CN1911457A - 复合型纳米羟基磷灰石/医用高分子材料组织工程支架材料及制备方法 - Google Patents

Abstract

复合型纳米羟基磷灰石/医用高分子材料组织工程支架材料及制备方法。该支架材料由纳米羟基磷灰石成分和医用高分子材料成分构成具有相互贯通孔隙的骨架结构，其特征是在骨架结构材料中散布有带微孔结构的微球成分，微球与纳米羟基磷灰石/医用高分子成分的重量比＜2∶9，且微球成分的量不为0。将该比例量的微球与纳米羟基磷灰石/医用高分子复合成分的浆料及受热能分解产气的盐充分混合均匀后升温，使该盐类分解产生气体，再于≤－20℃条件下至少冷冻24小时后，冷冻干燥除去其中的水成分即得。该组织工程支架材料中具有空隙率高、连通性好孔隙，微球中负载的药物、生长因子等多种活性成分可具有良好的缓释效果。

Description

复合型纳米羟基磷灰石/医用高分子材料 组织工程支架材料及制备方法

技术领域

本发明涉及的是一种复合型的纳米羟基磷灰石/医用高分子材料组织工程支架材料及其制备方法。

背景技术

组织工程学是应用细胞生物学和工程学原理，以生物替代物为目的，研究、开发、修复和维护或改善人体组织和部分器官功能和形态的一门科学，是用于修复和治疗组织或器官的功能障碍或丧失的一种重要措施和手段。

关于由纳米羟基磷灰石与各种医用高分子材料制备而成的纳米羟基磷灰石/高分子复合材料为基础的组织工程修复材料和/或其制备方法，目前已多有报道。如，公开号为CN1460526A的专利文献公开了一种由1/1～1/0.3组成形式的羟基磷灰石/医用聚酰胺类成分的多孔型骨修复体。公告号分别为CN1200043C、CN1225290C和CN1230210C的中国专利文献分别公开了一种以由重量比为0.25/1～1.5/1的纳米羟基磷灰石/医用聚酰胺66形式的复合生物活性多孔材料、一种以摩尔比为0.25/1～1.5/1的纳米羟基磷灰石/医用聚酰胺成分复合组织工程支架材料、和一种由重量比为8/2～2/8的聚酰胺/纳米羟基磷灰石系列生物医用复合材料的制备方法。公告号CN1238062C的中国专利公开了一种纳米磷灰石占复合材料总重量的5％～60％的磷灰石/医用高分子多元生物复合材料。公开号CN1765423A的文献中提出了一种磷灰石的含量为高分子材料重量的0.1～9倍的纳米磷灰石/医用高分子成分生物活性多孔支架材料的制备方法。

组织工程技术成功运用的关键是多孔性支架材料的选择和制备。理想的组织工程支架除应具备如良好的生物相容性和良好的三维、网络贯通的多孔结构，孔隙率一般应在75％～95％之间并具有适合的孔径大小，以及具有一定的生物力学性能和易于成型外，还提出了应能携带如骨诱导蛋白、细胞生长因子及抗生素等活性物质及相关药物成分的要求。

目前制备孔隙率达到90％以上的高度多孔支架材料的方法，主要可有纤维粘接、溶液浇铸/粒子沥滤、熔融成型、气体发泡、相分离/乳化、冷冻干燥、热致凝胶化等。其中以粒子沥滤法、冷冻干燥法、气体发泡技术最为常见和引人注目，其中气体发泡技术采用气体作为致孔剂，所得支架的孔隙率可高达93％，孔直径可达100μm.该技术的优点是不需滤除过程，也避免了使用有机溶剂。将其与相转移法联用即可保证成孔率又可保证孔间的连通。

在支架材料中载药或者相关生长因子的方法，目前大多是将这些活性成分直接放入支架材料中。这些材料被植入体内后，由于大量的药物等活性成分同时接触体液，会造成药物的突释，不利于组织生长需要。而对于有些药物等活性成分则是需要通过其长期释放而产生效果。因此制备具有良好的药物等活性成分缓释效果，并且成孔良好、空隙率高、连通性好的组织支架已经成为研究的重点。

