CN1817846B - 采用新型菌体处理方法制造多不饱和脂肪酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种生物质的新型分离方法，该方法将一种或多种化合物从包含产生上述化合物的微生物的生物质中分离，该方法包括以下步骤：(a)准备或取得平均水分含量为30％到80％的湿菌体；(b)将湿菌体提供给干燥并成形的一次干燥器，得到平均水分含量为5％到50％的成形菌体；(c)将上述(b)得到的一次干燥菌体进行二次干燥，得到平均水分含量为10％或10％以下的二次干燥菌体；(d)从上述(c)得到的二次干燥菌体中精制、提取或分离上述化合物或各化合物。

Description

采用新型菌体处理方法制造多不饱和脂肪酸的方法
技术领域
本发明涉及含有微生物的微生物生物质、从生物质提取得到的粗油及/或粗磷脂、以及由粗油及/或粗磷脂精制得到的精制油脂及/或精制磷脂的制造方法，所述微生物产生含有多不饱和脂肪酸的化合物，所述多不饱和脂肪酸以组成脂肪酸的形式存在，本发明还涉及添加了该生物质及该油脂(粗油及/或精制油脂)及/或该磷脂(粗磷脂及/或精制磷脂)的饮料、食品、治疗用营养食品、饲料及医药品。 
背景技术
人体多不饱和脂肪酸(以下称“PUFA”)的生物合成有两大代表系列，ω3系列和ω6系列(ω表示从脂肪酸的甲基末端开始数到第一个双键处碳原子的碳原子数)，例如ω6系列时，由亚油酸(18：2ω6)反复进行去饱和与碳链延长，转化成γ-亚麻酸(18：3ω6)、双高-γ-亚麻酸(20：3ω6)、花生四烯酸(20：4ω6)及4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸(22：5ω6)。 
同样，ω3系列时，由α-亚麻酸(18：3ω3)反复进行去饱和与碳链延长，转化成二十碳五烯酸(20：5ω3)、7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸(22：5ω3)及4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸(22：6ω3)。作为ω3系列的PUFA，已知二十碳五烯酸(以下称“EPA”)、二十二碳六烯酸(以下称“DHA”)尤其具有多种生理功能，例如对动脉硬化、血栓等成人病的预 防效果、抗癌作用、增强学习能力等，且在医药、特定保健食品上的利用也多有尝试。但最近ω3系列以外的PUFA(ω6系列及ω9系列)的生理功能也受到关注。 
在构成血液和肝脏等重要器官的脂肪酸中，花生四烯酸约占10％(例如，在人体血液磷脂的脂肪酸组成比中，花生四烯酸占11％，二十碳五烯酸占1％，二十二碳六烯酸占3％)，花生四烯酸作为细胞膜的主要结构成分参与膜流动性的调节，在体内代谢上显示各种功能，同时花生四烯酸作为前列腺素类的直接前体，起着重要的作用。尤其是最近，花生四烯酸作为婴幼儿营养的作用和作为显示神经活性作用的内源性大麻素样物质(2-花生四烯酰单甘油(2-arachidonoyl monoglycerol)，花生四烯酰乙醇胺(anandanide))的组成脂肪酸而受到关注。通常，只要摄取富含亚油酸的食品，就会转化成花生四烯酸，但是，成人病患者及其易患人群、婴儿、老年人体内参与生物合成的酶活力降低，易导致这些花生四烯酸缺乏，因此优选直接摄取油脂(甘油三酯的组成脂肪酸)。 
ω3系列PUFA的EPA和DHA具有鱼油这一丰富的供应源，但ω6系列PUFA的γ-亚麻酸、双高-γ-亚麻酸、花生四烯酸及4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸(22：5ω6)几乎不能从以往的油脂供应源中获得，目前一般使用微生物发酵得到的含有以组成脂肪酸形式存在的PUFA的油脂(以下称“含有PUFA的油脂”)，例如，建议使用下述方法：培养各种能产生含有花生四烯酸的油脂(以下称“含有花生四烯酸的油脂”)的微生物，所述花生四烯酸以组成脂肪酸的形式存在，通过培养上述微生物而获得含有花生四烯酸的油脂。 
