CN1850855A - 用于免疫或制备单克隆抗体的方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了使用T细胞表位增强免疫的方法和T细胞表位、编码核酸、载体、宿主细胞、药物组合物、人工抗原及其用途。

Description

用于免疫或制备单克隆抗体的方法和组合物

技术领域

本发明涉及免疫学领域，更具体地涉及使用T细胞表位增强免疫的方法和T细胞表位、其编码核酸、载体、宿主细胞、药物组合物、人工抗原及其用途。

背景技术

外源蛋白抗原进入机体后首先被树突状细胞(DC)、巨噬细胞等抗原呈递细胞(APC)吞噬，抗原在APC内被降解，其中包含的T细胞表位与MHC II分子结合而呈递于APC表面。在淋巴结内，抗原特异的T辅助细胞(Th)被呈递了Th表位肽的APC激活后移动到富含B细胞的滤泡附近。滤泡内抗原特异的B细胞则通过其表面的膜免疫球蛋白(mIg)结合外源蛋白抗原的B细胞表位而吞噬该蛋白，经过与APC细胞同样的生化过程，将抗原内包含的Th表位与MHC II分子复合物呈递于细胞表面。抗原特异的T细胞与抗原特异的B细胞通过细胞表面TCR与MHC II-肽复合物的相互识别而结合，进而通过B7-CD28、CD40-CD40L等分子的相互作用及细胞因子分泌而激活B细胞(GarsideP，Ingulli E，Merica RR，et al.Science 1998，281(5373)：96-99)。

根据抗体产生的机理，抗原特异性Th细胞的活化程度和速度对抗体产生的时间和滴度有重要的影响。缩短抗原特异性抗体产生的时间、提高抗体产生的滴度对于以下举例的及其它相关的领域将具有重要的价值：

1提高非颗粒蛋白抗原的免疫原性。基因工程颗粒性蛋白疫苗具有良好的免疫原性及免疫保护性，能够在机体内诱导全面的体液免疫、粘膜免疫及细胞免疫应答，这已被大量的实践所证明(Kirnbauer R，Booy F，Cheng N，et al.Proc Natl Acad Sci USA 1992；89(24)：12180-12184)。目前正在进行临床实验的四价人乳头瘤病毒(HPV)疫苗，包括HPV6、11、16、18四型，均为基因工程颗粒性蛋白疫苗，有报道其对持续性感染的保护率达到88％，对相关疾病的保护率可达100％(Villa LL，Costa RL，Petta CA，et al.Lancet Oncol 2005；6：271-278)。然而，非颗粒性蛋白疫苗的免疫原性则往往很弱，难以诱导足够的免疫保护反应。Clair NS等将人血清白蛋白交联之后免疫大鼠诱导产生的抗体最高可增强30倍[StClair N，Shenoy B，Jacob LD，et al.Proc Natl Acad Sci USA.1999；96(17)：9469-9474]。非颗粒性蛋白形成颗粒之后免疫原性大为增强的现象虽然为人所共知，其机制却并未被阐明。对于那些尚未在体外建立培养系统的病原微生物而言，由于无法进行灭活疫苗或减毒疫苗的研制，因此基因工程疫苗成为疫苗研究的重要方向，然而试图使表达出的靶蛋白形成颗粒的尝试常常是不成功的，因此提高非颗粒蛋白抗原的免疫原性是疫苗研究急待解决的重要问题。

2缩短多肽或其它弱免疫原性抗原的单克隆抗体研制周期，并提高抗体滴度。

本发明满足了上述需要。本发明的一个目的在于通过预激活抗原特异性Th细胞，提高蛋白特异性抗体产生的速度并提高抗体产生的滴度。本发明的其它目的从以下说明中将是显然的。

发明内容

第一方面，本发明涉及一种制备抗体的方法，其中：以T细胞表位肽免疫动物或人体，随后、同时或预先用天然含有T细胞表位的目标抗原或者共价偶联或融合表达该T细胞表位肽的目标抗原免疫同一动物或人体。

本发明还涉及一种免疫动物的方法，其中：以T细胞表位肽免疫动物或人体，随后、同时或预先用天然含有T细胞表位的目标抗原或者共价偶联或融合表达该T细胞表位肽的目标抗原免疫同一动物或人体。

本发明还涉及一种提高目标抗原免疫原性的方法，其中：以T细胞表位肽免疫动物或人体，随后、同时或预先用天然含有T细胞表位的目标抗原或者共价偶联或融合表达该T细胞表位肽的目标抗原免疫同一动物或人体。

本发明还涉及一种提高抗体产生的速度的方法，其中：以T细胞表位肽免疫动物或人体，随后、同时或预先用天然含有T细胞表位的目标抗原或者共价偶联或融合表达该T细胞表位肽的目标抗原免疫同一动物或人体。

本发明还涉及一种提高产生抗体的滴度的方法，其中：以免疫动物或人体，随后、同时或预先用天然含有T细胞表位的目标抗原或者共价偶联或融合表达该T细胞表位肽的目标抗原免疫同一动物或人体。

目标抗原是待针对其产生免疫应答例如待针对其产生抗体的抗原。

在本发明中，目标抗原可以是天然的或者人工合成的。下文将进一步说明目标抗原。

T细胞表位肽和目标抗原共价偶联或融合表达，因此，这种共价偶联或融合表达的抗原在本发明中也称为本发明的人工抗原。如果抗原已经天然含有T细胞表位，则该抗原可以不和T细胞表位肽共价偶联或融合表达，也可以进一步和另外的T细胞表位肽共价偶联或融合表达。

在本发明这些方法中，优选地，使用T细胞表位肽的免疫发生在目标抗原免疫之前。

在本发明中，所述抗体可以是单克隆抗体或者多克隆抗体，优选单克隆抗体。

优选地，所述T细胞表位肽免疫可以增强共价偶联或融合表达该表位肽的目标抗原的免疫原性，和/或缩短抗所述抗原的抗体产生的时间和/或提高所述抗体的滴度。

在另一方面，本发明还涉及一种增强免疫的方法，其中：在个体接触目标抗原之前、同时、和/或之后，用目标抗原中所含的T细胞表位肽免疫个体，其中，所述免疫优选发生在个体接触目标抗原之前。

在另一方面，本发明还涉及一种预防或治疗由抗原导致或参与的疾病的方法，其中：以T细胞表位肽免疫动物或人体，随后、同时或预先用天然含有T细胞表位的目标抗原或者共价偶联或融合表达该T细胞表位肽的目标抗原免疫同一动物或人体，其中优选地，使用T细胞表位肽的免疫发生在目标抗原免疫之前。

相应的，本发明还涉及T细胞表位肽和与该表位肽共价偶联或融合表达的目标抗原联合一起在制备药物中的用途，该药物用于预防或治疗由抗原导致或参与的疾病。

在本发明上述方法的一个实施方案中，本发明所述T细胞表位肽为不超过大约15个(例如5-10个，例如10、11、12、13、14、15个)氨基酸的多肽，或数个(2-20个，如2-10个，包括2、3、4、5、6、7、8、9个)此类多肽的共价偶联或者融合产物，该类多肽可以特异性地激活宿主T细胞免疫应答。

