CN1765423A - 生物活性多孔支架材料的制备方法 - Google Patents

Abstract

生物活性多孔支架材料的制备方法，将至少含有由医用高分子材料以其良溶剂溶解制成重量百分含量为1％－50％的溶液所成的发泡前体材料，与为其中高分子重量0.1－10倍的HLB值为8－20的表面活性剂充分搅拌发泡至乳化泡沫体的总体积达到预定值，将乳化泡沫体置模具中冷冻干燥成型后，去除原溶解溶剂和表面活性剂即得到相应的生物活性多孔支架材料。用该制备方法可以得到在高分子固化材料中分布有孔径为1～500微米且相互贯通的孔隙，孔隙率为50～95％，使材料中的孔隙率和孔径大小容易控制，孔隙的贯通性也好控制，制备的设备简单，操作方便。不但适宜于制备厚度较小的多孔薄膜等材料，也可制备性能良好的复合三维多孔材料。

Description

生物活性多孔支架材料的制备方法

技术领域

本发明涉及的是一种可用于组织工程支架的多孔材料的制备方法。

背景技术

组织、器官的丧失或功能障碍是人类健康所面临的主要危害之一，也是人类疾病和死亡的最主要原因之一。新兴的组织工程技术为此提供了一种崭新的修复和制造器官的手段，为器官的缺损、坏死患者带来了新的治疗途径。

组织工程学是应用细胞生物学和工程学原理，以生物替代物为目的，研究、开发、修复和维护或改善人体组织和部分器官功能和形态的一门科学。在组织工程研究中，细胞支架材料是指能与组织活体细胞结合并能植入生物体的材料，是组织工程中起中心作用的最基本构架。细胞支架不仅为特定细胞提供结构支撑作用，而且还起到模板作用，引导组织再生和控制组织结构。因此，在组织工程中，除了考虑材料的化学性质、表面性能外，还应考虑包括孔隙形态、大小、连通性、孔隙率等因素在内的多孔三维细胞支架的结构，以利于细胞的黏附、渗透和营养物质的传送及代谢产物的交换。实验显示，有利于纤维细胞生长的最佳孔径是20μm，成年哺乳动物皮肤生长孔径是20～125μm，骨纤维原是100～250μm。因此，组织工程支架材料主要的目标是精确地控制孔隙的孔径和孔隙率。

多孔支架材料的选择和制备是组织工程技术成功运用的一个关键。除了考虑材料的化学性能，材料的物理性能如孔隙率、孔的尺寸以及用于细胞粘附的表面积等也极其重要。理想的组织工程支架应具备以下功能：(1)支架应为三维、多孔网络结构，孔的尺寸应能允许细胞的生存，且孔间应相互贯通，以利于营养物质和细胞代谢废物传递；(2)良好的生物相容性，即无明显的炎性反应、免疫性和细胞毒性；(3)表面应适于细胞粘附及正常的分化和增殖；(4)具有一定的生物力学性能，与所修复组织相一致；(5)可以携带活性物质；(6)可加工成各种形状和结构，易于重复制作；(7)由于所用的材料与人体直接接触，为了防止感染，材料还必须易于消毒。

目前，制备高度多孔支架材料的主要方法包括有：纤维粘接、溶液浇铸/粒子沥滤、熔融成型、气体发泡、相分离/乳化、冷冻干燥、热致凝胶化与其它方法结合制备纳米级纤维细胞外基质和聚合物微球聚集等。这些方法各有优点和发展前景，其中以粒子沥滤法、冷冻干燥法、气体发泡技术最为常见和引人注目。

较经典的溶液浇铸/粒子沥滤技术存在的较明显不足可表现在，如不能直接制备出多孔三维细胞支架，只能制备出厚度不超过2mm的多孔膜；材料中的孔隙为粗糙的立方体状，孔隙间的相互连通程度不高，并且连通通道大小和形态不规则、不可控制；材料中残存的有机溶剂可能影响细胞的生长等。

目前的气体发泡技术是采用气体作为致孔剂，所得支架的孔隙率可高达93％，孔直径可达100μm，该技术的优点是无需滤除过程，也避免了使用有机溶剂，但其所形成的泡沫中的孔与孔之间大多数是非连通的，非连接性的孔结构使得细胞在支架中的种植和移动变得困难，而在支架形成过程中所需的高温处理会导致如胶原等一些生物活性物质的变性，还可能产生妨碍细胞或生物活性分子引入的后果。

