CN1882705A - 遗传多态性用于预测药物诱导肝脏毒性的用途 - Google Patents

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Abstract

IL1A或染色体2q14上位于IL1A附近的基因促进了肝脏毒性，如通过在N－苯甲酰－星形孢菌素治疗黄斑水肿的过程中血清天冬氨酸转氨酶水平升高所测定。因此，IL1A基因的遗传多态性是预测星形孢菌素衍生物介导肝脏毒性的有用的生物标志物。

Description

遗传多态性用于预测药物诱导肝脏毒性的用途
发明领域
本发明总体涉及组织样品的体外分析测试，并且更加具体而言涉及作为预测药物诱导肝脏毒性发生有用的生物标志物的遗传多态性分析。
相关领域描述
由于糖尿病患者微脉管系统机能障碍而产生的失调之一是视网膜病变，其自身的临床表现为视力障碍并且能够导致失明。糖尿病性视网膜病变特征为微动脉瘤、过度血管渗透性、视网膜无灌注区和视网膜新生血管形成。许多证据表明在高血糖水平与导致器官功能缺损的潜在损伤发展之间存在因果联系。对于综述见Way KJ等，Diabetic Medicine 18：945-59(2001)。
高血糖症效应之一是二酰甘油(DAG)-蛋白激酶C(PKC)信号转导途径的过度活化。糖尿病的细胞培养实验和动物模型都证明在血管内皮细胞中DAG和PKC的水平和活性过高。Koya D和King GL，Diabetes 47：859-866(1998)；Ishii H等，JMol Med 76：21-31(1998)和Way KJ等，TrendsPharmacol Sci 21：181-7(2000)。许多PKC丝氨酸-苏氨酸激酶异型体的活化依赖于DAG，即膜磷脂的裂解产物。PKC丝氨酸-苏氨酸激酶的活化异型体之一是主要的异型体PKCβ，该异型体与糖尿病性视网膜病变相关。DAG一般通过激动剂刺激的膜磷脂水解产生，但是也能够通过葡萄糖直接代谢作用从头合成。Dunlop ME和Larkins RG，Biochem Biophys ResCommun 132：467-73(1985)；Ishii H等，JMol Med 76：21-31(1998)。作为对高血糖症的反应，DAG从头合成大量增加，导致PKCβ的活化。IshiiH等，J Mol Med 76：21-31(1998)。
DAG-PKC途径持续活化的结果影响到血管功能的许多方面。刺激细胞因子活化和白细胞粘附；改变血流量和微血管收缩性；以及增加细胞外基质合成，导致基膜变厚。由于上述改变视网膜微环境变得局部缺血。作为对局部缺血的反应并且通过其它PKCβ依赖机制上调了一种新血管形成有效刺激物即血管内皮生长因子(VEGF)的表达。Aiello LP等，Diabetes 46：1473-80(1997)。
N-苯甲酰-星形孢菌素(PKC412)是PKC和重要VEGF受体KDR(包含激酶插入结构域受体，也称为VEGF-R2)的抑制剂。N-苯甲酰-星形孢菌素正在研发用于几种指征，包括糖尿病黄斑水肿的治疗。见美国专利号6,214,819。还可见美国专利申请20030119812、20030125343和20030153551。尽管N-苯甲酰-星形孢菌素治疗是一种有前途的药物治疗，但其可导致出现包括肝脏毒性在内的已知副作用。因此，在本领域中需要降低N-苯甲酰-星形孢菌素的副作用。
发明简述
本发明提供了用于确定处于发展成药物诱导肝脏毒性危险的受试者的方法。在一个实施方案中，本发明提供了基因组分析用于鉴定在星形孢菌素治疗期间处于形成肝脏毒性危险的患者的途。在特定实施方案中，星形孢菌素治疗包括施用N-苯甲酰-星形孢菌素用于治疗糖尿病黄斑水肿。肝脏毒性的预测包括测定血清天冬氨酸转氨酶(AST)水平。在另一个实施方案中，本发明提供了确定用于这些患者的最佳治疗策略的方法。
本发明还提供了用于在服药之前预测肝脏毒性的临床测定法、试剂盒和试剂。在一个实施方案中，试剂盒包含用于确定IL1A基因中遗传多态性的试剂。在特定实施方案中，遗传多态性位于IL1A基因的PG基因座ID 279。在PG基因座ID 279遗传多态性的测定中，CC基因型(SEQ IDNO：1)是预测具有较高肝脏毒性危险的生物标志，而CT基因型(SEQ IDNO：1和2)和TT基因型(SEQ ID NO：2)是预测具有较低肝脏毒性危险的生物标志。在另一个实施方案中，试剂盒包含用于确定IL1A基因中遗传多态性的试剂。在特定实施方案中，遗传多态性位于IL1A基因的PG基因座ID 302。在PG基因座ID 302遗传多态性的测定中，GG基因型(SEQ IDNO：3)是预测具有较高肝脏毒性危险的生物标志，而GT基因型(SEQ IDNO：3和4)和TT基因型(SEQ ID NO：4)是预测具有较低肝脏毒性危险的生物标志。
附图简述
图1显示AST/ALT(天冬氨酸转氨酶/丙氨酸转氨酶)水平最大值对IL1A(白介素1-α；PG基因座ID 279)。散点图显示在临床试验中IL1A PG基因座ID 279基因型为CC或T(CT或TT)的受试者的(A)天冬氨酸转氨酶水平最大值，(B)AST MAX和正常值上限(ULN)的比值，(C)丙氨酸转氨酶水平最大值，和(D)ALT MAX和ULN的比值。对于年龄为3-64岁的受试者天冬氨酸转氨酶正常值上限为42U/L且对于年龄为65岁以及更大的受试者为55U/L，并且对于所有年龄的受试者丙氨酸转氨酶正常值上限为48U/L。ULN用直线表示。
图2显示AST/ALT(天冬氨酸转氨酶/丙氨酸转氨酶)水平最大值对IL1A(白介素1-α；PG基因座ID 302)。散点图显示在临床试验中IL1A PG基因座ID 302基因型为G或T(GT或TT)的受试者的(A)丙氨酸转氨酶水平最大值，(B)AST MAX和ULN比值，(C)ALT水平最大值和(D)ALTMAX和ULN比值。对于年龄为3-64岁的受试者天冬氨酸转氨酶正常值上限为42U/L且对于年龄为65岁和更大的受试者为55U/L，并且对于所有年龄的受试者丙氨酸转氨酶正常值上限为48U/L。ULN用直线表示。
发明详述
本发明有利地提供了在真正服药之前确定患者在药物治疗期间是否将经历肝脏毒性的方法。因此本发明通过帮助临床医师(1)改变药物剂量、(2)提供另外的或备选的合并用药(concomitant medication)法或者(3)选择对于该患者不开该药物药方而提供了对于患者更加安全的疗法。
在N-苯甲酰-星形孢菌素的多中心、随机、双盲安慰剂对照控制剂量发现II期试验中鉴定了相关遗传多态性，该试验在患有糖尿病黄斑水肿的受试者中进行。在受试者中评价了N-苯甲酰-星形孢菌素的安全性并且收集其它药物代谢动力学信息。虽然N-苯甲酰-星形孢菌素显示了良好的安全性，但是在登记进行临床试验的140名受试者中有9名受试者经历肝脏毒性，如通过肝脏转氨酶比正常值上限(ULN)增加倍数所确定。如果在第3、4或5次随访时天冬氨酸转氨酶(AST)或丙氨酸转氨酶(ALT)比正常值上限成倍增加，则将受试者标记为经历过肝脏毒性。
在进行基因分型的7个基因的18个单核苷酸多态性(SNP)中，白介素1-α(IL1A)基因中2个单核苷酸多态性与第3、4或5次随访时所记录的血清天冬氨酸转氨酶水平最大值关联。IL1A编码在介导急性期反应中起至关重要作用的炎性细胞因子。一个IL1A多态性位于IL1A的启动子区域并且另一个为氨基酸位置114上丝氨酸至丙氨酸的替换。这些结果表明IL1A或在2q14上定位于其附近的基因内的多态性直接参与N-苯甲酰-星形孢菌素施用后肝脏毒性的发病。
如文中所使用，当遗传多态性与药物诱导肝脏毒性的发展或者血清天冬氨酸转氨酶水平上升显著关联时，IL1A遗传基因座中的多态性是肝脏毒性“高”危险的“预示”。例如见下，在这里PG基因座ID 279位的CC基因型和PG基因座ID 302位的GG基因型预示具有肝脏毒性的高危险。如文中所使用，当遗传多态性与缺乏肝脏毒性发展显著关联时，IL1A遗传基因座中的多态性是肝脏毒性“低”危险的“预示”。例如见下，在这里PG基因座ID 279位的CT或TT基因型和PG基因座ID 302位的GT或TT基因型预示具有肝脏毒性的低危险。通过方差分析(ANOVA)或Fisher精确检验能够测定显著性(p值)。对某一IL1A遗传位点中具有发展成肝脏毒性高危险的一个SNP多态性的确定和对该IL1A遗传位点中具有发展成肝脏毒性低危险的另一个SNP多态性的确定可以结合起来以得到更高的确定精确性。对于PG基因座ID 279和302，IL1A多态性和血清天冬氨酸转氨酶水平之间关联的p值为0.0089和0.0097。
基于星形孢菌素衍生物的结构相似性和在肝脏内的作用方式，能够合理地将这些结果外推至能够预测在任意星形孢菌素衍生物施用之后患者的肝脏毒性。星形孢菌素衍生物是描述于美国专利号5,093,330中的那些。优选的化合物是N-酰基星形孢菌素及其可药用盐，包括N-(2-氨基乙酰基)星形孢菌素；N-(3，5-二硝基苯甲酰基)-星形孢菌素；N-(3-羧基丙酰基)星形孢菌素；N-(3-氟苯甲酰基)-星形孢菌素；N-(3-硝基苯甲酰基)星形孢菌素；N-(4-羧基苯甲酰基)星形孢菌素；N-[(叔丁氧基羰基氨基)-乙酰基]-星形孢菌素；N-丙氨酰星形孢菌素；N-苯甲酰星形孢菌素；N-羧甲基-星形孢菌素；N-乙基-星形孢菌素；N-甲基氨基硫代羰基星形孢菌素；N-苯氨羰基星形孢菌素；N-叔丁氧基羰基星形孢菌素和N-三氟乙酰基星形孢菌素。
而且，这些结果能够推广至在治疗糖尿病黄斑水肿之外的其他疾病的患者中预测肝脏毒性。本发明的方法适用于脊椎动物受试者，具体而言是哺乳动物受试者，更加具体而言是人类受试者。本发明特别适用于糖尿病受试者。
使用血清酶水平测定法能够实现肝脏毒性诊断。指示肝脏功能障碍的血清酶测定法是医学领域中那些技术人员众所周知的并且是医院实验室中常规进行的测定法。对于肝脏毒性的定义基于血清天冬氨酸转氨酶(AST)水平并用于实施例：在该分析中使用的肝脏毒性定义是基于第3、4或5次随访时血清天冬氨酸转氨酶或丙氨酸转氨酶超过正常值上限(ULN)的增加倍数。对于年龄为3-64岁的受试者血清天冬氨酸转氨酶正常值上限为42U/L并且对于年龄为65岁及以上的受试者为55U/L；对于血清丙氨酸转氨酶正常值上限为48U/L(Smithkline Beecham临床实验室的参考警惕范围)。虽然在第3、4或5次随访时任一种酶的升高均构成肝脏毒性，但在未施用药物时的随后随访过程中的转氨酶升高可以忽视。而且，在基线期(第2次随访)时肝脏功能测试结果升高的受试者不标记为经历肝脏毒性，而不管在施用药物后他们的酶水平升高情况如何。9名受试者被标记为将经历肝脏毒性。他们当中有6名受试者同意进行临床药物遗传学分析。
使用本领域众所周知的各种技术可以在DNA、RNA或蛋白质水平检测携带多态性等位基因的个体。用于鉴定和检测的策略描述于例如EP730,663、EP 717,113和PCT US 97/02102。本发明的方法可以包括检测预先表征的多态性。即已经确定了该位点存在的基因分型位置和多态性形式特性(见关于所检查基因的讨论)。该信息的可利用性允许设计多套探针用于已知多态形式的特异性鉴定。包含单核苷酸多态性的等位基因的鉴定可以包括从靶样品扩增DNA。通过例如PCR能够实现扩增。通常见PCRTechnology：Principles and Applications for DNA Amplification，(Erlich编，Freeman Press，New York，New York，1992)；PCR Protocols：A Guide toMethods and Applications(Innis等编，Academic Press，San Diego，Calif.，1990)。通过各种方法能够实现特异性DNA序列中多态性的检测，其中所述方法包括但不限于基于等位基因特异性限制性核酸内切酶断裂的限制性片段长度多态性检测(Kan和Dozy，Lancet II：910-912(1978))、与等位基因特异性探针(Wallace等，Nucl.Acids Res.6：3543-3557(1978))包括固定化寡核苷酸(Saiki等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：6230-6234(1969))或寡核苷酸阵列(Maskos和Southern，Nucl.Acids Res.21：2269-2270(1993))杂交、等位基因特异PCR(Newton等，Nucl.Acids Res.17：2503-2516(1989))、错配修复检测(MRD)(Faham和Cox，Genome Res.5：474-482(1995))、MutS蛋白质结合(Wagner等，Nucl.Acids Res.23：3944-3948(1995))、变性梯度凝胶电泳(DGGE)(Fisher和Lerman，Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.80：1579-1583(1983))、单链构象多态性检测(Orita等，Genomics 5：874-879(1983))、在错配碱基对处的RNA酶断裂(Myers等，Science 230：1242(1985))、异源双链体DNA的化学断裂(Cotton等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，8Z：4397-4401(1988))或酶学断裂(Youil等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：87-91(1995))、基于等位基因特异性引物延伸的方法(Syvanen等，Genomics 8：684-692(1990))、遗传位元分析法(genetic bit analysis)(GBA)(Nikiforov等，Nucl.Acids Res.22：4167-4175(1994))、寡核苷酸连接分析法(OLA)(Landegren等，Science 241：1077(1988))、等位基因特异性连接链式反应(LCR)(Barrany，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88：189-193(1991))、缺口LCR(Abravaya等，Nucl.Acids Res.23：675-682(1995))、使用本领域众所周知的标准程序进行的放射性和/或荧光DNA测序和肽核酸(PNA)测定法(Orum等，Nucl.Acids Res.21：5332-5356(1993)；Thiede等，Nucl.Acids Res.24：983-984(1996))。Sambrook J等的Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第三版(Cold Spring Harbor Press，Cold SpringHarbor，New York，2000)提供了另外的指导。
对于N-苯甲酰-星形孢菌素和相关星形孢菌素衍生物用途的指导在美国专利号5,744,460；5,827,846；6,018,042；6,153,599和6,214,819中提供，其中每一专利引用作为参考。对于N-苯甲酰-星形孢菌素相关星形孢菌素衍生物用于治疗眼新血管形成疾病和降低视网膜内毛细血管渗透性的指导在美国专利申请20030119812、20030125343和20030153551中提供，其中每一专利引用作为参考。
单核苷酸多态性.
