CN1824807A - 钙蛋白酶抑制蛋白基因475位snp标记筛选猪的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种钙蛋白酶抑制蛋白基因475位SNP标记筛选猪的方法，属于家畜分子生物学技术领域。其步骤包括，提取猪的基因组RNA，钙蛋白酶抑制蛋白基因的反转录PCR扩增，SNP标记的检测及其与猪肉嫩度的相关性分析。本发明的特征是分离鉴定出猪钙蛋白酶抑制蛋白基因新的SNP标记，筛选出一个适用于猪肉嫩度的SNP标记(475位T→G)，设计了扩增该位点的引物，还提供了用于该方法的试剂盒。本发明利用钙蛋白酶抑制蛋白基因编码区域中第475位的SNP与猪肉嫩度显著相关的特性，为猪的标记辅助选种和选配提供了新的分子标记方法。

Description

钙蛋白酶抑制蛋白基因475位SNP标记筛选猪的方法

技术领域

本发明涉及一种基于SNP标记筛选猪的方法，具体是利用钙蛋白酶抑制蛋白基因编码区域中第475位的SNP标记与猪肉嫩度显著相关的特性，作为猪的SNP标记进行辅助选种和选配。属于家畜分子生物学技术领域。

背景技术

SNP标记(单核苷酸多态性)是指在染色体基因组水平上单个核苷酸的变异引起的DNA序列多态性，而其中一种等位基因在群体中的频率不少于1％。SNP标记在基因组内可以划分为2种形式：第一是遍布于基因组的大量单碱基变异；第二是基因编码区的功能性突变。后者由于分布在基因编码区(codingregion)，故又称其为cSNP(coding SNP)。cSNP常引起表达蛋白的多态性变异，从而影响它们的功能特性。在家畜分子生物学技术领域，SNP标记主要作为一种标记辅助技术应用于家畜的筛选，从而指导家畜的选种和选配。

猪的SNP标记起步于90年代中期并且进展十分迅速，与此同时有关猪SNP标记的专利争夺正逐步展开。鉴于猪SNP标记数目多，还有大量未被发现，且它们有重要的理论和应用价值，特别是我国大量的优良地方猪种还可能存在特有的SNP标记，因此在我国开展猪的SNP标记的分析、鉴定和应用研究，开发具有我国知识产权的SNP标记显得十分迫切和必要。

随着生活水平提高，人们对食物有了更高的要求。猪肉作为人膳食中重要的组成部分，是人们近年来改善的重点。既瘦又嫩，多汁味美的猪肉在市场上颇受消费者青睐。另一方面，随着养猪业对提高肉猪生长速率和饲料效率的遗传选育，使得肉猪生产水平得到了提高，但同时，猪肉品质变得粗老，适口性差，降低了消费者对肉质的满意度。猪肉品质成了当今世界养猪界专家共同关心研究的一项重大课题。其中猪肉嫩度是消费者对猪肉肉质进行评价的重要指标，猪肉嫩度受大量的遗传和非遗传因素的影响，肉质专家们针对这些影响因子做了大量的研究，许多研究都揭示了遗传因子的重要性，这使得育种公司意识到利用基因技术来进行动物的遗传育种在改良猪肉的嫩度上发挥着重要作用。

钙蛋白酶抑制蛋白基因是影响猪肉嫩度的一个重要的候选基因，许多科研工作者都试图在钙蛋白酶抑制蛋白基因中寻找影响猪肉嫩度的SNP标记位点。经文献检索和专利检索发现，Ernst(1998)等将钙蛋白酶抑制蛋白基因定位于2q2.1-2.4，并发现了3个在非编码区上的PCR-RFLP多态性位点(HinfI，MspI，RsaI)。孙立彬(2005)等也发现了2个在非编码区上的PCR-RFLP多态性位点(HinfI，TaqI)。但由于非编码区的变异不影响蛋白质的改变，很难证实非编码区上的基因突变与猪肉嫩度的相关性。Rothschild(2003)等在钙蛋白酶抑制蛋白基因编码区上发现了两个与肉质相关的SNP，并申请了美国国家专利(SerialNo.：339279)。但Rothschild是以西方猪种为研究对象，而东西方猪品系有很大的遗传差异，西方猪种的多态位点是否能指导中国猪种的改良还需要验证。

为了提高猪肉品质和指导中国地方猪的保种和降低生产成本，本领域迫切需要在编码区找到更多新的影响猪肉(特别是中国地方品系)嫩度的SNP位点，并开发基于猪肉嫩度进行猪只筛选的SNP标记方法和试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，利用钙蛋白酶抑制蛋白基因编码区域中第475位的SNP与猪肉嫩度显著相关的特性，提供一种利用SNP标记筛选猪的方法，进而提供一种新的筛选猪的试剂盒，为猪的标记辅助选种和选配提供新的分子标记，可进行猪只早期筛选。

