CN1924012A - 一种凝乳酶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种凝乳酶，体外凝乳活力≥8000U/g，生物活性更强，凝乳速度块，不影响乳制品风味；用于治疗各类慢性胃炎、胃下垂、食欲不振和婴儿消化不良和腹泻，有更好的疗效。本发明在原料选择上，不采用非清真原料，而是采用清真小牛胃粘膜为主要原料，扩大了产品的使用范围；并且采用电渗析与亲和层析纯化技术，操作简单、无残留毒素、产品活力高。
Description
技术领域
本发明公开了一种凝乳酶(Chymosin)的制备方法，特别是，公开了一种凝乳酶及其电渗析与离子交换层析相结合的制备方法。
背景技术
凝乳酶Chymosin，；一般也称rennet，因为容易与血管紧张肽原酶(rennin)混淆，国际酶学委员会推荐使用此名，即Chymosin，亦称rennet。Chymosin是一种蛋白酶，EC3.4.23.4。存在于幼龄的反刍动物的胃液中，很类似胃蛋白酶，但凝乳作用(即酪蛋白→衍酪蛋白的转变作用)远比胃蛋白酶强。分解血红蛋白的最适pH约3.5。随着动物的生长，胃中的凝乳酶减少，为胃蛋白酶所取代。在胃中是以凝乳酶原(proChymosin)(从牛的第四胃纯化的样品，分子量约3万6千，氨基末端残基为丙氨酸)形态被分泌的，在酸性条件下由于本身的催化作用从氨基末端切去肽链，变成活性的凝乳酶(分子量约3万1千，氨基末端残基为甘氨酸)。其具体作用有：酪蛋白→衍酪蛋白的转变作用。凝乳酶还适用于各类慢性胃炎，胃下垂、胃大部切除后所至的上腹部不适、食欲不振等，亦可用于婴儿消化不良和腹泻。
工业上制备凝乳酶的有三种来源：从小牛胃提取，植物提取，微生物发酵产生。从小牛胃提取是最传统的途径，但是从70年代始因为小牛胃来源问题，该方法已经不能满足大规模的工业化生产。植物提取和微生物发酵是逐步发展起来的替代方法，但是这些途径产生的酶在使用时会产生异味，往往需要再添加其它酶以改善产品味道。
本发明产品采用小牛血清工业副产品小牛胃为原料，利用电渗及离子交换等工艺，成功制备了效价高，纯度高的凝乳酶。该方法可实现大规模工业化制备凝乳酶。同时，原料采集满足了清真要求，因而该产品可广泛应用于清真乳制品工业，扩大了产品使用的范围。
本发明在资料分析和发明者以往丰富的工作经验的基础上，广泛的研究了各种制造凝乳酶的工艺，结合电渗析与离子交换层析等新技术，现采用“活化、电渗析、装柱、洗提、分段收集、冻干”的产品工艺。该工艺路线优点是操作方便、产品活力高。凝乳酶和杂蛋白分子的三维结构很相似，而且它们的活性部位丝氨酸附近的几个氨基酸顺序也是完全一样的。由于这些酶分子在结构上及其他很多性质上的相似之处，使得传统的一些分离、纯化技术难以达到十分满意的效果，制剂中往往混杂有彼此的组分而难以除净。只是在采用了电渗析与离子交换层析技术以后，才大大提高了分离纯化的效果。
发明内容
本发明的目的是提供了一种凝乳酶。在工艺技术上，克服了传统技术对凝乳酶的分离、纯化效果差、成品活力低的困难。本发明通过常规原料，采用电渗析与离子交换层析相结合的方法，分离出具有较高生物活性的凝乳酶。并且采用电渗析与离子交换层析纯化技术，操作简单、无残留毒素、产品活力高。
——本发明是这样实现的：
本发明公开了一种凝乳酶，体外凝乳活力≥8000U/g，生物活性更强，凝乳速度块，不影响乳制品风味。本发明在原料选择上，不采用非清真原料，而是采用清真小牛胃粘膜为主要原料，扩大了产品的使用范围；并且采用电渗析与离子交换层析纯化技术，操作简单、无残留毒素、产品活力高。