另一方面，微球作为一种药物缓释载体目前已经得到了公认。目前制作微球的方法有乳化法、膜乳化法、微管道乳化法、喷雾干燥法等。在微球中载入药物或其它活性成分，能具有明显的缓释效果，既可以保持有效药物浓度，又可以保持长期的药物释放时间，同时可以有效减低由于药物突释带来的毒附作用。给长期用药的患者带来了福音，目前缓释微球也是药物释放研究的一个重点领域。

发明内容

针对上述情况，本发明首先的目的是提供一种在纳米羟基磷灰石/医用高分子材料组织工程支架材料载有微球成分的复合型纳米羟基磷灰石/医用高分子材料组织工程支架材料，以满足目前对组织工程支架材料日益提高的性能要求。在此基础上，本发明的另一个目的是提供这种载微球成分的复合型纳米羟基磷灰石/医用高分子材料组织工程支架材料的制备方法。

本发明复合型纳米羟基磷灰石/医用高分子材料组织工程支架材料，由纳米羟基磷灰石成分和医用高分子材料成分构成具有相互贯通孔隙的骨架结构，在骨架结构材料中散布有带微孔结构的微球成分，其中微球与纳米羟基磷灰石/医用高分子材料成分的重量比＜2∶9，且微球成分的量不为0。

其中，所说的由纳米羟基磷灰石成分和医用高分子材料成分构成具有相互贯通孔隙的纳米羟基磷灰石/医用高分子材料骨架结构，可以为上述文献等目前已有报道的各种相应形式的纳米羟基磷灰石/医用高分子材料、制备方法、以及由其制成的组织工程支架材料，如已有报道的不同比例组成形式的纳米羟基磷灰石与多种医用聚酰胺类成分复合材料、纳米羟基磷灰石与壳聚糖形式的复合材料材料，以及进一步制备成的相应支架结构。

目前制作微球的方法有乳化法，膜乳化法等。例如常用的乳化法，是运用油水不相容的原理，在油相中加入表面活性剂(如吐温80、司盘85、聚乙二醇、硬脂酸钠等等)，在一定搅拌速度的条件下(如一般为200转～4000转/分钟)加入由水溶性高分子成分制备成的水溶液，使水溶性高分子溶液均匀的分散在油相中形成微乳液，液滴在表面张力条件下成球状。在微乳液稳定后可形成凝胶，收集形状固定后的凝胶并洗涤即可得到微球。常用的能溶于水并形成粘稠液体的高分子物质有：聚乙烯醇水溶液、壳聚糖水溶液、聚乙烯醇二甲亚砜溶液，海藻酸钠水溶液，明胶水溶液等。水溶性高分子具有增稠作用，其机理与氢键，疏水作用及静电相互作用有关，离子型水溶性高分子一般比非离子水溶性高分子有更强的增稠能力。其它还有溶剂蒸发法，喷雾干燥法，膜乳化法等，也可以制备得到微球。本发明所说的微球以采用乳化法方式制备的为佳。其中，在200转～4000转/分钟的搅拌下，高分子水溶液在油相中分散可形成微乳液。其中搅拌速度大小可影响乳液中乳滴形成的大小，搅拌速度越大，制备出的微球颗粒越小，因此通过改变和控制搅拌速度，可以调整和控制得到所需适当大小的微球成分。