人类基因组中的序列变异主要由单核苷酸多态性(“SNP”)组成，其它的序列变异为短串联重复(包括微卫星序列)、长串联重复(小卫星序列)以及其它插入和缺失。SNP是在人类种群中以可觉察的频率(即＞1％)出现2个交替碱基的位置。由于多态性的存在，SNP称为“等位的”，物种中的一些成员可以具有未突变的序列(即最初“等位基因”)，而其它成员可以具有突变序列(即等位基因的变体或突变体)。在最简单的例子中，仅存在一个突变序列，并且多态性称为二对等位基因的多态性。交替突变的存在能够产生三对等位基因多态性等等。SNP分布于整个基因组中并且改变基因功能的SNP可能是表型变异的直接促成者。由于其流行性和广泛分布的特点，SNP有可能成为重要的工具用于定位参与人类疾病状态的基因，见例如Wang等，Science 280：1077-1082(1998)，其公开了一项先导研究，其中将2,227个SNP在2.3兆碱基DNA区域上进行了作图。
单核苷酸多态性和特定表型之间的关联不表示或者要求SNP是表型的成因。相反，此种关联仅可以表示该SNP定位于基因组上某位点附近，其中在所述的位点存在表型的决定因子，并且因此更有可能发现SNP与这些决定因子的关联从而发现SNP与目的表型的关联。因此，SNP与‘真正’功能变体处于连锁不平衡(LD)。当基因组的2个不同位点处的等位基因的关联比预期的更高时，则存在LD(也称作等位基因关联性)。
因此，由于其与引起特定表型的突变的接近，SNP可以作为具有价值的标志物。
与疾病关联的SNP对其所定位的基因的功能也可以具有直接的影响。序列变体可以导致氨基酸改变或者可以改变外显子-内含子剪接，从而直接修饰相关蛋白质，或者序列变体存在于调控区域，从而改变表达循环或mRNA稳定性，见Nowotny P Current Opinions in Neurobiology 11：637-641(2001)。
日益明显，发展成许多共同病症的危险性以及用于治疗这些状况的药物的代谢基本上受到潜在基因组变异的影响，尽管任何一个变体的影响可能很小。
因此，SNP和临床表型之间的关联表明：(1)SNP在功能上决定表型或者，(2)在基因组上靠近SNP的位置存在引起表型的其它突变。第二种可能性是基于遗传生物学。大的DNA片段是遗传的并且彼此接近的标志物不可能在许多代不相关的个体中进行重组，即标志物是连锁不平衡的(LD)。
SNP鉴定和表征.
许多不同的技术能够用于鉴定和表征SNP，包括单链构象多态性分析、通过变性高效液相色谱(DHPLC)的异源双链体分析、直接DNA测序和计算机方法，见Shi MM，Clin Chem 47：164-172(2001)。由于公共数据库序列信息的丰富，可以使用计算机工具通过对独立提交的特定基因的序列(cDNA或者基因组序列)进行比对在计算机上鉴定SNP。对通过实验所获得的SNP和通过计算机方法获得的SNP进行比较显示，在通过SNPFinder(http://Ipgws.nci.nih.gov：82/perl/snp/snp_cgi.pl)发现的候选SNP中有55％的SNP也已经通过实验发现，见Cox等，Hum Mutat17：141-150(2001)。然而，这些计算机方法仅能够找到27％的真正SNP。
目前，最常见的SNP分型方法包括杂交、引物延伸和断裂方法。这些方法的每一种必须与适当检测系统相结合。检测技术包括荧光偏振(见Chan X等，Genome Res 9：492-499(1999))、焦磷酸盐释放的发光计检测(焦磷酸测序)(见Ahmadiian A等，Anal Biochem 280：103-10(2000))、基于荧光共振能量转移(FRET)的裂解测定、DHPLC和质谱法(见Shi MM，ClinChem 47：164-172(2001)和美国专利号6,300,076B1)。检测和表征SNP的其它方法是公开于美国专利号6,297,018B1和6,300,063B1的那些方法。上面参考文献的公开在文中全部引用作为参考。
在特别优选的实施方案中，通过所谓的INVADERTM技术(可以从Third Wave Technologies公司(Madison，Wisconsin，美国)获得)能够实现多态性的检测。在该测定法中，特异性上游“侵略者”寡核苷酸和部分重叠的下游探针当结合至互补DNA模板时一起形成特异结构。该结构被裂解酶识别并在特异位点切割，并且这导致探针寡核苷酸5’侧翼的释放。然后该片段可以作为关于反应混合物中所包含的合成二级靶标和二级荧光标记信号探针的“侵略者”寡核苷酸。这导致裂解酶对二级信号探针的特异裂解。当用能够进行荧光共振能量转移的染料分子所标记的该二级探针被裂解时，则产生荧光信号。裂解酶对于重叠DNA序列或侧翼所形成的结构具有严格的要求，并且因此裂解酶能够特异性检测在下游DNA链上的紧邻裂解位点上游的单个碱基对错配。见Ryan D等，MolecularDiagnosis 4(2)：135-144(1999)和Lyamichev V等，Nature Biotechnology17：292-296(1999)，还可参见美国专利5,846,717和6,001,567(其公开在文中全部引用作为参考)。
在一些实施方案中，组合物包含2种或多种不同标记的基因分型寡核苷酸，其用于同时探测2种或多种多态性位点处的核苷酸。还可预见引物组合物包含2套或多套等位基因特异引物对以允许同时靶向并扩增包含多态性位点的2个或多个区域。
本发明的基因分型寡核苷酸还可以固定在固体表面例如微芯片、珠子或载玻片上或者在其上合成(见例如WO 98/20020和WO 98/20019)。此类固定化的基因分型寡核苷酸可以用于多种多态性检测测定，包括但不限于探针杂交和聚合酶延伸测定。本发明的固定化基因分型寡核苷酸可以包含有序寡核苷酸阵列，其中所述阵列被设计成同时快速筛选DNA样品中的多重基因的多态性。
本发明的等位基因特异寡核苷酸引物具有3’末端核苷酸，或者优选地具有3’次末端核苷酸，其与特定SNP的唯一一个核苷酸互补，从而仅仅当存在包含该核苷酸的等位基因时才能够作为引物用于聚合酶介导的延伸。杂交至编码链或非编码链的等位基因特异寡核苷酸引物也处于本发明的范围内。使用本领域技术人员已知的技术能够研发用于检测基因多态性的ASO引物。
本发明的其它基因分型寡核苷酸与位于此处所鉴定新多态性位点之一的下游一个至几个核苷酸的靶区域杂交。此类寡核苷酸用于聚合酶介导的引物延伸方法以检测文中所叙述的新多态性之一，并且因此此类基因分型寡核苷酸在文中称为“引物延伸寡核苷酸”。在一个优选的实施方案中，引物延伸寡核苷酸的3’末端是与紧邻多态性位点的核苷酸互补的脱氧核苷酸。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含至少2种包装于分开容器中的基因分型寡核苷酸的试剂盒。该试剂盒还包含其他成分例如包装于分开容器中的杂交缓冲液(在这里寡核苷酸将用作探针)。备选地，当寡核苷酸用于扩增靶区域时，试剂盒还包含包装于分开容器中的聚合酶和反应缓冲液，该反应缓冲液对于聚合酶介导的引物延伸例如PCR是优化的。
上述的寡核苷酸组合物和试剂盒可用于个体基因的基因分型和/或单体型分析方法。如文中所使用，术语“基因型”和“单体型”意思分别是包含存在于文中所描述的一个或多个新多态性位点的核苷酸对或核苷酸的基因型或单体型，并且还可以任选地包含存在于基因中一个或多个另外多态性位点的核苷酸对或核苷酸。另外的多态性位点可以是目前已知的多态性位点或者后来发现的位点。
基因分型方法的一个实施方案包括从个体分离包含个体中存在的2个拷贝基因或其片段的核酸混合物，和确定位于这2个拷贝中一个或多个多态性位点的核苷酸对以确定个体的基因型。如熟练的技术人员将容易理解，个体中基因的2个“拷贝”可以是相同的等位基因或者是不同的等位基因。在特别优选的实施方案中，基因分型方法包括确定每个多态性位点的核苷酸对。
一般地，核酸混合物从取自个体的生物学样品如血液样品或组织样品分离得到。适当的组织样品包括全血、精液、唾液、眼泪、尿液、排泄物、汗液、颊膜涂片、皮肤和毛发。核酸混合物可以由基因组DNA、mRNA或cDNA组成，并且在后两种情况下生物学样品必须是从表达该基因的器官获得。此外，熟练技术人员应当理解，mRNA或cDNA样品不能用于检测位于内含子内或者5’和3’非转录区内的多态性。如果基因片段是分离的，则其必须包含待进行基因分型的多态性位点。
单体型分析方法的一个实施方案包括从个体分离仅包含个体中存在的基因或其片段的2个拷贝之一的核酸分子和确定位于该拷贝中一个或多个多态性位点的核苷酸以确定个体的单体型。使用能够分离2个拷贝基因或片段的任意方法可以分离核酸，方法包括但不限于上面所描述的用于制备同源基因的方法之一，其中体内靶向克隆是优选的方法。本领域技术人员将容易理解，任何单个克隆将仅提供个体中存在的两个基因拷贝之一的单体型信息。如果单体型信息是个体的其它拷贝，则需要检测其它克隆。一般地，为了使对个体基因两个拷贝的单体型分析具有高于90％的可能性，至少要检测5个克隆。在特别优选的实施方案中，鉴定每个多态性位点处的核苷酸。
在优选的实施方案中，通过鉴定个体中存在的每个拷贝基因中一个或多个多态性位点处的核苷酸的相位序列(phased sequence)确定个体的单体型对。在特别优选的实施方案中，单体型分析方法包括鉴定基因每个拷贝中每个多态性位点处核苷酸的相位序列。当对基因的两个拷贝进行单体型分析时，优选地使用放置于分开容器中的每一拷贝基因开展鉴定步骤。然而，也应该想象到，如果2个拷贝是用不同标签标记的或者是分别可区别的或可辨别的，在某些情况下可以在同一容器中开展该方法。例如，如果基因的第一个和第二个拷贝分别用不同的第一种和第二种荧光染料标记并且用第三种不同的荧光染料标记的等位基因特异寡核苷酸用于测定多态性位点，则检测第一种和第三种染料的组合将鉴定第一个基因拷贝中的多态性而检测第二种和第三种染料的组合将鉴定第二个基因拷贝中的多态性。
在基因分型和单体型分析方法中，多态性位点处的核苷酸(或核苷酸对)的鉴定可以通过包含直接来自基因或其片段的一个或两个拷贝的多态性位点的靶区域的扩增进行，并且通过常规方法确定扩增区域的序列。熟练技术人员应该容易理解，在该位点为纯合子的个体中多态性位点处将仅检测到一种核苷酸，而如果该个体在该位点为杂合子则将检测到2种不同的核苷酸。多态性可以直接鉴定，称为肯定型鉴定，或者通过推断鉴定，称为否定型鉴定。例如，当在参照种群中SNP已知为鸟嘌呤和胞嘧啶，可以肯定地确定对于该位点为纯合子的患病个体该位点为鸟嘌呤或胞嘧啶，如果个体在该位点为杂合子则位点为鸟嘌呤和胞嘧啶。备选地，该位点可以否定性地确定为不是鸟嘌呤(并且因此也不是胞嘧啶/胞嘧啶)或者不是胞嘧啶(并且因此也不是鸟嘌呤/鸟嘌呤)。
