组合物，所含的结构对应于结构式XIII、XIV和XV中任一种或它们的任何组合的结合物将低于约10重量％，优选低于约5重量％，优选低于约4重量％，更优选低于约3重量％，更优选低于约2重量％，最优选低于约1重量％。
实验
提供以下实施例是为了说明本发明，但不应被认为是对本发明的限制。例如，虽然在这些实施例中以单官能团PEG试剂为例对本发明加以说明，但双官能团或多官能团PEG聚合物也可同样用于本发明，其它类型的水溶性非肽类聚合物也是如此。
除非另行说明，在所附实施例中提到的所有PEG试剂均可从阿拉巴马州汉茨维尔的Nektar AL公司获得。所有的核磁共振数据是由Bruker公司制造的300或400兆赫核磁共振仪产生的。
实施例1说明了使用丙烯酸叔丁酯(作为丙烯酸叔烷基酯试剂)以及从四丁基溴化铵和氢氧化钾原地制备的四丁基氢氧化铵(作为迈克尔加成催化剂)，生成分子量为20,000Da的mPEG丙酸聚合物。使用TFA以断开叔丁基。实施例2与实施例1相似，不同之处在于使用以四丁基氢氧化铵作为催化剂的直接加成反应生成了20,000Da的苄氧基PEG丙酸聚合物。实施例3与实施例1相似，不同之处在于mPEG的分子量为30,000Da。
比较例1显示，在授予Sanders等人的美国第5,523,479号专利中实施例1所述的合成方法，当使用分子量为20,000Da的聚合物为起始材料时，未能生成所需的丙酸叔丁酯。据信，美国第5,523,479号专利所公开的方法，对于本发明所用的这类分子量较高的丙酸官能化聚合物的形成是无效的。尤其是，当使用较高分子量的聚合物为起始材料时，据信Sanders的专利所建议的催化剂，不能在任何明显的程度上促进迈克尔加成反应。
比较例2显示，在授予Harris等人的美国第5,672,662号专利中实施例1所述的合成方法，当使用混有分子量为20,000Da的低级二醇的甲氧基封端PEG为起始材料时，未能产生纯的m-PEG(分子量20,000Da)-丙酸，因为较苛刻的反应条件导致了甲氧基封端PEG的脱甲基化和链断裂，并生成了大量的HO-PEG(分子量20,000Da)-丙酸。
实施例1
合成mPEG(分子量20,000Da)-丙酸
A.mPEG(分子量20,000Da)-丙酸叔丁酯
以共沸蒸馏干燥mPEG(分子量20,000Da)(35.0g，0.00175摩尔)(NOF Corporation)和四丁基溴化铵(0.6g)的甲苯(125ml)溶液，蒸去105ml甲苯。加入氢氧化钾细粉末(0.15g)，在氩气气氛中将混合物加热至60℃。然后，在2小时期间加入丙烯酸叔丁酯(2.0ml，0.01365摩尔，7.8倍过量)，并在氩气气氛中于60℃搅拌该混合物过夜。然后，在减压条件下蒸出溶剂，将残余物溶于二氯甲烷(400ml)。用去离子水(2×50ml)洗涤所得溶液两次，然后用无水硫酸镁干燥。再在减压条件下蒸出溶剂，即得产物28.5g。NMR(d6-DMSO)：1.40ppm(s，(CH3)3C-，9H)，2.41ppm(t，-CH2-COO-，2H)，3.24ppm(s，-OCH3，3H)，3.51ppm(s，PEG主链)；取代率69.1％。
B.mPEG(20,000Da)-丙酸
将步骤A所得mPEG(分子量20,000Da)-丙酸叔丁酯(20g)溶于二氯甲烷与三氟乙酸的混合物(1∶1；120ml)，于60℃搅拌该溶液1小时。冷却至室温后，将二氯甲烷(400ml)加入该反应混合物，用去离子水(400ml)洗涤所得溶液，并用无水硫酸镁干燥。然后，在减压条件下蒸出溶剂。将粗产物溶于去离子水(400ml)，用1.0M NaOH将溶液的pH值调整至12。在pH值12的条件下搅拌该溶液2小时。然后加入NaCl(40g)并用10％磷酸将pH值调整至3。用二氯甲烷提取产物，用无水硫酸镁干燥溶液，在减压条件下蒸出溶剂，即得16.5g白色固体产物。阴离子交换色谱显示该产物含有：m-PEG(分子量20,000Da)-丙酸68.2％和m-PEG-20K 31.8％。然后，用典型的阴离子交换色谱介质以色谱法纯化产物，即得100％纯的PEG(分子量20,000Da)-丙酸(9.8g)。此处，所谓“100％PEG(分子量20,000Da)-丙酸”意为100％纯的PEG(分子量20,000Da)-单丙酸。