在本发明的上述组织工程支架材料中，所说的微球成分除可以使用目前已有报道的由不同制备方式得到的和/或不同形式的微球外，优选的是采用乳化法/内凝胶法由壳聚糖与海藻酸钠两种成分，制备得到以海藻酸钠成微球和壳聚糖为包衣的壳聚糖/海藻酸钠复合微球。其具体制备方法可参见Antonio J.Ribeiro等在EuropeanJournal of Pharmaceutical Sciences报道的以钙离子为凝胶剂制备的海藻酸钠成微球和壳聚糖为包衣的壳聚糖/海藻酸钠复合微球。这由两种成分形成的复合微球，不但可以克服目前单一壳聚糖等成分制备微球时需引入的对身体不利的有机化合物，而且壳聚糖还可以与海藻酸钠形成聚电质，有利于提高微球力学性能。例如，已有广泛报道的以戊二醛为交联剂制备的壳聚糖微球，其中的戊二醛虽然交联效果良好，但因有致癌性，对生物体会造成不良影响；以硫酸钠、柠檬酸钠、多聚磷酸等为壳聚糖交联剂，由于其交联效果不佳又限制了其应用。而以海藻酸钠为原料的微球，已有文献报导其与钙离子等多种离子可以形成强度较大的凝胶，因此在海藻酸钠乳液中加入这些凝胶成分后，海藻酸钠微球可得以固定。而所用的钙离子，锌离子，镁离子等凝胶剂则对人体几无不利影响。在此基础上再加入壳聚糖，通过其相互作用而与海藻酸钠形成聚电质而彼此提高力学强度，从而提高了微球的力学强度。

上述所说的壳聚糖/海藻酸钠复合微球，特别推荐使用的是按下述方式制备所成的微球：将重量/体积比为1％～2.5％的海藻酸钠水溶液在200～4000转/分钟的搅拌速度下，逐滴加入到已混合有体积含量为1％～5％表面活性成分的水不溶性有机相液体，如液体石蜡、松节油、苯酚、菜油、豆油、三氯甲烷，甲烷、二氯甲烷、一氯甲烷、石油醚等与水不混溶的有机相溶剂，充分混合均匀，使海藻酸钠在油相中成球并且均匀分散后加入如钙离子，锌离子，镁离子等凝胶剂，混合均匀。以使用碳酸钙凝胶剂为例，此时可以通过向乳状液中加入醋酸，使碳酸钙分解释放出钙离子，并同时放出二氧化碳，钙离子可以使海藻酸钠形成为凝胶，使海藻酸钠微球得以固定并具有一定强度，放出的二氧化碳则可同时在微球中形成微孔。然后，在充分搅拌下将由所说比例量的壳聚糖配制成重量/体积比为2％～3％也混合有体积含量为1％～5％表面活性成分的壳聚糖水溶液加入其中，搅拌下充分反应(例如一般至少可反应1小时)后，过滤洗涤并冷冻干燥后得到所说的壳聚糖/海藻酸钠复合微球。

表面活性剂以选用低毒或者无毒的为宜，如常用的肥皂、硬脂酸钠盐、十二烷基硫酸钠盐和十二烷基苯磺酸钙盐等羧酸盐、硫酸盐和磺酸盐形式的型乳化剂；N-十二烷基二甲胺等正离子型乳化剂；对辛基苯酚聚氧乙烯醚等常用的有聚氧乙烯醚类和聚氧丙烯醚类非离子型乳化剂等。表面活性剂的用量一般可为1％～10％，过少时达不到理想的乳化效果，过多则无必要。

必要时，还可以按常规方式使用适当形式的凝胶剂，更有助于凝胶的形成。例如在上述的海藻酸钠微乳液中还可以预先加入钙离子，或如锌离子、铜离子、镁离子等其它凝胶剂，使其与海藻酸钠充分反应后，再使两种微乳液混合得到复合微球。

