CN105148319A - 复合微球的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种复合微球的制备方法，包括如下步骤：步骤1)制备复合微球的大球、小球，采用生物陶瓷材料且表面具有开孔结构的空心陶瓷多孔微球作为大球，大球上载抗炎症药物；采用高分子材料且表面为多孔结构的微球作为小球，小球上载促血管生长因子；步骤2)将大球、小球复合，将大球、小球混合组装，即得到大球载小球的复合微球。本方法制备出的复合微球大球和小球可以同载两种不同的药物，起到双重药物释放的目的。

Description

复合微球的制备方法

技术领域

本发明涉及生物陶瓷材料技术领域，更为具体地，涉及一种复合微球的制备方法。

背景技术

创伤、肿瘤及感染等原因所致的大段骨缺损是骨科面临的难题。近年来迅猛发展的骨组织工程和再生医学为骨缺损修复带来的光明前景已初见端倪。微球是骨修复用生物材料领域一种重要的材料形式，与常规形式的生物材料相比，微球具有如下特点和性能：1)具有微/纳米尺寸的微球，由于具有较小的尺寸和较大的比表面积，已被广泛用作药物控释载体。2)通过微球表面修饰，微球可以对环境温度、pH、磁场、超声、辐射等因素产生快速的响应。3)微球可以作为致孔剂，提高传统块体支架材料的孔隙率，有利于组织的长入，同时改善材料的力学性能。4)微球作为微反应器，诱导磷灰石在其表面矿化，有利于骨组织再生。5)微球本身固有的球形属性使其具有良好的可注射性，可用于微创治疗，并在修复复杂部位的骨缺损失时容易成型。6)在微球内制作较大直径的孔道，使之可容纳细胞生存，微球即为一种组织工程支架，作为可注射支架材料应用于微创治疗。因此，微球材料是目前生物材料领域发展较快以及应用前景较好的材料类型之一。

生物陶瓷材料具有良好的骨传导性，是细胞黏附生长的重要支架材料，但是较难降解，且陶瓷载药性能较差，一般只能通过表面吸附负载药物，释放较快。而生物高分子微球，具有较好的降解性能，可以通过乳化包裹的形式载药，且药控释性能较好。高分子微球降解产生的酸性物质可以促进陶瓷的降解，并可向骨缺损部位提供有益的硅、钙、磷离子。因此，可以将二者结合构建一种大球载小球的复合微球，大球作为一种良好的骨组织工程支架材料，小球作为药物载体材料，两者结合构成一种较好的载药微球骨修复材料。

植入材料作为异物进入体内后，首先会引起组织的炎症反应，而炎症反应持续存在会延长骨愈合的时间。随着材料的降解和骨组织的再生，新生组织内血管会逐渐形成，能够促进血管形成的材料对骨再生也会起到良好的促进作用。因此，在具有能够促进成骨再生的材料上控释抗炎症药物、促血管生长因子或促干细胞成骨分化骨生长因子将会对成骨再生有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种复合微球的制备方法，制备出的复合微球的大球上可以载抗炎症药物，小球上可以载促血管生长因子或促干细胞成骨分化骨生长因子，能够有效促进血管形成以及骨组织再生，缩短骨愈合的时间。

本发明的目的是这样实现的：

一种复合微球的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤1)制备复合微球的大球、小球

采用生物陶瓷材料作为大球，该大球是以陶瓷粉末通过乳化法制备具有一个开孔结构的空心陶瓷微球，以双重乳化法制备具有多孔结构的高分子微球，高分子微球直径小于陶瓷微球的1/10；

步骤2)将大球、小球复合

将大球、小球混合组装，即得到大球载小球的复合微球。

为了使大球和小球能有效结合。在步骤1)、步骤2)之间将小球表面使用聚醚酰亚胺(Polyetherimide,PEI)改性。

为了实现PEI改性，优选地，小球表面使用PEI改性的方法为：向小球中加入PEI溶液，将小球、PEI溶液的混合物放在摇床上振荡，使小球表面均匀吸附PEI，然后将小球、PEI溶液的混合物离心，除去未牢固吸附的PEI。