此外，通过对文中未公开的多态性位点(其与目的多态性位点是连锁不平衡的)进行基因分型可以间接鉴定存在于文中所公开的任意新多态性位点处的等位基因。如果在一个位点处存在的特定变体增强了第二个位点处另一个变体的可预测性，则两个位点被称为是连锁不平衡的(见，StevensJC，Mol Diag 4：309-317(1999))。与目前公开的多态性位点处于连锁不平衡的多态性位点可以定位于基因区域内或者文中未检测到的其它基因组区域内。通过(但不限于)上述用于鉴定多态性位点处等位基因的任意方法，可以对与文中所述新多态性位点处于连锁不平衡的多态性位点进行基因分型。
使用任意寡核苷酸定向扩增方法可以扩增靶区域，所述方法包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)(美国专利号4,965,188)、连接酶链式反应(LCR)(Barany等，Proc Natl Acad Sci USA 88：189-193(1991)；PCT专利申请WO 90/01069)和寡核苷酸连接测定法(OLA)(Landegren等，Science241：1077-1080(1988))。在此类方法中用作引物或探针的寡核苷酸将与包含多态性位点或与多态性位点相邻的核酸区域特异性杂交。一般地，寡核苷酸长度在10和35个核苷酸之间，并且长度优选地在15和30个核苷酸之间。最优选地，寡核苷酸长度为20-25个核苷酸。寡核苷酸的确切长度将取决于许多因素，这些因素是技术人员常规考虑和实践的。
其它已知核酸扩增方法也可以用于扩增靶区域，包括基于转录的扩增系统(美国专利号5,130,238；EP 329,822；美国专利号5,169,766、WO89/06700)和等温法(Walker等，Proc Natl Acad Sci USA 89：392-396(1992))。
靶区域内的多态性也可以通过使用本领域已知的几种基于杂交的方法之一在扩增之前或之后测定。一般地，在开展此类方法时利用等位基因特异寡核苷酸。等位基因特异寡核苷酸可以用作带有不同标记的探针对，其中探针对之一与靶序列的一个变体完全匹配而另一个探针与不同的变体完全匹配。在一些实施方案中，使用一套等位基因特异寡核苷酸或寡核苷酸对可以立刻检测一个以上的多态性位点。优选地，当与待检测的每个多态性位点杂交时，则该套等位基因特异寡核苷酸或寡核苷酸对的成员相互之间的熔解温度在5℃内并且更加优选地在2℃内。
等位基因特异寡核苷酸与靶多聚核苷酸的杂交可以使用溶液中的两种实体进行，或者可以把寡核苷酸或靶多聚核苷酸共价或非共价附着于固体支持物上进行此种杂交。附着可以是通过例如抗体-抗原相互作用、多聚L-Lys、链霉亲和素或抗生物素蛋白-生物素、盐桥、疏水相互作用、化学键、UV交联烘烤等等间接进行。等位基因特异寡核苷酸可以在固体支持物上直接合成或者在合成之后附着于固体支持物上。适宜用于本发明检测方法的固体支持物包括由硅、玻璃、塑料、纸等等制成的基质，它们可以被制成如孔(如在96孔板中)、载玻片、薄片、膜、纤维、芯片、盘和珠的形状。可以将固体支持物进行处理、包被或衍生以易于等位基因特异寡核苷酸或靶核酸的固定化。
个体基因的基因型或单体型的确定还可以通过将包含一个或两个基因拷贝的核酸样品与如WO 95/11995中所述核酸阵列和子阵列杂交进行。阵列将包含代表着在基因型或单体型中所包括的每一多态性位点的一组等位基因特异寡核苷酸。
对多态性的鉴定还可以使用错配检测技术进行，所述技术包括但不限于使用核糖核酸探针(Winter等，Proc Natl Acad Sci USA 82：7575(1985)；Meyers等，Science 230：1242(1985))和识别核苷酸错配的蛋白质如大肠杆菌(E.coli)mutS蛋白质(Modrich P.Ann Rev Genet 25：229-253(1991))的RNA酶保护方法。备选地，可以通过单链构象多态性(SSCP)分析(Orita等，Genomics 5：874-879(1989)；Humphries等，在：Molecular Diagnosisof Genetic Diseases，R.Elles编，第321-340页(1996))或变性梯度凝胶电泳(DGGE)(Wartell等，Nucl Acids Res 18：2699-2706(1990)；Sheffield等，Proc Natl Acad Sci USA 86：232-236(1989))鉴定变体等位基因。
聚合酶介导引物延伸方法也可以用于鉴定多态性。几种此类方法已经在专利和科学文献中描述过并且包括“遗传位元分析”方法(WO 92/15712)和连接酶/聚合酶介导的遗传位元分析法(美国专利号5,679,524)。相关方法公开于WO 91/02087、WO 90/09455、WO 95/17676、美国专利号5,302,509和5,945,283。如美国专利号5,605,798中所描述，通过质谱法可以检测包含多态性的延伸的引物。另一种引物延伸方法是等位基因特异PCR(Ruafio等，Nucl Acids Res 17：8392(1989)；Ruafio等，Nucl Acids Res19：6877-6882(1991)；WO 93/22456；Turki等，J Clin Invest 95：1635-1641(1995))。此外，如WO 89/10414所描述，通过使用多套等位基因特异引物同时扩增核酸的多重区域可以研究多重多态性位点。
在优选的实施方案中，测定了每一人种地理学群的单体型频率数据以确定其是否与哈迪-温伯格平衡相一致。哈迪-温伯格平衡(D.L.Hartl等，Principles of Population Genomics，第三版，Sinauer Associates，Sunderland，MA，1997)假定发现单体型对H1/H2的频率等于PH-W(H1/H2)＝2p(H1)p(H2)(如果H1≠H2)和PH-W(H1/H2)＝p(H1)p(H2)(如果H1＝H2)。所观察和所预测的单体型频率之间的统计学上的显著差异可以归因于一种或多种因素，包括种群中明显的近交、对基因的强选择压力、抽样偏差和/或基因分型过程中的误差。如果在人种地理学群中观察到来自哈迪-温伯格平衡的大的偏差，则可以增加该群个体数量以判断偏差是否是由于抽样偏差造成的。如果使用较大样本量也没有降低所观察和所预测单体型对频率之间的差异，那么可以考虑使用直接单体型分析方法例如CLASPER SystemTM技术(美国专利号5,866,404)、SMD或等位基因特异性长范围PCR(Michalotos-Beloin等，Nucl Acids Res 24：4841-4843(1996))对个体进行单体型分析。
在用于预测单体型对的该方法的一个实施方案中，指定步骤包括开展以下分析。首先，将每个可能的单体型对与参照种群中的单体型对进行比较。通常，参照种群中仅一个单体型对和可能的单体型对匹配，并且将该单体型对指定为个体的单体型对。偶尔，参照单体型对中仅一个单体型与个体可能的单体型对相一致，并且在此种情况下将该个体指定为包含该已知单体型和新单体型的单体型对，其中所述新单体型是通过从可能单体型对中扣除已知单体型得到的。在极少数情况下，参照种群中没有一种单体型与可能单体型对相一致，或者备选地，多重参照单体型对与可能的单体型对相一致。在此类情况下，优选使用直接分子单体型分析方法例如CLASPER SystemTM技术(美国专利号5,866,404)、SMD或等位基因特异长范围PCR(Michalotos-Beloin等，Nucl Acids Res 24：4841-4843(1996))对个体进行单体型分析。
本发明还提供了用于确定种群中基因型或单体型频率的方法。该方法包括确定存在于种群中每个成员的基因的基因型或单体型对，其中基因型或单体型包含在基因中一个或多个多态性位点处检测到的核苷酸对或核苷酸，以及计算在种群中发现的任意特定基因型或单体型的频率。种群可以是参照种群、家族种群、相同性别种群、种群组、性状种群(例如，出现目的性状如对治疗性治疗具有医学状态或反应的一群个体)。
在本发明的另一方面，在参照种群中发现的基因型和/或单体型频率数据可以用于鉴定性状和基因型或单体型之间关联的方法中。性状可以是任何可检测的表型，其包括但不限于疾病易感性或者对治疗的反应。方法涉及从参照种群以及表现出性状的种群得到目的基因型或单体型频率数据。使用如上所述方法之一，对种群中的每一个体进行基因分型或单体型分析可以得到参照种群和性状种群之一或两者的频率数据。性状种群的单体型可以直接确定，或者备选地通过上述的预测基因型或单体型方法确定。
在另一个实施方案中，参照和/或性状群体的频率数据通过使用先前所确定的书面形式或电子形式的频率数据得到。例如，频率数据可以存在于通过计算机可进入的数据库中。一旦得到频率数据，可以比较参照种群和性状种群中目的基因型或单体型频率。在优选实施方案中，对在种群中所观察到的所有基因型和/或单体型频率进行比较。如果基因的特定基因型或单体型在性状种群中的频率在统计学上显著高于在参照种群中的频率，则可以预测该性状与基因型或单体型关联。
在优选实施方案中，通过使用具有Bonferoni校正的标准ANOVA检验和/或模拟基因型表型校正许多次的bootstrapping法开展统计学分析并计算显著性数值。当分析多个多态性时，要对因子进行校正以便校正偶然发现的显著性关联。对于用于该发明方法的统计学方法见StatisticalMethods in Biology，第3版，Bailey NTJ，(Cambridge Univ.Press，1997)；Introduction to Computational Biology，Waterman MS(CRC Press，2000)和Bioinformatics，Baxevanis AD和Ouellette BFF编(John Wiley&Sons，Inc.，2001)。
在该方法的优选实施方案中，目的性状是患者对一些治疗性治疗所表现出的临床反应，例如对药物靶向的反应或者对治疗性治疗医学状况的反应。
在本发明的另一个实施方案中，与目的基因型或单体型处于连锁不平衡的可检测的基因型或单体型可用作替代标志物。通过确定基因的特定基因型或单体型在种群(也证明存在潜在替代标志物基因型)中的频率是否在统计学上显著高于参照群体，预测标志物基因型是否与基因型或单体型关联以及是否能够用作取代基因型的替代标志物，来发现与基因型连锁不平衡的基因型。
定义.