微球已被证明能拥有良好的药物负载和缓释性能，可做为良好的药物载体。因此，在组织工程支架材料中载入了微球，特别是在材料中以大致均匀形式散布的微球，可以为药物或者其它活性成分，如常用的骨形态发生蛋白(BMPs)，转化生长因子-β(TGF-β)，胰岛素样生长因子(IGF)，成纤维细胞生长因子(FGFs)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，血管内皮细胞生长因子(VRGF)，血小板源性生长因子(PDGF)，肿瘤坏死生长因子(TNF)等组织生长因子成分，和/或青霉素，庆大霉素，妥布霉素，万古霉素，黄连素等抗生素成分，及黄芪，黄芪苷，三七，三七总苷，丹参，淫羊藿等药物成分，和/或包括铜、锌、银、镧、铈、钕金属离子及其相应的硫酸铜、氯化铜、硫酸锌、氯化锌、硝酸银、硝酸镧、硝酸铈、硝酸钕盐类化合物等无机抗菌成分，以及所需要的其它活性物质成分的良好载体，既达到保护这些物质成分，又能发挥出缓释的效果。

本发明上述复合型纳米羟基磷灰石/医用高分子材料组织工程支架材料的基本制备方法，是采用共混法将适当的微球成分，例如上述的壳聚糖/海藻酸钠复合微球，与前述已有文献报道的纳米羟基磷灰石/医用高分子材料的浆料共同混合均匀，随后用气体发泡法和相转移法，即可得到本发明的载微球复合型纳米羟基磷灰石/医用高分子材料组织工程支架材料。

以上述的壳聚糖/海藻酸钠的复合微球成分，和以纳米羟基磷灰石/壳聚糖形式的复合成分浆料为例，其载微球的复合型组织工程支架材料的基本制备过程是：将微球成分、纳米羟基磷灰石/医用高分子复合成分的浆料、以及在≤85℃加热条件下可分解产生气体的盐类成分(如常用的碳酸氢钠或碳酸氢铵等)充分混合均匀，升温至≤85℃使所说盐类成分分解产生气体。对混合物料的升温速率的优选方式是为0.5～3℃/分钟。于≤-20℃条件下冷冻至少24小时，再经冷冻干燥除去其中的水成分，得到所说的载微球复合型组织工程支架材料。其中，所说的微球成分与纳米羟基磷灰石/医用高分子材料成分的重量比＜2∶9，且微球成分的量不为0，所说纳米羟基磷灰石/医用高分子复合成分浆料中水含量的重量比例为50％～60％。

其中，所说的纳米羟基磷灰石/医用高分子复合成分浆料为纳米羟基磷灰石与壳聚糖复合成分的浆料，纳米羟基磷灰石与壳聚糖复合成分的重量比例范围是1/9～8/2；所说的微球成分可以为上述以海藻酸钠成微球和壳聚糖为包衣的壳聚糖/海藻酸钠复合微球。

试验显示，在纳米羟基磷灰石/医用高分子复合成分中加入的微球量过大，会降低所得组织工程支架材料的力学性能，也会降低材料中孔隙的贯通性。

加入可反应产气的盐类，通过其在受热条件下分解产生的气体，可以在混合浆料原料中形成气泡。这些盐类成分的用量一般可为复合材料成分质量的4％～6％左右。继而将其冷冻，除可以使材料中由产气盐类分解所形成的微孔在冷冻室中因冰冻而变得坚硬从而得到固定外，还可以使浆料混合物中的水分在其中形成冰晶，在随后的冷冻干燥过程中，冰晶干燥后即留下小孔，从而也保证了孔隙间的连通，并且坚硬的固态冰晶也有进一步增强材料力学性能的作用。

通过测试表明，以上述方式制备得到的多孔纳米羟基磷灰石/壳聚糖组织工程支架中，微球没有团聚现象，也没有发生变形，微球与支架结合紧密，分布均匀。支架孔隙率高，孔隙贯通。是一种具有药物缓释效果的性能优良的组织工程用支架材料。

除上述的载有壳聚糖/海藻酸钠复合微球的复合型纳米羟基磷灰石/壳聚糖组织工程支架材料外，以前述文献记载形式的纳米羟基磷灰石/医用高分子材料浆料，及其它成分/方法得到微球成分为原料，制备相应的载微球复合型组织工程支架材料的方法，可参照上述的基本方法进行。