本发明提供的钙蛋白酶抑制蛋白基因475位SNP标记筛选猪的方法包括如下步骤：

(a)提取猪的耳组织总RNA样品，进行反转录反应，用钙蛋白酶抑制蛋白基因特异性引物进行PCR反应，得到扩增产物；

(b)检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性：

475位T→G；

其中，核苷酸位置编号基于GenBank索引号：M20160。

所述的基因特异性引物具有5’-AAAGGAACACCCAGAGCC-3’和5’-GACCGTTTCGTCATCTTCAC-3’的序列。

所述的扩增产物的长度为100～4000bp，且含有M20160中第475位。

进而，本发明提供了一种基于钙蛋白酶抑制蛋白基因475位SNP标记筛选猪的试剂盒，它包括进行PCR反应的钙蛋白酶抑制蛋白基因特异性引物，所述的特异性引物具有5’-AAAGGAACACCCAGAGCC-3’和5’-GACCGTTTCGTCAT CTTCAC-3’的序列；引物扩增长度为100～4000bp，且含有M20160中第475位的扩增产物。

所述试剂盒还可以含有选自下组的试剂：

(a)与M20160中第475位的突变结合的探针；

(b)识别M20160中第475位的突变限制性内切酶。

所述的突变选自以下单核苷酸多态性：

475位T→G；

其中，核苷酸位置编号基于M20160。

本发明的积极效果：

(1)在钙蛋白酶抑制蛋白基因编码区475位分析鉴定出一个突变位点，经国际基因数据库中检索，证明为新的SNP标记。

(2)经将上述的SNP标记与梅山猪等五个群体的110头猪的猪肉嫩度进行相关性分析，首次证明该标记与猪肉嫩度显著相关，可以用于猪只的早期筛选，从而降低饲养成本，增加产品的附加值。

(3)所发明的试剂盒可用于早期检测以提高检测效率，降低检测成本。

具体实施方式

本发明针对中国地方猪种梅山猪和苏太猪进行了深入的研究，并和西方猪的品系进行了对比研究。对钙蛋白酶抑制蛋白基因整个编码区域进行了测序，在编码区发现多个新的SNP位点，其中统计分析结果显示，在钙蛋白酶抑制蛋白基因编码区第475位的SNP与猪肉嫩度显著相关(p＜0.05)，因此可作为检测猪肉嫩度的特异性SNP，用于猪的标记辅助选种和选配。在此基础上完成了本发明。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验手册(New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

1.1研究对象

由于猪肉嫩度是多基因参与的受多种环境因素影响的数量性状，为了降低环境的影响，所有实验猪都在相同的饲养水平下饲养，并在同一天进行屠宰，参照陈润生(2002)等的方法测定每一个样品的肌肉嫩度。

实验用110头猪实验猪均在苏州市苏太集团饲养，28头梅山；27头苏太猪、15头长白×苏太猪杂种、15头大白×苏太猪、25头杜×长×大杂种猪。通过直接测序的方法进行SNP的检测。

1.2实验方法和结果

1.2.1RNA提取

在猪场采取猪耳组织样，迅速放入液氮中，冷冻后保存于实验室-80℃冰箱中，准备提取组织总RNA。取100mg耳组织样放入1ml Trizol(trizal reagent，invitrogen BRL，USA)的匀浆器管中匀浆。4℃ 12000g离心10分钟。吸取上清液，15-30℃温育5分钟。加0.2ml氯仿，盖上盖子，用手剧烈震荡15秒。15-30℃温育2-3分钟。4℃ 12000g离心15分钟。吸取上清液，加0.8ml异丙醇，混合均匀。15-30℃温育10分钟，4℃ 12000g离心10分钟，离心管底部白色沉淀即为RNA。倒掉上清，加1ml 75％乙醇洗涤RNA，4℃ 7500g离心10分钟。自然干燥或真空干燥RNA溶于水(RNase free)中分装，-70℃保存。

1.2.2PCR及测序引物的设计

根据GenBank中猪钙蛋白酶抑制蛋白基因的编码序列M20160，(可参见网址 http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。用引物设计软件primer5.0设计引物。具体引物如下表1所示。

        表1  引物序列表

引物名称	序列(5’-3’)
		上游引物	AAAGGAACACCCAGAGCC
下游引物	GACCGTTTCGTCATCTTCAC

1.2.3钙蛋白酶抑制蛋白基因的RT-PCR(反转录PCR)扩增

反转录反应液组成：10μL 2×Bca 1st Buffer，4μL 25Mm MgSO₂，1μL dNTPMixtμre，0.5μL Rnase Inhibitor(40U/μL)，1μL BcaBEST Polymerase(22U/μL)，1μL Oligo dT Primer，1μL RNA Sample，1.5μL Rnase Free dH₂O，总体系为20μL。反转录反应条件：65℃1分钟，30℃5分钟(15分钟-30分钟内匀速升温)，65℃25分钟，98℃5分钟，5℃5分钟。PCR扩增条件：97℃变性5分钟；95℃30秒→55℃30秒→72℃1分钟，如此进行30次循环；72℃延伸10分钟，RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证。结果，获得844bp的扩增产物。

