CN1872117A - 一种益气健脾的药物组合物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种益气健脾的药物组合物，它是由含有人参总皂苷、白术油、红参和白术复合多糖为原料制备而成药剂。本发明还提供了该药物组合物的制备方法。本发明药物具有治疗胃癌癌前病变的作用，且四个有效部位组合，药效明确，发挥了协同增效的作用，可控性强，质量稳定，为临床提供了一种新的选择。

Description

一种益气健脾的药物组合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种益气健脾的药物组合物，具体地，是以中药材为原料提取制备的有效部位为原料制备而成的药物组合物，属药物领域。

背景技术

恶性肿瘤对人类身心健康的严重威胁众所周知。全世界每年死于恶性肿瘤的患者，35％为消化系统的肿瘤，其中，胃癌的死亡率具首位。我国1997年癌情公布，癌症的病死率已由70年代的11.7％上升到90年代的18.14％，而胃癌居10种恶性肿瘤之首。近年来研究表明，胃癌由正常组织发展到恶性肿瘤之前，要经过一个相当长的演变阶段，即胃癌癌前病变(Precancerous Lesions of gastric cancer)。由于胃癌的病因尚不完全清楚，实施针对病因的一级预防比较困难，因此，国内外学者把胃癌癌前病变作为开展胃癌二级预防的重要内容。世界卫生组织于1978年已经统一了癌前疾病(或状态)和癌前病变(或病损)的认识。癌前疾病是指与胃癌的发生有密切关系的胃良性疾病，包括萎缩性胃炎、残胃、胃息肉、恶性贫血及胃溃疡等。而胃癌癌前病变是指胃粘膜出现中、重度不典型增生或/和不完全性结肠型肠化生。国内外学者对胃癌癌前病变进行了广泛地研究。如Levin B.等发现，钙、硒、叶酸等适合于胃癌癌前病的化学预防，化学预防的机制可能包括矫正致癌物的活性和细胞摄入，抑制异常信号的传导，诱导细胞调亡和抑制致癌作用；国外学者Fang JY.NenseyYM.国内学者杨佳琦、房静远、李春启等研究结果表明，叶酸、维甲酸对胃癌癌前疾病和胃癌癌前病变有一定的药效作用，其机理可能一诱导癌细胞凋亡有关。但以上的研究成果，还有许多问题有待解决，诸如药物的效价比不高，抑制癌前病变的远期疗效不肯定，药物的剂量与逆转的效果关系不清楚，抑制癌前病变的机理不确切。总之，到目前为止，尚缺乏疗效肯定的化学治疗药品。

近年来，我国学者在中医药理论指导下，对胃癌癌前病变进行了一些研究。如董建华教授认为，胃癌癌前病变属中医“虚痞”的范畴，分为气阴两虚、虚火灼胃、脾胃虚阴弱三型。张镜人教授认为，萎缩性胃炎合并不完全性结肠型肠上皮化生或中、重度不典型增生，就是胃癌癌前病变，发病与脾胃虚弱、正气不足有关。目前一般认为胃癌癌前病变属中医痞满、胃脘痛的范畴，以虚证多见，脾虚是胃癌癌前病变的基本病机，脾虚症状的轻重与胃癌癌前病变及胃癌发生发展各阶段病变之间呈等级正相关。

由人参、白术为原料制备的药物制剂始载于明《证治准绳》，由人参、白术组成，是治疗脾气虚证的基本代表方剂。它渊源于汉代张仲景《伤寒论》理中汤、唐代王焘《外台秘要》人参饮、宋代《和剂局方》，成方于明代《证治准绳》。明代王肯堂《证治准绳.类方》卷一载“本发明药物膏……人参、白术各等分，水煎稠汤化服之”。由于工艺简单，其中的挥发油易挥发，且有效成分易损失，药效不明确。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的技术方案是提供了一种益气健脾的药物组合物，本发明的另一技术方案是提供了该药物组合物的制备方法和用途。

本发明提供了一种益气健脾的药物组合物，它是含有由下述重量配比的原料制备而成的药剂：

人参总皂苷5-50份、白术油1-10份、红参和白术复合多糖5-50份。

进一步地，它是由下述重量配比的原料制备而成的药剂：

人参总皂苷5-50份、白术油1-10份、红参和白术复合多糖5-50份。

其中，所述的人参总皂苷中人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的总重量百分含量占0.5-5％，所述白术油中挥发油的重量百分比≥60％，每毫升白术油中含亚油酸≥30mg。

所述的药剂是：丸剂、胶囊剂、颗粒剂、片剂、口服液、注射剂。

本发明还提供了该药物组合物的方法，它包括如下步骤：

a、取红参药材，加50％～80％乙醇浸泡，回流提取，滤过，合并滤液，滤液通过大孔吸附树脂，收集洗脱液，回收乙醇，浓缩，得人参总皂苷；

c、取白术，食用植物油为溶剂，提取，滤过，滤液回收溶剂植物油，所得产物为白术油；

d、取白术药渣，加乙醇提取滤过，药渣再与红参药渣混合，加水煎煮，滤过，精制，备用，得红参和白术复合多糖；

e、将b、c、d制备的人参总皂苷、白术油、红参和白术复合多糖按如下重量配比，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。

人参总皂苷5-50份、白术油1-10份、红参和白术复合多糖5-50份。

其中，步骤c所述的白术油可加入到β-环糊精水溶液中，超声包合，冷藏，离心，沉淀即得经包合后得白术油。

其中，所述的红参干浸膏中人参总皂苷的重量百分含量≥60％，人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的总重量百分含量≥6％，白术油中挥发油的重量百分含量≥60％；d步骤红参和白术干浸膏中的复合多糖的重量百分含量以葡萄糖计≥60％。