本发明上述运用气体发泡法，气体膨胀占据空间而形成微孔，在低温冷冻下通过相转移过程，即支架中的水在冷冻干燥状态下先形成为空间占位的冰，然后在真空状态下直接气化除去而留下占位形成的微孔，从而在对支架内部结构进行固定的同时，又能有效地在复合材料支架中形成微孔并保持孔间的贯通。通过在支架材料中均匀散布负载的微球成分，既能有效地使组织工程支架材料中加入有效浓度的细胞生长因子、中草药有效成分或者抗生素类药品，又可保持长期的释放效果，从为修复和治疗组织或器官提供了一种能同时具有修复或替换缺损器官和药物缓释两种功能的新型支架材料。

以下结合附图所示实施例的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均应包括在本发明的范围内。

附图说明

图1是以气体发泡及相转移的方法制备的未负载微球的多孔支架材料的微观形态。

图2是本发明采用内凝胶/乳化法制备的微球的扫描电镜照片。

图3是本发明方法制备的载微球多孔组织工程支架的扫描电镜图片。

具体实施方式

                          实施例1

载海藻酸钠/壳聚糖微球的纳米羟基磷灰石/壳聚糖组织工程支架的制备

1′：海藻酸钠/壳聚糖微球的制备

将壳聚糖原料加入到含1％(w/v)醋酸水溶液中，搅拌使溶解，制备成3％(w/v)的壳聚糖醋酸水溶液备用。另将海藻酸钠原料溶入已加热并保持于70℃的去离子水中搅拌使溶解，制备得到2％(w/v)的海藻酸钠溶液备用。

在烧杯中倒入液体石蜡150ml和松节油50ml及4ml吐温80，搅拌均匀，得到含有2％(v/v)吐温80油混合相液体。所用的液体石蜡和松节油等油相材料的用量虽无需过多限定，但未有利于微球在油相中能有足够的分散而不致团聚，一般以为所加入溶液体积的2倍或更多为宜。

取备用的2％海藻酸钠溶液80ml，按0.01g/ml的量加入CaCO₃并混和均匀后，在转速为3000～3500转/min的搅拌条件下，以1～2滴/分钟的速度滴加到上述的混合油相液体中，随后按0.01ml/ml的量滴加在含有1％(v/v)吐温80的2ml液体石蜡中混合有0.8ml冰醋酸的混合溶液并混合均匀，反应1小时，使碳酸钙与醋酸反应，释放出钙离子作为凝胶剂，并同时有二氧化碳生成，在微球中形成微孔。

另取备用的3％壳聚糖溶液80ml与含有1％(v/v)吐温80的液体石蜡均匀混合稀释形成乳状液(用量多少无显著影响，为使其能在海藻酸钠溶液中有更理想的混合均匀程度，量大的效果一般常优于用量小)，随后加入到上述的海藻酸钠微球乳液中，保持转速为3000～3500转/分钟的搅拌约1小时，使壳聚糖与海藻酸钠微球充分作用后，抽滤洗涤再冷冻干燥，得到海藻酸钠/壳聚糖复合微球。其状态如图2所示，其中图2(b)是图2(a)中的局部放大状态。

2′：纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合材料浆料的制备

按照壳聚糖与纳米羟基磷灰石成分重量比70∶30的比例，将不含醋酸的3％(w/v)壳聚糖的水溶液与纳米羟基磷灰石浆料(含水率为80％)混合均匀，即，取壳聚糖500ml于600ml烧杯中，再称取含6.43g纳米羟基磷灰石的浆料32.15克，在转速为300～500转/分钟的持续搅拌下加入到壳聚糖溶液中混合，并保持温度在60℃～70℃，至混合浆料的含水率达到50％～60％时停止加热，得到纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合材料的浆料。

