CN1902487B - 以头发中的氧化蛋白质为指标的头发损伤评价方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种评价头发损伤的方法，其特征在于，通过对头发中的氧化蛋白质的羰基进行特异的荧光标记，检测其荧光来进行评价。所述损伤起因于下述诱因中的任一种或它们多种的组合，所述诱因是，头发的烫发处理、脱色处理、氧化染发剂处理、梳理、吹风机等的热处理、暴露于紫外线、在游泳池中暴露在次氯酸中。

Description

以头发中的氧化蛋白质为指标的头发损伤评价方法
技术领域
本发明涉及一种通过对头发中的氧化蛋白质的羰基进行特异荧光标记、检测其荧光来评价头发的损伤度的方法，以及为了实施该方法而使用的试剂盒。
背景技术
头发因烫发处理、脱色、氧化染发剂处理、梳理、吹风机等的热处理、暴露于紫外线、在游泳池中暴露于次氯酸等的各种各样的外在因素而受到损伤。头发一旦受到损伤就不会得到修复。另外，损伤也有随着时间流逝而发展的情况。因此，为了保持头发的健康状态，当然通过日常护理来使头发不易受到损伤是很重要的，但是，事先确认其损伤度，抑制损伤的发展也极为重要。作为评价头发损伤度的方法，已知有视觉评价、物性评价等方法，例如利用扫描型电子显微镜的头发表面分析法(Swift J.A.等、J.Society of Cosmetic Chemists(1972)Vol.23，p695)、测定头发的机械强度的抗拉试验法(Donald E.D.等，J.Society of Cosmetic Chemists(1968)Vol.19，p395)、测定头发内部结构变化的方法(Humphres W.T.等，J.Societyof Cosmetic Chemists(1972)Vol.23，p359)、用荧光物质标记头发、用荧光显微镜测定损伤的方法(Tate M.L.等，J.Societyof Cosmetic Chemists(1993)Vol.44，p347)等，但任何一种方法都需要特殊的装置，而且有操作麻烦的缺点。
特开平8-178920号公报、特开平8-271515号公报中公开了，以SH基团为头发损伤的指标，采用对该SH基团进行选择性标记的荧光物质对头发进行荧光染色，测定头发的损伤度的方法，所述SH基团因例如烫发处理等导致角蛋白中大量含有的S-S键断裂而产生，所述荧光物质例如为N-(9-吖啶基)马来酰亚胺、N-(7-二甲基-氨基-4-甲基香豆素基)马来酰亚胺，。通过该方法，可以不需要荧光显微镜等，用目视进行损伤度的检测，谋求测定的简便化。通常，烫发处理由以下步骤构成：经过还原处理来暂时切断头发角蛋白中的S-S键而生成SH基团，然后通过氧化处理使该SH基团恢复成S-S键。另外，脱色处理仅由氧化处理构成。但是，如果在进行烫发处理、脱色处理的同时、过度发生氧化反应，则SH基团、S-S键转化为半胱氨酸(SO3H)，这也被认为是头发损伤的原因之一。半胱氨酸不与选择性标记SH基团的荧光物质反应，因此以SH基团为头发损伤指标的此类方法所得到的结果，被认为有时无法准确反映头发的实际损伤度。
发明内容
本发明的课题在于提供一种可以简便的、并且能更加准确地反映头发的实际损伤度的头发损伤度评价方法。
本发明提供一种评价头发损伤的方法。该方法的特征在于，通过对头发中的氧化蛋白质的羰基进行特异荧光标记，检测其荧光来进行评价。该损伤起因于下述诱因中的任一种或它们多种的组合，所述诱因是头发的烫发处理、脱色、氧化染发剂处理、梳理、吹风机等热处理、暴露于紫外线、在游泳池中暴露于次氯酸中。