NMR(d6-DMSO)：2.43ppm(t，-CH2-COO-，2H)，3.24ppm(s，-OCH3，3H)，3.51ppm(s，PEG主链)；NMR未测出PEG-OH基(4.58ppm处无三重峰)；此实验结果意味着该产物是100％纯的mPEG(分子量20,000Da)-单丙酸，不含可检测出的HO-PEG(分子量20,000Da)-丙酸。
实施例2
合成苄氧基-PEG(分子量20,000Da)-丙酸
以共沸蒸馏干燥苯氧基-PEG(分子量20,000Da)(35.0g，0.00175摩尔)(NOF Corporation)和四丁基氢氧化铵(2.0g，40wt％水溶液)的甲苯(200ml)溶液，蒸去175ml甲苯。在氩气气氛中将所得溶液加热至65℃。然后，在3.5小时期间加入丙烯酸叔丁酯(1.5ml，0.01024摩尔，5.85倍过量)，并在氩气气氛中于60-65℃搅拌该混合物过夜。然后，在减压条件下蒸出溶剂，将残余物溶于二氯甲烷(40ml)。
加入三氟乙酸(40ml)并将该溶液加热至沸2小时。在减压条件下蒸出二氯甲烷和三氟乙酸，将粗产物溶于400ml去离子水。用1.0MNaOH将溶液的pH值调整至12，在pH值12条件下搅拌该溶液2小时。然后加入NaCl(40g)并用10％磷酸将pH值调整至3。用二氯甲烷提取产物，用无水硫酸镁干燥提取液，在减压条件下蒸出溶剂即得28.5g白色固体产物。阴离子交换色谱显示该产物含有：PEG(分子量20,000Da)-单丙酸69.7％和PEG(分子量20,000Da)30.3％。然后，以色谱法纯化产物，即得100％纯的PEG(分子量20,000Da)-单丙酸。NMR(d6-DMSO)：2.43ppm(t，-CH2-COO-，2H)，3.24ppm(s，-OCH3，3H)，3.51ppm(s，PEG主链)，4.49ppm(s，-CH2-，苄氧基，2H)，7.33ppm(m，C6H5-，5H)。未测出PEG-OH基(4.58ppm处无三重峰)；这意味着该产物是100％纯的苄氧基-PEG(分子量20,000Da)-丙酸。
实施例3
合成mPEG(分子量30,000Da)-丙酸
A.mPEG(分子量30,000Da)-丙酸叔丁酯
以共沸蒸馏干燥mPEG(分子量30,000Da)(50.0g，0.00167摩尔)(NOF Corporation)和四丁基溴化铵(0.8g)的甲苯(200ml)溶液，蒸去100ml甲苯。加入氢氧化钾细粉末(0.16g)，在氩气气氛中将混合物加热至60℃。然后，在4小时期间加入丙烯酸叔丁酯(2.5ml，0.01707摩尔，10.2倍过量)，并在氩气气氛中于60℃搅拌该混合物过夜。然后，在减压条件下蒸出溶剂，将残余物溶于二氯甲烷(400ml)。用去离子水洗涤两次(2×100ml)所得溶液，然后用无水硫酸镁干燥。再在减压条件下蒸出溶剂，即得42.5g固体产物。NMR(d6-DMSO)：1.40ppm(s，(CH3)3C-，9H)，2.41ppm(t，-CH2-COO-，2H)，3.24ppm(s，-OCH3，3H)，3.51ppm(s，PEG主链)；取代率73.8％。
B.mPEG(分子量30,000Da)-丙酸
将步骤A所得mPEG(分子量30,000Da)-丙酸叔丁酯(40g)溶于二氯甲烷与三氟乙酸的混合物(1∶1；150ml)，于55℃搅拌该溶液1小时。在冷却至室温后，将二氯甲烷(600ml)加入该反应混合物，用去离子水(400ml)洗涤所得溶液，并用无水硫酸镁干燥。再在减压条件下蒸出溶剂。将粗产物溶于去离子水(800ml)，并用1.0M NaOH将溶液的pH值调整至12。在pH值12条件下搅拌该溶液2小时，然后加入NaCl(80g)并用10％磷酸将pH值调整至3。用二氯甲烷提取产物，即得33.5g白色固体产物。阴离子交换色谱显示该产物含有：PEG(分子量30,000Da)-单丙酸67.7％和PEG(分子量30,000Da)32.3％。然后，用典型的阴离子交换色谱介质以色谱法纯化产物，即得100％纯的PEG(分子量30,000Da)-单丙酸(25.3g)。
NMR(d6-DMSO)：2.43ppm(t，-CH2-COO-，2H)，3.24ppm(s，-OCH3，3H)，3.51ppm(s，PEG主链)。未测出PEG-OH基(4.58ppm处无三重峰)；这意味着该产物是100％纯的mPEG(分子量30,000Da)-丙酸。
