具有增强机体免疫力作用的中药制剂
技术领域
本发明涉及保健品或中药口服制剂,特别是一种具有增强机体免疫力的保健品或中药口服制剂及其制备方法。
背景技术
免疫功能不仅是机体防御外来病源入侵的第一道防线,也是对自身或受外界刺激所产生的种类变异细胞进行识别和杀灭,消除体内“杂质”,保证机体细胞功能正常和平衡稳定的“卫士”。各种原因引起的免疫功能降低不仅常见于亚健康状态下对细菌和病毒感染的抵抗力下降,也是导致癌症以及一些慢性疾病并发感染性疾病的重要原因。因此,纠正失调的免疫功能,对于防病、治病,提高人们生活质量具有重大意义。
目前常用的免疫增强药如卡介苗、左旋咪唑以及白介素-2、干扰素和胸腺素等,或使用不便,或不良反应严重,均限制了它们的应用。
中医药在调节人体自身机能方面积累了丰富的经验,并在中医药实践中发现多种中药具有较强的免疫调节与免疫增强功能,如灵芝、人参、黄芪等。现代药理学研究证明多糖是上述中药中调节机体免疫平衡,发挥免疫调节作用的主要功效成分。活性多糖可通过激活淋巴细胞和巨噬细胞、促进各种细胞因子(干扰素、白细胞介素、肿瘤坏死因子)的生成、激活网状内皮系统和增强自然杀伤细胞的活性等途径调节机体的免疫功能。且毒理学研究显示天然多糖成分无毒副反应,使用安全,以其为原料所制备的保健产品可供一般人群长期服用。
灵芝,广义上包括已知180余种的多孔菌灵芝属之中的任何一种,狭义上是指为中华人民共和国药典(2005年版二部)所收载的赤芝Ganoderma Lucidum(Leyss ex Fr.)Karst.或紫芝Ganoderma sinensiZhao,Xu et Zhang的干燥子实体。据药典所载,灵芝性味甘,平;有补气安神,止咳平喘之功效,可治眩晕不眠,心悸气短,虚劳咳喘。灵芝在我国最早的药学著作《神农本草经》中被列为上品,它也是美国《草药药典》仅收录的10种中草药之一。现代科学研究表明,灵芝含有多糖、多种氮基酸、甾类、三萜类、生物碱、有机酸、甘露醇等多种生物活性物质,并含有多种微量元素。其所含的灵芝多糖被认为是其药理活性的主要成分,《中华人民共和国药典》(2005年版一部)已将灵芝多糖作为灵芝质量的控制标准。目前以从赤芝中获得的灵芝多糖的药理活性研究最多、最为深入,发现灵芝多糖具有抗肿瘤、提高机体免疫力和耐缺氧能力等作用(参见:世界科学技术-中医药现代化6(2):57-62;2004),来源于灵芝属其他种的多糖与赤芝具有相似的药理活性。灵芝多糖对肿瘤细胞无直接的杀伤能力,其抗肿瘤作用与其调节机体力有关,发现其主要通过促进T淋巴细胞增殖,提高小鼠的B细胞产生特异性抗体的能力,促进白介素、干扰素和TNF-α等因子的产生,以及增强小鼠巨噬细胞的吞噬功能和提高自然杀伤(NK)细胞活性等增强机体免疫功能。
灵芝多糖的生产,除以野生或人工栽培的灵芝子实体为原料外,也可从灵芝菌深层发酵的菌丝体或发酵液中提取。有研究显示灵芝子实体、菌丝体中灵芝多糖均由葡萄糖、果糖组成,且这两种单糖在子实体和菌丝体多糖中的摩尔比相同,为不同种属来源的灵芝多糖具有相似的生物学活性提供了分子基础。因人工栽培子实体生产周期长、成本高,现多采用深层液体发酵法生产灵芝多糖(参见:灵芝胞内多糖高产菌株G7深层发酵工艺的研究,中国食用菌23(6):36-39;2004)。灵芝多糖分子量从数百到数十万,除一小部分小分子多糖外,大多不溶于高浓度酒精,而溶于热水,因此适用于水提取-醇沉淀工艺提取。