在优选的方案中，氧化蛋白质的羰基的特异的荧光标记，是通过使含有肼基的荧光物质与氧化蛋白质作用·键合而进行的。优选从荧光素-5-氨基硫脲和丹磺酰肼(Dansyl hydrazine)中选择该含有肼基的荧光物质。
在优选的方案中，上述评价可在荧光显微镜下进行。但是，当含肼基的荧光物质为丹磺酰肼时，上述荧光检测可以目测进行。
从另一观点考虑，本发明可提供一种用于在评价头发的损伤的方法中使用的试剂盒。该试剂盒的特征在于，是含有用于对氧化蛋白质的羰基进行特异荧光标记的荧光物质而构成的。
优选的情况是，荧光物质为含有肼基的荧光物质，更优选的情况是含肼基的荧光物质选自荧光素-5-氨基硫脲和丹磺酰肼组成的组中。
通过本发明，可提供一种简便的、且能显示准确反映头发的实际损伤结果的头发损伤评价方法。通过该评价方法，可对由以下诱因引起的损伤进行评价：烫发处理、脱色、氧化染发剂处理、梳理、利用吹风机等的热处理、暴露于紫外线、在游泳池中暴露于次氯酸试剂等。
附图说明
图1示出利用荧光素-5-氨基硫脲进行的头发氧化蛋白质的检测结果。
图2示出显示经紫外线处理、次氯酸钠处理引起的头发氧化蛋白质的亢进的荧光显微镜照片。
图3是将图2的结果以平均亮度的形式进行数值化的图。
图4用平均亮度表示经烫发处理、脱色处理引起的头发氧化蛋白质的亢进。
图5用平均亮度表示使用丹磺酰肼作为荧光物质时的经烫发处理、脱色处理引起的头发氧化蛋白质的亢进。
图6显示医疗用紫外线荧光灯引起的头发损伤的定量实验结果。
图7示出人工太阳照明灯引起的头发损伤的照片(a)及其定量试验的结果(b)。
具体实施方式
本发明提供一种通过对头发中的氧化蛋白质的羰基进行特异荧光标记、检测其荧光来评价头发的损伤度的方法、及用于实施该方法的试剂盒。
头发(或发干)由覆盖其表面的毛小皮、位于其内部占头发大部分的毛皮质及中心部位的毛髓质构成。特别地，毛小皮从头发的根部向前端以鳞状重合覆盖头发的表面保护内部，如果毛小皮未受到损伤，保持健康的状态，则头发看上去很有光泽。头发大致由80～90％的蛋白质、1～8％的脂质、0.6～1.0％的微量元素、及12～13％的水构成。头发中存在各种各样的蛋白质，主要的蛋白质为角蛋白。含角蛋白的头发蛋白质伴随着暴露于烫发剂、脱色剂、氧化染发剂等中含有的化学类氧化剂、紫外线、大气污染物质、游泳池中使用的次氯酸类试剂、梳理产生的摩擦、吹风机等产生的热等各种因素，而被氧化，结果引入了羰基。可以认为此类氧化包括：蛋白质中的Lys、Arg、Pro等氨基酸残基的NH2基被直接氧化成羰基的情况；及脂质被氧化成过氧化脂质，进而分解成反应活性很高的醛类，其与蛋白质结合而发生氧化的情况等。
本发明中可利用的对氧化蛋白质的羰基进行特异荧光标记的荧光物质，优选具有可与氧化蛋白质的羰基键合的肼基-NHNH2。作为此类荧光物质的例子，可列举出荧光素-5-氨基硫脲、丹磺酰肼、德克萨斯红酰肼(Texas Red hydrazide)、荧光黄酰肼(LuciferYellow hydrazide)等。
在使用此类含肼基荧光物质时，氧化蛋白质的检测可按照例如以下方法实施：
(1)对头发采样；
(2)使适当的缓冲液(例如100mM的MES-Na缓冲液(pH5.5)中的含肼基荧光物质与头发在室温下反应数小时(例如1小时)；
(3)反应结束后用适当的生理溶液(例如用缓冲液磷酸缓冲生理食盐液(PBS))充分洗净后，用例如荧光显微镜来检测氧化蛋白质；
(4)任选地，拍摄显微镜照片。