在本发明上述方法的另一个实施方案中，所述免疫采用的T细胞表位肽和目标抗原是蛋白质形式或者是编码此蛋白质的核酸形式，其中优选地所述目标抗原是戊型肝炎病毒或者AIV抗原，更优选地是戊型肝炎病毒(HEV)的包膜蛋白HEV 239或其变体或片段，其中优选地所述抗原性疾病由戊型肝炎病毒引起。

在另一方面，本发明还涉及T细胞表位肽，其包含(或者由如下序列组成)：

(a)SEQ ID NO：1或者7所示的序列；

(b)SEQ ID NO：1或者7所示序列的保守性变异体，其中，所述保守性变异体的氨基酸序列与SEQ ID NO：1或者7之氨基酸序列相比，存在一个或多个(优选地，1-10个，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100个)保守性氨基酸的替换、添加和/或删除；或

(c)(a)或者(b)所述序列的活性片段；

其中，所述保守性变异体和活性片段能保持与H-2d型主要组织相容性复合物分子的特异性结合，或者能够特异性地激活宿主T细胞免疫应答。

优选地，所述表位肽优选长大约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、200、250、300、350、400个氨基酸，更优选地所述表位肽来源于含有选自SEQ ID NO：1-7的序列的天然序列，例如不超过15个氨基酸的多肽。

在一个实施方案中，本发明的T细胞表位肽包含SEQ ID NO：5，非必需地在SEQ ID NO：5的N端或者C端或者两端可添加有一个或者多个(优选地，1-10个，1-20个，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100个)另外的氨基酸残基，该氨基酸残基优选来源于含有序列SEQ ID NO：5的天然序列。或者，本发明的T细胞表位肽由SEQ ID NO：5和所述在SEQ ID NO：5的N端或者C端或者两端非必需地添加的氨基酸残基组成。

在一个实施方案中，本发明的T细胞表位肽包含SEQ ID NO：7，非必需地在SEQ ID NO：7的N端或者C端或者两端可添加有一个或者多个(优选地，1-10个，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100个)另外的氨基酸残基，该氨基酸残基优选来源于含有序列SEQ ID NO：7的天然序列。或者，本发明的T细胞表位肽由SEQ ID NO：7和所述在SEQ ID NO：7的N端或者C端或者两端非必需地添加的氨基酸残基组成。

在一个实施方案中，本发明的T细胞表位肽包含(或者由如下序列组成)下列序列之一：SEQ ID NO：1-7的序列，优选SEQ ID NO：1-4的序列；或者它们在对应于SEQ ID NO：1第6位的苯丙氨酸(F)突变成缬氨酸(V)、和/或在对应于SEQ ID NO：1第7位的缬氨酸(V)突变成天冬氨酸(D)、和/或在对应于SEQ ID NO：1第14位的亮氨酸(L)突变成蛋氨酸(M)之后的相应序列。

在另一方面，本发明还涉及数个(1-10个如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个，或者15、20个或者更多)本发明的T细胞表位肽的共价偶联物或串联物(融合蛋白)，例如氨基酸序列HSKTF FVLPL RGKLSFWEAG(SEQ ID NO：15)。

在另一方面，本发明还涉及包含编码本发明所述的T细胞表位或者共价偶联物或串联物的核酸分子。

在另一方面，本发明还涉及包含本发明所述核酸分子的载体。

在另一方面，本发明还涉及用本发明所述的载体转化的宿主细胞。

在另一方面，本发明还涉及包含本发明所述的T细胞表位或者共价偶联物或串联物、或本发明的核酸分子、或本发明的载体、或本发明的宿主的免疫原性组合物，其中优选地所述免疫原性组合物是疫苗，所述免疫原性组合物还可包含可药用载体，所述免疫原性组合物优选地还包含佐剂，所述佐剂优选是弗氏完全佐剂或铝佐剂。

在另一方面，本发明还涉及人工抗原，其包含本发明所述的T细胞表位或者共价偶联物或串联物和与该T细胞表位或者共价偶联物或串联物共价偶联或融合的目标抗原。

优选地，目标抗原可以是蛋白质抗原例如非颗粒蛋白抗原，或者糖抗原；当目标抗原是蛋白质时，优选该T细胞表位目标抗原融合构成融合蛋白。

在一个实施方案中，所述目标抗原是一个或者数个B细胞表位。优选地，所述B细胞表位优选是待针对其产生免疫应答的目标抗原的B细胞表位。

在一个实施方案中，所述目标抗原是病毒抗原、细菌抗原、肿瘤抗原，例如HEV抗原或者AIV抗原，优选地是戊型肝炎病毒(HEV)的包膜蛋白HEV 239或其变体或片段。

在另一方面，本发明还涉及含有本发明的人工抗原的免疫原性组合物，其中优选地所述免疫原性组合物是疫苗，所述免疫原性组合物还可包含可药用载体，所述免疫原性组合物优选地还包含佐剂，所述佐剂优选是弗氏完全佐剂或铝佐剂。

在另一方面，本发明还涉及联合制剂或者试剂盒，其包含：

(a)本发明所述的T细胞表位或者共价偶联物或串联物、或本发明的核酸分子、或本发明的载体、或本发明的宿主、或本发明的免疫原性组合物，和

(b)本发的人工抗原或本发明的免疫原性组合物，

所述(a)和(b)组分混合在一起或者彼此分开放置。

在另一方面，本发明还涉及T细胞表位例如本发明所述的T细胞表位或者共价偶联物或串联物、或本发明的核酸分子、或本发明的载体、或本发明的宿主、或本发明的免疫原性组合物、或本发明的人工抗原、或本发明的免疫原性组合物在制备抗体或者免疫动物或者提高目标抗原免疫原性或者提高抗体产生的速度或者提高产生抗体的滴度或者预防或治疗由抗原导致或参与的疾病的方法中的用途。

在另一方面，本发明还涉及T细胞表位例如本发明所述的T细胞表位或者共价偶联物或串联物、或本发明的核酸分子、或本发明的载体、或本发明的宿主、或本发明的免疫原性组合物、或本发明的人工抗原、或本发明的免疫原性组合物在制备免疫原性制剂或者药物中的用途，所述免疫原性制剂或者药物用于制备抗体或者免疫动物或者提高目标抗原免疫原性或者提高抗体产生的速度或者提高产生抗体的滴度或者预防或治疗由抗原导致或参与的疾病。

在另一方面，本发明还涉及T细胞表位例如本发明所述的T细胞表位或者共价偶联物或串联物、或本发明的核酸分子、或本发明的载体、或本发明的宿主、或本发明的免疫原性组合物在制备本发明的人工抗原中的用途。

在另一方面，本发明还涉及T细胞表位例如本发明所述的T细胞表位或者共价偶联物或串联物、或本发明的核酸分子、或本发明的载体、或本发明的宿主、或本发明的免疫原性组合物、或本发明的人工抗原、或本发明的免疫原性组合物在制备本发明的联合制剂或者试剂盒中的用途。