本发明使用的灰树花(Grif ola f rondosa(Dicks,ex Fr)S.F.Gray)为多孔菌科树花菌属真菌,又名贝叶多孔菌、千佛菌、栗子蘑、云蕈、莲花菌等。其子实体气味芳香,口味鲜美,且富含多种维生素、矿物质与生物活性物质,为一种珍贵的食、药两用兼用真菌。现代药理学研究证明其所含的多糖成分具有抗肿瘤、调节免疫和抗病毒等多种药理学活性(参见:天然产物研究与开发15(4):364-368;2003)。灰树花多糖的生产,除以人工栽培的子实体为原料外,也可从灰树花菌深层发酵的菌丝体或发酵液中提取。
本专利发明研究发现,以灵芝和灰树花为原料,得到的富含灵芝多糖和富含灰树花多糖的提取物均具有升高注射环磷酰胺的小鼠的白细胞计数的作用,且由上述两种多糖成分组成的复方制剂口服,在减少总多糖用量的前提下,不仅能增加注射环磷酰胺的小鼠的白细胞计数水平,而且能逆转注射环磷酰胺小鼠胸腺指数和脾指数的降低,并能增加正常小鼠巨噬细胞的吞噬功能。安全性试验研究显示,小鼠每日口服20g/kg以上本发明的复方制剂无任何不良反应,即本发明的复方制剂属于无毒物质,适合一般人群长期大量服用。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有增强机体免疫力作用的口服制剂及其制备方法。
本申请的发明人研究发现,采用《中华人民共和国药典》入药的灵芝和食药两用的真菌灰树花为原料,提取的灵芝多糖和灰树花多糖均具有增强机体免疫力的效应。并且上述两种多糖成分组成的复方制剂口服,在减少多糖总用量的前提下,能显著逆转细胞毒性化疗药物引起的小鼠血白细胞计数、胸腺指数和脾指数的降低,增加正常小鼠网状内皮系统的吞噬功能。安全性试验研究显示,小鼠每日口服20g/kg以上无任何不良反应,即本发明的复方制剂属于无毒物质,适合一般人群长期大量服用。
本发明提供了一种具有增强机体免疫力作用的口服制剂,其中含有有效量的灵芝多糖,以及选择性的药学上可接受的载体。相应的,本发明还提供了灵芝多糖用于制备治疗或预防具有增强机体免疫力的药物的用途。
另一方面,本发明提供了一种具有增强机体免疫力作用的口服制剂,其中含有有效量的灰树花多糖,以及选择性的药学上可接受的载体。相应的,本发明还提供了灰树花多糖用于制备治疗或预防具有增强机体免疫力的药物的用途。
在优选的技术方案中,本发明提供了一种具有增强机体免疫力的复方口服制剂,其中含有有效量的灵芝多糖和灰树花多糖,以及选择性的药学上可接受的载体。在更优选的技术方案中,本发明的口服制剂中以多糖重量计含有:灵芝多糖10%~95%、灰树花多糖5%~90%,优选灵芝多糖20%~90%、灰树花多糖10%~80%,更优选灵芝多糖70~85%、灰树花多糖15~30%。
用于本发明的灵芝多糖和灰树花多糖可以按照本发明实施例提供的制备方法制备得到,也可以按照现有技术公开的已知方法获得,也可以通过市售途径获得。
按照不同的提取方法均可获得适用于本发明的多糖提取物。例如水提取-醇沉淀法、膜过滤法和碱液提取-盐沉淀法技术等。