如文中所使用，“医学状况”包括但不限于表现为一种或多种需要进行治疗的生理和/或心理症状的任何状况或疾病，并且还包括先前或最近鉴定的疾病和其它病症。
如文中所使用，术语“临床反应”意思是指下列任何一种或全部：反应的定量测量、无反应和不良反应即副作用。
为了推导对治疗的临床反应与基因型或单体型的相关性，获得接受治疗个体种群(以后称作“临床种群”)所表现出来的临床反应数据。该临床数据可以通过分析已经开展的临床试验的结果得到和/或通过设计和开展一个或多个新的临床试验得到。
如文中所使用，术语“临床试验”意思是指设计收集特定治疗反应临床数据的任何调查研究，其包括但不限于I期、II期和III期临床试验。使用标准方法定义患者种群和招募受试者。
优选地将临床种群中的个体按照目的医学状况的存在分级。这种潜在患者的分级采用标准身体检查或一种或多种实验室测试。备选地，对于在单体型对和疾病易感性或严重性之间具有强相关性的情况下，可以使用单体型分析对患者分级。
对试验种群中每一个体进行目的治疗性治疗，并且使用一种或多种预先确定的标准测定每一个体对治疗的反应。应到考虑到，在许多情况下试验种群会表现出一系列反应并且研究者会选择由多种反应构成的反应者组的数目(例如低、中、高)。此外，对试验种群中的每一个体的基因进行基因分型和/或单体型分析，这可以在治疗之前或之后进行。
在获得临床数据和多态性数据两者之后，建立个体反应和基因型或单体型含量(haplotype content)之间的相关性。相关性可以多种方式产生。在一种方法中，将个体通过其基因型或单体型(或单体型对)分组(也称作多态性组)，然后计算每一多态性组成员所出现的临床反应的平均值和标准差。
然后分析这些结果以确定在多态性组之间所观察到的任何临床反应变异是否具有统计学显著性。所使用的统计学分析方法描述于L.D.Fisher和G.vanBelle，Biostatistics：A Methodology for the Health Sciences(Wiley-Interscience，New York，1993)。该分析还包括确定基因中哪一个多态性对表型差异的贡献最明显的回归计算。
发现单体型含量和临床反应之间相关性的第二中方法使用基于错误最小化优化算法的预测模型。许多可能的优化算法之一是遗传算法(R.Judson，“Genetic Algorithms and Their Uses in Chemistry”在Reviews inComputational Ch emistry，第10卷，第1-73页，K.B.Lipkowitz和D.B.Boyd，编，VCH Publishers，New York，1997)。还可以使用模拟退火(Press等，“Numerical Recipes in C：The Art of Scientific Computing”，CambridgeUniversity Press(Cambridge)1992，第10章)、中性网络(E.Rich和K.Knight，“Artificial Intelligence”，第2版，McGraw-Hill，New York，199l，第18章)、标准梯度下降方法(Press等，见上，第10章)或其它整体或局部优化方法(见Judson中的讨论，见上)。
也可以使用方差分析(ANOVA)技术分析相关性，以便确定临床数据中的多少变异可以通过基因多态性位点的不同亚组进行解释。ANOVA用于检验关于反应变异是否由一种或多种所测定的性状或变异引起或者是否与其相关的假设(Fisher和vanBelle，见上，第10章)。
本领域技术人员可以容易地从上述分析中构建数学模型，所述模型能够预测作为基因型或单体型含量函数的临床反应。
对临床反应与基因的基因型或单体型(或单体型对)之间关联的鉴定是设计诊断方法的基础，其中所述诊断方法用于确定这些个体中谁将会或将不会对治疗发生反应或者备选地谁将在低剂量发生反应并且因此需要加强治疗即使用更大剂量药物治疗。诊断方法可以采取几种形式之一：例如直接DNA测试(即对基因的一个或多个多态性位点进行基因分型或单体型分析)、血清学测试或者身体检查测试。唯一需要的是，在诊断测试结果和与临床反应具有相关性的潜在基因型或单体型之间存在良好的相关性。在一个优选的实施方案中，该诊断方法使用上述的预测单体型分析的方法。
计算机可以执行本发明方法中涉及的任何或全部分析和数学操作。此外，计算机可以执行能够在显示设备上显示视图(或屏幕)的程序，通过该程序在用户和视图间产生交互界面并分析与基因和其基因组变异相关的大量信息，包括染色体定位、基因结构、基因家族、基因表达数据、多态性数据、遗传序列数据和临床种群数据(例如关于一个或多个种群的人种地理学起源、临床反应、基因型和单体型数据)。文中描述的多态性数据可以作为相关数据库的部分储存(例如Oracle数据库的实例或者一组ASCII文本文件)。这些多态性数据可以储存于计算机的硬盘驱动器上或者储存于如CD-ROM或者计算机可取得的一种或多种其它储存设备中。例如，数据可以储存于借助于网络可以与计算机通讯的一个或多个数据库中。
在其它实施方案中，本发明提供了对个体基因型进行单体型分析和/或基因分型的方法、组合物和试剂盒。组合物包含寡核苷酸探针和引物，其中所述寡核苷酸探针和引物被设计成能够与包含多态性位点或者与多态性位点临近的一个和多个靶区域特异性杂交。用于确立文中所述新多态性位点在个体中的基因型和单体型的方法和组合物可以用于研究多态性对通过蛋白质表达和功能所影响疾病的病因学的影响，研究药物靶向的效率，预测个体对通过蛋白质表达和功能所影响疾病的易感性以及预测个体对靶向该药物基因产物的药物的反应。在另外一个实施方案中，本发明提供了鉴定基因型和单体型与性状之间关联的方法。在优选实施方案中，性状是对疾病的易感性、疾病的严重性、疾病分期或者对药物的反应。此种方法可适用于研发用于所有药物遗传学应用的诊断测试和治疗性治疗中，其中在所述药物遗传学应用中潜在地存在基因型和治疗结果(包括效率测定、PK测定的副作用测定)之间的关联。
本发明还提供了用于储存和显示所确定基因的多态性数据的计算机系统。计算机系统包括计算机处理单元、显示器和包含多态性数据的数据库。多态性数据包括在参照种群中的基因中所鉴定的多态性、基因型和单体型。在一个优选实施方案中，计算机系统能够产生展示单体型的显示结果，其中单体型是根据其进化关系进行组织的。
在另一方面，本发明提供了SNP探针，该探针可以用于根据人的遗传变异将人分类。根据本发明的SNP探针是能够在常规等位基因区分测定法中区分SNP核酸等位基因的寡核苷酸。
如文中所使用，“SNP核酸”是包含这样一种核苷酸的核酸序列，即核苷酸在个体或者个体组之间的同一核酸序列中是可变的，因此作为等位基因存在。此种SNP核酸长度优选为大约15至大约500个核苷酸。SNP核酸可以是染色体的部分，或者可以是染色体部分的精确拷贝(例如通过PCR或者通过克隆将此种染色体部分扩增)。以后将SNP核酸简单地称作“SNP”。
根据本发明的SNP探针是与SNP核酸互补的寡核苷酸。
如文中所使用，术语“互补”意思是Watson和Crick意义上的寡核苷酸全长互补。
在某些优选实施方案中，根据本发明该方面的寡核苷酸与SNP核酸的一个等位基因互补，而不与SNP核酸的任何其它等位基因互补。根据本发明该实施方案的寡核苷酸能够以多种方式区分SNP核酸的等位基因。例如，在严格杂交条件下，适当长度的寡核苷酸会与SNP核酸的一个等位基因互补，但不与SNP核酸的任何其它等位基因互补。寡核苷酸可以是放射性标记的或者荧光标记的。备选地，适当长度的寡核苷酸可以用作PCR的引物，其中3’末端核苷酸与SNP核酸的一个等位基因互补，而不与任何其它等位基因互补。在该实施方案中，通过PCR的扩增反应的有或无确定SNP核酸的单体型。
本发明的基因组片段和cDNA片段包含至少一种文中所鉴定的新的多态性位点，且长度至少10个核苷酸并且范围可达基因全长。优选地，根据本发明的片段长度在100-3000个核苷酸之间、且更优选在200-2000个核苷酸之间、并且最优选在500-1000个核苷酸之间。
为了方便起见，在描述文中所鉴定多态性位点时提及的是基因的有意链。然而，如本领域技术人员公认的那样，包含基因的核酸分子是互补的双链分子，并且因此当提及有意链上的特定位点时同样也提及了互补的反义链上的相应位点。因此，提及的是任一条链上的同一多态性位点并且可以将寡核苷酸设计成能够与包含多态性位点的靶区域任一条链特异性互补。因此，本发明还包括与文中所述基因组变体的有意链互补的单链多核苷酸。
在优选实施方案中，此种试剂盒还包括DNA样品收集工具。
具体而言，基因分型引物组合物包含至少两套等位基因特异性引物对。优选地，两个基因分型寡核苷酸包装在分开的容器里。
应当理解，文中所述的本发明的方法一般还包括根据本发明的试剂盒的用途。通常，本发明的方法可以间接体内开展，并且此种间接体内方法是本发明所特别期望的。同样，在本发明的方法可能包括在人或动物身体实践的步骤的情况下，仅包括不在人或动物身体中实践的那些步骤的方法是本发明所特别期望的。
通过制备包含基因多态性变体的重组细胞和/或生物体(优选重组动物)研究文中所鉴定多态性对表达的影响。如文中所使用，“表达”包括但不限于下列的一种或多种：基因转录成前体mRNA；前体mRNA的剪接和其它加工以产生成熟mRNA；mRNA稳定性；成熟mRNA向蛋白质的翻译(包括密码子选择和tRNA可利用性)；以及翻译产物的糖基化和/或其它修饰(如果需要产生正确表达和功能的话)。
为了制备本发明的重组细胞，将目的同源基因导入细胞中的载体上以致于同源基因仍然在染色体外。在此种情况下，基因可以通过细胞从染色体外位点表达。在优选实施方案中，同源基因以这样一种方式导入细胞，即同源基因与细胞中存在的内源基因重组。此种重组需要发生双重组事件，由此导致产生目的基因多态性。用于重组方式或者染色体外维持方式将基因导入的载体是本领于公知的，并且适宜载体或载体构建体可以用于本发明。将DNA导入细胞的方法如电穿孔、粒子轰击、磷酸钙共沉淀和病毒转染是本领域公知的，因此对方法的选择取决于技术实践者的能力和偏好。
表达变体基因的重组生物体(即转基因动物)可以使用本领域已知的标准方法制备。优选地，将包含变体基因的构建体导入非人动物或胚胎阶段的动物祖先，其中胚胎阶段即单细胞期或者一般不晚于大约8细胞期。携带本发明构建体的转基因动物可以通过本领域技术人员已知的几种方法产生。一种方法涉及将逆转录病毒转移入胚胎中，其中对逆转录病毒进行构建以包含一种或多种绝缘子元件、目的基因或多个基因和本领域技术人员已知的其它成分以提供携带作为转基因的所隔离基因的完整穿梭载体，见例如美国专利号5,610,053。另一种方法涉及向胚胎直接注射转基因。第三种方法涉及胚胎干细胞的使用。
同源基因将导入的动物的实例包括(但不限于)小鼠、大鼠、其它啮齿类和非人灵长类(见“The Introduction of Foreign Genes into Mice”和文中所引用的文献，在：Recombinant DNA，J.D.Watson，M.Gilman，J.Witkowski，和M.Zoller编；W.H.Freeman and Company，New York，第254-272页)。稳定表达人同源基因并且产生人蛋白质的转基因动物可以用作生物学模型用于研究与不正常表达和/或活性相关的疾病和用于筛选和测定降低这些疾病症状或影响的多种候选药物、化合物或治疗方案。