本发明还提供了该药物组合物在制备益气健脾的药物中的用途。

本发明还提供了该药物组合物在制备治疗胃癌的药物中的用途。进一步地，所述的药物是抑制胃癌癌前病变的药物。

祖国医学认为，胃癌癌前病变属“痞满”、“胃脘痛”等范畴，脾气虚是其基本病机，临床主要以食欲减退，食后饱胀或上腹部钝痛，以及大便溏薄，神疲体倦等脾虚气弱症状表现为特征。故本方针对上述脾虚症状和病机，采取“虚者补之”、“损者益之”的治疗原则，重用红参为君，甘温入脾，“调中益气”(《汤液本草》)，“和中健脾”(《本草汇言》)，“消食开胃”(《日华子本草》)，“通血脉，破坚积”(《名医别录》)，凡脾气虚衰，而见食少、腹胀、便溏、体倦懒言等症，用之皆有确实疗效。臣以白术，苦温燥湿健脾，“除心下急满”  (《名医别录》)。两药合用，共奏补气与健脾之功。使脾气之虚得补而湿不滞，运化之健得复而积滞消。故能对脾虚型胃癌癌前病变及一般脾胃气虚而运化机能衰减者，切中病情，疗效显著。经药理实验证明，由本发明药物有效部位红参皂苷、白术油、红参复合多糖、白术复合多糖组成的药物组合物具有明显改善食醋脾虚大鼠的脾虚症状，增加尿液D-木糖的含量，升高胸腺小体的数量，扩大脾脏T、B细胞区，提高T-淋巴细胞转换率，纠正胃肠组织病损，提高脾虚小鼠胃肠运动的能力；延长脾虚小鼠的游泳时间，增加耐缺氧、耐寒、耐高温的能力；纠正胃癌癌前病变大鼠、小鼠的脾虚症状，改善胃粘膜萎缩、充血水肿，胃腺体囊性扩张、异型增生、肠腺化生的病理变化，纠正肠组织的病理损害，纠正胃癌转移鼠的脾虚症状，抑制胃癌病变，调控胃癌基因。

本发明药物具有治疗脾虚胃癌癌前病变的作用，且四个有效部位组合，药效明确，发挥了协同增效的作用，可控性强，质量稳定，为临床提供了一种新的选择。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

具体实施方式

实施例1本发明原料的提取工艺

取红参药材，加50％乙醇浸泡，回流提取，滤过，合并滤液；药液回收乙醇，浓缩，上大孔吸附树脂，先用及20％乙醇洗脱除杂，继用的70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，备用。白术用溶剂油(或植物油)浸泡，回流提取，滤过，滤液回收溶剂，加入到β-环糊精水溶液中，超声包合，冷藏，离心，沉淀备用；取白术药渣，加乙醇提取滤过，药渣再与红参药渣混合，加水煎煮，滤过，滤液浓缩，离心，上清液醇沉，离心，沉淀备用。红参皂苷浓缩液加入白术油β-环糊精包合物及复合多糖沉淀，混合均匀，以淀粉为母核，制粒，整粒，装入胶囊，即得。

实施例2本发明原料的提取工艺

取红参药材，加80％乙醇浸泡，回流提取，滤过，合并滤液；药液回收乙醇，浓缩，上大孔吸附树脂，先用及20％乙醇洗脱除杂，继用的70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，备用。白术溶剂油(或植物油)浸泡，回流提取，滤过，滤液回收溶剂，浓缩，备用；取白术药渣，加乙醇提取滤过，药渣再与红参药渣混合，加水煎煮，滤过，滤液浓缩，离心，上清液醇沉，离心，沉淀备用。红参皂苷浓缩液加入白术油及复合多糖沉淀，混合均匀，以淀粉为母核，制粒，整粒，装入胶囊，即得。

实施例3本发明药物的制备

按实施例1的方法制备得人参总皂苷50g、白术挥发油10g、红参和白术复合多糖50g，加入淀粉制粒、整粒，加硬脂酸镁，压片，得片剂。

实施例4本发明药物的制备

按实施例1的方法制备得人参总皂苷5g、白术挥发油1g、红参和白术复合多糖5g，加入淀粉制粒、整粒，加硬脂酸镁，压片，得片剂。

实施例5本发明药物的制备

按实施例1的方法制备得人参总皂苷25g、白术挥发油10g、红参和白术复合多糖25g，加入淀粉制粒、整粒装胶囊，得胶囊剂。

实施例6本发明药物的制备

按实施例1的方法制备得人参总皂苷40g、白术挥发油10g、红参和白术复合多糖50g加入淀粉制粒、整粒装胶囊，得胶囊剂。

实施例7本发明药物的制备

按实施例1的方法制备得人参总皂苷10g、白术挥发油10g、红参和白术复合多糖10g，将白术油乳化、加入人参总皂苷、复合多糖，加入注射用附加剂，调pH值及渗透压，制备成注射剂。

实施例8本发明药物的制备

按实施例1的方法制备得人参总皂苷50g、白术挥发油1g、红参和白术复合多糖5g，加入淀粉制粒、整粒装胶囊，得胶囊剂。

实施例9本发明药物质量控制方法

(1)红外光谱鉴别

取本发明药物胶囊内容物适量，加水溶解多糖，滤过，滤液加95％乙醇至含醇量达到约80％后，静置12小时，离心，收集沉淀，真空干燥，得复合多糖。两批复合多糖的IR图谱一致。并对同一批样品中分得的复合多糖比较除蛋白前后的IR图谱，结果，两张图谱非常相似。又将与复合多糖相同制法制得的红参多糖与白术多糖在未除蛋白的情况下，作IR图谱比较，红参多糖与白术多糖的IR图谱，从吸收峰的位置来看很相近，但峰的大小有一些区别。在1740.5cm^-1处，红参多糖与复合多糖有一小峰而白术多糖没有。

(2)高效毛细管电泳法

①仪器：BeckmanHPCE毛细管电泳仪；二极管阵列检测器；毛细管柱(56cm×75μm)。

色谱条件的考察：对影响分离和检测的条件如柱温、流动相、检测波长进行了考察。最终确定色谱条件为：  L硼酸-硼酸钠；柱温：30℃；电压：15KV。

②样品溶液制备方法的考察

对影响样品水解的各因素如水解时间、水解方式、H₂SO₄加入量、中和试剂的选择等进行了考察。最终确定水解条件为称取30mg多糖，加入H₂SO₄5ml，100℃水解，用Ba(OH)₂先中和一部分，临近终点时，再用BaCO₃中和至中性。分别以12000转/分钟的转速离心10分钟，上清液用0.45μm滤膜滤过，即得。