按照本发明优选的技术方案,可以将灵芝或灰树花发酵的菌丝体用水提取,或者将药用灵芝或灰树花原料用水提取(优选采用水煮法,或水回流提取法,控制温度80℃-100℃,时间1小时-4小时),用醇沉淀(优选用乙醇,优选醇浓度为65%-95%,温度4℃-30℃,时间3小时-12小时),由此可获得富含灵芝多糖或灰树花多糖的粗提物,将得到的粗提物以适量水溶解,再用醇沉淀(优选用乙醇,优选醇浓度为65%-95%,温度4℃-30℃,时间3小时-12小时)精制,然后分别喷雾干燥或减压干燥,制成粉末,粉碎过筛,用于配制所述制剂。
在优选的实施方案中,将粉碎后的灵芝原料热水回流浸提1-3次,滤渣重提1-3次,合并滤液,减压浓缩,乙醇沉淀,沉淀以去离子水稀释,喷雾干燥或减压干燥成浸膏粉。灰树花原料热水回流浸提1-3次,滤渣重提1-3次,合并滤液,减压浓缩,乙醇沉淀,沉淀以去离子水稀释,喷雾干燥或减压干燥成浸膏粉。
本发明产品的主要功效成分为灵芝多糖和灰树花多糖,因此以多糖含量的检测为产品质量的控制方法。提取物中多糖的含量测定可采用硫酸-蒽酮法、苯酚-硫酸法等,本发明参照《中华人民共和国药典》2005年版一部130页灵芝含量测定项下,采用硫酸-蒽酮法,优选的适用于本发明的灵芝和灰树花提取物中多糖含量为10~90%。
本发明还提供了上述复方制剂的制备方法,所述方法包括将所述灵芝多糖和灰树花多糖提取物或其粉末按所需比例混合,可以直接配制成制剂,也可以选择性的加入药学上可接受的载体,混合均匀,加工成口服制剂,例如胶囊、片剂、颗粒剂或口服液。
本发明的制剂以多糖为主要成分,可调节机体免疫力,对人体具有保健作用,特别是增强免疫力作用。以多糖重量计,本发明复方口服制剂中含有:灵芝多糖10%~95%、灰树花多糖5%~90%,优选灵芝多糖20%~90%、灰树花多糖10%~80%,更优选灵芝多糖70~85%、灰树花多糖15~30%。按常规方法可直接或选择性添加适宜的药用载体制成胶囊、片剂、颗粒剂或口服液,即可作为一般亚健康人群的保健品,又可作为细胞毒性化疗药物治疗后的防治药物。对于体重60kg的成年人,如单用灵芝多糖或单用灰树花多糖使用剂量为不低于0.2g/次,优选不低于0.8g/次,最优选2g/次-10g/次,1-4次/日,优选2次或3次;服用按比例组成的灵芝多糖和灰树花多糖的复方制剂使用剂量为多糖总量计不低于0.03g/次,优选不低于0.05g/次,最优选0.1g/次-0.5g/次,1-4次/日,优选每日2次或3次。
本发明中口服制剂可通过如下特征的制剂来解决,即该制剂含有灵芝多糖和灰树花多糖作为主药,附加药学上可接受的载体(即添加剂)作为辅料。添加剂选自崩解剂、粘合剂、润滑剂、填充剂中一种或几种混合。
根据本发明制剂添加剂可为崩解剂、粘合剂、润滑剂、填充剂中任意组合。其中填充剂优选为预胶化淀粉、淀粉、糊精、甘露醇、微晶纤维素、硫酸钙、碳酸钙、轻质氧化镁中的一种或几种混合;润滑剂优选为硬脂酸钙、硬脂酸镁、滑石粉中一种或几种混合;崩解剂优选为交联羧甲基纤维素钠、微晶纤维素、干淀粉、交联聚维酮中一种或几种混合;粘合剂优选为淀粉浆、糊精、纤维素及其衍生物的一种或几种混合。
优选主药多糖总量为10-100%,进一步优选为20-90%,最优选为30-75%。