在实践本发明中，使用了许多分子生物学、微生物学和重组DNA的常规技术。这些技术是众所周知的并且分别解释于例如“Current Protocolsin Molecular Biology”，第I-III卷，Ausubel编，(1997)；Sambrook等，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”，第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)；“DNA Cloning：APractical Approach”，第I和II卷，Glover编，(1985)；“OligonucleotideSynthesis”，Gait编，(1984)；“Nucleic Acid Hybridization”，Hames和Higgins编，(1985)；“Transcription and Translation”，Hames和Higgins编，(1984)；“Animal Cell Culture”，Freshney编，(1986)；“Immobilized Cells andEnzymes”，IRL Press(1986)；Perbal，“A Practical Guide to MolecularCloning”；丛书，Methods in Enzymol.，Academic Press，Inc.(1984)；“GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells”，Miller和Calos编，Cold SpringHarbor Laboratory，NY(1987)；以及Methods in Enzymology，第154和155卷，Wu和Grossman和Wu编。
将在不同对照组中确定的基因表达产物的标准对照水平与所测量的特定患者基因表达产物的水平相比较。该基因表达产物可以是与特定基因型组相关的特征性mRNA或者该基因型组的多肽基因表达产物。基于所测定水平与特定组对照水平的相似程度将患者分类并指定一特定基因型组。
如本领域技术人员所理解的那样，在得出该结论时会包括一定程度的不确定性。因此，对照组水平的标准差用于得出概率性的结论，并且本发明的方法可以适用于广范围的基于概率的基因分型组结论。因此，例如但非限定性地在一个实施方案中，如果所测定的基因表达产物水平落在任何对照组平均值的2.5个标准差范围内，则该个体被指定为那个基因型组。在另一个实施方案中，如果所测定的基因表达产物水平落在任何对照组平均值的2.0个标准差范围内，则该个体被指定为那个基因型组。仍然在另一个实施方案中，如果所测定的基因表达产物水平落在任何对照组平均值的1.5个标准差范围内，则该个体被指定为那个基因型组。还在另一个实施方案中，如果所测定的基因表达产物水平落在任何对照组平均值的1.0或者更少个标准差范围内，则该个体被指定为那个基因型组。
因此，该方法许可得出具有多种程度可能性的结论，将特定患者放在哪一组以及对基因型组的这种指定将决定个体应该被放入的危险性种类。
检测和测定mRNA水平和基因表达产物多肽水平的方法是本领域众所周知的，并且包括核苷酸微阵列的使用和涉及质谱和/或抗体检测和定量技术的多肽检测方法。还可见Human Molecular Genetics，第2版，TomStrachan和Andrew，Read John Wiley and Sons，Inc.Publication，NY，1999)。
此外，对体液或组织中基因表达产物多肽(蛋白质)浓度的检测可以用于确定多态性存在与否，并且表达产物多肽的相对水平可以用于确定多态性是否存在于纯化子状态或者杂合子状态并且因此是否存在于个体的危险性种类中。
如文中所使用，“医学状况”包括(但不限于)表现为一种或多种需要进行治疗的生理和/或心理症状的任何状况或疾病，并且还包括先前或最近鉴定的疾病和其它病症。
如文中所使用，术语“多态性”意思是指在种群中以＞1％的频率出现的任何序列变体。序列变体可以以显著高于1％(例如5％或10％或更高)的频率出现的序列变体。同样，术语可以用于指在个体的多态性位点所观察到的序列变体。多态性包括核苷酸替代、插入、缺失和微卫星并且可能(但没必要)导致产生基因表达或蛋白质功能的可检测的变化。
如文中所使用，术语“临床反应”意思是指下列任何一种或全部：反应的定量测量、无反应和不良反应即副作用。
如文中所使用，术语“等位基因”意思是指特定染色体位置(基因座)上特定形式的基因或DNA序列。
如文中所使用，术语“基因型”意思是指在个体的一对同源染色体上的基因座内一个或多个多态性位点上所发现的核苷酸对的非定相5’-3’序列。如此处所使用，基因型包括全基因型和/或亚基因型。
如文中所使用，术语“多核苷酸”意思是指任何RNA或DNA，其可以是非修饰的或修饰的RNA或DNA。多核苷酸包括但不限于单链和双链DNA、单链和双链区域混合的DNA、单链和双链RNA、单链和双链区域混合的RNA、包含DNA和RNA的杂合分子，其中杂合分子为单链或更一般为双链或者为单链和双链区域混合物。此外，多核苷酸指包含RNA或DNA或者RNA和DNA两者的三链区域。术语多核苷酸还包括包含一个和多个修饰碱基的DNA和RNA和为了稳定性和其它原因对主链进行修饰的DNA和RNA。
如文中所使用，术语“基因”意思是指包含用于调节RNA产物生物合成所有信息的DNA片段，其包括启动子、外显子、内含子和控制表达的其它非翻译区。
如文中所使用，术语“多肽”意思是指包含两个或以上通过肽键或修饰肽键(肽电子等排物)彼此连接的氨基酸的多肽。多肽指短链的(一般称作肽、糖肽或寡聚物)或者长链的(通常称作蛋白质)。多肽可以包含编码基因的20种氨基酸以外的氨基酸。多肽包括通过天然加工如翻译后加工修饰的氨基酸序列或者通过本领域众所周知的化学修饰技术修饰的氨基酸序列。此种修饰在基本教科书中有很好地描述，并且在专论以及在庞大的研究文献中有更加详细地描述。
如本文所使用，术语“多态性位点”意思是指基因座上的一个位置，其中发现该位置在种群具有至少两种选择性的序列，其中最常见序列的频率不高于99％。
如文中所使用，术语“核苷酸对”意思是指在个体的2个拷贝染色体上的多态性位点发现的核苷酸。
如文中所使用，当应用于基因座中两个或多个多态性位点的核苷酸对序列时，术语“定相的”意思是指存在于已知基因座的单一拷贝上的这些多态性位点的核苷酸的组合。
为了推断对治疗的临床反应和基因型或单体型之间的相关性，有必要得到在接受治疗的个体的群体(以后称作“临床群体”)所出现临床反应数据。该临床数据可以通过分析已经开展的临床试验的结果得到和/或通过设计和开展一个或多个新的临床试验得到。
如文中所使用，术语“临床试验”意思是指设计收集特定治疗反应临床数据的任何调查研究，其包括但不限于I期、II期和III期临床试验。使用标准方法定义患者种群和招募受试者。
如文中所使用，术语“基因座”意思是指染色体或者DNA分子上对应于基因或者物理或表型性状的位置。
对试验群体中的每一个体进行目的治疗性治疗，并且使用一种或多种预先确定的标准测定每一个体对治疗的反应。预期在许多情况下试验种群会出现一系列反应，并且研究者会选择由多种反应构成的反应者组的数目(例如低、中、高)。此外，对试验种群中的每一个体的基因进行基因分型和/或单体型分析，这可以在治疗之前或之后进行。
作为标志物的核酸和蛋白质的检测.
在特定实施方案中，使用本领域已知的方法通过原位形式和通过体外形式在生物样品中测定了相当于标志物的mRNA的水平。术语“生物学样品”旨在包括从受试者分离的组织、细胞、生物流体和其分离物以及受试者中的组织、细胞和流体。许多表达检测方法使用分离的RNA。对于体外方法，不能对mRNA进行选择分离的任何RNA分离技术可以用于从细胞中纯化RNA。见例如Ausubel等编，Curr.Prot.Mol.Biol.，John Wiley &Sons，NY(1987-1999)。此外，大量的组织样品可以使用本领域技术人员众所周知的技术容易地处理，例如美国专利号4,843,155的一步RNA分离方法。
所分离的mRNA可以用于杂交或者扩增分析中，其中所述的杂交或者扩增分析包括(但不限于)Southern或Northern分析、PCR分析和探针阵列。检测mRNA水平的一个优选诊断方法包括将分离的mRNA与能够同被检测基因编码的mRNA杂交的核酸分子(探针)接触。核酸探针可以是全长cDNA或其部分，例如长度至少为7、15、30、50、100、250或500个核苷酸并且在严格条件下足以与编码本发明标志物的mRNA或基因组DNA特异性杂交的寡核苷酸。可以用于本发明诊断法中的其它适宜探针在文中进行了描述。mRNA与探针的杂交表示所述标志物被表达。
在一种形式中，mRNA被固定在固体表面并且与探针接触，例如通过将mRNA在琼脂糖凝胶上电泳并将mRNA从凝胶转移至膜如硝酸纤维素膜上。在另一备选的形式中，mRNA被固定在固体表面并且与探针接触，例如在Affymetrix基因芯片阵列上。技术人员可以容易地使已知mRNA检测方法适用于检测本发明标志物所编码的mRNA水平。
用于确定样品中本发明标志物的mRNA水平的备选方法包括核酸扩增方法，例如通过RT-PCR(Mullis，美国专利号No.4,683,202(1987)所述的实验性实施方案；连接酶链反应，Barany(1991)，见上；自动维持序列扩增，Guatelli等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第87卷，第1874-1878页(1990)；转录扩增系统，Kwoh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第86卷，第1173-1177页(1989)；Q-β复制酶，Lizardi等，Biol.Technology，第6卷，第1197页(1988)；滚环复制，美国专利号5,854,033(1988)；或者任何其它核酸扩增方法。接着使用本领域技术人员众所周知的技术检测所扩增的分子。如果此种分子存在非常低的数量，则这些检测方案对于核酸分子的检测特别有用。如文中所使用，扩增引物定义为能够与基因(分别为正链和负链，反之亦然)5’或3’区域退火并且在它们中间包含短区域的一对核酸分子。通常，扩增引物长度为大约10-30个核苷酸并且中间为长度大约50-200个核苷酸。在适当条件下和适当试剂中，此种引物允许包含以引物作为两侧的核苷酸序列的核酸分子扩增。
对于原位方法，mRNA没有必要在检测之前从细胞中分离。在此种方法中，使用已知的组织学方法制备/处理细胞或组织样品。然后将样品固定在支持物上(一般为载玻片)然后将其与能够同编码标志物的mRNA杂交的探针接触。
作为对基于标志物的绝对表达水平得出结论的一种备选方法，结论是基于标志物的归一化表达水平作出的。通过将其表达与不是标志物的基因(例如组成型表达的管家基因)的表达相比较对标志物的绝对表达水平进行校正，通过这种校正使表达水平归一化。用于归一化的适宜基因包括管家基因例如肌动蛋白基因或者上皮细胞特异基因。这种归一化可以将一种样品(例如患者样品)的表达水平与另一种样品相比较或者在来自不同来源的样品之间进行比较。
备选地，表达水平也可以以相对表达水平提供。为了确定标志物的相对表达水平，在确定标志物在所述样品中的表达水平之前，在10或更多、优选50或更多个正常对疾病生物学样品中确定标志物的表达水平。确定了在更大数量样品中所测定的每一基因的平均表达水平，并且该水平用作标志物的基线表达水平。将在测试样品中确定的标志物的表达水平(表达的绝对水平)除以所得到的该标志物的平均表达值。从而给出了相对表达水平。
优选地，在基线值确定中使用的样品可以来自没有多态性的患者。对细胞来源的选择取决于相对表达值的使用。使用正常组织中的表达值作为平均表达值则可以帮助确定所测定的标志物是否是特异的(对正常细胞)。此外，随着更多数据的积累，平均表达值可以被修订，只要改进的相对表达值是以所积累数据为基础即可。
多肽的检测.