本发明公开的一种凝乳酶的制备方法，依次包括如下步骤：
【1】取新鲜的小牛胃粘膜，加适量盐酸调节PH，活化后过滤，得活化滤液。
【2】这些提取物在缓冲液A中进行电渗析。
【3】取渗析出来的小牛胃膜，用于以下的分离实验。
【4】阳离子交换树脂(HZ-202强酸性)悬浮于缓冲液A，然后填充一根10cm柱，用40mL缓冲液A平衡离子交换柱，然后加入上述小牛胃膜渗析液。
【5】用缓冲液B洗提出有效成分。以2mL为一个片断收集洗脱液，用RIE分析凝乳酶和胃蛋白酶；收集含量高的片断，冻干即得成品凝乳酶。
本发明以清真的牛胃粘膜脏为主要原料，在深入的资料分析和发明者以往丰富工作经验的基础上，结合电渗析与离子交换层析等新技术，现采用活化、电渗析、装柱、洗提、分段收集、冻干的工艺。该工艺路线优点是操作方便、产品活力高。
工艺路线
牛胃粘膜脏→加酸活化→电渗析→准备树脂→装柱→交换柱预洗→加样→洗提→分段收集→冻干→凝乳酶精品
(二)工艺过程(按以下次序进行)
【1】取新鲜的小牛胃粘膜，加适量盐酸调节到PH2.0，活化后过滤，得PH2.0的活化滤液。
【2】这些提取物在缓冲液A中进行电渗析，条件如下：20mmol/L柠檬酸和0.1％(w/v)安息香酸钠，pH 2.45～2.55，传导率2.3mS/cm。
【3】取渗析出来的小牛胃膜，浓度大约22CHU/mL，PH2.4～2.5、传导率4.3mS/cm，用于以下的分离实验。
【4】阳离子交换树脂(HZ-202强酸性)悬浮于缓冲液A，然后填充一根10cm柱(FPLC.TM.)，用40mL缓冲液A平衡离子交换柱，然后加入上述小牛胃膜渗析液。
【5】用缓冲液B洗提出有效成分；缓冲液B成分：10％NaCl溶解于0.05mol/L磷酸盐，pH 5.9，传导率114mS/cm。以2mL为一个片断收集洗脱液，用RIE分析凝乳酶和胃蛋白酶；收集含量高的片断，冻干即得成品凝乳酶。
【6】成品取样进行全项检测。
干酪是高附加值奶制品，且有极高的营养价值。制造干酪需要大量的凝乳酶。以清真原料提取的凝乳酶，制造方便、无残留毒素、产品活力高，适用范围更广。
实际例1
【1】取新鲜的小牛胃粘膜100g，加适量盐酸调节到PH2.0，活化后过滤，得PH2.0的活化滤液。
【2】这些提取物在缓冲液A中进行电渗析，条件如下：20mmol/L柠檬酸加0.1％(w/v)安息香酸钠，pH 2.45～2.55，传导率2.3mS/cm。
【3】取50mL渗析出来的小牛胃膜，浓度大约22CHU/mL，PH2.4～2.5、传导率4.3mS/cm，用于以下的分离实验。
【4】2.5g的阳离子交换树脂(HZ-202强酸性)悬浮于25mL缓冲液A，然后填充一根10cm柱(FPLC.TM.)，用40mL缓冲液A平衡离子交换柱，然后加入50mL上述小牛胃膜渗析液。
【5】用缓冲液B洗提出有效成分；缓冲液B成分：10％NaCl溶解于0.05mol/L磷酸盐，pH5.9，传导率114mS/cm。以2mL为一片断收集洗脱液，用RIE分析凝乳酶和胃蛋白酶；收集含量高的片断，冻干即得成品凝乳酶。(成品检测体外凝乳活力＝9680U/g)结果总结于下：
片断 Ch，CHU/mL BpA，CHU/mL
4 ＜0.5 1.5
7 ＜0.5 1.5
10 ＜0.5 1.3
13 ＜0.5 1.1
16 ＜0.5 1.4
19 ＜0.5 1.5
22 ＜0.5
25 ＜0.5 1.5
28 ＜0.5 1.4
30 ＜0.5 0.1
31 0.16
32 170 0.4
上述结果表明，所选择的色普分离系统对于分离凝乳酶牛胃蛋白酶是有效的。
实际例2.