在使用通过照射紫外线发出可目视的荧光的荧光物质例如丹磺酰肼作为含有肼基的荧光物质的情况下，被荧光标记的氧化蛋白质也可以不使用荧光显微镜，仅凭目测进行检测。作为通过照射紫外线发出可目视的荧光的其他荧光物质，可列举出N-(9-芴基甲氧基羰基)肼(FMOC-肼)等。
在使用通过照射紫外线发出可目视的荧光的荧光物质例如丹磺酰肼作为含有肼基的荧光物质的情况下，氧化蛋白质的检测可以按照例如下述方法进行：
(1)对头发采样；
(2)使适当的缓冲液(例如100mM的MES-Na缓冲液(pH5.5)中的含肼基荧光物质与头发在室温下反应数小时(例如1小时)；
(3)反应结束后、用适当的生理溶液(例如缓冲液磷酸缓冲生理食盐液(PBS))充分洗净后，使用例如黑光等对其照射紫外线；
(4)目视观察发出荧光的氧化蛋白质；
(5)任选地，拍摄照片。
氧化蛋白质的特异荧光标记，也可利用生物素酰肼和荧光标记抗生物素蛋白的组合。由于生物素酰肼也含有肼基，所以可与蛋白质的羰基键合。此时，首先在氧化蛋白质上键合生物素酰肼，然后通过生物素-抗生物素蛋白键使荧光标记抗生物素蛋白与生物素酰肼结合，其结果是对氧化蛋白质进行了荧光标记。生物素酰肼可使用在本领域中广为人知的，例如由ピア一ス社制造销售的产品。另外，荧光抗生物素蛋白可使用例如荧光素抗生物素蛋白。
在使用这样的含肼基的荧光物质的情况下，氧化蛋白质的检测例如可按照以下述方法实施：
(1)对头发采样；
(2)使适当的缓冲液(例如100mM的MES-Na缓冲液(pH5.5)中的生物素酰肼在室温下与头发反应数小时(例如1小时)；
(3)反应结束后、用适当的生理溶液(例如缓冲液磷酸缓冲生理食盐液(PBS))充分洗净后，与荧光标记抗生物素蛋白在室温下反应数小时(例如1小时)；
(4)用例如荧光显微镜检测氧化蛋白质；
(5)任选地，拍摄显微镜照片。
本发明所涉及的试剂盒，除了上述荧光物质之外，还可同时含有实施上述各种评价方法所必需的试剂、例如各种缓冲试剂。
本发明者发现，如下述实施例中所示那样，头发内的氧化蛋白质的量与头发的损伤度有一定程度相关性。例如，烫发处理中使用的氧化剂一般分为过氧化氢类的物质和溴酸钠类物质这两类，已知其中过氧化氢类氧化力强，对头发产生的损伤大。另外，以氧化蛋白质为指标，比较由过氧化氢类及溴酸钠类烫发处理产生的头发的损伤度，结果发现过氧化氢类烫发处理的头发比溴酸钠类烫发处理的头发受到的损伤更强。另外，头发的脱色处理与烫发处理不同，仅由头发的氧化处理步骤构成，当反应过度进行时，SH基团、S-S键转变为半胱氨酸(SO3H)，因此在目前以SH基团为指标的方法中，无法正确评价损伤。但是，以氧化蛋白质为指标，比较脱色处理及烫发处理产生的头发的损伤度，结果发现脱色处理的头发与烫发处理的头发相比、受到更强的损伤。由上述结果可知，伴随头发的损伤度的提高，头发中的氧化蛋白质的量也增大。因此可知，以氧化蛋白质为指标的头发损伤评价方法，可以显示出更加准确地反映了头发实际损伤的结果。
通过使用上述氧化蛋白质的检测方法及试剂盒，可实现以氧化蛋白质为指标的简便的头发损伤测定。本发明的方法不需要蛋白质的提取操作、电泳操作、蛋白质印迹操作等，只要有荧光显微镜便可实施。另外，如果使用丹磺酰肼等作为荧光物质，则仅照射紫外线就可以目视评价被荧光染色的氧化蛋白质。因此，上述氧化蛋白质的检测方法及试剂盒，可通过简单的操作及设备来获得对头发评价的有力的信息，可在例如化妆品销售铺面等进行简单地实施。
通过以下的实施例对本发明进行进一步详细的说明。
实施例
实施例1
利用荧光素-5-氨基硫脲进行的头发氧化蛋白质的检测