现有的相分离/冻干法所产生的材料中的孔隙较小，因而只可用于皮肤等的再生，适用面较窄。

纵观上述由目前制备方法得到的相应支架材料，都存在着相应的不足，性能及使用效果尚不能令人满意。如何制备得到既能释放生物活性物质，又符合理想支架基本要求的组织工程多孔支架仍是值得不断努力研究的课题。

发明内容

针对上述情况，本发明将提供一种生物活性多孔支架材料的制备方法。该制备方法能使多孔材料中的孔隙率和孔径大小容易控制，孔隙的贯通性也好控制，制备的设备简单，操作方便。由该方法所得到的生物活性多孔支架材料不但适宜于制备厚度较小的多孔薄膜等材料，也可制备性能良好的复合三维多孔材料。

本发明的生物活性多孔支架材料的制备方法。基本原理和过程是利用表面活性剂能稳定气泡的原理制孔，即：将表面活性剂加入到医用高分子材料的良溶剂溶液中，通过搅拌产生泡沫后，将其置于相应的赋形模具中，低温冷冻、干燥固化成型后，去除原溶解溶剂和表面活性剂成分，即为本发明所称的生物活性多孔支架材料。其中，制备过程中该气泡所占据的空间即成为多孔材料中的孔隙，表面活性剂的去除则可以使孔与孔间互相连通。

上述制备方法的具体过程是：将至少含有由医用高分子材料以其良溶剂溶解制成重量百分含量为1％～50％的溶液所成的发泡前体材料，与为其中高分子重量0.1～10倍的HLB值为8～20的表面活性剂充分搅拌发泡至乳化泡沫体的总体积达到预定值，将乳化泡沫体置模具中冷冻干燥成型后，去除原溶解溶剂和表面活性剂即得到相应的生物活性多孔支架材料。

泡沫是指气体分散在液体中的分散体系，其中气体是分散相，液体是分散介质的气液相分散体系。乳化泡沫是气体以小的球形均匀分散在较黏稠的液体中，气泡间的相互作用力弱，外观类似乳状液，有时甚至称这种稀泡为“气体乳状液”，决定泡沫稳定性的关键因素是液膜的表面粘度与弹性，液膜的表面粘度高，气体的相对透过率就低，气泡的排气较慢、泡沫就越稳定。

大量的试验结果显示，在制备过程中改变发泡前体材料中高分子溶液的浓度、表面活性剂的种类和/或用量比例、搅拌速率等操作因素的一种或几种，最终都能影响和改变乳化泡沫体体积的增大程度：体积增大越多，则孔径越大、孔隙率越高，反之亦反。因此，根据对所需材料的指标要求，通过对相应操作因素的改变和/或调整，即可得到具有所希望的孔径和/或孔隙率的相应生物活性多孔材料。

作为生物材料应具有一定的力学强度。试验显示，上述发泡前体材料中高分子材料溶液的浓度若低于1％，可能会对制得的材料的力学强度有较明显的不利影响；如果浓度超过50％，高分子在溶剂中发生溶胀后可能会使溶液过于浓稠而影响后序的发泡过程，并且会影响制品的孔隙率。试验结果显示，在上述的高分子浓度范围内，减小溶液中的高分子成分浓度，可有利于形成大孔和高的孔隙率；提高浓度则有利于形成小孔和低的孔隙率，例如在以聚乙烯醇制备多孔材料的一个具体实施例中所显示的，当聚乙烯醇浓度为5％时平均孔径为153.2μm，孔隙率81.5％的多孔材料，聚乙烯醇浓度为10％时平均孔径为107.2μm，孔隙率75％的多孔材料。大量试验结果显示，在上述高分子溶液中，高分子材料成分进一步的理想浓度可以为2％-20％。

如上述，本发明所用医用高分子材料，根据其不同性质可以是能溶解于水，溶解于有机溶剂，或是溶解于水/有机混合溶剂中的材料，溶解后即可形成相应的黏稠液体。所说的这些医用高分子，一般可包括来自于天然动植物的高分子材料、来自以石油矿物原料经化学合成的高分子化合物、以及经微生物发酵代谢或生物酶催化合成的高分子化合物等不同的形式。例如，常用的医用高分子材料主要可有：天然高分子多糖、淀粉、蛋白质和胶质等；合成高分子材料可有聚丙烯酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯和聚乳酸等；生物高分子可包括有右旋糖酐、质酸、聚谷氨酸、生物多糖等；还有利用天然或生物高分子的活性进行化学反应引入新基团以及产生新结构的半合成高分子。

