CN1850765A

CN1850765A - 一类醌类化合物及其制备方法与抗肿瘤应用

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Publication number: CN1850765A
Application number: CN 200610035637
Authority: CN
Inventors: 佘志刚; 林永成; 夏雪奎; 符立梧; 梁永钜
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2006-05-26
Filing date: 2006-05-26
Publication date: 2006-10-25
Anticipated expiration: 2026-05-26
Also published as: CN100410226C

Abstract

本发明涉及醌类化合物领域，具体涉及一类具有抗肿瘤活性的醌类化合物及其制备方法与应用。本发明从南海海洋真菌Halorosellinia sp.1403的发酵培养物中提取分离得到一种红色的醌类化合物及其乙酰化产物均能有效抑制肿瘤细胞株的生长，能用于开发抗肿瘤药物，应用前景广阔。

Description

一类醌类化合物及其制备方法与抗肿瘤应用

技术领域

本发明涉及醌类化合物领域，具体涉及一类具有抗肿瘤活性的醌类化合物及其制备方法与应用。

背景技术

海洋微生物以其独特的代谢途径，产生结构新颖的活性代谢产物，其代谢产物成为了药物的丰富来源，海洋微生物的代谢产物还广泛的药用价值，如抗肿瘤，治疗心血管疾病，免疫调节剂等。由于海洋环境的特殊性，海洋微生物种类繁多，来源广泛，筛选获得率高，根据John教授在2005年《Natural Product Reports》的报道，2003年发现海洋天然产物新化合物中，海洋微生物是主要来源之一。

植物内生真菌(Endophytic fungi)生活在高等植物的组织中，是植物微生态系统中的天然组成成分，在进化过程中与宿主建立了和谐的共生关系，据保守的估计内生真菌的种类繁多，大约有1.5×10⁶种，由于数量庞大，而且与其他生物之间紧密的生态关系，使这类真菌成为潜在的具有产生丰富的次级代谢产物的来源。

红树林是生长在热带及热带沿海潮间带泥泞地之植物，红树林生态系是世界上最富多样性、生产力最高的海洋生态系之一。外海水域营养缺乏，但红树林沼泽区是典型的稍咸的水域带，汇集来自上游及海洋所带来的各种无机盐及有机物加上红树林植物体本身枯枝落叶的掉落，有充足的植物材料，有丰富的浮游藻类和浮游生物，这些条件正适合于为微生物(细菌和真菌)的繁殖。在过去的十几年里，红树林栖息地被证明是真菌新种属的丰富来源，这形成了海洋真菌第二大的生态学亚类。

发明内容

本发明的目的在于提供一类来源于海洋红树林真菌的具有抗肿瘤活性的醌类化合物及其乙酰化衍生物。

本发明的另一个目的是提供上述醌类化合物的制备方法。

本发明的进一步目的是提供上述醌类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明从南海海洋真菌Halorosellinia sp.1403(以下简称真菌1403)的发酵培养物中提取分离得到一种红色的醌类化合物(1403C)，其结构式如式(I)：其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅都为H。

醌类化合物1403C，在催化剂的作用下，经过醋酐/吡啶乙酰化得到一系列一乙酰基取代至五乙酰基取代的乙酰醌类化合物，其结构式如式(I)，其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅为H或CH₃CO，R₁、R₂、R₃、R₄、R₅不同时为H。

本发明所用的真菌1403已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉大学校内)，保藏号为CCTCC NO：M201018，保藏日为2001年4月23日。

本发明的醌类化合物1403C可从真菌1403的发酵培养液中提取分离得到，制备方法的具体步骤如下：

(1)真菌Halorosellinia sp.1403 CCTCC NO：M 201018的种子培养：培养基按重量比为：葡萄糖0.5-1.5，酵母提取物0.05-0.15，蛋白胨0.1-0.3，琼脂1-1.5，氯化钠3-5，水100，制成试管斜面，挑取菌株接入斜面，30-35℃培养5-7天；

(2)真菌Halorosellinia sp.1403 CCTCC NO：M 201018的发酵培养：发酵培养基按重量比为：葡萄糖5-15，酵母提取物1-4，蛋白胨0.5-4，氯化钠3-5，水100，将斜面中培养好的菌株挑入发酵培养基，于室温25-35℃静置1-2个月；

(3)将上述培养好的发酵液过滤除去菌体得到培养液；

(4)真菌1403培养液加热浓缩(温度不超过50℃)至原液体积的1/20-1/5，用乙酸乙酯萃取多次，浓缩乙酸乙酯萃取液，在硅胶柱中进行色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂梯度洗脱；

(5)培养液浸膏经过柱层析后，收集50％-100％的乙酸乙酯/石油醚洗脱液，70％的乙酸乙酯/石油醚为洗脱液，再以聚酰胺柱层析分离，重结晶纯化，即得到红色颗粒状晶体1403C。