在9名被试验者(头发没有经过化学处理的经历)的头发根侧和前端侧(离根部大约20厘米的部位)、以5厘米的长度各采取1根，用具有下述组成的洗涤剂(处方1)、在室温下浸泡10分钟进行洗涤，然后在水中浸泡漂洗1小时。将其干燥后，用瞬间强力粘合剂阿隆发(Aron alpha)固定于载玻片上。使其在20μM的荧光素-5-氨基硫脲的100mM的MES-Na缓冲液(pH＝5.5)中在室温下反应1小时。反应结束后、用PBS充分洗涤后，用荧光显微镜进行观察，每个样品摄取4张图像。在进行数值化时，从图像上分离头发和背景，求出头发的平均亮度。
处方1(洗涤剂)
Figure S04840242820060719D000071
其结果在图1中示出。从图1可知，在根部侧没有观察到有个人差异。与此相反，在前端侧观察到有相当大的个人差异。可以认为这反映了保养方法的个人差异等。
实施例2
利用荧光素-5-氨基硫脲的头发氧化蛋白质的检测
以5厘米的长度采取一名被试验者的头发前端侧(头发没有经过化学处理的经历)，共取3根，在洗涤剂(处方1)中、在室温下浸泡10分钟进行洗涤，然后在水中浸泡漂洗1小时。对第1根照射紫外线(UVA)200J/cm2，将第2根在0.2mM次氯酸钠中、在37℃下保温16小时，对最后的第3根不做任何处理。最后，将经过紫外线处理、次氯酸钠处理的头发在洗涤剂(处方1)中、在室温下浸泡10分钟进行洗涤，然后在水中浸泡漂洗1小时。将其干燥后，用瞬间强力粘合剂阿隆发固定在载玻片上。将其在20μM的荧光素-5-氨基硫脲的100mM的MES-Na缓冲液(pH＝5.5)中、在室温下反应1小时。反应结束后、用PBS充分洗涤后，用荧光显微镜进行观察，每个样品各摄取12张图像。在进行数值化时，从图像上分离头发和背景，求出头发的平均亮度。
如上所述，图2为荧光处理过的头发的荧光显微镜照片，图3示出各头发的平均亮度。如图2和图3所示，在紫外线处理、次氯酸钠处理的任一种处理中，都能观察到头发的氧化蛋白质亢进。
实施例3
利用荧光素-5-氨基硫脲进行的头发氧化蛋白质的检测
以5厘米的长度采取一名被试验者的头发前端侧(头发没有经过化学处理的经历)，共取4根，在洗涤剂(处方1)中、在室温下浸泡10分钟进行洗涤，然后在水中浸泡漂洗1小时。对第1根进行脱色处理，对第2根进行烫发处理(溴酸钠类)，对第3根进行烫发处理(过氧化氢类)，对最后的第4根不做任何处理。脱色处理为，将以下所示的处方2的A剂、B剂、C剂按照4:6:1的比例进行混合，在室温下将头发在其中浸泡30分钟。重复该操作4次。烫发处理(溴酸钠类)为，在以下所述的处方3的1号液中在30℃浸泡10分钟，水洗涤30秒，在2号液(溴酸钠类)中在30℃浸泡10分钟。烫发处理(过氧化氢类)为，在处方3的1号液中在30℃浸泡10分钟，水洗涤30秒，在3号液(过氧化氢类)中在30℃浸泡5分钟。将经过脱色、烫发处理过的头发最后在洗涤剂(处方1)中在室温浸泡10分钟、进行洗涤，然后在水中浸泡漂洗1小时。将其干燥后，用瞬间强力粘合剂阿隆发固定于载玻片上。将其在20μM的荧光素-5-氨基硫脲的100mM的MES-Na缓冲液(pH＝5.5)中在室温下反应1小时。反应结束后用PBS充分洗涤，然后用荧光显微镜进行观察，每个样品各摄取8张图像。在进行数值化时，从图像上分离头发和背景，求出头发的平均亮度。
处方2(脱色损伤用的脱色剂处方)
Figure S04840242820060719D000081
Figure S04840242820060719D000092
处方3(烫发损伤用的烫发剂处方)