白术多糖样品的制备：精密称取白术多糖约30mg，按上述方法制备，即得。

红参多糖样品的制备：精密称取红参多糖约30mg，按上述方法制备，即得。

红参、白术复合多糖样品的制备：精密称取红参、白术复合多糖约30mg，按上述方法制备，即得。

β-环糊精样品的制备：精密称取β-环糊精约30mg，按上述方法制备，即得。

③淀粉的制备：精密称取淀粉约30mg，按上述方法制备，即得。

④测定方法：分别吸取上述样品溶液各1μl，注入高效毛细管电泳仪进行测定，结果如下：

在固定波长204和214nm测定下，白术多糖和红参多糖的出峰时间基本一致，谱图基本一致。但在全波长扫描下，得到三维谱图，发现白术多糖在284nm处有一峰，红参多糖无此峰；而红参多糖在190nm处有一吸收峰，白术多糖无此峰；复合多糖在284nm和190nm处都有吸收峰。

另外，将β-环糊精和淀粉进行了测定，发现它们的谱图在284nm和190nm处无吸收。说明它们不影响多糖的毛细管电泳分析。

结论：采用高效毛细管电泳法可区分人参多糖和白术多糖，并且方中β-环糊精和淀粉无干扰。

实施例10本发明药物原料白术油的质量控制

(1)总挥发油的测定：精密量取白术油1ml，按《中国药典》2000年版药典附录XD挥发油测定法中甲法操作，测定挥发油含量。

本品含挥发油量不得少于60％。

(2)白术油中亚油酸含量的测定：照气相色谱法(《中国药典》2000年版一部附录VIE)测定。

色谱条件与系统适用性试验：10％DEGS为担体，Chromsorb w Aw-DMCS为固定相(60～80目，2.1m×3mm)玻璃柱。柱温：165℃。进样口温度：220℃。检测器：FID，230℃。H₂：30ml/分钟。Air：100ml/分钟。N₂：60ml/分钟。理论塔板数(N)以亚油酸甲酯计不低于1000。

对照品溶液的制备：取亚油酸甲酯对照品约1g，精密称定，置50ml量瓶中，加正已烷溶解并定容至刻度。精密量取3.0ml置10ml量瓶，加正已烷至刻度，即得。

供试品溶液的制备与测定：量取本品约0.25ml，精密称定取，置具塞刻度试管中，加入0.5mol/L的氢氧化钾-甲醇溶液2.0ml，摇匀，置70℃水浴中皂化15分钟，取出，冷至室温，再加入12.5％的三氟化硼-甲醇溶液2ml，置70℃水浴中甲酯化5分钟，取出，冷至室温，精密加入正已烷2.0ml，摇匀，再加入饱和氯化钠溶液2.0ml，摇匀，静置，摇匀，静置，记下上清液的总体积，精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2μl，注入气相色谱仪，测量亚油酸甲酯峰面积，用外标法计算含量，即得。

本品每ml含亚油酸(C₁₈H₃₂O₂)不得少于30.0mg。

(3)稳定性

按《中国药典》2000年版及“药品注册管理办法”中有关稳定性技术要求，试验按照“本发明药物胶囊质量标准草案”的方法，对白术油包合物及成品经常温6个月稳定性考察，结果表明本品基本稳定。

以下通过具体的药效学试验证明本发明的有益效果。证明本发明药物具有抑制胃癌癌前病变。

试验例1本发明药物对脾虚胃癌癌前病变大鼠的治疗作用

一、实验材料

1、药物

①受试药物：本发明药物胶囊剂，实施例1的方法制备，每g干浸膏含原生药10g。用蒸馏水配制成1％、2％、4％的药液(即每ml含原生药0.1g、0.2g、0.4g)备用。

②阳性药物：正大养胃冲剂，由正大青春宝药业有限公司生产，批准文号：浙卫药准字(1993)0376-1号。丽珠得乐颗粒，由丽珠制药有限公司生产，批准文号：(90)卫药准字X-91-3号。

2、动物

SD大鼠，雌雄均有，体重180～220g，  由成都中医药大学实验动物研究中心提供，合格证号：川实动管质(97)第8号。检疫后备用。

二、实验方法

取SD大鼠70只，随机分为空白对照组(N＝10)、脾虚胃癌癌前病变模型组(N＝10)、正大养胃冲剂组(N＝10)、丽珠得乐组(N＝10)、本发明药物胶囊高剂量组(N＝10)、本发明药物胶囊中剂量组(N＝10)、本发明药物胶囊低剂量组(N＝10)。除空白对照组外，主动免疫、饥饱不均加饮用氨水法复制脾虚胃癌癌前病变动物模型90d。第91d，按组分别灌胃等容积蒸馏水、养胃冲剂药液15g/kg、丽珠得乐药液1.00g/kg、4％、2％、1％本发明药物胶囊药液10ml/kg，连续给药30d。实验前、造模后测定动物体重、体温、摄食量和自发活动，以后每10d测体重1次，以便调整给药容积；治疗后同法测定动物体重、体温、摄食量和自发活动。第121d，股静脉取血，分离血清，按胃泌素放射免疫分析测定试剂盒的要求，FJ-2003r计数器测定血清胃泌素含量；处死动物，剖检后取胃、空肠组织各一块，立即投入10％甲醛液内固定，石腊包埋，HE染色，光学显微镜观察。

三、实验结果

1.对脾虚胃癌癌前病变大鼠脾虚症状的影响

脾虚胃癌癌前病变模型组大鼠摄食量明显降低，自发活动减少，竖毛，腹胀，大便异常，部分动物肛周污移，与空白对照组比较，差异明显。经本发明药物治疗后，摄食量、自发活动均明显升高，高剂量组动物体重明显增加，与脾虚胃癌癌前病变模型组比较，有明显差异，与正大养胃冲剂组比较，无明显差异，但明显优于丽珠得乐组。结果详见表1。