由所说的高分子材料成分与适当溶剂所形成的发泡前体材料，可以包括如上述目前常用的聚乙烯醇水溶液、聚乙烯醇二甲亚砜溶液或是聚乙烯醇的水/二甲亚砜混合溶液，聚乙烯吡咯烷酮水溶液、聚乙烯吡咯烷酮二甲亚砜溶液或聚乙烯吡咯烷酮的水/二甲亚砜混合溶液，壳聚糖的酸性水溶液，海藻酸钠水溶液，明胶水溶液，聚乳酸氯仿溶液、聚乳酸二氧六环溶液或聚乳酸的氯仿/二氧六环混合溶液等多种形式高分子溶液当中的一种。其中，水溶性高分子成分与水混合后可具有增稠作用，离子型的水溶性高分子一般比非离子水溶性高分子有更强的增稠能力。聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、壳聚糖、海藻酸钠等高分子成分，它们都有良好的水溶性，不仅能提高所得到的水溶剂型液相的粘度阻止液膜排液，同时还能形成强度高的膜，因此可以有理想的稳泡作用。对有机溶剂而言，如溶剂本身的分子量大，缔合程度高或分子能发生凝聚作用的溶剂，其粘度均较高，高分子成分的溶入更增大了所得到的有机溶剂型的液相的粘度。

在上述发泡前体材料中，所使用的高分子材料除可以仅为单一形式的高分子材料外，根据对所制得材料的综合性能要求，还可以使用由两种或更多种的高分子形成的二元或多元形式的高分子复合物，如目前已有使用的壳聚糖胶原复合物、壳聚糖明胶复合物、聚乳酸壳聚糖复合物、壳聚糖海藻酸钠复合物、壳聚糖粘多糖复合物、壳聚糖聚乙烯醇复合物、明胶丝素复合物、明胶-硫酸软骨素-透明质酸钠等。

上述的发泡前体材料除单纯使用所说的医用高分子外，还可以按目前在制备骨组织修复材料中的常用方式，进一步使用微米级的或纳米级的磷灰石、羟基磷灰石等成分，或是如磷酸三钙等钙的磷酸盐成分的浆料共同组成的混悬液，磷灰石或磷酸钙等成分的用量一般可为高分子成分重量的0.1-9倍。由于磷灰石或磷酸钙等无机成分的加入，可以使混合液更为粘稠，搅拌生成的气泡容易被稳定，因而造孔将更为容易。由此也可以理解，在上述所说的生物活性多孔支架材料的制备过程中，凡能与所说的高分子溶液形成较为粘稠的均相溶液或混悬液的发泡前体材料，都是允许使用的。

生物支架材料的目的主要是用于细胞培养和组织生长，因此要求无细胞毒性。本发明制备方法中使用的表面活性剂虽然只存在于制备过程的中间阶段，且最终需被除净，因而虽允许使用各种类型的表面活性剂，但为从提高安全性的角度考虑，仍以采用无毒或低毒、起泡力和稳泡力好且易溶于水的表面活性剂为佳，以方便后续的处理。表面活性剂的HLB值在8-20之间，以保证发泡性能的需要。就表面活性剂的毒性而言，一般来讲，阳离子表面活性剂的毒性较大，阴离子表面活性剂和两性离子表面活性剂较小，相对安全性更高的是非离子表面活性剂。在本发明制备方法中可以选择使用的表面活性剂可包括如，十二烷基硫酸钠、月桂酰肌氨酸钠或钾、月桂基磺基琥珀酸钠或钾等阴离子表面活性剂；氨基酸型和甜菜碱型两性离子表面活性剂；以及包括聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯吐温类、聚氧乙烯脂肪酸酯卖泽类、聚氧乙烯脂肪醇醚苄泽类、聚氧乙烯-聚氧丙烯泊洛沙姆类等非离子型表面活性剂等多种类型表面活性剂中的至少一种。