Figure S04840242820060719D000101
3号剂(过氧化氢类)
图4中显示出各头发的平均亮度的结果。烫发处理、脱色处理中均观察到了头发氧化蛋白质的亢进。另外，有趣的是，过氧化氢类的烫发处理比溴酸钠类烫发处理观察到了更多的氧化蛋白质。可以认为这反映了，如果烫发处理方法不同，则头发受到的氧化程度不同。
实施例4
利用丹磺酰肼进行的头发氧化蛋白质的检测
以5厘米的长度采取一名被试验者的头发前端侧(头发没有经过化学处理的经历)，共取4根，在洗涤剂(处方1)中在室温浸泡10分钟进行洗涤，然后在水中浸泡漂洗1小时。对第1根进行脱色处理，对第2根进行烫发处理(溴酸钠类)，对第3根进行烫发处理(过氧化氢类)，对最后的第4根不做任何处理。脱色处理为，将以下所示的处方2的A剂、B剂、C剂按照4:6:1的比例进行混合，在室温下将头发在其中浸泡30分钟。重复该操作4次。烫发处理(溴酸钠类)为，在以下所述的处方3的1号液中在30℃浸泡10分钟，水洗涤30秒，在2号液(溴酸钠类)中在30℃浸泡10分钟。烫发处理(过氧化氢类)为，在处方3的1号液中在30℃浸泡10分钟，水洗涤30秒，在3号液(过氧化氢类)中在30℃浸泡5分钟。将脱色、烫发处理过的头发最后在洗涤剂(处方1)中在室温浸泡10分钟进行洗涤，然后在水中浸泡漂洗1小时。将其干燥后，用瞬间强力粘合剂阿隆发固定于载玻片上。将其在50μM的丹磺酰肼的100mM的MES-Na缓冲液(pH＝5.5)中在室温下反应1小时。在反应结束后、用PBS充分洗涤后，用荧光显微镜进行观察，每个样品各摄取4张图像。在进行数值化时，从图像上分离头发和背景，求出头发的平均亮度。
图5示出各头发的平均亮度的结果。在烫发处理、脱色处理中、均观察到了头发氧化蛋白的亢进。另外，有趣的是，过氧化氢类烫发处理比溴酸钠类烫发处理观察到了更多的氧化蛋白质。可以认为这反映了，如果烫发方法不同，则头发受到的氧化程度不同。
实施例5
使用本方法，对健康正常黑发和脱色头发的紫外线导致的头发损伤进行定量。
(1)试验1
紫外线照射条件为，将3根医疗用紫外线荧光灯(UV-B)[FL20S·E-30/DMR]设定在离目标15cm的高度处。(0.641mW/cm2)。
样品为4个等级
①健康正常黑发
②脱色头发1(健康正常黑发进行15分钟脱色处理后的头发)
③脱色头发2(健康正常黑发进行30分钟脱色处理后的头发)
④脱色头发3(健康正常黑发进行30分钟×2次脱色处理后的头发)
在将上述4个等级的头发洗发干燥后，分为未照射和照射2类，照射样品经紫外线照射70小时。将照射后的样品与未照射样品一并洗净，按照本方法进行头发的损伤评价。使用得到的平均亮度，利用以下式子，对头发曝晒损伤进行数值化。
头发曝晒损伤＝照射头发平均荧光亮度-未照射头发平均荧光亮度
其结果在图6中示出。
结果：
在黑色素少的脱色头发2及3中，确认有很大的头发损伤。头发内部的黑色素量的减少依赖于脱色的处理时间，由此可以认为，在脱色头发中、由于黑色素的原因，对紫外线的防御力降低。
另外，可知本试验法适合于进行头发的损伤评价。
以后的试验是通过影响力大的脱色头发3来进行试验的。
(2)试验2
以脱色处理30分钟×2次的头发为对象进行试验。
紫外线照射条件为，将1个人工太阳照明灯SOLAX500W的XC-500B型(セリツク株式会社制)的照明装置，设定在离目标40cm的高度处。
(UV强度：54W/m2，UV照射量：210KJ/m2，用UV传感器[東レテクノ(株)制]进行测定)。
照射水平为6个等级(3，6，12，24，48，72小时)