本发明还涉及与这里公开的序列SEQ ID NO：1-8和14-16中的任何一个具有至少70％，优选80％、85％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的序列。同源性的确定可通过本领域已知的方法进行。

为了更清楚的理解本发明，给出以下术语的定义。

由抗原导致或参与的疾病在本文中指由于抗原在宿主中引起的疾病或病症或者抗原所参与的疾病或病症，包括但不限于，由外来抗原引起的疾病，例如细菌和真菌感染、寄生虫疾病、变态反应，由内源抗原引起的疾病，例如自身免疫病。罹患抗原性疾病的个体将得以于本发明采用所述抗原所包含的T细胞表位进行的免疫。

蛋白质在本文中仅就蛋白质的一级结构而言，而不旨在指其长度，因此，在本文中，如果适当的话，“肽”、“多肽”和“蛋白质”可以互换使用。

核酸序列在本文中不仅包括脱氧核糖核酸序列、核糖核酸序列，也包括其类似物，例如包含天然核苷的类似物和/或磷酸二酯键的类似物。

作为本发明的一个非限制性的实例，本发明人从戊型肝炎病毒(HEV)的包膜蛋白HEV 239(ORF2AA368-AA606，氨基酸序列为：

IALTLFNLADTLLGGLPTELISSAGGQLFYSRPVVSANGEPTVKLYTSVENAQQDKGIAIPHDIDLGESRVVIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQSTYGSSTGPVYVSDSVTLVNVATGAQAVARSLDWTKVTLDGRPLSTIQQHSKTFFVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQLLVENAAGHRVAISTYTTSLGAGPVSISAVALAPPPR；SEQ ID NO：18)中筛选鉴定到两个H-2^d限制性优势Th表位：P34(ORF2 AA532-AA546)和P35(ORF2 AA537-AA551)。P34与P35虽然重叠10个氨基酸，它们识别具有不同TCR受体的T细胞群，即P34和P35为两个独立的T细胞表位。以P34或P35肽初免BALB/c小鼠后可提高与P34或P35偶联的多肽或蛋白的免疫原性，缩短抗体产生的时间并提高抗体的滴度。

附图说明：

图1显示不同肽库刺激HEV 239免疫小鼠脾细胞的IFN-γ-ELISPOT分析结果。

图2显示不同肽段刺激HEV 239免疫小鼠脾细胞的IFN-γ-ELISPOT分析结果

图3显示剔除CD4⁺或CD8⁺细胞后的脾细胞对P34肽刺激的ELISPOT分析。

图4显示P34(图A)或P2(图B)免疫小鼠脾细胞对HEV 239及P34应答的IFN-γ-ELISPOT分析。

图5显示IFN-γ-ELISPOT分析P34截短肽对免疫小鼠脾细胞的刺激效果。

图6显示IFN-γ-ELISPOT分析P35与P34-10对免疫小鼠脾细胞的刺激效果代表图。

图7显示P34、P35肽对P34、P35肽免疫小鼠脾细胞的刺激效果。

图8显示混合CFA的P34、P35初免对E2免疫原性的影响。图中“●”代表P34-CFA初免小鼠；“▲”代表P 35-CFA初免小鼠；“○”代表P18-CFA初免小鼠；其中每一条曲线为同一只小鼠在不同时间点的抗体滴度变化曲线。

图9显示Al佐剂吸附的P34同时或随后免疫对E2免疫原性的影响。

图10显示P34-P35-CFA预免诱导多肽抗体的快速产生。

图11显示239突变蛋白的SDS-PAGE图。其中：A：239(PBS复性)；B：ls-ms(PBS复性)；C：ls-ms(AMS复性)；D：v-d(PBS复性)；E：v-d(AMS复性)；F：f-v(PBS复性)；G：f-v(AMS复性)

图12显示Western-Blotting检测239突变蛋白与8C11抗体的反应性。其中：A：239(PBS复性)；B：ls-ms(PBS复性)；C：ls-ms(AMS复性)；D：V-d(PBS复性)；E：v-d(AMS复性)；F：f-v(PBS复性)；G：f-v(AMS复性)。其中，8C11抗体为本实验室制备的HEV E2蛋白的单克隆抗体，是针对E2中和表位的单抗，该表位在HEV239中亦存在。

图13显示ELISA检测239突变蛋白的免疫反应性。

图14显示239免疫小鼠脾细胞对239突变蛋白应答的IFN-γ-ELISPOT分析。

序列说明：

SEQ ID NO：	说明
		1	P34
2	P34-14

3	P34-13
		4	P34-12
5	P34-11
		6	P34-10
7	P35
		8	P18
9	定点突变用引物
		10	定点突变用引物
11	定点突变用引物
		12	定点突变用引物
13	定点突变用引物
		14	模拟禽流感病毒(AIV)B细胞表位的9肽(序列为CHGMLPVYC)
15	P34和P35融合肽，共20个氨基酸“HSKTF FVLPL RGKLS FWEAG”
		16	B细胞表位的9肽和P34肽及P35肽融合产生的29肽(序列为HSKTFFVLPL RGKLS FWEAG CHGML PVYC)
17	8H5A：HEV239的C端通过连接肽与9肽融合
		18	HEV 239蛋白
19	HEV E2蛋白

实施例

实施例1：HEV 239的H-2^d限制性T细胞表位的筛选

1)肽库的合成：

合成覆盖HEV 239蛋白(氨基酸序列为：

IALTLFNLADTLLGGLPTELISSAGGQLFYSRPVVSANGEPTVKLYTSVENAQQDKGIAIPHDIDLGESRVVIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQSTYGSSTGPVYVSDSVTLVNVATGAQAVARSLDWTKVTLDGRPLSTIQQHSKTFFVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQLLVENAAGHRVAISTYTTSLGAGPVSISAVAVLAPPPR；SEQ ID NO：18)全长的15氨基酸肽库(西安美联公司，70％纯度)，相邻肽相互重叠10个氨基酸，即从N端的-1位开始(注：在重组表达HEV 239蛋白时在该蛋白质的N端之前额外添加了甲硫氨酸残基，此-1位指的是该甲硫氨酸)，每隔5个氨基酸起始合成一条肽，共46条肽。各肽自N端开始依次被命名为P1-P46，以DMSO溶解各多肽，分别配置浓度为10mg/mL的储存液。其中每4-7条肽混合在一起组成子肽库，共组成14个子肽库(表1)。

                      表1肽库的组成

Libraries	H	I	J	K	L	M	N
								A	P1	P2	P3	P4	P5	P6	P7
B	P8	P9	P10	P11	P12	P13	P14
								C	P15	P16	P17	P18	P19	P20	P21
D	P22	P23	P24	P25	P26	P27	P28
								E	P29	P30	P31	P32	P33	P34	P35
F	P36	P37	P38	P39	P40	P41	P42
								G	P43	P44	P45	P46