3′：载微球的纳米羟基磷灰石/壳聚糖组织工程支架的制备

取上述制备的微球5克，与纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合材料的浆料50ml混合均匀，在搅拌条件下以0.03g/ml的比例加入1.5克NaHCO₃与浆料充分混合均匀，之后置真空烘箱中加热，以1℃/分钟的升温速率控制温度在40℃～85℃，最后于85℃时保温5分钟。此时在微球与复合浆液混合物料中的NaHCO₃发生反应，产生部分二氧化碳及少量水蒸汽排出。随后取出放入-20℃冷冻室中速冻并保持24小时，对已经形成的孔隙进行固定，并使未除去的水形成冰晶再次制孔。将冷冻后的复合物料放入冷冻干燥机中冷冻干燥，除去其中冰晶状态的水，即得到所说的载微球组织工程支架材料。其状态如图3所示，其中图3(b)是图3(a)的局部放大状态。由图中清楚可见，基本呈均匀散在分布于支架材料表面的微球，没有团聚现象，也没有发生变形，微球与支架结合紧密。图1所示的是与之对照的未负载有微球成分的单一纳米羟基磷灰石/壳聚糖组织工程支架材料的微观状态，其中图1(b)是图1(a)的局部放大状态。

                    实施例2

载壳聚糖微球的纳米羟基磷灰石/壳聚糖组织工程支架的制备

1′：壳聚糖微球的制备

将壳聚糖原料加入到含2％(w/v)醋酸水溶液中，搅拌使溶解，制备成3％(w/v)的壳聚糖醋酸水溶液备用。

在烧杯中倒入液体石蜡100ml和松节油60ml及2.5ml吐温80和2.5ml司盘(span)，搅拌均匀，得到含有3.12％(v/v)吐温80/司盘油混合相液体.

取50％的戊二醛溶液2ml，与蒸馏水混合制备出含戊二醛10％的溶液10ml。再将其与10ml液体石蜡混合后备用。

取备用的3％壳聚糖溶液60ml，在转速为3300～3500转/min的搅拌条件下，以1～2滴/分钟的速度滴加到上述的混合油相液体中，半小时后，用分液漏斗以1～2滴/秒的速度向壳聚糖乳状液中滴入戊二醛与液体石蜡的混合液。搅拌3小时后，取出洗涤冷冻干燥，得到壳聚糖微球。

2′：纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合材料浆料的制备

按照壳聚糖与纳米羟基磷灰石成分重量比80∶20的比例，将3％壳聚糖溶液与纳米羟基磷灰石浆料(其含水率为80％)在搅拌下混合均匀，即取壳聚糖溶液300ml于600ml烧杯中，再称取含2.25g纳米羟基磷灰石的浆料11.25克，在转速为300～500转/分钟的持续搅拌下加入到壳聚糖溶液中混合，并保持温度在60℃～70℃，至混合浆料的含水率达到50％～60％时停止加热，得到纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合材料的浆料。

3′：载微球的纳米羟基磷灰石/壳聚糖组织工程支架的制备。

取上述制备的壳聚糖微球3克，与纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合材料的浆料60ml混合均匀，在搅拌条件下以0.01g/ml的比例加入0.6克NH₄HCO₃与浆料充分混合均匀，之后置真空烘箱中加热，以1℃/分钟的升温速率控制温度在40℃～45℃，保温5分钟。此时在微球与复合浆液混合物料中的NH₄HCO₃发生反应，放出二氧化碳和氨气及部分水蒸汽排出。随后取出放入-20℃冷冻室中速冻并过夜，对已经形成的孔隙进行固定，并使未除去的水形成冰晶再次制孔。将冷冻后的复合物料放入冷冻干燥机中冷冻干燥，除去其中冰晶状态的水，即得到所说的载微球组织工程支架材料。

                       实施例3

载海藻酸钠微球的纳米羟基磷灰石/壳聚糖组织工程支架的制备

1′：海藻酸钠微球的制备

将海藻酸钠配制成2％的溶液备用。

在烧杯中倒入液体石蜡100ml及2.5ml吐温80，搅拌均匀，得到含有2.5％(v/v)吐温80混合油相液体.