其中，特别是已知通过被孢霉属微生物可得到在组成脂肪酸中花生四烯酸比例高的油脂(以下称“花生四烯酸含量高的油脂”)(日本特开昭63-44891， 日本特开昭63-12290)。近年来，作为必须的成分，开始使用花生四烯酸，例如在婴幼儿营养领域，具体为在配方奶粉中开始使用由发酵得到的含有花生四烯酸的油脂。此外，含有花生四烯酸的油脂的新功效也逐渐明了(日本特开2003-48831：对脑功能下降引起的症状或疾病具有预防或改善作用的组合物)，并期待着今后有更大的需求。 
培养被孢霉属微生物而得到的油脂，其大部分为甘油三酯(约70重量％或70重量％以上)及磷脂。食用油脂的形态为甘油三酯，用作食用油脂时，从培养微生物而得到的菌体生物质中提取由菌体生成的原油脂(原油脂是从菌体中提取得到的油脂，称为“粗油”)，该粗油再经食用油脂的精制工艺(脱胶、脱酸、脱臭、脱色)，可得到去除磷脂的精制油脂。 
通过培养被孢霉属微生物而得到的含有PUFA的油脂在菌丝内蓄积，因此为了使该油脂的生产经济化，必须进行更高浓度培养，提高单位培养液中含有PUFA的油脂的产量。因单位培养液中含有PUFA的油脂的产量为菌体浓度和单位菌体中含有PUFA的油脂的含量的积算，所以必须同时提高菌体浓度和单位菌体中含有PUFA的油脂的含量。为了提高菌体浓度，通常可通过提高培养基中转化成菌体成分的氮源浓度来实现。为了提高单位菌体中含有PUFA的油脂的含量，必须将菌形态控制在良好的状态，并供给充足的氧。作为控制菌体形态的方法，报告有：使培养基盐类组成最优化等方法(日本再公表特许98/029558)，另外，有关供给氧的方法，报告有：加压培养法和氧富集空气通气法等方法(日本特开平06-153970)。 
另外，已知：不仅在培养工序上而且在培养后的菌体回收工序上，有各种改善工序的尝试。例如，报告有如下方法：取得微生物生物质(水分含量为20～75％)，在维持水分含量的状态下造粒，制成颗粒状粒子后，干燥至水分 含量为20％或20％以下，该报告称：通过制成颗粒状，使干燥变得容易，且易于提取目标化合物(WO97/36996)。且该报告称：制颗粒状粒子优选挤出法，一般来说，挤出法不改变水分含量。 
颗粒状粒子的干燥方法例如有喷雾干燥法、流化床干燥、冷冻干燥、输送带(belt)式干燥、真空干燥等方法。此外，其他方法已知还有：过滤被孢霉属丝状菌培养液，回收菌体，干燥后破碎，用有机溶剂提取油脂(CN1323904A)，在Yamada等的报告中，采用球磨机破碎法(“Industrialapplications of single cell oils，edited by D.J.Kyle and C.Ratledge，AOCSpress(1992)p.118-138”)。如上所述，虽然有各种菌体回收方法的报告，但均为以往已知干燥方法的一步干燥，没有与设计新型干燥器或组合使用多种以往干燥器相关的研制例的报告。也没有与干燥后的微生物生物质的处理方法相关的报告。 
从微生物油脂的缺减和微生物油脂的质量等角度考虑，虽然菌体回收工序在微生物油脂的制造中极其重要，但目前几乎没有与该工序的研制相关的报告。 
干燥工序一般可分三个阶段(《食品工学基础讲座(6)浓缩与干燥》松野隆一等，光琳(1988)，第5章)。首先，当物料中存在充足的水分时，物料的水分蒸发可以认为与水滴表面的水分蒸发相同，物料温度向空气的湿球温度变化，此期间称为预热阶段。物料达到湿球温度后，由于来自空气的热量全部用于水分蒸发，物料含水率与时间呈比例地直线下降。此期间干燥速度一定，称为恒率干燥阶段。干燥进一步进行，因物料内部的水分转移成为限速步骤，水分蒸发的速度减小，最终在干燥空气中达到平衡含水率，干燥结束。此期间称为降率干燥阶段。 
实际应用的干燥方法可大致分为对流传热方式、传导传热方式、辐射传热方式。辐射传热方式已知有红外线辐射法等，但在须大量处理的食品加工中并不常用，通常广泛地采用对流传热方式或传导传热方式。 