为了达到所需的改性效果，优选地，所述PEI溶液的浓度为0.01-0.5％，将小球在PEI溶液中搅拌7-17h后，将小球、PEI溶液的混合物放在摇床上振荡，摇床的震荡速度为120rpm，震荡时间为4h，小球与PEI的混合物用二次水离心，控制离心速度7000rpm、离心时间10min，反复离心3次，以除去未牢固吸附的PEI。

为了使小球与大球混合后组装到一起，优选地，步骤2)中大球、小球混合组装的方法为：将小球移入离心管中，向离心管中加入二次水，再向离心管中加入大球，然后将离心管置于摇床上振荡2-6h，离心后冷冻干燥，即可将小球嫁接到大球表面。

能够有效促进血管形成以及骨组织再生，缩短骨愈合的时间，优选地，在步骤1)中，大球通过表面吸附载抗炎症药物，小球通过双重乳化包裹促血管生长因子。

为了制备出所需的小球，并使小球载促血管生长因子，优选地，所述小球通过双重乳化包裹载促血管生长因子。

为了使抗炎症、促血管生长的效果更好，以及使机体内具有合适的药物浓度，优选地，所述抗炎症药物为地塞米松(Dexamethasone,DEX)，所述DEX的药物浓度为5-15mg·mL^-1；所述促生长因子为血管内皮生长因子(Vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)；所述VEGF的药物浓度为50-200ng·mL^-1。

为了使大球可以吸附更多的抗炎症药物，以及更好地起到组织工程支架材料的作用，优选地，所述大球为空心球。

为了实现合适的药物释放量以及释放时间，优选地，所述大球的直径为400-600μm，所述小球的直径为20-40μm。

优选地，所述大球的材料采用硅酸钙、羟基磷灰石、磷酸三钙及羟基磷灰石/磷酸三钙双相陶瓷中的其中一种；所述小球的材料采用聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolicacid)，PLGA)。硅酸钙、羟基磷灰石、磷酸三钙陶瓷和羟基磷灰石/酸酸三钙双相陶瓷本身具有良好的骨传导性，其降解后产生的硅、钙、磷等成分能够刺激干细胞向成骨细胞转化。因此，将具有开孔结构的硅酸钙、羟基磷灰石、磷酸三钙陶瓷、羟基磷灰石/酸酸三钙双相陶瓷空心微球作为药物控释载体，同时还会起到组织工程支架材料的作用。PLGA由两种单体——乳酸和羟基乙酸随机聚合而成，是一种可降解的功能高分子有机化合物，具有良好的生物相容性、无毒、良好的成囊和成膜的性能，被广泛应用于制药、医用工程材料和现代化工业领域。在美国PLGA通过FDA认证，被正式作为药用辅料收录进美国药典。

由于采用了上述技术方案，本发明具有如下有益效果：

本发明方法制备出的复合微球通过大球与小球结合载不同的药物，在大球表面控释抗炎症的DEX，可以抑制植入过程中的炎症反应，通过嫁接在大球表面的小球控释促血管再生作用的VEGF。大球释放DEX速率较快，在修复前期能快速起到抗炎症的作用；而PLGA降解较慢，后期持续地释放VEGF，能促进新生血管的生成，两种药物的双重控释，大球同时可起到骨组织工程支架材料的作用，将共同促进骨组织再生，为大段骨缺损修复提供新的思路。