                   表1对脾虚大鼠脾虚症状的影响( X±SD)

组别	体重(g)		摄食量(g)	自发活动(次/10min)
					实验前	实验后
	空白对照模型对照正大养胃丽珠得乐高剂量中剂量低剂量	181.60±11.35181.80±11.77184.40±10.28182.80±11.60184.10±12.97184.80±11.21184.90±10.88					328.90±55.13262.60±29.13**306.90±30.28ΔΔ283.40±41.44339.30±49.72ΔΔ309.30±26.96ΔΔ302.50±13.46ΔΔ	30.32±2.5422.49±3.47**24.29±3.9723.91±3.8530.73±2.39ΔΔ29.54±2.01ΔΔ29.24±1.64ΔΔ	656.80±88.90442.90±120.41**469.10±152.35452.80±94.40685.70±84.47ΔΔ710.30±104.22ΔΔ667.00±50.22ΔΔ

注：与空白对照组比较^**P＜0.01；

与模型组比较ΔΔP＜0.01；

2、对脾虚胃癌癌前病变大鼠胃肠病理形态学的影响

①剖检观察：脾虚胃癌癌前病变模型组动物胃肠胀气，胃粘膜变薄，空肠充血水肿。经药物治疗后，本发明药物高中低剂量组、丽珠得乐组、正大养胃冲剂组基本恢复正常。

②组织病理学观察：脾虚胃癌癌前病变模型组动物胃上皮细胞坏死萎缩，胃腺体囊性扩张、异型增生、肠腺化生，胃粘膜下充血水肿；空肠充血水肿、上皮细胞坏死脱落。本发明药物高中低剂量组、丽珠得乐组大鼠胃肠病损基本恢复正常，与空白对照组无显著性差异。结果详见表2。

表2本发明药物胶囊对脾虚胃癌癌前病变大鼠胃、空肠组织形态的影响( X±SD)

组别	动物(只)	剂量(g/kg)	胃												空肠
																			炎症		坏死		萎缩		腺体囊性扩张		异型增生		肠腺化生		炎症		坏死
			-	+	-	+	-	+	-	+	-	+	-	+	-	+	-	+
																			空白对照脾虚模型养胃冲剂丽珠得乐高剂量中剂量低剂量	8888888	——等容积蒸馏水15.000.480.40.20.1	8046887	08*42Δ0Δ0Δ1Δ	8056887	08*32Δ0Δ0Δ1Δ	8046887	08*42Δ0Δ0Δ1Δ	8047887	08*41Δ0Δ0Δ1Δ	8368888	05*200Δ0Δ0Δ	8346888	05*420Δ0Δ0Δ	8068888	08*2Δ0Δ0Δ0Δ0Δ	8266877	06*2Δ2Δ0Δ1Δ1Δ

注：与空白对照组比较^*P＜0.05；

与脾虚模型组比较ΔP＜0.05；

四、结论

本发明药物能够改善脾虚萎缩性大鼠的症状，升高血清胃泌素的含量，纠正胃粘膜坏死萎缩、胃腺体囊性扩张、异型增生、肠腺化生、胃粘膜下充血水肿及空肠充血水肿、上皮细胞坏死脱落的病理变化，其作用优于丽珠得乐和正大养胃冲剂。

试验例2本发明药物对脾虚胃癌癌前病变小鼠的治疗作用

一、实验材料

1、药物

①受试药物：本发明药物胶囊，由实施例2方法制备，每g干浸膏含原生药10g。用蒸馏水配制成1％、2％、4％的药液(即每ml含原生药0.1g、0.2g、0.4g)备用。

②阳性药物：胃复春片，规格：0.37g/片，由杭州胡庆余堂药业有限公司生产，批号000102，配制：29片(10.73g)碾为细末加无菌水溶解为72.5ml。

③2-乙基亚硝胺，华西医大肿瘤研究所提供；山西白醋由山西省美和居老陈醋有限公司生产，酸度3.5g/100ml，批号200012。

2、动物

NIH小鼠，雌雄均有，体重18～22g，由成都中医药大学实验动物研究中心提供，合格证号：川实动管质(99)第6号。检疫后备用。

二、实验方法

取NIH小鼠60只，随机分为空白对照组(N＝10)、脾虚胃癌癌前病变模型组(N＝10)、胃复春组(N＝10)、本发明药物胶囊高剂量组(N＝10)、本发明药物胶囊中剂量组(N＝10)、本发明药物胶囊低剂量组(N＝10)。除空白对照组外，其余各组按文献{11.12.}禁食后灌胃山西白醋15ml/kg，第2-10日灌胃山西白醋10ml/kg，第11-130日灌胃2-乙基亚硝胺2.8mg/kg，复制脾虚胃癌癌前病变动物模型。第131-160日，按组分别灌胃等容积蒸馏水、胃复春药液1.48g/kg、本发明药物胶囊药液0.4g/kg、0.2g/kg、0.1g/kg，连续给药30d。实验前、造模后测定动物体重、体温、摄食量和自发活动，以后每10d测体重1次，以便调整给药容积；治疗后同法测定动物体重、体温、摄食量和自发活动。第161d，处死动物，剖检后取胃组织一块，立即投入10％甲醛液内固定，石腊包埋，HE染色，光学显微镜观察。

三、实验结果

1.对脾虚胃癌癌前病变小鼠脾虚症状的影响

脾虚胃癌癌前病变模型组小鼠竖毛、拱背、自发活动减少、摄食明显降低、体重减轻、腹胀、大便异常、部分动物肛周污移、消瘦、被毛蓬松失泽。经本发明药物胶囊治疗后，摄食量、自发活动、体重、腹形、被毛等脾虚症状消失。