试验结果显示，使用单一形式的表面活性剂时虽然一般能有较好的起泡性，但形成泡沫的稳定性有时会出现不够理想的情况。为提高泡沫稳定性，可采用联合使用几种表面活性剂的方式解决。多种表面活性剂联合使用时的混合体系相互作用可表现有不同的形式，如：同系物型表面活性剂混合体系，特别是二个同系物等量混合体系的表面活性，可介于各自表面活性之间而更趋于活性较高的组分，即碳氢链更长的同系物；非离子表面活性剂与离子表面活性剂混合体系，其更容易形成混合胶束；阳离子表面活性剂与阴离子表面活性剂混合体系，其在水溶液中，带有相反电荷的离子表面活性剂的适当配伍可形成具有很高表面活性的分子复合物，对润湿、增溶、起泡、杀菌等均有增效作用。

如上述，本发明的生物活性多孔支架材料制备采用的是一种含有高分子溶液的发泡前体材料与表面活性剂的混合体系，它们之间的相互作用主要可包括电性相互作用、疏水作用和色散力相互作用。在表面活性剂作用下，水溶性高分子的增稠能力可得到提高，如在非离子水溶性高分子溶液中加入离子型表面活性剂，此时离子型表面活性剂吸附在高分子链上并使其带电，具有高分子电解质类似性质的物质，即在水中高分子链膨胀形成伸张的构型而使溶液的粘度明显增高。例如，在聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PVA)、聚氧化乙烯(PEO)等非离子型高分子溶液中加入十二烷基磺酸钠(SDS)等阴离子表面活性剂都可使其粘度明显增大。在水溶性高分子电解质溶液中加入带有相反电荷的离子型表面活性剂时，由于静电吸引作用可相互结合形成凝胶，结果也会使其粘度大大增加。在高分子溶液与表面活性剂的混合体系中，表面活性剂和水溶性高分子相互作用能得到液滴均匀、细微、气泡稳定性好的乳状液；而有机溶剂(或混合溶剂)本身的分子量大，缔合程度高或分子能发生凝聚作用的溶剂，其粘度均较高，加上高分子的溶入，其粘度会更高。

试验显示，发泡前体材料中的高分子溶液对表面活性剂分子有吸附作用，减少溶液中游离表面活性剂分子数量，临界胶团浓度可因此升高。因此表面活性剂的用量范围一般可以为高分子材料重量的0.3-3倍。发泡前体材料中如未使用无机颗粒成分，表面活性剂的用量一般可以略少些，如发泡前体材料使用的是高分子溶液与无机物成分所成的混合物，因无机颗粒吸附表面活性剂，要得到孔径良好、孔隙率高的多孔材料，可以适当增大表面活性剂的使量，如一般可以为高分子材料用量的1-3倍。通过改变和调整表面活性剂的用量，可以实现将最终多孔材料产品中的孔隙结构调整至所需的要求。例如，增大表面活性剂的用量，可增大发泡材料中的孔径和孔隙率。

在上述的制备方法中，改变发泡处理时的搅拌速度可影响孔隙的形成。例如，试验显示，在200-3000转/分的搅拌速度范围内，提高搅拌速度或采用高速搅拌产生起泡时，可有利于气体进入黏稠的发泡材料体中，对在材料形成大孔和高的孔隙率很有利；而在搅速恒定的情况下，所形成的大孔孔径比较均一，最后去除表面活性剂后，在大孔的孔壁上即能产生出大量的微孔，并使大孔互相贯通，实现大孔和微孔共存，其中大孔孔径达到50～500μm，微孔孔径达到1～10μm，并提高了孔隙率。

在上述的发泡搅拌过程中，根据需要还可以进一步同时向搅拌溶液中通入空气、氮气等常用气体协助发泡。试验显示，通入的气体种类和/或气体流速对孔径和孔隙率无明显影响。在气体流速一定的情况下，降低搅拌速率，可增大平均孔径；搅拌速率提高，则平均孔径减小，但对孔隙率的影响不明显。一般情况下，通入气体的流速可以为5～50毫升/分，搅拌速率可以控制在50～500转/分范围内，均能在所得产品中形成可控的所希望孔径和/或孔隙率要求的孔隙。

经搅拌发泡处理的这一外观呈类似乳状液的乳化泡沫体具有流动性，易于塑形，因此根据需要可以通过采用不同形式或形状的模具成型而得到所需形式或状态的产品。试验结果显示，其泡沫体结构在后续的冷冻、干燥的过程中基本不发生变化，被聚合物包裹的气体也不会逸出，能很好地保持其冷冻之前泡沫体状的结构。