在本发明的另一个实施方案中，检测了对应于标志物的多肽。检测本发明多肽的优选试剂是能够与对应于本发明标志物的多肽结合的抗体，优选具有可检测标记的抗体。抗体可以是多克隆的，或者更加优选地为单克隆的。可以使用完整的抗体或其片段，例如Fab或F(ab’)2。对于探针或抗体，术语“标记的”旨在包括通过向探针或抗体偶联(例如物理交联)可检测物质而直接标记的探针或抗体以及通过与直接标记的另一试剂的反应性而间接标记的探针或抗体。间接标记实例包括使用荧光标记的次级抗体对初级抗体的检测和对用生物素进行末端标记的DNA探针的检测，其中生物素进行标记使得可以用荧光标记链霉亲和素检测。
使用本领域技术人员众所周知的技术可以个体中分离蛋白质。蛋白质分离方法可以采用例如Harlow和Lane(1988)(见上)所描述的那些方法。
可以采用多种方式确定样品是否包含与特定抗体结合的蛋白质。此种方式的实例包括(但不限于)EIA、放射免疫测定(RIA)、Western印迹分析和ELISA。技术人员可以容易地将已知蛋白质/抗体检测方法用于确定细胞是否表达本发明的标志物以及在血液或其它身体组织中该特异多肽表达的相对浓度。
在一种方式中，抗体或抗体片段可以用于例如Western印迹或免疫荧光技术的方法中以便检测所表达的蛋白质。在此种用途中，一般优选将抗体或蛋白质固定在固体支持物上。适宜的固相支持物或载体包括能够结合抗原或抗体的任何支持物。众所周知的支持物或载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和修饰纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁体。
本领域技术人员知道结合抗体或抗原的许多其它适宜载体，并且能够将此类支持物用于本发明。例如，从患者细胞分离的蛋白质可以进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并且固定在固相支持物如硝酸纤维素上。然后用适宜缓冲液洗涤支持物，接着用可检测性标记的抗体处理。然后，用缓冲液第二次洗涤固相支持物以去除未结合的抗体。使用常规方法检测固相支持物上结合标志物的数量并且将该测量转换成血液或其它身体组织中的蛋白质的水平或浓度。
本发明还包括检测生物样品中对应于本发明标志物的多肽或核酸存在的试剂盒，其中所述的生物样品例如包括(但不限于)血清、血浆、淋巴、囊内液、尿、粪便、脑脊液、腹水或血液的任何体液以及身体组织活检样品。例如，试剂盒可以包含能够检测生物样品中多肽或mRNA(编码对应于本发明标志物的多肽)的标记化合物或试剂以及测定样品中多肽或mRNA数量的工具，例如结合多肽的抗体或者结合编码多肽的DNA或mRNA的寡核苷酸探针。试剂盒还包括解释使用试剂盒所获得结果的说明书。
对于基于抗体的试剂盒，试剂盒可以包含例如1)结合对应于本发明标志物的多肽的第一种抗体，例如附着于固体支持物上的抗体；和任选地2)结合多肽或者第一种抗体的并且缀合有可检测标记的第二种不同抗体。
对于基于寡核苷酸的试剂盒，试剂盒可以包含例如1)与编码对应于本发明标志物的多肽的核酸序列杂交的寡核苷酸，例如可检测性标记的寡核苷酸；或2)用于扩增对应于本发明标志物的核酸分子的一对引物。
试剂盒还包含例如缓冲试剂、防腐剂或蛋白质稳定剂。试剂盒还包含检测可检测标记所必需的组分，例如酶或底物。试剂盒还包含可以进行分析并与测试样品相比较的对照样品或一系列对照样品。试剂盒中的每一组分可以装入单独的容器中并且可以将所有多个容器以及用于解释使用试剂盒开展分析所获得结果的说明书放在一个包装盒内。
试剂盒.
本发明的试剂盒可以包含在试剂盒容器上或试剂盒容器内的书面产品。书面产品描述了如何使用试剂盒所包含的试剂来确定患者在药物治疗过程中是否将经历肝脏毒性。在几个实施方案中，可以根据本发明的方法使用试剂。在一个实施方案中，试剂是开展ILlA遗传多态性的PCR分析的引物对。
实施例在临床试验中对肝脏毒性的临床药物遗传学分析
临床药物遗传学分析参加者的人口统计学.
在临床试验中所登记的139名受试者中，83名受试者同意参加临床试验的临床药物遗传学部分。这代表了参加临床试验的总人数的大约60％。从年龄、种族和性别观点来看，临床药物遗传学分析人群代表了临床试验组。而且，同意率对于试验的每一组(安慰剂、50、100和150mg/天)是可比的，从而使临床药物遗传学分析对于每一剂量组没有偏差。与全部试验人群相比临床药物遗传学人群的人口统计学之间未观察到统计学显著差异。
表1  与全部临床试验样品相比临床药物遗传学样品的分布
  CPG样品   试验样品
  年龄(平均值，年)a种族b高加索人黑人东方人   58.8(70)84％(5)6％(1)1.2％   59.3(117)84％(9)6.4％(2)1.4％
  西班牙人其它性别c男性女性剂量d0mg/天50mg/天100mg/天150mg/天肝脏毒性e是否   (7)8.4％(0)0％(50)60％(33)40％(23)28％(20)24％(20)24％(20)24％(6)7％(77)93％   (9)7％(2)1.4％(88)63％(51)37％(34)24％(32)23％(37)27％(36)26％(9)6％(130)94％
  ap＜0.7748(ANOVA)bp＜0.9112(Fisher精确检验)cp＜0.6698(Fisher精确检验)dp＜0.9342(Fisher精确检验)ep＜1.000(Fisher精确检验)
在独立的试验点收集来自每个患者的血液样品并运送至Covance(Geneva，瑞士)，在那里使用PUREGENETM DNA分离试剂盒(D-50K)(Gentra，Minneapolis，MN)提取基因组DNA。
基因分型.
对位于7个基因中的总共18个基因座进行了基因分型。利用来自公共数据库例如OMIM、SNP Consortium、Locus Link和dbSNP的信息以及来自Third Wave Technologies公司(TWT，Madison，WI)的信息设计了SNP测定法。对于在本试验群体中不具有多态性的任何基因座不再进一步分析。使用Third Wave Technologies研发的Invader测定法按照制造商的说明对40-60ng基因组DNA进行基因分型。Lyamichev V等，NatBiotechnol 17：292-6(1999)；Ryan D等，Mol Diagn 4：135-449(1999)。
将本试验中所研究的每个SNP指定为临床药物遗传学(CPG)标识，称为PG基因座ID。本试验中所测定的全部SNP的列表以及其PG基因座ID和关于目的基因内多态性位置的详细内容见表2。
表2  临床药物遗传学分析中所检查的基因列表
  基因符号   基因名称   CPG基因座ID   参考序列登录号(REF_ACC)   等位基因1的频率   等位基因2的频率   位置   定位
  ABCB1ABCB1ABCB1CD14CYP2D6   ATP结合盒，亚家族B(MDR/TAP)，成员1ATP结合盒，亚家族B(MDR/TAP)，成员1ATP结合盒，亚家族B(MDR/TAP)，成员1CD14抗原细胞色素P450，亚家族IID (代谢   18110061045170831   M29445AC005068.1AC002457.1U00699M33388   0.470.630.480.560.86*   0.530.370.520.440.14*   17683646199812023123465   外显子26ILE1144ILE未知未知启动子内含子
CYP2D6CYP2D6CYP2D6CYP3A4IL1AIL1AIL1A+NR1I2NR1I2NR1I2   脒基四氢异喹胍，司巴丁等)，多肽6细胞色素P450，亚家族IID(代谢脒基四氢异喹胍，司巴丁等)，多肽6细胞色素P450，亚家族IID(代谢脒基四氢异喹胍，司巴丁等)，多肽6细胞色素P450，亚家族IID(代谢脒基四氢异喹胍，司巴丁等)，多肽6细胞色素P450，亚家族IILA(niphedipine氧化酶)，多肽4白介素1，α白介素1，α白介素1，α核受体亚家族1，组I，成员2核受体亚家族1，组I，成员2核受体亚家族1， 2112122132325279302303264126422643 M33388M33388M33388AF209389X03833X03833X03833AC069444AF061056AF061056 0.60*0.520.830.84*0.72*0.72*1.000.62*0.600.80 0.40*0.480.170.16*0.28*0.28*0.000.38*0.400.20 44695799171920338549628242824281325211156 外显子6ARG269CYS外显子9THR486SER外显子1PRO34SER内含子10启动子外显子5外显子4启动子内含子3’UTR
ORM1ORM1ORM1 组I，成员2血清类粘蛋白1(α-1-酸性糖蛋白)血清类粘蛋白1(α-1-酸性糖蛋白)血清类粘蛋白1(α-1-酸性糖蛋白) 183118321833 NT_031830NT_031830NT_031830 0.57*0.970.96 0.43*0.030.04 19120775041 外显子1外显子5内含子
  *在该患者群体中该SNP不处于哈迪-温伯格平衡。+该基因座在这些患者群体中不是多态性的并且不用于分析。
使用Third Wave Technologies的技术通过直接测定基因组DNA研究了ABCB1、CD14、IL1A和ORM1中的基因座。由于CYP2D6与CYP450家族基因具有高度序列同源性，所以在Invader测定法进行基因分型之前在三个部分对CYP2D6进行了聚合酶链式反应(PCR)扩增以保证特异性。每个片段的引物序列和每一引物组所跨越的基因区域列于表3。包含20-60ng基因组DNA、0.5μl 10mM dNTP、2.5μl的带有15mM MgCl2的10×PCR缓冲液I(Applied Biosystems，Foster City，CA)、2.5μl DMSO、0.5μl20μM CYP2D6-正向引物、0.5μl 20μM CYP2D6-反向引物和1.25U TaqDNA聚合酶(Applied Biosystems)的25μl反应液中产生每一扩增子。使用以下条件进行35轮扩增：94℃，30秒；65℃，1分钟；72℃，2分钟。通过在含溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶上分离5个随机样品以证实适当产物的扩增。在基因分型之前将扩增子以1∶10稀释于TE(pH 8.0)中。
表3  用于扩增CYP2D6的引物
 基因区域(PG基因座ID) 引物名称 引物序列(5’→3’) 大小(bp)