2、对脾虚胃癌癌前病变小鼠胃肠病理形态学的影响

①剖检观察：脾虚胃癌癌前病变模型组动物胃肠胀气，胃粘膜变薄，空肠充血水肿。经药物治疗后，本发明药物胶囊高中低剂量组、胃复春组基本恢复正常。

②组织病理学观察：脾虚胃癌癌前病变模型组动物胃中重度异型增生明显，与空白对照组比较有显著性差异。本发明药物胶囊高中低剂量组、胃复春组小鼠胃组织基本恢复正常，与模型对照组比较有显著性差异。结果详见表3。

表3本发明药物胶囊对脾虚胃癌癌前病变小鼠胃组织形态的影响( X±SD)

组别	动物(只)	剂量(g/kg)	胃组织
								正常	非典型增生			癌变
			轻	中	重
						空白对照模型对照胃复春高剂量中剂量低剂量	101010101010		——等容积蒸馏水1.480.40.20.1	1007988	012121		031001	040000	02*0Δ0Δ0Δ0Δ

注：与空白对照组比较^*P＜0.05；

与脾虚模型组比较ΔP＜0.05；

四、结论

本发明药物能够改善脾虚小鼠的症状，改善胃组织的胃癌癌前病变，能逆转异型增生。

试验例3本发明药物对脾虚胃癌转移鼠的治疗作用

一、实验材料

1、药物

①受试药物：本发明药物胶囊，由实施例1制备，每g干浸膏含原生药10g。用蒸馏水配制成1％、2％、4％的药液(即每ml含原生药0.1g、0.2g、0.4g)备用。

②阳性药物：胃复春片，规格：0.37g/片，由杭州胡庆余堂药业有限公司生产，批号020717，配制：29片(10.73g)碾为细末加无菌水溶解为72.5ml。5-氟尿嘧啶，规格：0.25g/10ml，由天津金耀氨基酸有限公司生产，批号0207012，配制：12ml5-Fu加无菌水至100ml(100ml∶300mg)。

2、动物

BALB/c-nu/nu裸鼠108只，SPF动物，雌雄均有，8周龄。由成都中医药大学实验动物研究中心提供。动物合格证：99-6，检疫后备用。

3、瘤源

人胃癌细胞株SGC-7901悬液(3×10⁶)由华西肿瘤研究所提供。

4、试剂

TIMP1(H-150)，rabbit polyclonal IgG，购自Santa Cruz公司。

TIMP2(H-140)，rabbit polyclonal IgG，购自Santa Cruz公司。

MMP2(C-19)，goat polyclonal IgG，购自Santa Cruz公司。

uPA(M-20)，goat polyclonal IgG，购自Santa Cruz公司。

PAI-1(H-135)，rabbit polyclonal IgG，购自Santa Cruz公司。

MMP9，rabbit anti MMP-9(Ab1)，BA0573，购自武汉博士德生物技术有限公司。

相应二抗及试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。

5、设备

CB3201数字描记式小动物活动观测仪       中国川北电子工业公司

电子天平PA2003                         上海天平仪器厂

Olympus BX50光学显微镜                 日本

MIAS-2000型图像分析系统                四川大学图像图形研究所

6、设施

SPF(specific pathogen free condition)实验动物屏障系统，由成都中医药大学实验动物研究中心提供，实验动物设施环境符合SPF级标准，动物实验合格证号：99-5。

二、实验方法

1、脾虚胃癌转移鼠动物模型的建立及分组处理

取BALB/c-nu/nu裸鼠108只。实验第1 d将SGC-7901悬液接种于2只裸鼠腋下(0.2ml/只)，培育胃癌组织块，待胃癌组织块长成1cm×1cm大后将此胃癌组织块传代培育至实体瘤，本次实验传至第四代时待其长成1cmm×1cm大备用(8周)。其余自由摄食无菌全价颗粒饲料，第9周开始将其余100只裸鼠造脾虚证动物模型，实验前禁食36h后，首次灌胃以山西白醋按15ml/kg/d，以后按10ml/kg/d灌胃6 d；第10周时，在严格无菌操作条件下进行手术造胃癌转移动物模型，即在手术第1天用戊巴比妥钠40mg/kg腹腔麻醉下，手术视野皮肤消毒，并在裸鼠剑突下开-0.7cm-1cm长纵向切口，找到胃，在腺胃处切开浆膜并用荷包缝合法缝入前述传至第四代的胃癌组织块0.1×0.1cm后，关闭腹腔。实验过程在SPF动物实验室内进行，术后将此100只裸鼠随机分为6组，即脾虚胃癌模型组20只，西药对照组20只，中药对照组15只，本发明药物胶囊低剂量组15只，本发明药物胶囊中剂量组15只，本发明药物胶囊高剂量组15只，手术第2天开始除脾虚胃癌模型组自由饮用无菌水外，西药组灌胃给予5-氟尿嘧啶30mg/kg/d，中药对照组灌胃给予胃复春1.48g/kg/d，本发明药物胶囊低剂量组灌胃给予本发明药物胶囊药液100mg/kg/d，本发明药物胶囊中剂量组灌胃给予本发明药物胶囊药液200mg/kg/d，本发明药物胶囊高剂量组灌胃给予本发明药物胶囊药液400mg/kg/d，除模型组外均按此法治疗21天(3周)，禁食24小时，脱颈椎处死，取出胃，沿胃大弯侧纵向剖开，用生理盐水洗净食物残渣后，将胃组织用10％的中性福尔马林液固定待测。

实验中每周电子天平称一次体重、小动物活动观测仪测定10分钟内的自发活动、电子天平称24h动物的摄食量，观察大便性状、腹形及体表的其他表现。

2、病理组织学染色步骤及胃癌细胞的形态观察

将前述胃组织10％中性福尔马林液固定48小时，逐级酒精脱水，二甲苯透明、浸腊，石蜡包埋，常规切片4um，HE染色.每个标本在10×40高倍镜下，随机观察20个癌细胞核形态，并在MIAS-2000型图像分析系统下测量细胞核及相应核仁的面积(截面的面积等于落在截面内的像素点计数乘以每个测试像素点所代表的测试面积(a＝d²k₂Pc))、周长(指围绕被测试物体周边的长度)、最大直径、最小直径(平面图形的卡规直径是指正切该图形的两条平行线之间的距离，它可用最大直径、最小直径和平均卡规直径来描述)及形状因子(一般指二维形状因子，综合反映二维形态结构的变化，无量纲参数(即无单位)，当被测物体为园时，形状因子等于1，当物体不规则或呈椭圆时，形状因子小于1，反映被测物体截面的不规则程度)5种形态参数。

3、胃癌侵润、转移相关基因表达的检测

免疫组织化学染色步骤(SP法)：采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及基质素混合液来测定细胞和组织中的待测抗原。染色的主要过程如下：

1.石蜡切片脱蜡至水，用PBS液(0.01mol/L PH7.4)冲洗3次×5min.