乙酰化醌类化合物是由1403C经过醋酐/吡啶乙酰化得到乙酰化产物，制备方法的具体步骤如下：

取干燥后的1403C，在催化剂的作用下，加入已干燥的吡啶，再加入醋酸酐，在10～80℃下，搅拌30min～15h，加水，氯仿萃取；经过硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂梯度洗脱，收集5％-80％乙酸乙酯/石油醚洗脱液，重结晶纯化，得到1403C的一系列一乙酰基取代至五乙酰基取代的乙酰化醌类化合物。

20～50％乙酸乙酯/石油醚洗脱液，氯仿-甲醇重结晶，得到橙黄色晶体三乙酰化的产物1403C-3Ac(R₁、R₂、R₄CH₃CO，R₃、R₅为H)。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明经试验证明，醌类化合物1403-C及其乙酰化产物均能有效抑制肿瘤细胞株的生长，能用于开发抗肿瘤药物，应用前景广阔。

具体实施方式

实施例1 化合物1403-C及其乙酰化产物的制备

(1)真菌Halorosellinia sp.1403的种子培养：

培养基按重量比为：葡萄糖0.5-1.5，酵母提取物0.05-0.15，蛋白胨0.1-0.3，琼脂1-1.5，氯化钠3-5，水100，制成试管斜面，挑取菌株接入斜面，30-35℃培养5-7天；

(2)真菌Halorosellinia sp.1403的发酵培养：

发酵培养基按重量比为：葡萄糖5-15，酵母提取物1-4，蛋白胨0.5-4，氯化钠3-5，水100，将斜面中培养好的菌株挑入发酵培养基，于室温25-35℃静置1-2个月；

(3)将上述培养好的发酵液过滤除去菌体得到培养液；

(4)在温度不超过70℃条件下，将培养液加热浓缩至原液体积的1/20-1/5，用乙酸乙酯萃取多次，浓缩乙酸乙酯萃取液，在硅胶柱中进行色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂梯度洗脱。

乙酰化产物1403C-3Ac是由1403C，在催化剂，经过醋酐/吡啶乙酰化得到的三乙酰化产物，制备方法的具体步骤如下：

取干燥的1403C，加入干燥的吡啶和醋酸酐，少量的DMAP，室温下，搅拌3-6h，加水，氯仿萃取。经过硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂梯度洗脱，收集20～50％乙酸乙酯/石油醚洗脱液，氯仿-甲醇重结晶，得到橙黄色晶体1403-C-Ac-3。

1403C的试验数据：

FABMS：337(M+1)，m/z：55.EA(w/％，)：C 56.56，H 4.617。计算直(C₁₆H₁₆O₈)：C57.14，H4.76，mp 232℃.IRv/cm^-1(KBr)：3514，3479，3374，3029，2987，2938，2896，1595，1475，1440，1398，1370，1300，1200，1208，1138，1082，997，948，864，821，632，554，491.¹HNMR(500Mz，CDCl₃，TMS)：13.35(s，OH-9)，12.62(s，OH-10)，6.46(s，H-3)，4.77(t，4.5，4.5Hz，H-7，OH)，3.92(s，CH₃-16)，3.54(t，4.5，4.5Hz，H-5)，2.74(d，18Hz，H-8a)，2.67(d，18Hz，H-8b)，1.24(s，CH₃-15).¹³CNMR(CDCl₃)：183.3(C-4)，176.5(C-1)，160.9(C-10)，160.9(C-2)，160.2(C-9)，139.5(C-11)，136.8(C-12)，109.8(C-14)，109.6(C-3)，107.3(C-13)，76.3(C-7)，69.2(C-6)，68.2(C-5)，56.8(C-16)，34.8(C-8)，25.5(C-15).

1403C-3Ac的试验数据：

EI-MS：462，mp 259～260℃ ¹HNMR(500Mz，CDCl₃，TMS)：6.026(H-3)，5.287(dd，)，3.98(d)，3.07(dd，15，15HZ)，2.9(dd，15，15HZ)，1.361(H-15)，2.12(CH3-22)，2.37(CH₃-21)，2.12(CH₃-20)，12.65(OH-9)，6.19(OH-7)；¹³CNMR(CDCl₃)：184.8(C-4)，182.7(C-1)，170.5(C-18)，170.4(C-19)，169.9(C-17)，158.9(C-9)，158.9(C-2)，132.4(C-11)，132.1(C-12)，113.0(C-13)，112.0(C-14)，111.6(C-3)，73.6(C-6)，70.5(C-7)，69.4(C-8)，35.2(C-5)，29.7(C-15)，21.1(C-22)，20.8(C-21)，20.8(C-20).