本发明方法制备出的复合微球相对于现有技术具有如下优点：

1.和普通微球的使用方法一样，使用非常便利；

2.通过两种药物的双重控释，能维持正常的血药浓度，不引起药物积累中毒，对正常细胞、组织的毒副作用小；

3.血药浓度稳定，提高疗效、安全迅速。

附图说明

图1为本发明的复合微球SEM图片。

具体实施方式

参见图1，为本发明方法制备出的复合微球，复合微球的制备方法包括如下步骤：

步骤1)制备复合微球的大球、小球

采用生物陶瓷材料且表面为多孔结构的微球作为大球，所述大球的材料优选为硅酸钙、羟基磷灰石、磷酸三钙及羟基磷灰石/磷酸三钙双相陶瓷中的其中一种；所述大球为空心球，大球上通过表面吸附载抗炎症药物，优选地，所述抗炎症药物为DEX，所述DEX的药物浓度为5-15mg·mL^-1，所述大球的直径为400-600μm，优选为500μm。

采用高分子材料且表面为多孔结构的微球作为小球，所述小球的材料优选为PLGA。小球上载生长因子，优选地，所述生长因子为VEGF；所述VEGF的药物浓度为50-200ng·mL^-1，所述小球的直径为20-40μm，优选为30μm。所述小球通过双重乳液法制备，小球通过双重乳化包裹载促血管生长因子。

为了使大球和小球能有效结合，将小球表面使用聚醚酰亚胺(Polyetherimide,PEI)改性。为了实现PEI改性，优选地，小球表面使用PEI改性的方法为：向小球中加入PEI溶液，将小球、PEI溶液的混合物放在摇床上振荡，使小球表面均匀吸附PEI，然后将小球、PEI溶液的混合物离心，除去未牢固吸附的PEI。为了达到所需的改性效果，优选地，所述PEI溶液的浓度为0.01-0.5％，将小球在PEI溶液中搅拌7-17h后，将小球、PEI溶液的混合物放在摇床上振荡，摇床的震荡速度为120rpm，震荡时间为4h，小球、PEI的混合物用二次水离心，控制离心速度7000rpm、离心时间10min，反复离心3次，以除去未牢固吸附的PEI。

步骤2)将大球、小球复合

将大球、小球混合组装，即得到大球载小球的复合微球。为了使小球与大球混合后组装到一起，优选地，步骤2)中大球、小球混合组装的方法为：将小球移入离心管中，向离心管中加入二次水，再向离心管中加入大球，混合后置于摇床上振荡4h，离心后冷冻干燥，即可将小球嫁接到大球表面。

实施例一

采用乳化法制备空心陶瓷微球，将0.5-2g硅酸钙陶瓷粉末分散到含有5-10mL含3-5％PVB的二氯甲烷溶液中，混合搅拌12-15h后滴入含有1-4％的PVA水溶液中，乳化搅拌1-4h后，筛分干燥，再在1100℃烧结保温2h后得到具有开孔的空心陶瓷小球。称量烧结好的陶瓷微球加入到浓度为50-500mg·mL^-1DEX溶液中，震荡12h，待陶瓷微球表面充分吸附DEX后真空干燥得到载DEX的陶瓷微球。

采用双重乳化法制备高分子小球的方法，用浓度为1-4％的PVA溶液配制含有50-200ng·mL^-1的VEGF溶液，并取0.5-1.5mLVEGF溶液滴入PLGA的二氯甲烷溶液中，油水比为10：1，超声乳化1-5分钟，再滴到1-4％的PVA乳化4-8h，离心分离并冷冻干燥得到具有多孔结构的且载药高分子微球。。

微球的组装：称取5-15mg载有VEGF的多孔PLGA微球作为复合微球的小球,并加入5ml的0.01-0.5％PEI溶液，混合后在速度为120rpm的摇床上振荡4h，混合均匀，使PLGA微球表面均匀吸附PEI。然后将混合物用二次水离心，控制离心速度7000rpm、离心时间10min，反复离心3次，除去未牢固吸附的PEI。将洗涤干净的PLGA微球移入离心管中，加入约1ml二次水，加入50-120mg吸附有DEX的硅酸钙空心微球，此微球是复合微球的大球，混合后置于摇床上振荡4h，离心后冷冻干燥，即可将PLGA嫁接到硅酸钙微球表面。制备的大球载小球的多级复合微球可以缓慢地释放抗炎症的DEX和促进血管生长的VEGF。