2.3％H₂O₂室温孵育10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育10min.

3.蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟。

4.10％的正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加1∶100比例稀释的一抗，37℃孵育1小时。

5.PBS冲洗，5分钟×3次。

6.滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育30分钟。

7.PBS冲洗，5分钟×3次。

8.滴加第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃孵育30分钟。

9.PBS冲洗，5分钟×3次。

10.DAB显色。

11.自来水充分冲洗，苏木精复染，封片。

阳性结果判定：MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2、uPA及PAI-1阳性物质棕褐色至淡黄色，呈细丝状或者细颗粒状，MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2主要表达部位在肿瘤细胞胞浆，部分表达在肿瘤间质细胞(包括血管内皮细胞)胞浆及基质；uPA及PAI-1表达部位主要在血管内皮细胞胞浆，部分在肿瘤细胞胞浆及基质。

MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2、uPA及PAI-1基因表达的检测：首先将SP法染色切片在10×10低倍视野下进行全面观察，寻找肿瘤内MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2、uPA及PAI-1阳性物质最丰富区域(即“热点”区，染色颜色最深伴/或者染色面积最多)，然后在10×20中倍视野下选择20个热点区，采用MIAS-2000型图像分析系统测量各个指标阳性物质的面积、平均光密度、积分光密度、平均黑度，表示它们的含量。

统计学处理：所有计量资料以均数±标准差表示( x±SD)，采用SPSS11.0统计软件包处理，组间比较用LSD(方差齐)和S-N-K或Tamhane(方差不齐)。

三、实验结果

1、脾虚表现

用山西白醋灌胃6d后，实验裸鼠的一般情况都发生了变化，摄食量、自发活动、体重下降，腹部胀大，大便变溏或呈小干颗粒状，与造脾虚模型前有极显著差异。实验过程中共死亡60只动物，其中在食醋灌胃及手术双重打击下有47只动物死亡，后在灌胃治疗中又死亡13只，特别是西药组由于5-fu的副作用大，动物消瘦死亡多达7只，尸检无特殊。实验结束时，动物分别为脾虚胃癌模型组10只，西药对照组6只，中药对照组6只，本发明药物胶囊低剂量组6只，本发明药物胶囊中剂量组6只，本发明药物胶囊高剂量组6只。

2、病理组织学观察

HE染色切片下观察脾虚胃癌模型组癌组织结构紊乱，呈浸润性生长，与周围组织分界不清，癌细胞中等偏大，呈圆形、椭圆形、多边形及不规则形，胞浆较少，核染色较深，呈椭圆形、三角形及不规则形，多数呈空泡状，核分裂像较多，核仁粗大，位于核中央或偏位，多数具有一个核仁，少数有两个或者以上，染色深。5个治疗组癌细胞大小与模型组相似，但形状以圆形、椭圆形居多，多边形及不规则形减少，尤其是核的面积减小、形状明显变得规则、核仁数目和面积均较模型组减少。在核面积上，西药组有显著性差异，其余4个组差异无显著性；核周长和核最大直径较模型组减小，西药组和本发明药物高剂量组有显著性差异，其余3组差异无显著性；核最小直径较模型组减小，但均无显著性差异；代表核形状的核形状因子较模型组增大，其中西药组和中药对照组有显著性差异，本发明药物低、中、高剂量组有极显著性差异；核仁面积、核仁与核面积之比较模型组减小，且5个治疗组均有极显著性差异；核仁形状因子较模型组增大，除本发明药物高剂量组有显著性差异外，其余各组均差异无显著性。结果详见表4、表5。

表4 BALB/c-nu/nu裸小鼠胃癌组织内癌细胞核仁形态变化( x±SD)

组别	动物(只)	药物(g/kg)	核仁面积(um2)	核仁形状因子	核仁与核面积比
						脾虚胃癌组西药对照组中药对照组本发明药物低剂量本发明药物中剂量本发明药物高剂量	1066666	等容积无菌水0.031.480.10.20.4	105.08±13.7350.5±18.54**49.14±17.06**45.37±24.70**26.57±5.57**41.65±23.11**	0.91±0.030.96±0.020.92±0.030.95±0.040.94±0.020.97±0.02*	0.11±0.020.07±0.01**0.05±0.02**0.046±0.02**0.03±0.01**0.05±0.03**

注：与脾虚胃癌模型组比较：^*p＜0.05，^**p＜0.01。

表5 BALB/c-nu/nu裸小鼠胃癌组织内癌细胞核形态变化( x±SD)

组别	动物(只)	药物(g/kg)	核面积(um2)	核周长(um)	核最大直径(um)	核最小直径(um)	核形状因子
								脾虚胃癌组西药对照组中药对照组本发明药物低剂量本发明药物中剂量本发明药物高剂量	1066666	等容积无菌水0.031.480.10.20.4	977.36±197.20740.45±212.91*917.95±180.01944.32±254.15825.33±105.88814.82±149.02	117.55±11.96100.53±15.73*112.56±9.99112.96±14.75106.55±7.03105.11±9.07*	43.22±4.5236.47±5.15*41.17±3.6640.30±5.6539.23±3.2938.37±2.82*	26.65±3.0624.09±4.1126.33±2.7727.40±3.3125.44±1.7725.47±3.36	0.869±0.0300.896±0.019*0.895±0.019*0.906±0.019**0.905±0.032**0.913±0.020**