对流传热方式干燥器通过供给热风，将蒸发的水分迅速从原料附近除去，因此水分蒸发的推动力大，在希望大量减少水分含量时，可认为是有效方法。但另一方面，存在这样的问题：因供给大量热风，造成干燥物料微粉飞散、送风机耗能等，而且，高水分含量物料因物料间粘着而引起结块及热风接触面积减少。 
传导传热方式干燥器的热效率高，且几乎不需要风量，因此可大幅度减少送风能耗和原料飞散。但另一方面，存在这样的问题：因为只通过传热方式加热，所以很难干燥至低水分含量。 
[专利文献1]日本特开昭63-44891号公报 
[专利文献2]日本特开昭63-12290号公报 
[专利文献3]日本特开2003-48831号公报 
[专利文献4]日本特开平06-153970号公报 
[专利文献5]日本再公表特许98/029558 
[专利文献6]WO97/36996 
[专利文献7]CN1323904A 
[非专利文献1]Industrial applications of single cell oils，edited byD.J.Kyle and C.Ratledge，AOCS press(1992)p.118-138 
[非专利文献2]食品工业基础讲座(6)《浓缩与干燥》松野隆一等，光琳(1988)，第5章 
发明内容
因此，非常渴望研制一种适于干燥微生物生物质的新工序。其间，根据水分在干燥工序的预热阶段、恒率干燥阶段、降率干燥阶段这三个阶段中的动态特点，综合研究了大致分为对流传热方式及/或传导传热方式的干燥器的优缺点。 
本发明人等对通过培养微生物来生产含有PUFA的油脂的过程中回收微生物生物质的工序进行了潜心研究，发现通过组合使用多种不同原理的干燥方式，具体地说组合使用传导传热方式和对流传热方式，发挥各传热方式的优点并克服缺点，将能显著提高干燥工序的经济性。还发现干燥结束后到充填包装期间，对干燥菌体进行冷却可得到质量良好的含有PUFA的粗油。 
因此，本发明提供含有PUFA的油脂(甘油三酯)及/或含有PUFA的磷脂、含有PUFA的菌体的制造方法及保藏方法，其特征为：其干燥方法是组合使用多种方法的新型干燥方法，其干燥菌体冷却后再充填包装。 
本发明具体提供将一种或多种化合物从包含产生上述化合物的微生物的微生物生物质中分离的方法，该方法包括以下步骤： 
(a)准备或取得平均水分含量为30％到80％的湿菌体； 
(b)将湿菌体进行一次干燥，得到平均水分含量为5％到50％的一次干燥菌体； 
(c)将上述(b)得到的一次干燥菌体进行二次干燥，得到平均水分含量为10％或10％以下的二次干燥菌体； 
(d)从上述(c)得到的二次干燥菌体中精制、提取或分离上述化合物或各化合物。 
在上述方法中，例如，上述(b)中的一次干燥为传导传热方式，可优选 使用圆锥型螺条式(ribbon)混合干燥器、传导传热干燥器、鼓式干燥器(drumdryer)或旋风干燥器(cyclone dryer)。上述(c)中的二次干燥，例如为对流传热方式，可优选使用振动流化床干燥器、卧式连续式流化干燥装置、回转型干燥器、箱型平行流干燥器、箱型通气干燥器、振动干燥冷却装置、流化床干燥装置、带式通气干燥装置或带式干燥器。优选通过培养液的固液分离而得到上述(a)的湿菌体，该固液分离优选与机械脱水并用。 
上述生物质例如包含菌类或来自菌类。该菌类例如属于毛霉目(Mucorales)或被孢霉(Mortierella)属，如高山被孢霉(Mortierellaalpina)。 
上述生物质还例如包含藻类或来自藻类。该藻类例如属于红藻(Crypthecodinium)属、破囊壶菌(Thraustochytrium)属、裂殖壶菌(Schizochytrium)属、吾肯氏壶菌(Ulkenia)属、日本壶菌(Japonochytrium)属或海壶菌(Haliphthoros)属。 
上述藻类例如是隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)。 