2)小白鼠：

无特殊病原体(SPF)级BALB/c小鼠，雌性，6～8周龄，购自厦门大学实验动物中心，并在该中心饲养。

3)疫苗及免疫：

将纯化的HEV 239蛋白(北京万泰生物药业有限公司提供)与等体积完全弗氏佐剂(CFA，Sigma公司)混合，制备成0.5mg/mL浓度的疫苗(239-CFA)，以100μL/鼠的剂量腹股沟以及颈部皮下免疫小鼠，两周后加强一次，加强后第10天取小鼠脾脏，分离脾细胞检测。以生理盐水与CFA混合的疫苗(NS-CFA)作为阴性对照疫苗。

4)小鼠脾脏细胞分离：

取免疫后小鼠脾脏，2mL注射器研磨，200目筛网过滤，5％PBS(磷酸缓冲液)洗涤后离心，3mL红细胞裂解液(含0.15M NH₄Cl；10mMKHCO₃；0.1mM Na₂EDTA；pH 7.2-7.4)室温处理3min，加入50mL PBS，离心，PBS洗涤后将脾细胞重悬于10％1640(含10％胎牛血清、1％非必需氨基酸、50μmoL/L β-巯基乙醇、2mmoL/L谷氨酰胺、1mmoL/L丙酮酸钠、10mmoL/L Hepes、100U/mL青霉素钠、100U/mL硫酸链霉素)，细胞浓度调整为1×10⁷/mL。

5)IFN-γ-ELISPOT检测：

按照试剂盒(BD^TM ELISPOT SET)说明书进行。简言之：(a)以抗-鼠IFN-γ抗体100μL/孔(5μg/mL)包被ELISPOT 96孔板。(b)4℃孵育12小时后，各孔以含10％FBS的1640培养液室温封闭两小时；(c)每孔接种小鼠脾细胞1×10⁶个/200μL，刺激抗原分别采用10μg/mL HEV239蛋白，A-G肽库(其中每种肽的终浓度为5μg/mL)，10μg/mL单独肽或10μg/mL BSA，每个样品作3个复孔。阳性或阴性对照孔则分别加入2μg/mL ConA或单纯培养液。37℃静置培养24h；(d)各孔洗涤后加入生物素化抗鼠IFN-γ抗体，100μL/孔(2.5ug/mL)，室温反应2h；(e)各孔洗涤后加入链霉亲合素-HRP，100μL/孔(5μg/mL)，室温反应2h；(f)洗涤后加入HRP底物AEC，避光显色，以水冲洗终止，晾干；(7)以ImmunoSpot(Cellular Technolgy Ltd.公司)进行计数和数据处理。以斑点数/10⁶脾细胞(Spots/10⁶spleen cells)为单位，阴性孔＜10Spots/10⁶脾细胞，实验孔大于2倍阴性孔斑点数者为阳性。

6)筛选结果：

239-CFA免疫鼠对肽库E、M反应强烈，每10⁶个脾细胞中的斑点数超过300个；对肽库A、B、F、H、I、K、N有中等强度的反应(50～150Spots/10⁶脾细胞)；对肽库C、D、G、J、L几乎无反应(＜20Spots/10⁶脾细胞)(图1)。将具有中等程度以上反应的肽库内包含的肽单独刺激239-CFA免疫鼠脾细胞，结果表明肽P34的刺激效果最好(413Spots/10⁶脾细胞)，为HEV 239的优势H-2^d限制性(因为该表位的刺激效果显著强于其它肽端)T细胞表位；肽P35的刺激效果较好(76.5Spots/10⁶脾细胞)，为HEV 239的另一优势H-2^d限制性T细胞表位(图2)。

实施例2：HEV 239优势H-2^d限制性T细胞表位的T细胞限制性分析

1)疫苗制备、免疫BALB/c鼠方法同实施例1。

2)剔除小鼠脾细胞中的CD4⁺T细胞或CD8⁺T细胞：

参照Miltenyi公司产品130-049-201和产品130-049-401的操作手册，取10⁷新鲜分离的小鼠脾细胞，洗涤后重悬于90μL染色缓冲液中，加入10μL与抗鼠CD4或抗鼠CD8抗体连接的磁珠，通过磁场分离，得到剔除CD4⁺T细胞或CD8⁺T细胞的小鼠脾细胞，重悬，计数，调整细胞浓度为1×10⁷/mL。

3)IFN-γ-ELISPOT检测：

方法同实施例1，不同之处仅在于(c)步骤：每孔接种小鼠脾细胞或剔除CD4⁺T细胞或CD8⁺T细胞的小鼠脾细胞1×10⁶个/200μL，刺激抗原采用10μg/mL P34，每个样品作3个复孔。阳性或阴性对照孔则分别加入2μg/mL ConA或10μg/mL P2肽。

4)检测结果：

当CD8⁺细胞被剔除之后，脾细胞对P34的反应没有发生明显变化；而当CD4⁺细胞被剔除之后，脾细胞对P34的反应显著下降，说明P34表位为CD4⁺T细胞表位(Th表位)(图3)。以10μg/mL P2肽作为阴性对照，结果均显示为阴性。

实施例3：P34免疫BALB/c鼠诱导的细胞免疫应答

1)疫苗及免疫：

将70％纯度的P34或P2肽与等体积完全弗氏佐剂(CFA，Sigma公司)混合，制备成1mg/mL浓度的疫苗，以100μL/鼠的剂量腹股沟以及颈部皮下免疫小鼠，两周后加强一次，加强后第10天取小鼠脾脏，分离脾细胞检测。

2)剔除小鼠脾细胞中的CD4⁺T细胞或CD8⁺T细胞、IFN-γ-ELISPOT检测方法同实施例2。

3)检测结果：

经P34-CFA免疫可激活大量P34肽特异性T细胞，体外经P34或HEV239蛋白刺激可产生大量IFN-γ。将CD4⁺T细胞从脾细胞中剔除后，脾细胞经P34或HEV 239蛋白刺激的反应下降到本底水平，而剔除CD8⁺T细胞的脾细胞则几乎保持剔除前的应答水平，说明该抗原特异性T细胞基本上都是CD4⁺Th细胞。P2-CFA免疫的小鼠对P34或HEV 239蛋白刺激及P34-CFA免疫小鼠对P2肽均无反应，说明该应答的特异性(图4)。实施例4：P34肽表位中MHC II分子结合区域的分析

1)多肽合成：

合成分别从N端逐个氨基酸截短的P34肽(表2，西安美联公司，95％纯度)，以DMSO溶解多肽配置浓度为10mg/mL的储存液。

                表2  P34截短肽的序列

Peptides	SEQ ID NO.	Sequence
			P34	1	HSKTF FVLPL RGKLS
P34-14	2	SKTF FVLPL RGKLS
			P34-13	3	KTF FVLPL RGKLS
P34-12	4	TF FVLPL RGKLS
			P34-11	5	F FVLPL RGKLS
P34-10	6	FVLPL RGKLS
			P35	7	FVLPL RGKLS FWEAG
P18	8	PTPSP APSRP FSVLR