上述的制备方法中，根据所使用的溶剂的性质、特点，在对所形成的所说乳化泡沫体进行冷冻、固化成型时，可以选择使用目前已有报道和/或使用的多种方法。例如，当被冷冻干燥处理的乳化泡沫体混合物采用水为溶剂时，因其中表面活性剂的凝固点大多在-20℃以上，所以一般其冷冻干燥温度可以为-20℃或其以下。当乳化泡沫体混合物为由有机溶剂混合液形成时，其温度可视所用的有机溶剂的熔点而定。例如，在上述制备方法中可以采用的一些常用溶剂中，氯甲烷的熔点为-97.7℃，二氯甲烷为-95.14℃，三氯甲烷为-63.55℃，丁烷为-138.3℃，戊烷为-129.7℃，己烷为-95.3℃，甲醇为-97.49℃，乙醇为-114.5℃，丙酸为-126.2℃，丁酸为-89.8℃等。使用这些有机溶剂制备形成的乳化泡沫体，可以在液氮(温度-196～-170℃)条件下进行冷冻干燥处理。另外的一些有机溶剂，如：1，4-二氧六环熔点11.8℃，甲酸的熔点为8.27℃，乙酸的为16.66℃，二甲亚砜的为18.54℃等，熔点虽相对较高，但为了使乳化泡沫体能更好的被固化，一般也可以选择在-20℃左右的条件下进行冷冻干燥处理。因此，上述冷冻干燥温度，根据不同情况一般控制在-196℃～0℃范围内即可，特别是控制为-20℃～-196℃范围内。在以真空冷冻干燥去除有机溶剂时，尽量提高真空度是有利的，例如试验显示，当将真空度压力控制在20Pa或更低，并降低维持时间控制在12～48小时范围的情况下，有机溶剂一般均能比较容易被除尽。表面活性剂因固体蒸汽压较低，常不易除去，因此，可进一步采用水洗浸泡的方式，即可将表面活性剂清除干净。

大量试验显示，在以本发明上述方法制备得到的生物活性多孔支架材料中可以分布有理想的孔隙结构，孔隙的孔径为1～500μm且相互贯通，孔隙率50％～95％，而且，还可以得到在孔径为50～500μm的大孔孔壁中还分布有孔径为1～10μm微孔形式孔隙结构的材料。

由此可以理解，在制备过程中通过适当调整高分子溶液的浓度、和/或表面活性剂的用量、和/或搅拌速度等方面的因素，即可控制并得到具有所希望的孔径和/或孔隙率的多孔材料产品，且所需设备简单，操作方便。由于通过水溶处理方式除去表面活性剂时同样还可以在材料中形成适当的孔隙，因此该方法既可用于制备如多孔薄膜等厚度较小的多孔材料，也可制备和得到较大体积的性能良好的复合三维多孔材料。

以下通过由附图所示实施例的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。

附图说明

图1是本发明的聚乙烯醇多孔材料表面微观结构的扫描电子显微镜照片。

图2是本发明的聚乙烯醇/羟基磷灰石复合多孔材料表面微观结构的扫描电子显微镜照片。

图3是本发明的聚乙烯醇/羟基磷灰石复合多孔材料截面微观结构的扫描电子显微镜照片。

图4是本发明的海藻酸钙多孔材料截面微观结构的扫描电子显微镜照片

图5是本发明的壳聚糖多孔材料截面微观结构的扫描电子显微镜照片。

图6是本发明的一种多孔材料的表面状态。

具体实施方式

实施例1  聚乙烯醇多孔材料的制备

配制由重量比1∶1组成的水和二甲亚砜的混合溶液，称取30g PVA(聚乙烯醇，聚合度1799，重庆北碚化学试剂厂)加入270g水/二甲亚砜混合溶剂，95℃水浴温度下充分溶解，配成10％的PVA溶液，称取30克10％的PVA水/二甲亚砜溶液置于小烧杯中，加入1g吐温-20(HLB＝16.7)，在转速800转/分下搅拌15分后，迅速将其倒入模具中，于-20℃冷冻12小时，然后取出在室温20℃下解冻3h，反复操作3次，使聚乙烯醇交联固化后，置于-50℃的冷冻干燥器中，在压力20Pa下保持12h干燥成型。用水浸泡和漂洗以去除表面活性剂和剩余的二甲亚砜。所得多孔支架材料产品的平均孔径为107.2μm，孔隙率75％的多孔材料，其结构状态如图1所示。