实施例二

采用乳化法制备空心陶瓷微球，将0.5-2g羟基磷灰石陶瓷粉末分散到含有5-10mL含3-5％PVB的二氯甲烷溶液中，混合搅拌12-15h后滴入含有1-4％的PVA水溶液中，乳化搅拌1-4h后，筛分干燥，再在1100℃烧结保温2h后得到具有开孔的空心陶瓷小球。称量烧结好的陶瓷微球加入到浓度为50-500mg·mL^-1DEX溶液中，震荡12h，待陶瓷微球表面充分吸附DEX后真空干燥得到载DEX的陶瓷微球。

采用双重乳化法制备高分子小球的方法，用浓度为1-4％的PVA溶液配制含有50-200ng·mL^-1的BMP2溶液，并取0.5-1.5mLBMP2溶液滴入PLGA的二氯甲烷溶液中，油水比为10：1，超声乳化1-5分钟，再滴到1-4％的PVA乳化4-8h，离心分离并冷冻干燥得到具有多孔结构且载有药物的高分子微球。。

微球的组装：称取5-15mg载有BMP2的多孔PLGA微球作为复合微球的小球,并加入5ml的0.01-0.5％PEI溶液，在速度为120rpm的摇床上振荡4h，混合均匀，使PLGA微球表面均匀吸附PEI。然后将混合物用二次水离心，控制离心速度7000rpm、离心时间10min，反复离心3次，除去未牢固吸附的PEI。将洗涤干净的PLGA微球移入离心管中，加入约1ml二次水，加入50-120mg吸附有DEX的硅酸钙空心微球，此微球是复合微球的大球，二者混合后置于摇床上振荡4h，离心后冷冻干燥，即可将PLGA嫁接到硅酸钙微球表面。制备的大球载小球的多级复合微球可以缓慢地释放抗炎症的DEX和促干细胞成骨分化的BMP2。

实施例三

采用乳化法制备空心陶瓷微球，将0.5-2g磷酸三钙陶瓷粉末分散到含有5-10mL含3-5％PVB的二氯甲烷溶液中，混合搅拌12-15h后滴入含有1-4％的PVA水溶液中，乳化搅拌1-4h后，筛分干燥，再在1100℃烧结保温2h后得到具有开孔的空心陶瓷小球。称量烧结好的陶瓷微球加入到浓度为50-500mg·mL^-1DEX溶液中，震荡12h，待陶瓷微球表面充分吸附DEX后真空干燥得到载DEX的陶瓷微球。

采用双重乳化法制备高分子小球的方法，用浓度为1-4％的PVA溶液配制含有50-200ng·mL^-1的TGF-β溶液，并取0.5-1.5mLBMP2溶液滴入PLGA的二氯甲烷溶液中，油水比为10：1，超声乳化1-5分钟，再滴到1-4％的PVA乳化4-8h，离心分离并冷冻干燥得到具有多孔结构的且载药高分子微球。。

微球的组装：称取5-15mg载有TGF-β的多孔PLGA微球作为复合微球的小球,并加入5ml的0.01-0.5％PEI溶液，在速度为120rpm的摇床上振荡4h，混合均匀，使PLGA微球表面均匀吸附PEI。然后将混合物用二次水离心，控制离心速度7000rpm、离心时间10min，反复离心3次，除去未牢固吸附的PEI。将洗涤干净的PLGA微球移入离心管中，加入约1ml二次水，加入50-120mg吸附有DEX的硅酸钙空心微球，此微球是复合微球的大球，二者混合后置于摇床上振荡4h，离心后冷冻干燥，即可将PLGA嫁接到硅酸钙微球表面。制备的大球载小球的多级复合微球可以缓慢地释放抗炎症的DEX和促干细胞成骨分化的TGF-β。