优选添加剂用量为0-80%。优选崩解剂用量为0.5%-5%,更优选为0.8%-2%,特别优选为1.0%-1.5%。优选润滑剂用量为0.3%-1.0%,更优选为0.5%-0.9%。填充剂用量视制剂规格而定,粘合剂用量视具体生产中颗粒的流动性以及崩解情况而定。
本发明还涉及灵芝多糖和灰树花多糖相联合用于制备增强免疫力作用的复方口服制剂的药物的用途,其中所述药物可用于因使用细胞毒性抗癌药物出现的白细胞数目减少、中枢免疫器官(如胸腺)和外周免疫器官(如脾脏)萎缩而致的免疫功能低下症状的辅助治疗,也可用于其它原因引起的免疫功能低下的一般人群。以多糖重量计,所述药物中含有:灵芝多糖10%~95%、灰树花多糖5%~90%,优选灵芝多糖20%~90%、灰树花多糖10%~80%,更优选灵芝多糖70~85%、灰树花多糖15~30%。
附图说明
图1显示了单独用灵芝多糖和灰树花多糖对细胞毒性化疗药物引起的胸腺指数下降的影响。
图2显示了单独用灵芝多糖和灰树花多糖对对细胞毒性化疗药物引起的脾指数下降的影响。
图3显示了灵芝提取物和灰树花提取物复方制剂对细胞毒性化疗药物引起的血白细胞计数下降的影响。
图4显示了灵芝提取物和灰树花提取物单用,及其二者联合对细胞毒性化疗药物引起的血白细胞计数下降的影响。
图5显示了灵芝提取物和灰树花提取物组方I对细胞毒性化疗药物引起的血白细胞计数下降的影响。
图6显示了生物活性实施例4中的组方I对细胞毒性化疗药物引起的胸腺指数下降的影响。
图7显示了生物活性实施例5中的组方I对细胞毒性化疗药物引起的脾指数下降的影响。
图8显示了生物活性实施例6中的组方I对正常小鼠吞噬指数K的影响。
图9显示了生物活性实施例6中的组方I对正常小鼠吞噬活性α的影响。
在附图显示的数据中,n=10,*P<0.05,**P<0.01与正常对照组相比;#<0.05与环磷酰胺组相比。
具体实施方式
实施例1
取灵芝8kg,粉碎,加入10倍量热水回流浸提2小时,过滤,滤渣以同样方式重提1次,合并滤液,控制温度在50℃的条件下减压浓缩,浓缩液加入95%乙醇沉淀过夜,以去离子水重新溶解沉淀,加入95%乙醇沉淀12小时,减压干燥,得灵芝浸膏粉,粉碎,过100目筛,得灵芝提取物。经硫酸-蒽酮法检测,提取物中灵芝多糖含量为35%。
实施例2
取灰树花3kg,粉碎,加入10倍量水热水回流浸提2小时过滤,滤渣以同样方式重提1次,合并滤液,控制温度50℃的条件下减压浓缩,浓缩液加入95%乙醇沉淀过夜,去离子水重新溶解沉淀,加入95%乙醇沉淀12小时,减压干燥,得灰树花浸膏粉,粉碎,过100目筛,得灰树花提取物。经硫酸-蒽酮法检测,提取物中灰树花多糖含量为20%。
实施例3
制备1000粒复方中药胶囊:分别取如实施例1的方法制得的灵芝提取物229克和如实施例2的方法制得的灰树花提取物100克,总重量329克,(按复方中灵芝多糖80%、灰树花多糖20%的比例)混合均匀,充填成1000粒胶囊。
实施例4
冲剂的制备:分别取如实施例1的方法制得的灵芝提取物214克和如实施例2的方法制得的灰树花提取物125克(按复方中灵芝多糖75%、灰树花多糖25%的比例),混合均匀,制粒,分装即得。
实施例5