上述化合物优选含有多不饱和脂肪酸的油脂，所述多不饱和脂肪酸以组成脂肪酸的形式存在，上述多不饱和脂肪酸例如是碳原子数为18个或18个以上且含有2个或2个以上双键的ω3系列、ω6系列及/或ω9系列，如α-亚麻酸(9，12，15-十八碳三烯酸)、6，9，12，15-十八碳四烯酸(18：4ω3)、8，11，14，17-二十碳四烯酸(20：4ω3)、EPA(5，8，11，14，17-二十碳五烯酸)、DPAω3(7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸)、DHA(4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸)、γ-亚麻酸(6，9，12-十八碳三烯酸)、双高-γ-亚麻酸(8，11，14-二十碳三烯酸)、花生四烯酸(5，8，11，14-二十碳四烯酸)、7，10，13，16-二十二碳四烯酸(22：4ω6)、DPAω6(4， 7，10，13，16-二十二碳五烯酸)、6，9-十八碳二烯酸(18：2ω9)、8，11-二十碳二烯酸(20：2ω9)及/或Mead酸(5，8，11-二十碳三烯酸)。 
上述方法的优选方式是将上述工序(c)得到的二次干燥菌体用以下任意一种方法冷却处理后，提供给上述工序(d)： 
(i)通过供给含氧浓度为21％或21％以下的气体，至少冷却至60℃；或 
(ii)在含氧浓度为21％或21％以下的气体中，静置冷却，至少冷却至60℃。 
本发明还提供干燥菌体的获得方法，所述干燥菌体含有一种或多种化合物、产生上述化合物的微生物生物质，该方法包括以下步骤： 
(a)准备或取得平均水分含量为30％到80％的湿菌体； 
(b)将湿菌体进行一次干燥，得到平均水分含量为5％到50％的一次干燥菌体； 
(c)将上述(b)得到的一次干燥菌体进行二次干燥，得到平均水分含量为10％或10％以下的二次干燥菌体。 
在上述方法中，例如，上述(b)中的一次干燥为传导传热方式，上述(c)中的二次干燥例如是对流传热方式。 
本发明还涉及干燥菌体的保藏方法，所述干燥菌体含有微生物生物质，所述微生物生物质包含产生一种或多种化合物的微生物，该保藏方法为： 
(1)通过以下步骤获得干燥菌体： 
(a)准备或取得平均水分含量为30％到80％的湿菌体； 
(b)将湿菌体进行一次干燥，得到平均水分含量为5％到50％的一次干燥菌体；接着 
(c)将上述(b)得到的一次干燥菌体进行二次干燥，得到平均水分含量为10％或10％以下的二次干燥菌体；之后 
(2)用以下任意一种方法冷却处理上述得到的二次干燥菌体： 
(i)通过供给含氧浓度为21％或21％以下的气体，至少冷却至60℃；或 
(ii)在含氧浓度为21％或21％以下的气体中，静置冷却，至少冷却至60℃；然后 
(3)冷却后的二次干燥菌体通过以下任意一种方法保藏： 
(ア)将上述菌体与氮气一起充填到可密闭的容器中，至少在15℃或15℃以下保藏；或 
(イ)将上述菌体与氧浓度为20％或20％以下的气体一起充填到可密闭的容器中，至少在15℃或15℃以下保藏。 
在上述方法中，例如，上述(b)中的一次干燥为传导传热方式，上述(c)中的二次干燥例如是对流传热方式。 
本发明还提供根据上述方法分离、提取或精制得到的化合物的应用，其用于制造食品组合物、功能性食品、营养补助食品、早产儿配方奶粉、足月儿配方奶粉、婴儿配方奶粉、婴儿食品、孕产妇食品、老年人食品、化妆品及/或医药品组合物。本发明还提供根据上述方法提取或精制得到的化合物的应用，其用于制造动物饲料、鱼饲料及/或植物肥料。 
具体实施方式
本发明涉及通过培养微生物来制造干燥菌体及/或含有PUFA的油脂及/或含有PUFA的磷脂的方法，所述干燥菌体的菌体内包含含有PUFA的油脂及/或含有PUFA的磷脂，所述微生物能生产含有以组成脂肪酸形式存在的多不饱和脂肪酸的化合物(含有PUFA的油脂及/或含有PUFA的磷脂)。 