大球载小球的结构可以同时释放两种药物，结合陶瓷微球作为组织工程支架，利用其良好的生物相容性，可以共同起到促进骨组织再生的作用。陶瓷微球与高分子微球的有效组装构建的大球载小球的复合微球的上述性能，本发明提供的大球载小球的复合微球可以作为骨缺损填充材料，可以显著地提高骨创伤和缺损愈合的能力，是一种新型的骨修复材料。

如上参照附图以示例的方式描述了根据本发明提出的大球载小球的复合微球的制备方法。但是，本领域技术人员应当理解，对于上述本发明所提出的大球载小球的复合微球的制备方法，还可以在不脱离本发明内容的基础上做出各种改进，因此，本发明的保护范围应当由所附的权利要求书的内容确定。

Claims (10)

1.一种复合微球的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤1)制备复合微球的大球、小球

采用生物陶瓷微球作为大球，该大球是以陶瓷粉末通过乳化法制备，且表面具有多孔结构的空心陶瓷微球，以双重乳化法制备表面具有多孔结构的高分子微球作为小球，高分子微球直径小于陶瓷微球的1/10；

步骤2)将大球、小球复合

将大球、小球混合组装，即得到大球载小球的复合微球。

2.根据权利要求1所述的复合微球的制备方法，其特征在于：在步骤1)中的陶瓷微球采用了乳化法，将陶瓷粉末分散到含有3-5％PVB的二氯甲烷溶液中，混合搅拌12-15h后滴入含有1-4％的PVA水溶液中，乳化搅拌1-4h后，筛分干燥，再在1100℃烧结保温2h后得到具有开孔的空心陶瓷小球。

3.根据权利要求2所述的复合微球的制备方法，其特征在于：在步骤1)中的高分子微球采用了结合致孔剂双重乳化法，将含有1-4％的PVA溶液作为致孔剂滴入含5-100mg·mL^-1的PLGA的二氯甲烷溶液中，油水比为10：1，超声乳化1-5分钟，再滴入1-4％的PVA，油水比为1：10，乳化4-8h，离心分离并冷冻干燥得到具有多孔结构的高分子微球。

4.根据权利要求1所述的复合微球的制备方法，其特征在于；在步骤1)中，大球通过表面吸附载抗炎症药物，小球通过双重乳化包裹促血管生长因子。

5.根据权利要求1所述的复合微球的制备方法，其特征在于，在步骤1)、步骤2)之间将小球表面使用PEI改性，用PEI改性的方法为：向小球中加入PEI溶液，将小球、PEI溶液的混合物放在摇床上振荡，使小球表面均匀吸附PEI，然后将小球、PEI溶液的混合物离心，除去未牢固吸附的PEI。

6.根据权利要求5所述的复合微球的制备方法，其特征在于，所述PEI溶液的浓度为0.01-0.5％，将小球在PEI溶液中搅拌7-17h后，将小球、PEI溶液的混合物放在摇床上振荡，摇床的震荡速度为120rpm，震荡时间为4h，小球与PEI的混合物用二次水离心，控制离心速度7000rpm、离心时间10min，反复离心3次，以除去未牢固吸附的PEI。

7.根据权利要求1所述的复合微球的制备方法，其特征在于，步骤2)中大球、小球混合组装的方法为：将小球移入离心管中，向离心管中加入二次水，再向离心管中加入大球，混合后将离心管置于摇床上振荡2-6h，离心后冷冻干燥，即可将小球嫁接到大球表面。

8.根据权利要求1所述的复合微球的制备方法，其特征在于：所述大球为具有开孔结构的陶瓷空心球，所述的小球为多孔结构的高分子微球。

9.根据权利要求1所述的复合微球的制备方法，其特征在于：所述大球的直径为400-600μm，所述小球的直径为20-40μm。

10.根据权利要求1所述的复合微球的制备方法，其特征在于：所述大球的材料采用硅酸钙、羟基磷灰石、磷酸三钙及羟基磷灰石/磷酸三钙双相陶瓷中的其中一种；所述小球的材料采用PLGA。