实施例2  纳米羟基磷灰石/聚乙烯醇多孔材料的制备

称取30克纳米羟基磷灰石/聚乙烯醇组成的混悬液(纳米羟基磷灰石：聚乙烯醇的重量比为1∶3，其中纳米羟基磷灰石的制备可以参照Li Yubao，de Grot K，et al.[J].JMater Sci：Mater in Med，1994，(5)：326-331.报道的方法)置于烧杯中，分别加入3g乳化剂OP(辛基苯基聚氧乙烯醚，HLB＝13.5)，在转速1000转/分强烈搅拌15分后，将泡沫混合体迅速倒入模具中，于-20℃冷冻12小时，然后取出在室温20℃下解冻3h，反复操作至少3次，至聚乙烯醇交联固化，再用水浸泡和漂洗以去除表面活性剂，最后置于-50℃的冷冻干燥器中，在压力20Pa下保持12h冷冻干燥成型，得到平均孔径为184.2μm，孔隙率82％的多孔材料产品，其结构状态如图2和图3所示，其中的微孔分布于大孔的孔壁上，如图6所示。

实施例3  海藻酸盐多孔材料的制备

将海藻酸钠溶于水中配成重量百分含量4％的水溶液。称取50g该海藻酸钠水溶液与4g吐温-20混合后，于转速800转/分搅拌15分钟后，再加入0.2g月桂酰肌氨酸钠(HLB＝13.1)，继续搅拌5分钟，迅速将泡沫混合体倒入模具中，在-30℃的冰箱中冷冻48h，把冷冻的固体置于25℃常温2％CaCl₂溶液，使其慢慢解冻并使海藻酸钠变成不溶于水的海藻酸钙，然后进一步用水浸泡和漂洗以去除表面活性剂后冷冻干燥，得到平均孔径为165.3μm，孔隙率81.6％的多孔材料，其结构状态如图4所示。

实施例4  壳聚糖多孔材料的制备

将脱乙酰度85％-90％的壳聚糖溶于1M的乙酸配制成重量百分含量3％的水溶液。取30克该壳聚糖水溶液置于烧杯中，加入2g吐温-20(HLB＝16.7)和1g吐温-80(HLB＝15.0)，在1500转/分转速下搅拌30分钟，迅速将泡沫混合物倒入模具中，在-30℃冷冻24h后，用重量百分比浓度1％NaOH浸泡以中和乙酸，最后用水浸泡和漂洗以去除表面活性剂并冷冻干燥，得到平均孔径为255.40μm，孔隙率85.2％的多孔材料，其结构状态如图5所示。

实施例5  壳聚糖-胶原复合支架的制备

将壳聚糖粉末完全溶解于1M的稀醋酸溶液中，制得重量百分比浓度3％的壳聚糖醋酸溶液。在该壳聚糖醋酸溶液中加入配制的含牛胶原固体含量为1.2％的溶胀液(牛胶原的制备可以参照《生物医学工程学杂志》1999：16(2)：147-150吴志谷，盛志勇等报道的方法)，使壳聚糖/牛胶原固体重量比为1/1，充分搅拌，使胶原溶胀液溶解于壳聚糖溶液中并混合均匀。取该混合溶液30g置烧杯中，分别加入1g阳离子表面活性剂十六烷基三甲基氯化铵(HLB＝15.8)和1g阴离子表面活性剂磺基琥珀酸月桂酯二钠(HLB＝12.0)，在转速1200转/分下搅拌30分钟，加入少量的0.25％的交联剂戊二醛搅拌均匀后，注入玻璃培养皿中，于-30℃冷冻成型，取出将支架浸入1％的NaOH溶液中和残留的醋酸，用蒸馏水反复浸泡和漂洗，去除表面活性剂并冷冻干燥，得到壳聚糖-胶原复合多孔支架材料，平均孔径为202.5μm，孔隙率为81.2％。