分别取如实施例1的方法制得的灵芝提取物243克和如实施例2的方法制得的灰树花提取物75克(按复方中灵芝多糖85%、灰树花多糖15%的比例),与适当辅料混合均匀,制成粉末,加入去离子水稀释,分装、灭菌,即得。
生物活性实施例1
实验采用昆明小鼠,♂,体重18-22g。实验组分为空白对照组,环磷酰胺组和药物治疗组。小鼠适应环境3小时以后,药物处理组以灌胃方式给予灵芝提取物或灰树花提取物,正常和环磷酰胺组给相应量的生理盐水,给药2次/日。于末次给药前1天上午给药2小时后,除正常对照组外,其余各组腹腔注射环磷酰胺50mg/kg一次,正常对照组注射相应量的生理盐水;下午正常给药。末次给药前称重,给药1小时后,采血待测白细胞计数;处死动物,迅速取脾脏和胸腺,滤纸拭干后称重。
结果判定:以能逆转环磷酰胺注射所致的小鼠血白细胞计数、胸腺指数和脾指数的降低为有效。
研究发现小鼠给予细胞毒性药物环磷酰胺50mg/kg注射,其胸腺指数和脾指数分别降低28.4%和24.2%;当以灵芝多糖含量计为400mg/kg的剂量给予灵芝提取物时,可使给予环磷酰胺注射的小鼠的胸腺指数和脾指数分别上升13.6%和14.2%;当以灰树花多糖含量计为400mg/kg的剂量给予灰树花提取物时,可使给予环磷酰胺注射的小鼠的脾指数上升18.0%,与单纯给予环磷酰胺注射组比差异显著,如图1-2所示。
结论:灵芝提取物能逆转环磷酰胺注射小鼠胸腺指数和脾指数的降低,灰树花提取物可明显升高环磷酰胺注射小鼠的脾指数。
生物活性实施例2
按照均匀设计原则将实施例1的灵芝提取物和实施例2的灰树花提取物以多糖含量计算按不同比例组方如下:
组方I灵芝多糖∶灰树花多糖=4∶1;
组方II灵芝多糖∶灰树花多糖=2∶1;
组方III灵芝多糖∶灰树花多糖=1∶1;
组方IV灵芝多糖∶灰树花多糖=1∶2;
组方V灵芝多糖∶灰树花多糖=1∶4;
采用生物实施例1的研究方法,研究发现小鼠给予细胞毒性药物环磷酰胺50mg/kg注射,其白细胞计数降低25.6%;灵芝提取物和灰树花提取物组成的复方制剂在总多糖含量为80mg/kg时均有不同程度的升高白细胞的作用。组方I、组方II、组方III、组方IV和组方V,2次/日,8次给药后,可使小鼠白细胞计数分别升高44.3%、19.7%、23.0%、16.4%和11.5%,如图3所示。
结论:灵芝提取物和灰树花提取物组成的复方制剂,特别是在灵芝多糖含量为20%-80%、灰树花多糖含量为20%-80%时,能够逆转化疗后小鼠降低的白细胞计数。
生物活性实施例3
按照均匀设计原则将实施例1的灵芝提取物和实施例2的灰树花提取物以多糖含量计算按不同比例组方如下:
组方XI灵芝多糖∶灰树花多糖=8∶1;
组方I灵芝多糖∶灰树花多糖=4∶1;
组方III灵芝多糖∶灰树花多糖=1∶1;
组方V灵芝多糖∶灰树花多糖=1∶4;
组方XII灵芝多糖∶灰树花多糖=1∶8;
采用生物实施例1的研究方法,与单独采用灵芝多糖或灰树花多糖进行对比试验。
结果发现小鼠给予细胞毒性药物环磷酰胺50mg/kg注射,其白细胞计数与正常对照组比降低了31.6%。
单独使用灵芝提取物或灰树花提取物,在灵芝多糖含量为80mg/kg时,可使经环磷酰胺注射的小鼠白细胞计数升高1.4%;灰树花多糖含量在80mg/kg时,可使经环磷酰胺注射的小鼠的白细胞计数升高10.5%。