比较例1
试图合成mPEG(分子量20,000Da)-丙酸叔丁酯
采用美国第5,523,479号专利的实施例1所述方法，以共沸蒸馏干燥mPEG(分子量20,000Da)(35.0g，0.00175摩尔)(NOF Corporation)的甲苯(125ml)溶液，蒸出105ml溶剂。加入氢氧化钾细粉(0.15g)并在氩气气氛中将该混合物加热至60℃。然后在2小时期间加入丙烯酸叔丁酯(2.0ml，0.01365摩尔，7.8倍过量)，并在氩气气氛中于60℃搅拌该混合物过夜。再在减压条件下蒸出溶剂。得产物36.5g。核磁共振分析显示聚合物起始材料未发生变化：mPEG(分子量20,000Da)。NMR(d6-DMSO)：3.24ppm(s，-OCH3，3H)，3.51ppm(s，PEG主链)，4.58ppm(t，OH，1H)。
比较例2
按照美国第5,672,662号专利合成mPEG(分子量20,000Da)-丙酸
A.mPEG(分子量20,000Da)-丙腈
将mPEG(分子量20,000Da)(25.0g，0.00125摩尔)(NOFCorporation)、蒸馏水(25.0ml)和氢氧化钾(0.5g)的混合物在冰浴中冷却至0-5℃。缓慢地加入丙烯腈(3.4g)，于0-5℃搅拌该溶液3小时。将10％NaCl溶液(225ml)加入该反应混合物，用二氯甲烷(200、100和50ml)提取产物。以硫酸镁干燥有机层，并在减压条件下蒸出溶剂。将粗产物溶于二氯甲烷(35ml)，并于室温以异丙醇(225ml)析出沉淀。以过滤除去沉淀物并在真空条件下干燥。得产物M-PEG腈23.5g。
B.mPEG(分子量20,000Da)-丙酰胺
将上述步骤所得M-PEG腈混合物(23.5g)和浓盐酸(117.5g)在室温下搅拌48小时。用1公升水稀释该溶液并用二氯甲烷(200、150和100ml)提取。将合并后有机提取液用水洗涤两次，以硫酸镁干燥、过滤、用旋转式蒸发器浓缩至干。得产物PEG酰胺21.5g。
C.mPEG(分子量20,000Da)-丙酸
将上述步骤所得M-PEG酰胺(16.0g)溶于1150ml蒸馏水，加入100g氢氧化钾，在室温下搅拌该溶液22小时。加入氯化钠(150g)，用二氯甲烷(150ml×3)提取该溶液。将合并后的有机提取液用5％磷酸、水(两次)洗涤，以硫酸镁干燥。然后，在减压条件下蒸出溶剂，即得14.0g白色固体产物。阴离子交换色谱法显示，产物含有：PEG(分子量20,000Da)-丙酸62.5％和PEG-20K 37.5％。然后用典型的阴离子交换色谱介质以色谱法纯化产物，即得100％纯的PEG(分子量20,000Da)-单丙酸(6.5g)。NMR(d6-DMSO)：2.43ppm(t，-CH2-COO-，2H)，3.24ppm(s，-OCH3，2.61H)，3.51ppm(s，PEG主链，1725H)，4.58ppm(t，PEG-OH，0.13H)。核磁共振分析(4.58处三重峰)显示，该产物含有13mol％PEG-OH基团；这意味着该产物是所需的mPEG(分子量20,000Da)-丙酸(87％)和HO-PEG(分子量20,000Da)-丙酸(13％)的混合物。
熟悉本发明领域的专业技术人员，在受益于以上说明之后，将能想象出本发明的许多改型以及其它实施方案。因此，应该理解，本发明并不局限于所公开的特定实施方案，并意图包括各种改型和其它实施方案。虽然本文使用了一些专门术语，但它们只是在笼统和说明的意义上使用，并非是出于限制的目的。

Claims (28)

1.被至少一个丙酸基官能化的水溶性非肽类聚合物的制备方法，该方法包括：
i)在催化剂存在的条件下，使含有至少一个羟基的水溶性非肽类聚合物与丙烯酸叔烷基酯发生反应，以形成该聚合物的丙酸酯，其中聚合物的重均分子量至少为约10,000Da；以及
ii)用强酸处理该聚合物的丙酸酯，以形成该聚合物的丙酸。
2.如权利要求1所述的方法，其中丙烯酸叔烷基酯在α-位或β-位被取代基取代。
3.如权利要求2所述的方法，其中取代基选自卤原子、羟基、硫羟基、烷硫基、酰基、酰氧基、硝基、氰基、叠氮基、三卤代甲基、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、取代的芳基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基以及取代的杂芳基。