【1】取新鲜的小牛胃粘膜800g，加适量盐酸调节到PH2.0，活化后过滤，得PH2.0的活化滤液。
【2】这些提取物在缓冲液A中进行电渗析，条件如下：160mmol/L柠檬酸加0.1％(w/v)安息香酸钠，pH 2.45～2.55，传导率2.3mS/cm。
【3】取400mL渗析出来的小牛胃膜，浓度大约22CHU/mL，约PH2.45、传导率4.3mS/cm，用于以下的分离实验。
【4】20g的阳离子交换树脂(HZ-202强酸性)悬浮于200mL缓冲液A，然后填充一根200cm柱(FPLC.TM.)，用800mL缓冲液A平衡离子交换柱，然后加入1000mL上述小牛胃膜渗析液。
【5】用缓冲液B洗提出有效成分；缓冲液B成分：10％NaCl溶解于0.05mol/L磷酸盐，pH5.9，传导率114mS/cm。以2mL为一片断收集洗脱液，用RIE分析凝乳酶和胃蛋白酶；收集含量高的片断，冻干即得成品凝乳酶。(成品检测体外凝乳活力＝9160U/g)结果总结于下：
片断 Ch，CHU/mL BpA，CHU/mL
4 ＜0.5 1.5
7 ＜0.5 1.5
10 ＜0.5 1.3
13 ＜0.5 1.1
16 ＜0.5 1.4
19 ＜0.5 1.5
22 ＜0.5 1.5
25 ＜0.5 1.5
28 ＜0.5 1.4
30 ＜0.5 1.5
33 ＜0.5 1.5
36 ＜0.5 1.4
39 ＜0.5 1.5
42 ＜0.5 1.4
45 ＜0.5 1.5
48 ＜0.5 1.4
51 ＜0.5 1.5
54 ＜0.5 1.4
57 ＜0.5 1.5
60 ＜0.5 1.4
63 ＜0.5 1.5
66 ＜0.5 1.4
69 ＜0.5 1.3
72 ＜0.5 0.1
74 0.15
75 170 0.4
上述结果表明，所选择的色普分离系统对于分离凝乳酶牛胃蛋白酶是有效的。
Claims (7)
1、一种凝乳酶，其特征在于：体外凝乳活力≥8000U/g，生物活性更强，凝乳速度块，不影响乳制品风味；用于治疗各类慢性胃炎、胃下垂、食欲不振和婴儿消化不良和腹泻，有更好的疗效。
2、本发明还公开了一种凝乳酶酶的透析与亲和层析相结合的制备方法，依次包括如下步骤：
【1】取新鲜的小牛胃粘膜，加适量盐酸调节到PH2.0，活化后过滤，得PH2.0的活化滤液。
【2】这些提取物在缓冲液A中进行电渗析，条件如下：20mmol/L柠檬酸和0.1％(w/v)安息香酸钠，pH2.45～2.55，传导率2.3mS/cm。
【3】取渗析出来的小牛胃膜，浓度大约22CHU/mL，PH2.4～2.5、传导率4.3mS/cm，用于以下的分离实验。
【4】阳离子交换树脂(HZ-202强酸性)悬浮于缓冲液A，然后填充一根10cm柱(FPLC.TM.)，用40mL缓冲液A平衡离子交换柱，然后加入上述小牛胃膜渗析液。
【5】用缓冲液B洗提出有效成分；缓冲液B成分：10％NaCl溶解于0.05mol/L磷酸盐，pH5.9，传导率114mS/cm。以2mL为一个片断收集洗脱液，用RIE分析凝乳酶和胃蛋白酶；收集含量高的片断，冻干即得成品凝乳酶。
【6】成品取样进行全项检测。
3、如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，选用清真宰牲场的小牛胃膜为主要原料，适应了向穆斯林国家的医药界供应食品原料的渠道。
4、如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤【2】中采用柠檬酸和安息香酸钠作为电渗析介质，取得了较好的分离效果。
5、如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤【4】中采用阳离子交换树脂(HZ-202强酸性)，既能很好的保护凝乳酶酶的活性，又达到了理想的分离效果。
6、如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤【5】中采用缓冲液B作为洗提溶剂，能够比较完全的洗脱凝乳酶，延长树脂的使用寿命。
7、如权利要求2所述的制备方法，其特征在于所得凝乳酶酶为无菌，体外凝乳活力≥8000U/g，生物活性更强，凝乳速度块，不影响乳制品风味。
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|---|---|---|---|---|
| WO2008114089A2 (en) * | 2006-11-30 | 2008-09-25 | Ou Nutrichym | Chymosin for the prevention and treatment of gastrointestinal disorders |
| CN103555699A (zh) * | 2013-11-11 | 2014-02-05 | 葵花药业集团(唐山)生物制药有限公司 | 一种提高复合凝乳酶效价的工艺 |
| CN103555698A (zh) * | 2013-11-11 | 2014-02-05 | 葵花药业集团(唐山)生物制药有限公司 | 一种复合凝乳酶的提取工艺 |
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