实施例6  聚乳酸-聚乙醇酸共聚物多孔支架的制备

将聚乳酸-聚乙醇酸重量比75∶25共聚物(PLGA，密度1.25g/cm³)溶解于氯仿配成10％的溶液。取50g该混合溶液置于烧杯中，分别加入0.5g阴离子表面活性剂磺基琥珀酸月桂酯二钠和3.5g非离子表面活性剂聚氧乙烯月桂醇醚(HLB＝15.5)，在1000转/分转速搅拌15分后，迅速将泡沫混合物倒入不锈钢模具中，将模具放入液氮中冷冻，制得样品，再放入冷冻干燥装置，于-50℃和低真空20Pa下冷冻干燥48小时去除氯仿溶剂，最后用水浸泡和漂洗以充分去除表面活性剂，并在室温下真空干燥24小时，去除残余的氯仿和水份，得到聚乳酸-聚乙醇酸多孔支架，所得多孔材料的平均孔径为157.2μm，孔隙率为78.6％。

实施例7  纳米羟基磷灰石/海藻酸盐多孔材料的制备

称取30克纳米羟基磷灰石/海藻酸钠组成的混悬液(纳米羟基磷灰石：海藻酸盐的重量比为2∶1，其中纳米羟基磷灰石的制备方法参照上述文献)，置于烧杯中，分别加入1g乳化剂OP和2g吐温-20，，于转速800转/分搅拌15分钟后，再加入0.2g磺基琥珀酸月桂酯二钠，继续搅拌5分钟，迅速将泡沫混合体倒入模具中，在-20℃的冰箱中冷冻48h，把冷冻的固体置于25℃常温2％CaCl2溶液，使其慢慢解冻并使海藻酸钠变成不溶于水的海藻酸钙，然后进一步用水浸泡和漂洗以去除表面活性剂后冷冻干燥，得到平均孔径为150.1μm，孔隙率78.3％的多孔材料。

实施例8  壳聚糖/微米羟基磷灰石多孔材料的制备

将脱乙酰度85％-90％的壳聚糖溶于pH值为5的乙酸配制成重量百分含量3％的水溶液500g，称取30克平均粒径为30μm的羟基磷灰石搅拌混合，制成混悬液。取30克该混悬液液置于烧杯中，加入2g两性离子表面活性剂十二烷基二甲基甜菜碱和1g吐温-60(HLB＝14.9)，在1500转/分转速下搅拌30分钟，迅速将泡沫混合物倒入模具中，在-30℃冷冻24h后，用重量百分比浓度1％NaOH浸泡以中和乙酸。最后用水浸泡和漂洗以去除表面活性剂并冷冻干燥，得到平均孔径为210.2μm，孔隙率81.3％的多孔材料。

实施例9  壳聚糖/聚乙烯醇多孔材料的制备

将脱乙酰度85％-90％的壳聚糖溶于1M的乙酸配制成重量百分含量3％的水溶液，加入10％的聚乙烯醇，使壳聚糖和聚乙烯醇的质量比为1∶1。取30克该混合水溶液置于烧杯中，加入1g十二烷基二甲基甜菜碱和1g卖泽49(聚氧乙烯硬酯酸酯，HLB＝15.0)，在1500转/分转速下搅拌30分钟后，迅速将泡沫混合物倒入模具中，在-30℃冷冻24h后，用重量百分比浓度1％NaOH浸泡以中和乙酸。最后用水浸泡和漂洗以去除表面活性剂并冷冻干燥，得到平均孔径为285.30μm，孔隙率86.1％的多孔材料。

实施例10  聚乳酸-聚乙醇酸/β-TCP(β磷酸三钙)复合物多孔支架的制备

将聚乳酸-聚乙醇酸重量比75∶25共聚物(PLGA，密度1.25g/cm3)溶解于1，4-二氧六环配成10％的溶液100g，称取20克平均粒径为20μm的羟基磷灰石搅拌混合，制成混悬液。取50g该混合溶液置于烧杯中，加入3.5g非离子表面活性剂苄泽30(聚氧乙烯月桂醇醚，HLB＝9.5)在800转/分转速搅拌15分后，再加入0.5g阴离子表面活性剂磺基琥珀酸月桂酯二钠继续搅拌5分钟，迅速将泡沫混合物倒模具中，在-30℃冷冻24h后，制得样品，再放入冷冻干燥装置，于-50℃和低真空15Pa下冷冻干燥48小时去除1，4-二氧六环溶剂，最后用水浸泡和漂洗以充分去除表面活性剂和可能剩下的1，4-二氧六环，得到聚乳酸-聚乙醇酸β-TCP(β磷酸三钙)多孔支架，所得多孔材料的平均孔径为105.1μm，孔隙率为70.2％。