注：与脾虚胃癌模型组比较：^*p＜0.05，^**p＜0.01。

3、胃癌侵润、转移相关基因的表达

3.1 TIMP1基因的表达

TIMP1基因在本发明药物胶囊低中高三剂量组的表达较脾虚胃癌模型组、西药对照组及中药对照组有所增强，但差异无显著性。结果详见表6。

表6 BALB/c-nu/nu裸小鼠胃癌组织细胞内TIMP1含量变化( x±SD)

组别	动物(只)	药物(g/kg)	面积(×104um2)	平均光密度(×105)	积分光密度(×106)	平均黑度
							脾虚胃癌组西药对照组中药对照组本发明药物低剂量本发明药物中剂量本发明药物高剂量	1066666	等容积无菌水0.031.480.10.20.4	1.03±0.791.01±0.631.13±0.512.14±1.121.92±1.061.82±0.50	1.08±0.641.13±0.931.02±0.611.61±0.910.90±0.761.50±0.61	2.30±1.722.26±1.302.25±1.024.56±3.433.36±3.543.57±1.12	124.70±8.61123.84±10.51127.91±8.33119.75±8.68129.66±7.09129.89±6.13

3.2.TIMP2基因的表达

TIMP2基因在五个治疗组的表达均较脾虚胃癌模型组增强，其中胃复春组、本发明药物胶囊高、中、低剂量组与脾虚胃癌组比较有显著性(p＜0.05)或极显著性差异(p＜0.01)。结果详见表7。

表7 BALB/c-nu/nu裸小鼠胃癌组织细胞内TIMP2含量的比较( x±SD)

组别	动物(只)	药物(g/kg)	面积(×104um2)	平均光密度(×105)	积分光密度(×106)	平均黑度
							脾虚胃癌组西药对照组中药对照组本发明药物低剂量本发明药物中剂量本发明药物高剂量	1066666	等容积无菌水0.031.480.10.20.4	1.82±1.313.20±1.014.70±4.40*4.32±2.674.14±1.098.21±3.03**	1.13±0.611.07±0.441.51±0.992.34±0.40**1.40±0.392.46±1.03**	3.37±1.325.49±1.158.78±7.338.34±4.507.20±1.56*15.46±5.87*	130.68±7.11127.40±4.61120.28±9.84*119.34±7.79**125.41±5.78118.93±8.96**

注：与脾虚胃癌模型组比较：^*p＜0.05，^**p＜0.01。

3.3 MMP2基因的表达

MMP2基因在五个治疗组中的表达均较脾虚胃癌模型组减弱，其中中药对照组、本发明药物胶囊中剂量组与高剂量组较脾虚胃癌模型组有极显著性差异(p＜0.01)，本发明药物胶囊低剂量组较脾虚胃癌模型组有显著性差异(p＜0.05)，而西药组较脾虚胃癌模型组差异无显著性。结果详见表8。

表8 BALB/c-nu/nu裸小鼠胃癌组织细胞内MMP2含量的比较( x±SD)

组别	动物(只)	药物(g/kg)	面积(×104um2)	平均光密度(×105)	积分光密度(×106)	平均黑度
							脾虚胃癌组西药对照组中药对照组本发明药物低剂量本发明药物中剂量本发明药物高剂量	1066666	等容积无菌水0.031.480.10.20.4	3.43±2.292.75±0.971.18±0.671.67±0.701.45±0.801.02±0.59	1.63±1.001.08±3.719.15±5.62*1.20±0.731.08±4.006.78±0.43**	6.63±3.935.03±2.222.46±1.36**3.34±1.31*2.82±1.29**1.97±1.17**	119.32±7.17127.26±11.21123.56±9.09123.42±10.27129.15±7.01*129.59±8.32*

注：与脾虚胃癌模型组比较：^*p＜0.05，^**p＜0.01。

3.4 MMP9基因的表达

MMP9基因在西药对照组中的表达较脾虚胃癌模型组有一定增强，但差异无显著性；在中药对照组、本发明药物胶囊低中高三剂量组的表达较脾虚胃癌模型组减弱，且本发明药物胶囊高剂量组较脾虚胃癌模型组有显著性差异(p＜0.05)。结果详见表9。

表9 BALB/c-nu/nu裸小鼠胃癌组织细胞内MMP9含量的比较( x±SD)

组别	动物(只)	药物(g/kg)	面积(×104um2)	平均光密度(×105)	积分光密度(×106)	平均黑度
							脾虚胃癌组西药对照组中药对照组本发明药物低剂量本发明药物中剂量本发明药物高剂量	1066666	等容积无菌水0.031.480.10.20.4	5.23±4.344.69±3.001.68±1.072.80±1.132.25±1.360.74±0.46	0.86±0.461.67±0.49**0.93±0.491.11±0.381.15±0.590.59±0.33	8.33±7.659.03±5.353.39±2.025.35±2.154.49±4.291.62±0.95*	123.23±4.17122.41±3.48120.75±2.45121.54±8.50118.51±9.05126.45±13.88

注：与脾虚胃癌模型组比较：^*p＜0.05，^**p＜0.01。

3.5 uPA基因的表达

uPA基因在五个治疗组的表达均较脾虚胃癌模型组减弱，且本发明药物中剂量组较脾虚胃癌模型组有显著性差异(p＜0.05)，本发明药物高剂量组较脾虚胃癌模型组有极显著性差异(p＜0.01)。结果详见表10。

表10 BALB/c-nu/nu裸小鼠胃癌组织细胞内uPA含量的比较( x±SD)