  外显子1和2(31)   2D6L1F1   CTGGGCTGGGAGCAGCCTC(SEQ ID NO：5)   2036
  2D6L1R1   CACTCGCTGGCCTGTTTCATGTC(SEQ ID NO：6)
  外显子3、4和5(31和211)   2D6L2F   CTGGAATCCGGTGTCGAAGTGG(SEQ ID NO：7)   1683
  2D6L2R2   CTCGGCCCCTGCACTGTTTC(SEQ ID NO：8)
  外显子7、8和9(212)   2D6L3F   GAGGCAAGAAGGAGTGTCAGGG(SEQ ID NO：9)   1754
  2D6L3R5B   AGTCCTGTGGTGAGGTGACGAGG(SEQ ID NO：10)
用于扩增CYP3A4基因的PCR在25μl反应液中进行，反应液包含15-30ng基因组DNA、0.4μl 10mM dNTP、2.5μl含15mM MgCl2的10×PCR缓冲液I(Applied Biosystems)、0.75μl 20μM CYP3A4-正向引物、0.75μl 20μM CYP3A4-反向引物和0.75U Taq DNA聚合酶(AppliedBiosystems)。使用以下条件进行30轮扩增：94℃，30秒；58℃，30秒；72℃，30秒。为了证实产生了适当产物，将5个样品在含溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶上进行分离并观察片段大小。引物序列如下：CYP3A4外显子10F-(5’-TGGATGGCCCACATTCTCG-3’；SEQ IDNO：11)，和CYP3A4外显子10R-(5’-CTTCCTACATAGAGTCAGTG-3’；SEQ IDNO：12)。将PCR产物用TE(pH 8.0)以1∶20稀释，在384孔biplex板中使用稀释液扩增PG基因座ID 2325的DNA。
限制性片段长度多态性(RFLP)分析用于对NR1I2中的3个多态性基因座进行基因分型。首先在25μl反应液中扩增NR1I2序列，反应液包含15-30ng基因组DNA、0.4μl 10mM dNTP、2.5μl含15mM MgCl2的10×PCR缓冲液I(Applied Biosystems)、0.50μl 20μM NR1I2-正向引物、0.50μl 20μM NR1I2-反向引物和0.75U Taq DNA聚合酶(AppliedBiosystems)。用于每一测定的引物组的序列列于表4。使用以下条件进行35轮扩增：94℃，30秒；60℃，30秒；72℃，30秒。将扩增子在含溴化乙锭的3％琼脂糖凝胶上进行分离。
表4  NR1I2多态性的RFLP分析
  PG基因座ID(测定名称)   引物名称   引物序列(5’-3’)   限制性内切酶   片段大小(bp)/等位基因判定
  2642(PXR-252)   PXR-252-F   GGACACAGAGTCTGTTCCTGG(SEQ ID NO：13)   BSMB1   318/A204和114/G
  PXR-252-R   GAAGATGAAGGATTCCTCTGGG(SEQ ID NO：14)
  2643(PXR-11156)   PXR-11156-F   GACAAGGCTACGCTGACAATCAG(SEQ ID NO：15)   DdeI   342/C193和149/A
  PXR-11156-R   GCTTGCGTATGTTTCTATTTCCAC(SEQ ID NO：16)
  2641(PXR-24113)   PXR-24113-F   CGGAGCAAAGAACTTACCACC(SEQ ID NO：17)   HphI   253/G195和58/A
  PXR-24113-R   TGCAGGACCAGAGAGCATCAG(SEQ ID NO：18)
用于对PCR产物进行RFLP分析的限制性内切酶以及它们所产生的片段大小和所得到的等位基因判定列于表4。全部限制性内切酶购自NewEngland Biolabs，Beverly，MA。反应条件如下：(1)使用2μl 10×缓冲液3(New England Biolabs)、8μl扩增DNA和2U BSMB1酶在20μl反应液中进行BMSB1消化。将反应混合物在55℃孵育4.5小时；(2)使用2μl 10×缓冲液3(New England Biolabs)、8μl扩增DNA和4U DdeI酶在20μl反应液中进行DdeI消化。将反应液在37℃孵育17小时；(3)除了使用10×缓冲液4(New England Biolabs)代替10×缓冲液3以外，如进行DdeI消化一样进行HphI消化。将消化的DNA在含溴化乙锭的3％琼脂糖凝胶上进行分离(10μl)并观察条带大小。
统计学分析.
方差分析(ANOVA)和Fisher精确检验用于基因型影响和肝脏毒性的分析。使用SAS 8.02软件进行全部统计学分析。为了校正多重测试，使用了Bonferroni校正方法(见下)。
肝脏毒性和N-苯甲酰-星形孢菌素代谢.
检测了在临床试验中肝脏毒性发生和所施用的N-苯甲酰-星形孢菌素剂量之间的关系。每个剂量组经历肝脏毒性的受试者百分比如下：对于50mg/天的组为3％、对于100mg/天的组为8％并且施用150mg/天的那些受试者为14％。尽管大多数经历肝脏毒性的受试者施用了最高剂量的N-苯甲酰-星形孢菌素，但N-苯甲酰-星形孢菌素剂量和肝脏毒性之间的关联不显著(p＝0.09；Fisher精确检验)。
在临床试验中进行了药物代谢动力学评价，但是由于N-苯甲酰-星形孢菌素的两种主要代谢产物牢固地结合至血清蛋白质α1-酸性糖蛋白(AGP)，所以在大多数受试者的血液中未检测到这两种主要代谢产物。AGP是主要在肝脏中合成的高度糖基化的蛋白质并且具有急性期反应蛋白质的功能。Hochepied T等，Cytokine Growth Factor Rev 14：25-34(2003)；IsrailiZH和Dayton PG，DrugMetRev 33：161-235(2001)。进行了一项分析以判断AGP水平与肝脏毒性发生是否相关。在第3-5次随访时的最高AGP水平用于本分析，并且包括了本临床试验中的全部参加者，而不仅仅是那些同意进行药物遗传学分析的参加者。在经历肝脏毒性的受试者中，AGP的平均最高浓度为109.7mg/dl，该值显著高于不经历肝脏毒性的受试者的平均最高浓度87.8mg/dl(p＝0.046，ANOVA)。
AGP由在染色体9q31-34.1上紧密连锁的ORM1和ORM2两个基因编码(Webb GC等，Cytogenet Cell Genet 47：18-21(1998))。ORM1具有高度多肽性(Yuasa I等，Hum Genet 99：393-8(1997))，并且在该试验中检查了ORM1中的三个SNP(PG基因座ID 1831，1832和1833)。在所检查的三个ORM1基因座上的基因型与所检测的血清AGP水平之间没有关联。见表5。
表5  ORM1 SNP与最大AGP水平没有关联
  PG基因座ID   AGP Max(p值，ANOVA)
  1831   0.51
  1832   0.07
  1833   0.95
此外，在该分析中检查的ORM1 SNP与肝脏毒性没有关联。见下表6。为了更全面地检查肝脏毒性发生与CYP2D6、CYP3A4、ABCB1和NR1I2中的SNP之间可能的关联，独立检查了每一个肝脏酶。在第3-5次随访时记录最大血清丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶数值，并使用ANOVA进行分析。在助于N-苯甲酰-星形孢菌素代谢和分布的基因内的SNP与丙氨酸转氨酶或天冬氨酸转氨酶最大升高之间没有发现关联。在最大丙氨酸转氨酶或天冬氨酸转氨酶水平和ORM1多态性之间没有显著性关联。
表6  肝脏毒性、ALT Max以及AST Max与位于
      6个不同基因中的17个SNP之间的关联
  基因   PG基因座   总体肝脏毒性判定(p值；Fisher精确   ALT Max(p值；ANOVA)   AST Max(p值；ANOVA)
  ID   检验)
  ABCB1ABCB1ABCB1CD14CYP2D6CYP2D6CYP2D6CYP2D6CYP3A4IL1AIL1ANR1I2NR1I2NR1I2ORM1ORM1ORM1   181100610451708312112122132325279302264126422643183118321833   0.591.000.501.001.001.000.460.220.720.230.290.820.841.000.610.241.00   0.550.630.350.870.990.850.160.170.380.370.380.560.280.570.720.800.96   0.320.240.090.900.630.660.520.590.490.0310.0290.210.860.730.760.820.64
总而言之，表5和表6中的数据未提供临床试验中所观察到的肝脏毒性是不同方式暴露于N-苯甲酰-星形孢菌素的结果的证据。
然而，N-苯甲酰-星形孢菌素是由CYP3A4和CYP2D6代谢的，并且是ABCB1所编码的p-糖蛋白泵的底物。CYP3A4的多态性不是很高，并且遗传变体很难解释蛋白质功能的差异。Spurdle AB等，pharmacogenetics 12：355-66(2002年7月)和内部分析。而且，CYP3A4的转录是由孕甾烷X受体PXR调控的(Goodwin B等，Annu Rev Pharmacol Toxicol 42：1-23(2002))，孕甾烷X受体由称为NR1I2的多态性基因编码。因此，检测了有助于N-苯甲酰-星形孢菌素代谢的以下基因中的多态性：CYP2D6(PG基因座ID 31、211、212、213)；CYP3A4(PG基因座ID 2325)；NR1I2(PG基因座ID 2641、2642、2643)和ABCB1(PG基因座ID 181、1006、1045)。未发现临床试验中肝脏毒性的发生与在这四个基因中所研究的任意多态性相关联。
与肝损伤的特异反应性机制相关的肝脏毒性和基因.
在药物研发的临床阶段期间所观察到的肝脏毒性通常与暴露于药物的水平关联。然而，由于其肝内环境中的某些物质(例如中和自由基的细胞因子或酶水平)促进了化合物的毒性，一些受试者可能经历肝脏酶升高。肝脏毒性的这些机制称为“特异反应性”。由于肝脏毒性是相对极少的能够受到多重信号途径影响的事件，所以发现遗传多态性和由特异反应性机制所引起的肝脏毒性之间的关联是极不可能的。
与炎症反应相关的肝脏毒性和基因.