对脱色头发进行洗发干燥后，分为未照射和照射2类，照射样品按照上述6个等级进行人工太阳照射。将照射后样品与未照射样品一并洗净，用本方法进行头发的损伤评价。使用得到的平均亮度，利用以下式子对头发曝晒损伤进行数值化。
头发曝晒损伤＝照射头发的平均荧光亮度-未照射头发的平均荧光亮度
其结果在图7中示出。
结果：确认了头发损伤依赖于人工太阳照明的照射时间而增加。因此，可知本试验法适合于评价因紫外线引起的头发的损伤。
考虑到实验的效率，下面进行人工太阳照明12小时，确认抗氧化剂的效果。
(3)试验3
以脱色处理30分×2次的头发为对象进行试验。
紫外线照射条件为，将1个人工太阳照明灯SOLAX500W的XC-500B型(セリツク株式会社制)的照明装置设定在离目标40cm的高度处，照射12小时。
(UV强度：54W/m2，UV照射量：210KJ/m2，用UV传感器[東レテクノ(株)制]进行测定)
试验水平：8个等级
①未涂布(离子交换水)
②红茶提取物(0.1％：香荣兴行社制)
③薰衣草提取液(0.1％：香荣兴行社制)
④葡萄种子提取物(0.1％：キツコ—マン社制)
⑤生育酚(0.001％)
⑥醋酸生育酚(0.001％)
⑦硫代牛磺酸(0.001％)
⑧甘油(0.1％)
对脱色头发进行洗发干燥后，分为未照射样品组和照射样品2类。在照射样品的情况下，将头发样品在上述8个等级的试样中浸泡15分钟，取出干燥。对干燥后的样品按照上述条件进行人工太阳照明的照射。将照射后样品与未照射样品一并洗净，用本方法进行头发的损伤评价。使用得到的平均亮度，利用下式1和2，算出抑制头发曝晒损伤的效果。
式1：头发曝晒损伤＝照射头发的平均荧光亮度-未照射头发的平均荧光
亮度
式2：
Figure S04840242820060719D000131
为了简便起见，如下设定头发曝晒损伤的防御效果的评价标准。
A：80％或其以上
B：大于等于50％、且小于80％
C：大于等于20％、且小于50％
D：小于20％
以下示出被测的试剂的效果。
红茶提取物：B，
薰衣草提取液：B，
葡萄种子提取物：A，
生育酚：A，
醋酸生育酚：A，
硫代牛磺酸：A，
甘油：D
结果：可以判断出本方法也适用于抗氧化剂的筛选体系。

Claims (9)

1.一种评价头发损伤的方法，其特征在于，通过对头发中的氧化蛋白质的羰基进行特异的荧光标记，检测其荧光来进行评价。
2.如权利要求1所述的方法，所述损伤起因于下述诱因中的任一种或它们多种的组合，所述诱因是，头发的烫发处理、脱色处理、氧化染发剂处理、梳理、热处理、暴露于紫外线、在游泳池中暴露在次氯酸中。
3.如权利要求1或2所述的方法，所述对氧化蛋白质的羰基的特异的荧光标记，是通过使含有肼基的荧光物质与所述氧化蛋白质进行作用键合来实施的。
4.如权利要求1或2所述的方法，所述含有肼基的荧光物质选自荧光素-5-氨基硫脲和丹磺酰肼。
5.如权利要求1或2所述的方法，所述评价在荧光显微镜下进行。
6.如权利要求3所述的方法，所述含有肼基的荧光物质为丹磺酰肼，所述荧光检测通过目测进行。
7.一种用于在头发的损伤评价方法中使用的试剂盒，其特征在于，含有用于对氧化蛋白质的羰基进行特异荧光标记的荧光物质而构成。
8.如权利要求7所述的试剂盒，所述荧光物质为含有肼基的荧光物质。
9.如权利要求7或8所述的试剂盒，所述含肼基的荧光物质选自荧光素-5-氨基硫脲和丹磺酰肼。
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