取CaCl₂10g和ZnCl₂5g加入10ml蒸馏水中，配制成溶液备用。

取备用的2％海藻酸钠溶液60ml，在转速为3000～3400转/min的搅拌条件下，以1～2滴/分钟的速度滴加到上述的混合油相液体中，半小时后，用分液漏斗以1～2滴/秒的速度向海藻酸钠溶液乳状液中滴入CaCl₂和ZnCl₂的混合油相液体。搅拌3小时后，待海藻酸钠充分形成凝胶后，取出洗涤冷冻干燥，得到壳聚糖微球。

2′：纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合材料浆料的制备

按照壳聚糖与纳米羟基磷灰石成分重量比80∶20的比例，将配制好的3％壳聚糖溶液与纳米羟基磷灰石浆料(其含水率为80％)在搅拌下混合均匀，即取壳聚糖溶液200ml于600ml烧杯中，再称取含6.0g纳米羟基磷灰石的浆料30克，在转速为300～500转/分钟的持续搅拌下加入到壳聚糖溶液中混合并保持温度60℃～70℃，至混合浆料的含水率达到50％～60％时停止加热，得到纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合材料的浆料。

3′：载微球的纳米羟基磷灰石/壳聚糖组织工程支架的制备。

取上述制备的海藻酸钠微球5克，与纳米羟基磷灰石/壳聚糖复合材料的浆料100ml混合均匀，在搅拌条件下以0.01ml/ml的比例加入双氧水1ml与浆料充分混合均匀，之后置真空烘箱中加热，以0.5摄氏度/分钟的速率升温至温度60℃左右并保温20分钟。此时在微球与复合浆液混合物料中的双氧水受热分解释放出氧气和部分水蒸气。随后取出放入-20℃冷冻室中速冻并过夜，对已经形成的孔隙进行固定，并使未除去的水形成冰晶再次制孔。将冷冻后的复合物料放入冷冻干燥机中冷冻干燥，除去其中冰晶状态的水，即得到所说的载微球组织工程支架材料。

                             实施例4

1′：海藻酸钠/壳聚糖微球的制备

将壳聚糖原料加入到含1％(w/v)醋酸水溶液中，搅拌使溶解，制备成3％(w/v)的壳聚糖醋酸水溶液备用。另将海藻酸钠原料溶入已加热并保持于70℃的去离子水中搅拌使溶解，制备得到2％(w/v)的海藻酸钠溶液备用。

在烧杯中倒入液体石蜡150ml和松节油50ml及4ml吐温80，搅拌均匀，得到含有2％(v/v)吐温80油混合相液体。所用的液体石蜡和松节油等油相材料的用量虽无需过多限定，但未有利于微球在油相中能有足够的分散而不致团聚，一般以为所加入溶液体积的2倍或更多为宜。

取备用的2％海藻酸钠溶液80ml，按0.01g/ml的量加入CaCO₃并混和均匀后，在转速为3000～3500转/min的搅拌条件下，以1～2滴/分钟的速度滴加到上述的混合油相液体中，随后按0.01ml/ml的量滴加在含有1％(v/v)吐温80的2ml液体石蜡中混合有0.8ml冰醋酸的混合溶液并混合均匀，反应1小时，使碳酸钙与醋酸反应，释放出钙离子作为凝胶剂，并同时有二氧化碳生成，在微球中形成微孔。

另取备用的3％壳聚糖溶液80ml与含有1％(v/v)吐温80的液体石蜡均匀混合稀释形成乳状液(用量多少无显著影响，为使其能在海藻酸钠溶液中有更理想的混合均匀程度，量大的效果一般常优于用量小)，随后加入到上述的海藻酸钠微球乳液中，保持转速为3000～3500转/分钟的搅拌约1小时，使壳聚糖与海藻酸钠微球充分作用后，抽滤洗涤再冷冻干燥，得到海藻酸钠/壳聚糖复合微球。