1.2.4SNP标记的检测

RT-PCR产物经Resin树脂纯化后，用ABI-PRISM^TM 377DNA测序仪(美国应用生物系统公司appliedbiosystems(ABI)进行荧光标记术端终止双向测序，用Polyphred.html)进行序列的判读和SNP确认。

1.2.5SNP基因分型和关联分析

用直接单向测序法进行SNP基因分型，将在编码区上发现了多个SNP采用以下模型对基因型效应和遗传模式进行分析：

                    y＝1μ+X₁S+X₂B+X₃M+e

模型中，y为个体表型记录向量，μ为总体均数，S为性别效应向量；B为群体效应向量；M为基因型效应向量；e为随机误差向量；1、X₁、X₂、X₃为设计矩阵；统计分析采用SAS(8.02)软件进行，其中多重比较采用SSR法。

结果，其中大部分SNP与猪肉嫩度并不相关。发现存在以下SNP：475位T→G，该SNP位于钙蛋白酶抑制蛋白基因的编码区，导致编码氨基酸发生变化，由Arg→Leu。关联研究表明该位点是与猪肉嫩度关联性非常高的SNP，对猪肉嫩度影响显著，多重比较发现，含有T型SNP的猪肉嫩度比含有G型SNP的猪肉嫩度高20.15％，证实了M20160中475位的T/G型SNP与猪肉嫩度存在着相关性。

实施例2

基于钙蛋白酶抑制蛋白基因475位SNP标记筛选猪的试剂盒，如实例1所述，M20160中的475位T→G的突变与猪肉嫩度密切相关。因此，可基于这个SNP位点设计钙蛋白酶抑制蛋白基因特异性引物进行扩增和检测。

制备一试剂盒(100次)，组成如下表所示：

名称	序列(5’-3’)	浓度
			上游引物	AAAGGAACACCCAGAGCC	100pmol/μL
下游引物	GACCGTTTCGTCATCTTCAC	100pmol/μL
			PCR反应液	含Taq酶dNTP镁离子PCR反应缓冲液

在猪场采取猪耳组织样，提取总RNA，按实施例1所述方法进行反转录反应。将试剂盒中的PCR引物稀释到1pmol/μL，以所提取的反转录产物为模板用上述试剂盒进行PCR反应。PCR扩增条件：97℃变性5分钟；95℃30秒→55℃30秒→72℃1分钟，如此进行30次循环；72℃延伸10分钟。PCR产物纯化后，用ABI-PRISM^TM377DNA测序仪进行荧光标记末端终止法双向测序，用Polyphred软件进行序列的判读和SNP确认。

根据本发明提供的标记方法，如果用与M20160中第475位的突变结合的探针或识别M20160中第475位的突变的限制性内切酶也可以检测出475位T→G。

检测结果，含有T型SNP的猪肉嫩度比含有G型SNP的猪肉嫩度高20.15％。

Claims (3)

1、一种钙蛋白酶抑制蛋白基因475位SNP标记筛选猪的方法，其特征在于包括如下步骤：

(a)提取猪的耳组织总RNA样品，进行反转录反应，再用钙蛋白酶抑制蛋白基因特异性引物进行PCR反应，得到扩增产物；

(b)检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性：

475位T→G；

其中，核苷酸位置编号基于GenBank索引号：M20160；

所述的基因特异性引物具有5’-AAAGGAACACCCAGAGCC-3’和5’-GACCGTTTCGTCATCTTCAC-3’的序列；

所述的扩增产物的长度为100～4000bp，且含有M20160中第475位。

2、一种钙蛋白酶抑制蛋白基因475位SNP标记筛选猪的方法试剂盒，其特征在于包括进行PCR反应的钙蛋白酶抑制蛋白基因特异性引物，所述的特异性引物具有5’-AAAGGAACACCCAGAGCC-3’和5’-GACCGTTTCGTCATCTTCAC-3’的序列；引物扩增长度为100～4000bp，且含有M20160中第475位的扩增产物。

3、根据权利要求2的试剂盒，其特征在于还含有选自下组的试剂：

(a)与M20160中第475位的突变结合的探针；

(b)识别M20160中第475位的突变限制性内切酶；

所述的突变选自以下单核苷酸多态性：

475位T→G；

其中，核苷酸位置编号基于M20160。