2)疫苗制备、免疫BALB/c小鼠方法同实施例1。

3)IFN-γ-ELISPOT检测：

方法同实施例1，不同之处仅在于(c)步骤：每孔接种小鼠脾细胞1×10⁶个/200μL，刺激抗原分别采用10μg/mL表2中的各肽，每个样品作3个复孔。

4)检测结果：

当P34肽从N端截至第5个氨基酸时，即P34-11肽的刺激活性开始下降，约为原始活性的90％；截至第6个氨基酸时，P34-10肽活性则明显减少，约占P34活性的26％(图5)，该结果表明P34肽中与MHC II分子结合的关键区域在于其C端的12个氨基酸，即“TF FVLPLRGKLS”。P34-10肽即为P34肽与P35肽相互重叠的10个氨基酸，然而与P35肽的刺激效果相比，虽然产生IFN-γ的T细胞频数差不多，但经P35刺激后T细胞产生的斑点较大(图6)。

实施例5：P34肽与P35肽识别不同的TCR受体

1)疫苗及免疫：

将70％纯度的P34或P35肽与等体积完全弗氏佐剂(CFA，Sigma公司)混合，制备成1mg/mL浓度的疫苗(239-CFA)，以100μL/鼠的剂量腹股沟以及颈部皮下免疫小鼠，两周后加强一次，加强后第10天取小鼠脾脏，分离脾细胞检测。

2)疫苗制备、免疫BALB/c小鼠方法同实施例1。

3)IFN-γ-ELISPOT检测：

方法同实施例1，不同之处仅在于(c)步骤：每孔接种小鼠脾细胞1×10⁶个/200μL，刺激抗原分别采用10μg/mL P34或P35，每个样品作3个复孔。

4)检测结果：

P34肽免疫小鼠的脾细胞对P35肽反应微弱(12Spots/10⁶脾细胞)，P35肽免疫小鼠的脾细胞对P34肽反应也很微弱(23.5Spots/10⁶脾细胞)(图7)，说明P34和P35肽尽管重叠10个氨基酸，它们分别识别带有不同TCR受体的T细胞群。

实施例6：与CFA混合的P34、P35肽可增强E2蛋白的免疫原性

1)疫苗及免疫：

将70％纯度的P34、P35或P18肽与等体积完全弗氏佐剂(CFA，Sigma公司)混合，制备成1mg/mL浓度的疫苗，以100μL/鼠的剂量腹股沟以及颈部皮下免疫小鼠，四周后免疫铝佐剂吸附的HEV E2蛋白(为从N端截短26个氨基酸的HEV 239，序列为QLFYSRPVVSANGEPTVKLYTSVENAQQDKGIAIPHDIDLGESRVVIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQSTYGSSTGPVYVSDSVTLVNVATGAQAVARSLDWTKVTLDGRPLSTIQQHSKTFFVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQLLVENAAGHRVAISTYTTSLGAGPVSISAVAVLAPPPR；SEQ ID NO：19)(北京万泰生物药业有限公司提供)，每只小鼠腹腔免疫5μg、10μg或20μg E2蛋白，分别于E2免疫后的第0、1、2、3、4周采血检测抗HEV抗体滴度。

2)ELISA方法检测抗HEV抗体滴度：

以HEV 239蛋白包板，4℃过夜，加入100μL系列稀释的血清，37℃半小时后加入HRP标记的羊抗鼠二抗，显色，检测450nm的吸光度。

3)检测结果：

与HEV 239相比，E2的N端短缺26个氨基酸而C端相同。E2为多聚体，其免疫原性比HEV 239低240倍。P34和P35肽分别位于HEV ORF2的AA533-AA547和AA538-AA552，均包含于E2蛋白内。结果表明在5μgE2组，P34初免的5只小鼠中有2只(40％)鼠可于E2免疫后的第2周检测到抗体，而P35和P18初免的小鼠均无抗体产生(图8A)；在10μgE2组，P34初免的全部4只小鼠(100％)均可于E2免疫后的第2周检测到抗体，而P35初免的5只小鼠中有1只(20％)鼠可检测到低滴度抗体，P18初免的小鼠均无抗体产生(图8B)；在20μg E2组，P34初免的全部5只小鼠(100％)均可于E2免疫后的第2周检测到抗体，而P35初免的5只小鼠中有3只(60％)鼠可检测到抗体，P18初免的小鼠均无抗体产生(图8C)。在相同剂量E2组内，P34初免小鼠的抗体滴度高于P35初免的小鼠。

实施例7：铝佐剂吸附的P34可增强E2蛋白的免疫原性

1)疫苗及免疫：

向每只小鼠腹腔免疫20μg铝佐剂吸附的E2蛋白(北京万泰生物药业有限公司提供)，同时(P34-E2组)或12小时后(E2-P34组)将1mg/mL铝佐剂吸附的70％纯度的P34疫苗，以100μL/鼠的剂量皮下免疫小鼠，分别于E2免疫后的第0、2周采血检测抗HEV抗体滴度。

2)抗HEV抗体滴度检测方法同实施例6。

3)检测结果：

在免疫后的第2周，E2-P34组的6只小鼠中有3只(50％)可检测到抗体，P34-E2组的6只小鼠中有5只(83.3％)可检测到抗体，单纯免疫E2的6只小鼠无一产生抗体(图9)，说明铝佐剂吸附的P34可增强E2蛋白的免疫原性。

实施例8：P34-P35-CFA预免快速诱导抗多肽抗体的产生

1)多肽的合成：

噬菌体9肽库中筛选出来的模拟禽流感病毒(AIV)B细胞表位的9肽(序列为CHGMLPVYC)(SEQ ID NO：14)，在其N端融合P34肽和P35肽共20个氨基酸“HSKTF FVLPL RGKLS FWEAG”(SEQ ID NO：15)，由此构成的29肽(序列为HSKTF FVLPL RGKLS FWEAG CHGMLPVYC)(SEQ ID NO：16)由西安美联公司合成(粗品未纯化)。

2)疫苗及免疫：

将CFA吸附的70％纯度的“HSKTF FVLPL RGKLS FWEAG”(SEQ ID NO：15)制备成1mg/mL浓度的疫苗，以100μL/鼠的剂量皮下免疫小鼠。3周后，同样的方法将合成的29肽制备成1mg/mL浓度的疫苗，以100μL/鼠的剂量皮下免疫小鼠。分别于29肽免疫后的第0、3周采血检测抗9肽抗体滴度。

3)抗9肽抗体滴度检测：

利用HEV239类病毒颗粒系统，表面融合展示噬菌体9肽库中筛选出来的模拟AIV表位的9肽，即在HEV239的C端通过连接肽与9肽融合表达，将此蛋白命名为8H5A(序列为