4.如权利要求3所述的方法，其中取代基选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基以及苄基。
5.前述权利要求中任一项所述的方法，其中丙烯酸叔烷基酯含有选自以下的叔烷基：叔丁基、叔戊基、α，α＇-二甲基苄基、三苯甲基、1-金刚烷基以及2-甲基-2-金刚烷基。
6.如权利要求1所述的方法，其中丙烯酸叔烷基酯具有以下结构：
其中：
R1和R2各自独立地选自氢、卤原子、羟基、硫羟基、烷硫基、酰基、酰氧基、硝基、氰基、叠氮基、三卤代甲基、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、烷氧基、取代的烷氧基、芳基、取代的芳基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基以及取代的杂芳基；以及
R3-R5各自独立地是烷基、取代的烷基、芳基或取代的芳基。
7.如权利要求5或6所述的方法，其中R3、R4和R5各自独立地是甲基、乙基或苯基。
8.如权利要求5至7中任一项所述的方法，其中R1和R2是氢。
9.如权利要求5至8中任一项所述的方法，其中R1是氢，R2选自甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基以及苄基。
10.前述权利要求中任一项所述的方法，其中强酸选自三氟乙酸、三氟甲磺酸、甲酸、盐酸以及对甲苯磺酸。
11.如权利要求1所述的方法，其中催化剂包括季铵盐。
12.如权利要求11所述的方法，其中季铵盐选自四甲基卤化铵、四乙基卤化铵、四丙基卤化铵、四丁基卤化铵、四甲基氢氧化铵、四乙基氢氧化铵、四丙基氢氧化铵以及四丁基氢氧化铵。
13.如权利要求11所述的方法，其中季铵盐具以下有结构：
Figure A2005800089940003C1
其中每个R各自独立地是烷基或取代的烷基，X是抗衡离子。
14.如权利要求13所述的方法，其中每个R是C1-C8烷基，X是卤离子或氢氧根。
15.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述反应步骤和所述处理步骤是在有机溶液存在的条件下进行的。
16.如权利要求15所述的方法，其中有机溶液选自二氯甲烷、四氢呋喃、二甲基甲酰胺、乙腈、甲苯、二甲苯、苯乙腈、硝基苯、四氯乙烯、苯甲醚以及氯苯。
17.前述权利要求中任一项所述的方法，其中水溶性非肽类聚合物选自聚烷撑二醇、聚烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚羟烷基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸羟烷基酯、多糖、聚α-羟基乙酸、聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚磷腈、聚_唑啉、聚N-丙烯酰吗啉，以及它们的二元共聚物或三元共聚物。
18.前述权利要求中任一项所述的方法，其中水溶性非肽类聚合物是聚乙二醇。
19.如权利要求18所述的方法，其中聚合物的重均分子量为约10,000Da至约100,000Da。
20.如权利要求18或19所述的方法，其中聚合物的重均分子量为约20,000Da至约40,000Da。
21.如权利要求18至20中任一项所述的方法，其中聚乙二醇选自单官能团PEG、双官能团PEG以及支化PEG。
22.如权利要求20所述的方法，其中聚乙二醇的重均分子量为约10,000Da至约100,000Da。
23.如权利要求22所述的方法，其中聚乙二醇的重均分子量为约20,000Da至约40,000Da。
24.可通过权利要求1至23中任一项所述的方法获得的产物。
25.权利要求1至23中任一项所述的方法，进一步包括使丙酸官能化聚合物衍生为活性酯的步骤。
26.可通过权利要求25所述的方法获得的产物。
27.权利要求25所述的方法，进一步包括通过活性酯与含氨基的生物活性分子反应而形成结合物的步骤。
28.可通过权利要求27所述的方法获得的产物。
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