实施例11  壳聚糖/明胶多孔材料的制备

分别称取脱乙酰度85％-90％的壳聚糖和明胶(M_w＝1.5×10⁵gmol^-1，Mn＝1.0×10⁵gmol^-1)3g溶于1M的乙酸水溶液。取30克该混合水溶液置于烧杯中，加入2g苄泽35(HLB＝16.7)，即聚氧乙烯月桂醇醚和1g泊洛沙姆188(HLB＝16.0)，在1500转/分转速下搅拌30分钟，迅速将泡沫混合物倒入模具中，在-30℃冷冻24h后，用重量百分比浓度1％NaOH浸泡以中和乙酸。最后用水浸泡和漂洗以去除表面活性剂并冷冻干燥，得到平均孔径为261.50μm，孔隙率86.3％的多孔材料。

实施例12  聚乙烯醇/胶原多孔材料的制备

称取一定量的PVA粉末，加入重蒸水，水浴加热，配制成10％的PVA溶液；再与离心后的牛胶原固体量为1.2％的溶胀液混合，使聚乙烯醇和胶原重量比为3∶1，充分搅拌混匀后，备用。取30克混合溶液置于小烧杯中，然后加入1g吐温-60，在转速800转/分下强烈搅拌15分后，迅速将其倒入模具中，于-20℃冷冻12小时，然后取出在室温20℃下解冻3h，反复操作3次，至聚乙烯醇交联固化后，置-50℃的冷冻干燥器中，在压力20Pa下保持12h干燥成型。用水浸泡和漂洗以去除表面活性剂。所得多孔支架材料产品的平均孔径为157.3μm，孔隙率82.3％的多孔材料。

通过上述的实施例可以对本发明有更清楚的理解，但不应将这些实施例理解为是对本发明主题范围的限制。在不脱离和改变本发明上述技术思想情况下，根据本领域的普通技术知识和/或惯用手段，显然还可以做出多种形式的替换或变更，并均应包括在本发明的范围之内。

Claims (11)

1.生物活性多孔支架材料的制备方法，其特征是将至少含有由医用高分子材料以其良溶剂溶解制成重量百分含量为1％～50％的溶液所成的发泡前体材料，与为其中高分子重量0.1～10倍的HLB值为8～20的表面活性剂充分搅拌发泡至乳化泡沫体的总体积达到预定值，将乳化泡沫体置模具中冷冻干燥成型后，去除原溶解溶剂和表面活性剂即得到相应的生物活性多孔支架材料。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征是用于与所说的发泡前体材料为由所说高分子材料溶液与微米级或纳米级的磷灰石类成分或钙的磷酸盐成分的浆料共同组成，其中磷灰石的含量为高分子材料重量的0.1～9倍。

3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征是所说发泡前体材料中的高分子材料为至少两种。

4.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征是所说发泡前体材料中的高分子材料的重量含量优选为2％～20％。

5.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征是所说发泡前体材料中的高分子溶液为聚乙烯醇的水溶液和/或二甲亚砜溶液、聚乙烯吡咯烷酮水溶液和/或二甲亚砜溶液、壳聚糖酸性水溶液、海藻酸钠水溶液、明胶水溶液、聚乳酸的氯仿和/或二氧六环溶液中的一种。

6.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征是所说的表面活性剂为阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、两性离子表面活性剂或非离子表面活性剂中的至少一种。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征是所说的表面活性剂为十二烷基硫酸钠、月桂酰肌氨酸钠盐或钾盐、月桂基磺基琥珀酸钠或钾的阴离子表面活性剂，氨基酸型或甜菜碱型的两性离子表面活性剂，聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯的吐温类表面活性剂，聚氧乙烯脂肪酸酯的卖泽类表面活性剂，聚氧乙烯脂肪醇醚的苄泽类表面活性剂，聚氧乙烯-聚氧丙烯的泊洛沙姆类表面活性剂中的至少一种。

8.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征是所说的表面活性剂的优选用量为发泡前体材料中高分子材料重量的0.3～3倍。

9.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征是在所说的搅拌发泡过程中同时向发泡材料中通入助发泡气体。

10.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征是所说发泡后的乳化泡沫体于-196℃～0℃冷冻干燥。

11.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征是水溶剂型的乳化泡沫体经至少一次冷冻操作过程；有机溶剂型的乳化泡沫体在低于20Pa的真空度下冷冻干燥去除有机溶剂。

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