IALTLFNLADTLLGGLPTELISSAGGQLFYSRPVVSANGEPTVKLYTSVENAQQDKGIAIPHDIDLGESRVVIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQSTYGSSTGPVYVSDSVTLVNVATGAQAVARSLDWTKVTLDGRPLSTIQQHSKTFFVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQLLVENAAGHRVAISTYTTSLGAGPVSISAVAVLAPPPRGGGGSGGGGSCHGMLPVYC；SEQ ID NO：17)。以8H5A蛋白包板(5μg/ml)，ELISA方法检测抗9肽抗体。

4)检测结果：

在29肽免疫后的第3周，免疫的4只小鼠中有3只(75％)检测到抗体的滴度较高(图10)。图10中图例代表血清稀释度。

实施例9：定点突变239内T表位对T表位活性及239蛋白抗原反应性的影响

1)定点突变239蛋白：针对239蛋白中的T细胞表位进行3引物2轮PCR定点突变。分别是239(SEQ ID NO：18)的第178个氨基酸(相对于P34的第14位)亮氨酸(L)突变成蛋氨酸(M)(ls-ms)；第170个氨基酸(相对于P34的第6位)苯丙氨酸(F)突变成缬氨酸(V)(f-v)；第171个氨基酸(相对于P34的第7位)缬氨酸(V)突变成天冬氨酸(D)(v-d)。

I.PCR引物设计：

upper-primer(SEQ ID NO：9)：

5′-CAT ATG ATA GCG CTT ACC CTG Tm：57.9

lower-primer(SEQ ID NO：10)：

5′-GAA TTC TTA GCG CGG AGG GGG G Tm：67.4

mid-primer(ls-ms)(SEQ ID NO：11)：

5′-G CCG CTC CGC GGT AAG ATG TCC TTT TGG GAG GCAGGT

mid-primer(f-v)(SEQ ID NO：12)：

5′-C CAG CAG CAT TCA AAG ACC TTC GTT GTC CTG CCG CT

mid-primer(v-d)(SEQ ID NO：13)：

5′-T CAA AGA CCT TCT TTG ACC TGC CGC TCC G

II.100μL PCR体系：

第一轮PCR：

1μL templete-239(即用于表达HEV 239疫苗的质粒DNA)；1μL rTaq；

1μL dNTP；10μL 10×PCR  buffer；2.5μL Mid-primer；2.5μLlower-primer；82μL ddH₂O。

12循环，OMEGA^TM柱回收。

第二轮PCR：

1μL templete-239；1μL rTaq；1μL dNTP；10μL 10×PCR buffer；4μL第一轮PCR产物作为引物；2.5μL upper-primer；80.5μL ddH₂O。

12循环，胶回收，按OMEGA^TM试剂盒。

III.包涵体洗涤方法：

20mL裂解液(10mM Tris-Cl，pH 7.2；10mM EDTA，Ph 8.0；300mM NaCl)重悬菌体；冰水浴超声5分钟，打2秒停5秒，功率750W；8000g 10℃离心10分钟；

【以buffer I(20mMTris-Cl，pH8.5；5mM EDTA，pH 8.0；100mMNaCl)+2％triton重悬；37℃ 225rpm摇床摇30分钟；8000g 10℃离心10分钟；buffer I重悬；37℃ 225rpm摇床摇30分钟；8000g 10℃离心10分钟】重复2次。

以buffer I+2M尿素重悬；37℃225rpm摇床摇30分钟；8000g 10℃离心10分钟；收集上清；buffer I+4M尿素重悬；37℃225rpm摇床摇30分钟；8000g 10℃离心10分钟；收集上清；buffr I+8M尿素重悬；37℃225rpm摇床摇30分钟；8000g 10℃离心10分钟；收集上清。以SDS-PAGE鉴定目标蛋白洗于哪一梯度尿素中。

IV.包涵体复性方法：

方法a)PBS复性方法：

包涵体置于透析袋4℃以PBS透析复性；每6小时换液一次，共3次。透析中止后以12000g 10℃离心10分钟，收集上清。

方法b)AMS(硫酸铵)复性方法：

将包涵体与4M尿素+1M硫酸铵+1×buffer I等体积混合，装入透析袋中；

在2M尿素+0.5M硫酸铵+1×PBS(事先放于37℃平衡)37℃透析2小时；

在1M尿素+0.5M硫酸铵+1×PBS(事先放于37℃平衡)37℃透析2小时；

在0.5M硫酸铵+1×PBS(事先放于37℃平衡)37℃透析2小时；

在1×PBS 4℃透析，每6小时换液一次，共3次。

V.所得蛋白性质：

a)SDS-PAGE出现明显单体带和双体带(图11)：

b)Western-Blotting检测发现反应性与239蛋白相似(图12)：

2)双抗体夹心ELISA法检测239突变蛋白的免疫反应性：

a)1mg/mL抗体用10mM PB稀释300倍后于聚苯乙烯板中每孔包被100μL。37℃孵育12～16小时。PBST洗一次。

b)加封闭液200μL，37℃孵育2小时。

c)加入一定稀释度的待测抗原样品100μL，37℃孵育1小时。PBST洗5次。

d)加入酶标抗体，37℃孵育30分钟，PBST洗5次。

e)每孔加入显色液A(H₂O₂)，B(TMB)各一滴，37℃避光显色10分钟。

f)每孔加入一滴终止液(2M硫酸)终止反应。

在酶标仪上450nm，620nm双波长处测各孔OD值。

g)检测结果：

发现f-v和ls-ms免疫反应性与239蛋白相似(图13A、B)：

3)疫苗制备、免疫BALB/c鼠方法同实施例1

4)IFN-γ-ELISPOT检测：

方法同实施例1，不同之处仅在于(c)步骤：每孔接种小鼠脾细胞1×10⁶个/200μL，刺激抗原分别采用10μg/mL 239、239fv、239vd、或239ls-ms，每个样品作3个复孔。

5)检测结果：

239fv和239vd的T表位活性明显降低，239ls-ms的T表位活性基本不变(图14)。

                               序列表

<110>厦门大学

<120>用于免疫或制备单克隆抗体的方法和组合物

<130>IDC060045

<160>19

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<400>1

His Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu Arg Gly Lys Leu Ser

1               5                   10                  15

<210>2

<211>14

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu Arg Gly Lys Leu Ser

1               5                   10

<210>3

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<400>3

Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu Arg Gly Lys Leu Ser

1               5                   10

<210>4

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<400>4

Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu Arg Gly Lys Leu Ser

1               5                   10

<210>5

<211>11

<212>PRT

<213>人工序列

<400>5

Phe Phe Val Leu Pro Leu Arg Gly Lys Leu Ser

1               5                   10

<210>6

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<400>6

Phe Val Leu Pro Leu Arg Gly Lys Leu Ser

1               5                    10

<210>7

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<400>7

Phe Val Leu Pro Leu Arg Gly Lys Leu Ser Phe Trp Glu Ala Gly

1               5                   10                  15

<210>8

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<400>8

Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro Phe Ser Val Leu Arg

1               5                   10                  15

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

catatgatag cgcttaccct g                                     21

<210>10

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

gaattcttag cgcggagggg gg                                    22

<210>11

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

 gccgctccgc ggtaagatgt ccttttggga ggcaggt                   37

<210>12

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

ccagcagcat tcaaagacct tcgttgtcct gccgct                    36

<210>13

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

tcaaagacct tctttgacct gccgctccg                            29

<210>14

<211>9

<212>PRT

<213>人工序列

<400>14

Cys His Gly Met Leu Pro Val Tyr Cys

1               5

<210>15

<211>20

<212>PRT

<213>人工序列

<400>15

His Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu Arg Gly Lys Leu Ser Phe