2′：纳米羟基磷灰石/医用聚酰胺66(PA66)复合材料浆料的制备

纳米羟基磷灰石与PA66的比例为50∶50，取10克PA66溶解于乙醇/氯化钙混合溶液中，溶液共300ml，再称取10克羟基磷灰石干粉，预先放入干燥箱中，除去所含的水分，然后与PA66溶液混合均匀，可以得到纳米羟基磷灰石/PA66复合材料浆料。

3′：载微球的纳米羟基磷灰石/医用聚酰胺66组织工程支架的制备。

取上述制备的海藻酸钠/壳聚糖复合微球3克，与纳米羟基磷灰石/PA66复合材料的浆料100ml混合均匀，于加热套中保持60摄氏度的恒温加热直到乙醇释放完全，即得到所说的载微球组织工程支架材料。

Claims (10)

1.复合型纳米羟基磷灰石/医用高分子材料组织工程支架材料，由纳米羟基磷灰石成分和医用高分子材料成分构成具有相互贯通孔隙的骨架结构，其特征是在骨架结构材料中散布有带微孔结构的微球成分，其中微球成分与纳米羟基磷灰石/医用高分子材料成分的重量比＜2∶9，且微球成分的量不为0。

2.如权利要求1所述的复合型纳米羟基磷灰石/医用高分子材料组织工程支架材料，其特征是所说的微球成分为以海藻酸钠成微球和壳聚糖为包衣的壳聚糖/海藻酸钠复合微球。

3.如权利要求1所述的复合型纳米羟基磷灰石/医用高分子材料组织工程支架材料，其特征是所说的医用高分子材料为壳聚糖，纳米羟基磷灰石与壳聚糖的质量比范围是1/9～8/2。

4.如权利要求1至3之一所述的复合型纳米羟基磷灰石/医用高分子材料组织工程支架材料，其特征是所说的微球中负载有包括药物或生物生长因子在内的活性成分。

5.制备权利要求1所述的载微球复合型纳米羟基磷灰石/医用高分子材料组织工程支架材料的方法，其特征是将微球成分和纳米羟基磷灰石/医用高分子复合成分的浆料，以及在≤85℃加热条件下可分解产生气体的盐类成分充分混合均匀，升温至≤85℃使所说盐类成分分解产生气体后，于≤-20℃条件下冷冻至少24小时，再经冷冻干燥除去其中的水成分，得到所说的组织工程支架材料，其中所说的微球成分与纳米羟基磷灰石/医用高分子材料成分的重量比＜2∶9，且微球成分的量不为0，所说纳米羟基磷灰石/医用高分子复合成分浆料中水含量的重量比例为50％～60％。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征是所说的纳米羟基磷灰石/医用高分子复合成分浆料为纳米羟基磷灰石与壳聚糖复合成分的浆料，纳米羟基磷灰石与壳聚糖复合成分的重量比例范围是1/9～8/2。

7.如权利要求5或6所述的制备方法，其特征是所说的微球成分为由壳聚糖与海藻酸钠所形成的以海藻酸钠成微球和壳聚糖为包衣的壳聚糖/海藻酸钠复合微球。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征是所说的壳聚糖/海藻酸钠复合微球是按下述方式所成的微球：将重量/体积比为1％～2.5％的海藻酸钠水溶液在200～4000转/分钟的搅拌速度下，逐滴加入到已混合有体积含量为1％～5％表面活性成分的水不溶性有机相液体充分混合均匀，并加入凝胶剂，然后在充分搅拌下将由所说比例量的壳聚糖配制成重量/体积比为2％～3％也混合有体积含量为1％～5％表面活性成分的壳聚糖水溶液加入其中，搅拌下充分反应后，过滤洗涤并冷冻干燥后得到所说的壳聚糖/海藻酸钠复合微球。

9.如权利要求5所述的制备方法，其特征是所说的对混合物料的升温速率为0.5～3℃/分钟。

10.如权利要求5所述的制备方法，其特征是所说的能分解产生气体的盐类成分为碳酸氢钠或碳酸氢铵。

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