在该试验中检测了在肝脏中能够有助于急性期反应的2个基因(CD14和IL1A)中的多态性。CD14调节炎性细胞因子从Kuppfer细胞的释放(Jarvelainen HA等，Hepatology 33：1148-53(2001))而IL1A是对组织损伤试剂反应的重要调节物。Ramadori G和Christ B，Semin Liver Dis 19：141-55(1999)。在该试验中研究了IL1A中的2个多态性基因座(PG基因座ID 279和302)并且研究了CD14中的3个基因座(PG基因座ID 2641、2642和2643)。未发现在我们所研究的基因座和临床试验中总体肝脏毒性判别之间存在关联。见表5。
其次，独立地分析了IL1A和CD14中的SNP与每种肝脏酶升高的可能关联。利用ANOVA发现，在第3次和第5次随访之间所记录的最高血清天冬氨酸转氨酶或丙氨酸转氨酶值与IL1A和CD14中目的基因座的基因型相关联。未发现丙氨酸转氨酶和IL1A或CD14中的SNP之间的关联。
然而，IL1A的2个SNP，即PG基因座ID 279和302都与第3、4或5次随访时所记录的最高血清天冬氨酸转氨酶值关联(p值分别为0.031和0.029)。已经报道PG基因座ID 279与PG基因座ID 302处于连锁不平衡，其中PG基因座ID 279为在IL1A启动子中具有C→T转换(GenBank登录号X03833中的位置549)的基因座。Jouvenne P等，EurCytokine Netw10：33-6(1999)。我们的发现强有力地支持这2个基因座之间的连锁(99.99％)。PG基因座ID 302是外显子5中的G→T碱基变化(GenBank登录号X03833中的位置6282)，这导致由丙氨酸至丝氨酸的氨基酸替换。对于这些SNP的每一个，TT基因型是罕见的；仅2个个体的PG基因座ID 279和302为TT。为此，我们分析了TT纯合子个体和GT(PG基因座ID 302)或CT(PG基因座ID 279)杂合子个体。因此，对于PG基因座ID 279，比较了具有CC基因型的受试者和在该基因座具有T(CT或TT)的受试者。对于PG基因座ID 279，CC个体的平均最高血清天冬氨酸转氨酶值为37.1U/L，而T(CT和TT)个体具有显著较低的平均最高血清天冬氨酸转氨酶值23.1U/L(p＝0.0089，ANOVA)。同样，对于PG基因座ID 302，比较了GG受试者和T(GT或TT)受试者。当使用该方法对数据进行分组时，发现每个基因座的基因型和肝脏毒性发生之间存在更强的关联。对于PG基因座ID 302，GG个体具有平均最高血清天冬氨酸转氨酶水平36.6U/L，该值显著高于T(CT和TT)个体的平均最高血清天冬氨酸转氨酶水平22.9U/L(p＝0.0097，ANOVA)。图1和图2中的散点图显示，当施用N-苯甲酰-星形孢菌素时，具有最高血清天冬氨酸转氨酶值的受试者为在PG基因座ID 279上为CC的受试者和在PG基因座ID 302上为GG的受试者。
因为测试了多重SNP与在临床试验中肝脏毒性的相关性，因此用校正系数对这些结果进行校正。Bonferroni校正方法要求将p值用系数17(该试验中所研究的多态性SNP的数目)进行校正。Bonferroni＝0.05/η＝0.05/17＝0.0029，这里η＝PCK412测试的数目(PCK412_number_of_tests)。使用该校正因子，具有p≥0.0029相关性的SNP是不显著的。IL1A多态性和血清天冬氨酸转氨酶水平之间的相关性p值为0.0089和0.0097。
总之，IL1A基因内PG基因座279为CC和PG基因座302为GG的受试者在施用N-苯甲酰-星形孢菌素后更有可能经历血清天冬氨酸转氨酶水平升高。虽然CC受试者的平均天冬氨酸转氨酶最高值不超过正常值上限，数据的散点图仍证明血清天冬氨酸转氨酶水平超过正常值上限的几乎全部受试者为在PG基因座ID 279上为CC(图1)和在PG基因座ID 302上为GG(图2)。
药物诱导肝脏毒性通常以炎症反应为特征。Jaeschke H等，Toxicol Sci65：166-76(2002)。已知白介素1蛋白质家族具有多种生物学活性并且是感染和损伤反应的关键调节物。象其它促炎细胞因子一样，IL1A诱导NF-κB活性，由此增加细胞因子诱导基因的转录。IL1A的效应是通过诱导其它细胞因子介导的，所述细胞因子包括粒细胞集落形成刺激因子、肿瘤坏死因子α(TNF)、白介素6、白介素8和血小板衍生生长因子。Paul WE，Fundamental Immunology，第4版(Lippingcott-Raven Publishers，Philadelphia，PA，1999)。值得注意的是，在小鼠模型中IL1A与TNF协同作用以诱导肝脏损伤。Nagakawa J等，Immunopharmacol Immunotoxicol13：485-98(1991)。
除了与肝脏毒性相关以外，白介素1蛋白质家族参与胰腺β细胞中胰岛素分泌的诱导和细胞凋亡的刺激。Paul WE，Fundamental Immunology，第4版(Lippingcott-Raven Publishers，Philadelphia，PA，1999)。由于临床试验参与者患有I型或II型糖尿病，因此这对于本试验是恰当的。在胰岛素依赖糖尿病(I型糖尿病)中自身免疫过程中，局部炎症细胞产生的IL1可能有助于胰腺β细胞的破坏。Mandrup-Poulsen T等，Cytokine 5：185-81(1993)。已经显示白介素1家族成员通过胰岛诱导一氧化氮(NO)的产生，并且文献报告支持NO在糖尿病发展中的作用。而且，用IL1A处理胰腺β细胞样细胞系RIN-5AH后4小时内导致细胞凋亡和坏死。Vassiliadis S等，Mediators Inflamm 8：85-91(1999)。有趣的是，IL1A在RIN-5AH细胞中诱导PKC表达增加30％。因此，IL1A除了影响肝脏毒性外，它还影响N-苯甲酰-星形孢菌素在糖尿病患者中的有效性。
文中引用的全部文献在此整体引用并为了所有目的以这样一种程度作为参考，所述程度即好像每一单独公开或专利或专利申请被特异地和单独地指定为为了所有目的整体引用作为参考。此外，文中引用的所有GenBank登录号、Unigene Cluster号和蛋白质登录号在此整体引用并为了所有目的以这样一种程度作为参考，所述程度即好像每一编号被特异地和单独地指定为为了所有目的整体引用作为参考。
本发明不受该申请中所述的特定实施方案的限制，所述的实施方案旨在作为本发明各个方面的一个例子。在不脱离本发明精神和范围的情况下可以对该发明进行许多修改和改变，并且这对于本领域技术人员是显而易见的。根据前述描述和附图，除了本文所列举以外的本发明范围内的功能等效方法和设备对于本领域技术人员是显而易见的。此种修改和改变旨在处于后附权利要求的范围内。本发明仅仅受后附权利要求以及与所授权的此种权利要求等效的全部范围的限制。
                     序列表
<110>诺瓦提斯公司(NOVARTIS AG)
<120>遗传多态性用于预测药物诱导肝脏毒性的用途
<130>DV/4-33390A
<150>60/508,972
<151>2003-10-06
<160>18
<170>用于Windows版本4.0的FastSEQ
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>变异
<222>(1)...(20)
<223>PG基因座ID 279；白介素1，α基因
(X03833)位置541-560；位置549为″C″变体
<221>变异
<222>(9)...(0)
<223>C
<400>1
aggcaacacc attgaaggct                                             20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>变异
<222>(1)...(20)
<223>PG基因座ID 279；白介素1，α基因
     (X03833)位置541-560；在位置549为″T″的变体
<221>变异
<222>(9)...(0)
<223>T
<400>2
aggcaacatc attgaaggct                                             20
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>变异
<222>(1)...(20)
<223>PG基因座ID 302；白介素1，α基因
     (X03833)位置6270-6290；在位置6282为″G″的变体
<221>变异
<222>(12)...(0)
<223>G
<400>3
agcctaggtc agcacctttt                                     20
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>变异
<222>(1)...(20)
<223>PG基因座ID 302；白介素1，α基因
     (X03833)位置6270-6290；在位置6282为″T″的变体
<221>变异
<222>(12)...(0)
<223>T
<400>4
agcctaggtc atcacctttt                                    20
<210>5
<211>19
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>结合引物
<222>(1)...(19)
<223>PCR引物2D6L1F1
<400>5
ctgggctggg agcagcctc                                     19
<210>6
<211>23
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>结合引物
<222>(1)...(23)
<223>PCR引物2D6L1R1
<400>6
cactcgctgg cctgtttcat gtc                                23
<210>7
<211>22
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>结合引物
<222>(1)...(22)
<223>PCR引物2D6L2F
<400>7
ctggaatccg gtgtcgaagt gg                              22
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>结合引物
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<223>PCR引物2D6L2R2
<400>8
ctcggcccct gcactgtttc                                 20
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<213>人
<220>
<221>结合引物
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<223>PCR引物2D6L3F
<400>9
gaggcaagaa ggagtgtcag gg                              22
<210>10
<211>23
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>结合引物
<222>(1)...(23)
<223>PCR引物2D6L3R5B
<400>10
agtcctgtgg tgaggtgacg agg                             23
<210>11
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<212>DNA
<213>人
<220>
<221>结合引物
<222>(1)...(19)
<223>PCR引物CYP3A4外显子10F
<400>11
tggatggccc acattctcg                               19
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>结合引物
<222>(1)...(20)
<223>PCR引物CYP3A4外显子10R
<400>12
cttcctacat agagtcagtg                               20
<210>13
<211>21
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>结合引物
<222>(1)...(21)
<223>PCR引物PXR 252 F
<400>13
ggacacagag tctgttcctg g                             21
<210>14
<211>22
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>结合引物
<222>(1)...(22)
<223>PCR引物PXR 252 R
<400>14
gaagatgaag gattcctctg gg                            22
<210>15
<211>23
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>结合引物
<222>(1)...(23)
<223>PXR 11156 F
<400>15
gacaaggcta cgctgacaat cag                          23
<210>16
<211>24
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>结合引物
<222>(1)...(24)
<223>PXR 11156 R
<400>16
gcttgcgtat gtttctattt ccac                       24
<210>17
<211>21
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>结合引物
<222>(1)...(21)
<223>PXR 24113 F
<400>17
cggagcaaag aacttaccac c                          21
<210>18
<211>21
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>结合引物
<222>(1)...(21)
<223>PXR 24113 R
<400>18
tgcaggacca gagagcatca g                          21

Claims (14)

1.N-苯甲酰-星形孢菌素在制造用于治疗具有降低肝脏毒性的所选择患者群体中糖尿病性视网膜病变的药物中的用途，其中患者群体是基于患者在预测肝脏毒性的IL1A遗传基因座上的基因型选择的。
2.预测受试者中肝脏毒性的方法，其包括步骤：
(a)获得受试者在预测星形孢菌素衍生物施用后肝脏毒性的IL1A遗传基因座上的基因型；和
(b)确定在施用星形孢菌素衍生物之后受试者是否有肝脏毒性的危险。
3.权利要求2所述的方法，其中IL1A遗传基因座是PG基因座ID 279。
4.权利要求3所述的方法，其中PG基因座ID 279上的CC基因型预测有肝脏毒性的高危险。
5.权利要求3所述的方法，其中PG基因座ID 279上的CT或TT基因型预测有肝脏毒性的低危险或平均水平危险。
6.权利要求2所述的方法，其中IL1A遗传基因座是PG基因座ID 302。
7.权利要求6所述的方法，其中PG基因座ID 302上的GG基因型预测有肝脏毒性的高危险。
8.权利要求6所述的方法，其中PG基因座ID 302上的GT或TT基因型预测有肝脏毒性的低危险或平均水平危险。
9.使用星形孢菌素衍生物治疗糖尿病状况的改良方法，其包括步骤：
(a)获得待治疗受试者在预测星形孢菌素衍生物施用后肝脏毒性的IL1A遗传基因座上的基因型；和
(b)向受试者施用星形孢菌素衍生物。
10.选择能够入选确定星形孢菌素衍生物治疗功效临床试验的受试者的方法，其包括步骤：
(a)获得受试者在预测星形孢菌素衍生物施用后肝脏毒性的IL1A遗传基因座上的基因型；和
(b)然后：
(i)如果基因型预示具有肝脏毒性的低危险或平均水平危险，则在试验中包括受试者；或者
(ii)如果基因型预示具有肝脏毒性的高危险，则在试验中不包括受试者。
11.用于预测肝脏毒性的试剂盒，其包括：
(a)检测IL1A基因遗传多肽性的试剂，其中所述的IL1A基因遗传多肽性是星形孢菌素衍生物介导的肝脏毒性的标志物；
(b)装试剂的容器；和
(c)在容器上和容器内的书面产品，其用于描述生物标志物在预测星形孢菌素衍生物介导受试者肝脏毒性中的用途。
12.权利要求11所述的试剂盒，其中IL1A遗传基因座是PG基因座ID 279。
13.权利要求11所述的试剂盒，其中IL1A遗传基因座是PG基因座ID 302。
14.权利要求11所述的试剂盒，其中试剂是一组引物对，其中所述的引物对与遗传多态性任一侧的多核苷酸杂交并且限定了跨越遗传多态性的核苷酸区域。
CNA2004800344189A 2003-10-06 2004-10-05 遗传多态性用于预测药物诱导肝脏毒性的用途 Pending CN1882705A (zh)

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