1               5                   10                  15

Trp Glu Ala Gly

            20

<210>16

<211>29

<212>PRT

<213>人工序列

<400>16

His Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu Arg Gly Lys Leu Ser Phe

1               5                   10                  15

Trp Glu Ala Gly Cys His Gly Met Leu Pro Val Tyr Cys

            20                  25

<210>17

<211>258

<212>PRT

<213>人工序列

<400>17

Ile Ala Leu Thr Leu Phe Asn Leu Ala Asp Thr Leu Leu Gly Gly Leu

1               5                   10                  15

Pro Thr Glu Leu Ile Ser Ser Ala Gly Gly Gln Leu Phe Tyr Ser Arg

            20                  25                  30

Pro Val Val Ser Ala Asn Gly Glu Pro Thr Val Lys Leu Tyr Thr Ser

        35                  40                  45

Val Glu Asn Ala Gln Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Pro His Asp Ile

    50                  55                  60

Asp Leu Gly Glu Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn Gln His

65                  70                  75                  80

Glu Gln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro Phe Ser

                85                  90                  95

Val Leu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala Ala Glu

            100                 105                 110

Tyr Asp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr Val Ser

        115                 120                 125

Asp Ser Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala Val Ala

    130                 135                 140

Arg Ser Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro Leu Ser

145                 150                 155                 160

Thr Ile Gln Gln His Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu Arg Gly

                165                 170                 175

Lys Leu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr Pro Tyr

            180                 185                 190

Asn Tyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu Val Glu Asn Ala Ala

        195                 200                 205

Gly His Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Gly Ala Gly

    210                 215                 220

Pro Val Ser Ile Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro Pro Pro Arg Gly

225                 230                 235                 240

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys His Gly Met Leu Pro Val

                245                 250                 255

Tyr Cys

<210>18

<211>239

<212>PRT

<213>HEV

<400>18

Ile Ala Leu Thr Leu Phe Asn Leu Ala Asp Thr Leu Leu Gly Gly Leu

1               5                   10                  15

Pro Thr Glu Leu Ile Ser Ser Ala Gly Gly Gln Leu Phe Tyr Ser Arg

            20                  25                  30

Pro Val Val Ser Ala Asn Gly Glu Pro Thr Val Lys Leu Tyr Thr Ser

        35                  40                  45

Val Glu Asn Ala Gln Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Pro His Asp Ile

    50                  55                  60

Asp Leu Gly Glu Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn Gln His

65                  70                  75                  80

Glu Gln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro Phe Ser

                85                  90                  95

Val Leu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala Ala Glu

            100                 105                 110

 Tyr Asp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Val Tyr Val Ser

         115                 120                 125

 Asp Ser Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Ala Val Ala

     130                 135                 140

 Arg Ser Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro Leu Ser

 145                 150                 155                 160

 Thr Ile Gln Gln His Ser Lys Thr Phe Phe Val Leu Pro Leu Arg Gly

                 165                 170                 175

Lys Leu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr Pro Tyr

            180                 185                 190

Asn Tyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu Leu VAl Glu Asn Ala Ala

        195                 200                 205

Gly His Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Ser Leu Gly Ala Gly

    210                 215                 220

Pro Val Ser Ile Ser Ala Val Ala Val Leu Ala Pro Pro Pro Arg

225                 230                 235

<210>19

<211>213

<212>PRT

<213>HEV

<400>19

Gln Leu Phe Tyr Ser Arg Pro Val Val Ser Ala Asn Gly Glu Pro Thr

1               5                   10                  15

Val Lys Leu Tyr Thr Ser Val Glu Asn Ala Gln Gln Asp Lys Gly Ile

            20                  25                  30

Ala Ile Pro His Asp Ile Asp Leu Gly Glu Ser Arg Val Val Ile Gln

        35                  40                  45

Asp Tyr Asp Asn Gln His Glu Gln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala

    50                  55                  60

Pro Ser Arg Pro Phe Ser Val Leu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu

65                  70                  75                  80

Ser Leu Thr Ala Ala Glu Tyr Asp Gln Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Thr

                85                  90                  95

Gly Pro Val Tyr Val Ser Asp Ser Val Thr Leu Val Asn Val Ala Thr

            100                 105                 110

Gly Ala Gln Ala Val Ala Arg Ser Leu Asp Trp Thr Lys Val Thr Leu

         115                120                 125

Asp Gly Arg Pro Leu Ser Thr Ile Gln Gln His Ser Lys Thr Phe Phe

    130                 135                 140

Val Leu Pro Leu Arg Gly Lys Leu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr

145                 150                 155                 160

Lys Ala Gly Tyr Pro Tyr Asn Tyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Leu

                165                 170                 175

Leu Val Glu Asn Ala Ala Gly His Arg Val Ala Ile Ser Thr Tyr Thr

            180                 185                 190

Thr Ser Leu Gly Ala Gly Pro Val Ser Ile Ser Ala Val Ala Val Leu

        195                 200                 205

Ala Pro Pro Pro Arg

    210

Claims (23)

1.一种制备抗体或者免疫动物或者提高目标抗原免疫原性或者提高抗体产生的速度或者提高产生抗体的滴度的方法，其中：以T细胞表位肽免疫动物或人体，随后、同时或预先用天然含有T细胞表位的目标抗原或者共价偶联或融合表达该T细胞表位肽的目标抗原免疫同一动物或人体，

其中，优选地，使用T细胞表位肽的免疫发生在目标抗原免疫之前，

其中，所述抗体可以是单克隆抗体或者多克隆抗体，且

其中，优选地，所述T细胞表位肽免疫可以增强共价偶联或融合表达该表位肽的目标抗原的免疫原性，和/或缩短抗所述抗原的抗体产生的时间和/或提高所述抗体的滴度。

2.一种增强免疫的方法，其中：在个体接触目标抗原之前、同时、和/或之后，用目标抗原中所含的T细胞表位肽免疫个体，其中，所述免疫优选发生在个体接触目标抗原之前。

3.一种预防或治疗由抗原导致或参与的疾病的方法，其中：以T细胞表位肽免疫动物或人体，随后、同时或预先用天然含有T细胞表位的目标抗原或者共价偶联或融合表达该T细胞表位肽的目标抗原免疫同一动物或人体，其中优选地，使用T细胞表位肽的免疫发生在目标抗原免疫之前。