在相同实验条件下,灵芝提取物和灰树花提取物组成的复方制剂在总多糖含量为80mg/kg时,组方XI、组方I、组方III、组方V和组方XII与单独给予细胞毒性化疗药物环磷酰胺组小鼠比,可使白细胞计数分别升高42.7%、36.4%、11.2%、20.3%和11.6%,如图4所示。
结论:灵芝提取物和灰树花提取物组成的复方制剂,其逆转细胞毒性化疗药物引起的小鼠白细胞计数降低的作用优于单独使用灵芝或灰树花的提取物的作用。
生物活性实施例4
根据该中药复方的筛选研究结果,选定灵芝多糖与灰树花多糖含量比为4∶1的组方I进一步作药效学研究。结果如下:
小鼠给予环磷酰胺50mg/kg腹腔注射,与正常对照组比其血白细胞计数下降31.0%。在同样条件下,组方I在浓度20mg/kg、80mg/kg、200mg/kg和400mg/kg时,使白细胞水平分别上升4.1%、18.3%、21.3%和27.8%,呈剂量依赖性效应,其中组方I 80mg/kg、200mg/kg和400mg/kg组小鼠白细胞水平与环磷酰胺50mg/kg组小鼠比差异显著;给予贞芪扶正胶囊485mg/kg(批号:20051201,甘肃兰药药业集团有限责任公司生产)组小鼠血白细胞升高16.0%,见图5。
结论:组方I对细胞毒性化疗药物引起的血白细胞计数的降低具有逆转作用。
生物活性实施例5
使用生物活性实施例1的方法,研究发现小鼠给予环磷酰胺50mg/kg腹腔注射,与正常对照组比其胸腺指数降低36.5%。在同样条件下,组方I在浓度20mg/kg、80mg/kg、200mg/kg和400mg/kg时,可使胸腺指数分别上升16.3%、10.9%、21.9%和10.0%;给予贞芪扶正胶囊485mg/kg(批号:20051201,甘肃兰药药业集团有限责任公司生产)组小鼠胸腺指数升高7.0%,见图6。
结论:组方I对细胞毒性化疗药物所致的胸腺萎缩具有逆转作用。
生物活性实施例6
小鼠给予环磷酰胺50mg/kg腹腔注射,与正常对照组比其脾指数降低30.5%。在同样条件下,组方I在浓度20mg/kg、80mg/kg、200mg/kg和400mg/kg时,使脾指数分别增加9.4%、5.1%、23.1%和12.4%;给予贞芪扶正胶囊485mg/kg(批号:20051201,甘肃兰药药业集团有限责任公司生产)小鼠脾指数升高23.2%,见图7。
结论:组方I对细胞毒性化疗药物所致的脾脏萎缩具有逆转作用。
生物活性实施例7
试验方法:试验使用昆明小鼠,♂,体重18-22g,随机分为正常对照组和不同剂量的药物处理组。于末次给药30分钟后,尾静脉注射印度墨汁0.1ml/10g体重,注射后分别于3min和20min用移液器(预先用肝素溶液湿润)分别从眶后静脉丛取血20μl,溶于2ml 0.1% Na2CO3溶液中摇匀,使用可见-紫外分光光度计,在波长600nm处比色测定光密度。
结果发现,正常小鼠灌胃给予天然药物组方I 20mg/kg,其巨噬细胞吞噬功能与正常对照组比吞噬指数K增加53.09%,吞噬活性增加23.26%,与正常对照组比差异显著;当其剂量为80mg/kg和400mg/kg时,可分别使吞噬指数K增加27.0%和11.0%,吞噬活性增加11.7%和12.3%,见图8-9。
结论:组方I能够增强正常小鼠的先天性免疫功能。