组别	动物(只)	药物(g/kg)	面积(×104um2)	平均光密度(×105)	积分光密度(×106)	平均黑度
							脾虚胃癌组西药对照组中药对照组本发明药物低剂量本发明药物中剂量本发明药物高剂量	1066666	等容积无菌水0.031.480.10.20.4	3.40±2.441.26±0.411.69±1.301.35±0.95*0.93±0.50*0.87±0.51*	0.70±0.321.26±0.340.75±0.590.95±0.550.52±0.180.47±0.20	5.25±4.232.58±0.622.99±2.382.62±1.731.72±0.85*1.64±0.91**	127.23±7.35124.78±10.98131.04±7.05128.38±7.59130.05±6.69126.20±6.88

注：与脾虚胃癌模型组比较：^*p＜0.05，^**p＜0.01。

3.6 PAI-1基因的表达

PAI-1基因在五个治疗组的表达均较脾虚胃癌模型组增强，其中中药对照组、本发明药物低中高三剂量组较脾虚胃癌模型组有显著性差异(p＜0.05)，西药对照组较脾虚胃癌模型组差异无显著性。结果详见表11。

表11  BALB/c-nu/nu裸小鼠胃癌组织细胞内PAI-1含量的比较( x±SD)

组别	动物(只)	药物(g/kg)	面积(×104um2)	平均光密度(×105)	积分光密度(×106)	平均黑度
							脾虚胃癌组西药对照组中药对照组本发明药物低剂量本发明药物中剂量本发明药物高剂量	1066666	等容积无菌水0.031.480.10.20.4	1.23±0.581.89±1.102.77±1.22*2.74±1.11*2.64±1.42*2.96±1.30**	0.94±0.441.22±0.821.09±0.341.60±0.511.20±0.601.02±0.13	2.63±1.283.79±2.424.83±1.85*5.09±1.36*4.73±2.46*4.87±1.78*	123.66±6.40126.23±9.45129.07±10.94125.25±6.14128.01±10.76131.81±4.64

注：与脾虚胃癌模型组比较：^*p＜0.05，^**p＜0.01。

四、结论

经本发明药物治疗后，脾虚胃癌转移鼠癌细胞重新分化，表现为异型性降低，分化程度增高；脾虚胃癌转移鼠癌细胞浸润、转移降低，表现在癌组织内ECM降解减少，其机制之一是降解酶及其激活剂较低，同时ECM降解酶抑制剂和激活剂抑制物较高。结果提示：本发明药物不仅具有诱导脾虚胃癌转移鼠胃癌细胞重新分化的作用，而且还可通过调节ECM降解酶系与其相应抑制剂的分泌发挥拮抗ECM消溶，起到抗胃癌细胞浸润、转移的作用。

4、小结

本发明药物由人参(红参)、白术组成，具有健脾、益气、抑制胃癌癌前病变的作用，主治胃癌癌前病变脾气虚证的作用。经主要药效学试验，结果如下：

①本发明药物能够改善食醋脾虚大鼠的脾虚症状，增加尿液D-木糖的含量，升高胸腺小体的数量，扩大脾脏T、B细胞区，提高T-淋巴细胞转换率，纠正胃肠组织病损，提高脾虚小鼠胃肠运动的能力。

②本发明药物能够延长脾虚小鼠的游泳时间，增加耐缺氧、耐寒、耐高温的能力。

③本发明药物能够明显纠正胃癌癌前病变大鼠、小鼠的脾虚症状，改善胃粘膜萎缩、充血水肿，胃腺体囊性扩张、异型增生、肠腺化生的病理变化，纠正肠组织的病理损害。

④本发明药物有明显纠正胃癌转移鼠的脾虚症状，抑制胃癌病变，调控胃癌基因的作用。

上述试验结果表明，本发明药物具有健脾、益气、抑制胃癌癌前病变，治疗脾虚胃癌癌前病变的作用。

Claims (10)

1、一种益气健脾的药物组合物，其特征在于：它是含有由下述重量配比的原料制备而成的药剂：

人参总皂苷5-50份、白术油1-10份、红参和白术复合多糖5-50份。

2、根据权利要求1所述的益气健脾的药物组合物，其特征在于：它是由下述重量配比的原料制备而成的药剂：

人参总皂苷5-50份、白术油1-10份、红参和白术复合多糖5-50份。

3、根据权利要求1或2所述的益气健脾的药物组合物，其特征在于：所述的人参总皂苷中人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的总重量百分含量占0.5-5％，所述白术油中挥发油的重量百分比≥60％，每毫升白术油中含亚油酸≥30mg。

4、根据权利要求1或2或3所述的益气健脾的药物组合物，其特征在于：所述的药剂是：丸剂、胶囊剂、颗粒剂、片剂、口服液、注射剂。

5、一种制备权利要求1所述的益气健脾的药物组合物的方法，它包括如下步骤：

a、取红参药材，加50％～80％乙醇浸泡，回流提取，滤过，合并滤液，滤液通过大孔吸附树脂，收集洗脱液，回收乙醇，浓缩，得人参总皂苷；

c、取白术，食用植物油为溶剂，提取，滤过，滤液回收溶剂植物油，所得产物为白术油；

d、取白术药渣，加乙醇提取滤过，药渣再与红参药渣混合，加水煎煮，滤过，精制，备用，得红参和白术复合多糖；

e、将b、c、d制备的人参总皂苷、白术油、红参和白术复合多糖按如下重量配比，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。

人参总皂苷5-50份、白术油1-10份、红参和白术复合多糖5-50份。

6、根据权利要求5所述的益气健脾的药物组合物的制备方法，其特征在于：步骤c所述的白术油加入到β-环糊精水溶液中，超声包合，冷藏，离心，沉淀即得经包合后得白术油。

7、根据权利要求5所述的益气健脾的药物组合物的制备方法，其特征在于：所述的红参干浸膏中人参总皂苷的重量百分含量≥60％，人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的总重量百分含量≥6％，白术油中挥发油的重量百分含量≥60％；d步骤红参和白术干浸膏中的复合多糖的重量百分含量以葡萄糖计≥60％。

8、权利要求1所述的药物组合物在制备益气健脾的药物中的用途。

9、权利要求1所述的药物组合物在制备治疗胃癌的药物中的用途。

10、根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述的药物是抑制和/或治疗胃癌癌前病变的药物。