4.权利要求1-3之任一项的方法，其中所述T细胞表位肽为不超过大约15个(例如5-10个，例如10、11、12、13、14、15个)氨基酸的多肽，或数个(2-20个，如2-10个，包括2、3、4、5、6、7、8、9个)此类多肽的共价偶联或者融合产物，该类多肽可以特异性地激活宿主T细胞免疫应答。

5.权利要求4的方法，其中所述免疫采用的T细胞表位肽和目标抗原是蛋白质形式或者是编码此蛋白质的核酸形式，其中优选地所述目标抗原是戊型肝炎病毒或者AIV抗原，更优选地是戊型肝炎病毒(HEV)的包膜蛋白HEV 239或其变体或片段，其中优选地所述抗原性疾病由戊型肝炎病毒引起。

6.T细胞表位肽，其包含(或者由如下序列组成)：

(a)SEQ ID NO：1或者7所示的序列；

(b)SEQ ID NO：1或者7所示序列的保守性变异体，其中，所述保守性变异体的氨基酸序列与SEQ ID NO：1或者7之氨基酸序列相比，存在一个或多个(优选地，1-10个，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100个)保守性氨基酸的替换、添加和/或删除；或

(c)(a)或者(b)所述序列的活性片段；

其中，所述保守性变异体和活性片段能保持与H-2d型主要组织相容性复合物分子的特异性结合，或者能够特异性地激活宿主T细胞免疫应答，

优选地，所述表位肽优选长大约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、200、250、300、350、400个氨基酸，更优选地所述表位肽来源于含有选自SEQ ID NO：1-7的序列的天然序列，例如不超过15个氨基酸的多肽。

7.权利要求6的T细胞表位肽，其包含SEQ ID NO：5，非必需地在SEQ ID NO：5的N端或者C端或者两端可添加有一个或者多个(优选地，1-10个，1-20个，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100个)另外的氨基酸残基，该氨基酸残基优选来源于含有序列SEQ ID NO：5的天然序列。

8.权利要求6的T细胞表位肽，其包含SEQ ID NO：7，非必需地在SEQ ID NO：7的N端或者C端或者两端可添加有一个或者多个(优选地，1-10个，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100个)另外的氨基酸残基，该氨基酸残基优选来源于含有序列SEQ ID NO：7的天然序列。

9.权利要求6的T细胞表位肽，其包含(或者由如下序列组成)下列序列之一：SEQ ID NO：1-7的序列，优选SEQ ID NO：1-4的序列；或者它们在对应于SEQ ID NO：1第6位的苯丙氨酸(F)突变成缬氨酸(V)、和/或在对应于SEQ ID NO：1第7位的缬氨酸(V)突变成天冬氨酸(D)、和/或在对应于SEQ ID NO：1第14位的亮氨酸(L)突变成蛋氨酸(M)之后的相应序列。

10.数个(1-10个如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个，或者15、20个或者更多)权利要求6的T细胞表位肽的共价偶联物或串联物(融合蛋白)，例如氨基酸序列HSKTF FVLPL RGKLS FWEAG(SEQID NO：15)。

11.一种包含编码权利要求6-10之任一项所述的T细胞表位或者共价偶联物或串联物的核酸分子。

12.一种包含权利要求11所述核酸分子的载体。

13.一种用权利要求12所述的载体转化的宿主细胞。

14.一种包含权利要求6-10之任一项所述的T细胞表位或者共价偶联物或串联物、或权利要求11的核酸分子、或权利要求12的载体、或权利要求13的宿主的免疫原性组合物，其中优选地所述免疫原性组合物是疫苗，所述免疫原性组合物还可包含可药用载体，所述免疫原性组合物优选地还包含佐剂，所述佐剂优选是弗氏完全佐剂或铝佐剂。

15.人工抗原，其包含权利要求6-10之任一项所述的T细胞表位或者共价偶联物或串联物和与该T细胞表位或者共价偶联物或串联物共价偶联或融合的目标抗原；优选地，目标抗原可以是蛋白质抗原例如非颗粒蛋白抗原，或者糖抗原；当目标抗原是蛋白质时，优选该T细胞表位目标抗原融合构成融合蛋白。

16.权利要求15的人工抗原，其中所述目标抗原是一个或者数个B细胞表位，优选地，所述B细胞表位优选是待针对其产生免疫应答的目标抗原的B细胞表位。

17.权利要求15-16任一项的人工抗原，其中所述目标抗原是病毒抗原、细菌抗原、肿瘤抗原，例如HEV抗原或者AIV抗原，优选地是戊型肝炎病毒(HEV)的包膜蛋白HEV 239或其变体或片段。

18.含有权利要求15-17任一项的人工抗原的免疫原性组合物，其中优选地所述免疫原性组合物是疫苗，所述免疫原性组合物还可包含可药用载体，所述免疫原性组合物优选地还包含佐剂，所述佐剂优选是弗氏完全佐剂或铝佐剂。

19.联合制剂或者试剂盒，其包含：

(a)权利要求6-10之任一项所述的T细胞表位或者共价偶联物或串联物、或权利要求11的核酸分子、或权利要求12的载体、或权利要求13的宿主、或权利要求14的免疫原性组合物，和

(b)权利要求15-17任一项的人工抗原或权利要求18的免疫原性组合物，

所述(a)和(b)组分混合在一起或者彼此分开放置。

20.T细胞表位例如权利要求6-10之任一项所述的T细胞表位或者共价偶联物或串联物、或权利要求11的核酸分子、或权利要求12的载体、或权利要求13的宿主、或权利要求14的免疫原性组合物、或权利要求15-17任一项的人工抗原、或权利要求18的免疫原性组合物在制备抗体或者免疫动物或者提高目标抗原免疫原性或者提高抗体产生的速度或者提高产生抗体的滴度或者预防或治疗由抗原导致或参与的疾病的方法中的用途。

21.T细胞表位例如权利要求6-10之任一项所述的T细胞表位或者共价偶联物或串联物、或权利要求11的核酸分子、或权利要求12的载体、或权利要求13的宿主、或权利要求14的免疫原性组合物、或权利要求15-17任一项的人工抗原、或权利要求18的免疫原性组合物在制备免疫原性制剂或者药物中的用途，所述免疫原性制剂或者药物用于制备抗体或者免疫动物或者提高目标抗原免疫原性或者提高抗体产生的速度或者提高产生抗体的滴度或者预防或治疗由抗原导致或参与的疾病。

22.T细胞表位例如权利要求6-10之任一项所述的T细胞表位或者共价偶联物或串联物、或权利要求11的核酸分子、或权利要求12的载体、或权利要求13的宿主、或权利要求14的免疫原性组合物在制备权利要求15-17任一项的人工抗原中的用途。

23.T细胞表位例如权利要求6-10之任一项所述的T细胞表位或者共价偶联物或串联物、或权利要求11的核酸分子、或权利要求12的载体、或权利要求13的宿主、或权利要求14的免疫原性组合物、或权利要求15-17任一项的人工抗原、或权利要求18的免疫原性组合物在制备权利要求19的联合制剂或者试剂盒中的用途。

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