实施例2 MTT还原法检测化合物1403C和1403C-3Ac抗肿瘤活性试验

1、材料：

1.1四脞盐(MTT)：用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解MTT(3-(4，5-dimethythiazol-z-yl)2，5-diphenyltetrazolium bromide，SIGMA)终浓度5mg/mL，过滤除菌，分装后4℃避光保存。

1.2靶细胞的制备(以HepG2细胞为例)：以HepG2细胞的复苏与培养：

a.从液氮罐中取出人肝癌细胞株HepG2细胞的冻存管，迅速置入37℃水浴中，不停摇动使之迅速溶化，无菌操作移入离心管中；

b.加全培养液至10mL，1000rmp离心5s，弃上清；

c.重复以上操作一次；

d.以全培养液吹打使细胞混匀后移入培养瓶中，5％CO₂，37℃培养；

e.观察细胞生长情况，及时更换培养液，分瓶。

1.3细胞计数：

a.选取对数生长期细胞，胰酶消化，全培养终止，移入离心管中，加全培至10mL；

b.取一滴滴入计数板一侧凹槽中，显微镜下计数四大格的细胞总数、除以4，乘10⁴，即为每毫升培养液所含细胞数；

c.调整细胞数至1×10⁵/mL；

1.4化合物E和F的配制：分别取化合物E和F加入到全培中，调整浓度为500μg/mL，超声乳化，过滤除菌，4℃保存。

2.试验方法(以HepG2细胞为例)

a.96孔板各孔加入HepG2细胞100μL(1×10⁵/mL)，5％CO₂，37℃培养4hr。

b.加入不同浓度受试对象100μL，对照加全培100μL，继续培养48hr。

c.加入MTT(5mg/mL)各10μL，继续培养4hr。

d.去除培养液。每孔加入DMSO100μL，轻轻振荡5-10min，使颗粒溶解。

e.酶联免疫仪570nm下测定每孔OD值。

f.计算抑制率

肿瘤细胞杀伤率％＝

[(对照组测定的平均OD值-加药组测定的平均OD值)/对照组测定的平均OD值]×100％

g.以抑制率对药物浓度的对数作图，求得IC₅₀值

以lgc为横坐标，抑制率为纵坐标，求得IC₅₀值

肺癌细胞株A549，肝癌细胞株Hep-2，口腔癌细胞株KB，乳癌细胞株MCF-7，多药抗药乳癌细胞株MCF-7/Adr的试验方法同上。

3.试验结果

试验结果显示化合物1403C和1403C-3Ac均能有效抑制肺癌细胞株A549，肝癌细胞株Hep-2和肝癌细胞株Hep G2，口腔癌细胞株KB，乳癌细胞株MCF-7，多药抗药乳癌细胞株MCF-7/Adr的生长。1403C和1403C-3Ac对这些癌细胞株的IC₅₀值(μg/ml)见表1。

表1、1403-C和1403-C-Ac-3的体外细胞毒试验结果(IC₅₀μg/mL)

细胞株	1403C	1403C-3Ac
细胞株	1403C	1403C-3Ac	肺癌细胞株A549	2.44	0.69
肝癌细胞株Hep-2	3.15	1.00	肺癌细胞株A549	2.44	0.69
肝癌细胞株Hep-2	3.15	1.00	肝癌细胞株Hep G2	4.41	0.85
口腔癌细胞株KB	3.15	0.92	肝癌细胞株Hep G2	4.41	0.85
口腔癌细胞株KB	3.15	0.92	乳癌细胞株MCF-7	4.76	3.02
多药抗药乳癌细胞株MCF-7/Adr	5.45	2.97	乳癌细胞株MCF-7	4.76	3.02

Claims

1.醌类化合物，其结构式如式(I)

(I)

其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅为H或CH₃CO；

2.如权利要求1所述的醌类化合物，其特征在于R₁、R₂、R₃、R₄、R₅均为H。

3.如权利要求1所述的醌类化合物，其特征在于R₁、R₂、R₄为CH₃CO，R₃、R₅为H。

4.权利要求1所述醌类化合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)真菌Halorosellinia sp.1403的种子培养：培养基按重量比为：葡萄糖0.5-1.5，酵母提取物0.05-0.15，蛋白胨0.1-0.3，琼脂1-1.5，氯化钠3-5，水100；制成试管斜面，挑取菌株接入斜面，30-35℃培养5-7天；

(2)真菌Halorosellinia sp.1403的发酵培养：发酵培养基按重量比为：葡萄糖5-15，酵母提取物1-4，蛋白胨0.5-4，氯化钠3-5，水100；将斜面中培养好的菌株挑入发酵培养基，于室温25-35℃静置1-2个月；

(3)将上述培养好的发酵液过滤除去菌体得到培养液；

(4)在温度不超过50℃条件下，将培养液加热浓缩至原液体积的1/20-1/5，用乙酸乙酯萃取多次，浓缩乙酸乙酯萃取液，在硅胶柱中进行色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇为洗脱剂梯度洗脱；

(5)培养液浸膏经过柱层析后，收集50％-100％的乙酸乙酯/石油醚洗脱液，70％的乙酸乙酯/石油醚为洗脱液，再以聚酰胺柱层析分离，重结晶纯化，即得到红色颗粒状晶体1403C；

(6)取干燥后的1403C，在催化剂的作用下，加入已干燥的吡啶，再加入醋酸酐，在10～80℃下，搅拌30min～12h，加水，氯仿萃取；经过硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂梯度洗脱，收集5％-80％乙酸乙酯/石油醚洗脱液，重结晶纯化，得到1403C的乙酰化产物。

5.权利要求1所述的醌类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。