因此，必须培养这样的微生物，该微生物能产生含有以组成脂肪酸形式存在的多不饱和脂肪酸的化合物(甘油三酯及/或磷脂)。优选下述微生物，该微生物产生至少一种下述的多不饱和脂肪酸：碳原子数为18个或18个以上且含有3个或3个以上双键的ω6系列多不饱和脂肪酸、碳原子数为18个或18个以上且含有2个或2个以上双键的ω9系列多不饱和脂肪酸、碳原子数为18个或18个以上且含有3个或3个以上双键的ω3系列多不饱和脂肪酸，且上述多不饱和脂肪酸主要作为甘油三酯及/或磷脂的组成脂肪酸。 
作为碳原子数为18个或18个以上且含有3个或3个以上双键的ω6系列多不饱和脂肪酸，可列举γ-亚麻酸(6，9，12-十八碳三烯酸)、双高-γ-亚麻酸(8，11，14-二十碳三烯酸)、花生四烯酸(5，8，11，14-二十碳四烯酸)、7，10，13，16-二十二碳四烯酸(22：4ω6)及DPAω6(4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸)；作为碳原子数为18个或18个以上且含有2个或2个以上双键的ω9系列多不饱和脂肪酸，可列举6，9-十八碳二烯酸、8，11-二十碳二烯酸及Mead酸(5，8，11-二十碳三烯酸)；作为碳原子数为18个或18个以上且含有3个或3个以上双键的ω3系列多不饱和脂肪酸，可列举α-亚麻酸(9，12，15-十八碳三烯酸)、6，9，12，15-十八碳四烯酸(18：4ω3)、8，11，14，17-二十碳四烯酸(20：4ω3)、EPA(5，8，11，14，17-二十碳五烯酸)、DPAω3(7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸)及DHA(4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸)。 
因此，在本发明中，任何能产生含有多不饱和脂肪酸的化合物(油脂(甘油三酯)及/或磷脂)的微生物都可以使用，所述多不饱和脂肪酸以组成脂肪酸的形式存在。例如，作为能产生含有花生四烯酸的油脂(甘油三酯)的微生物，且所述花生四烯酸以组成脂肪酸的形式存在，可列举属于被孢霉 (Mortierella)属、耳霉(Conidiobolus)属、腐霉(Pythium)属、疫霉(Phytophthora)属、青霉(Penicillium)属、枝孢霉(Cladosporium)属、毛霉(Mucor)属、镰刀霉(Fusarium)属、曲霉(Aspergillus)属、红酵母(Rhodotorula)属、虫霉(Entomophthora)属、刺孢囊霉(Echinosporangium)属、水霉(Saprolegnia)属的微生物。 
属于被孢霉(Mortierella)属被孢霉(Mortierella)亚属的微生物可列举长孢被孢霉(Mortierella elongata)、微小被孢霉(Mortierella exigua)、喜湿被孢霉(Mortierella hygrophila)、高山被孢霉(Mortierella alpina)等。具体可列举长孢被孢霉(Mortierella elongata)IFO8570、微小被孢霉(Mortierella exigua)IFO8571、喜湿被孢霉(Mortierella hygrophila)IFO5941、高山被孢霉(Mortierella alpina)IFO8568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS219.35、CBS224.37、CBS250.53、CBS343.66、CBS527.72、CBS529.72、CBS608.70、CBS754.68等菌株。 
作为能产生DHA的微生物，可列举属于红藻(Crypthecodinium)属、破囊壶菌(Thrautochytrium)属、裂殖壶菌(Schizochytrium)属、吾肯氏壶菌(Ulkenia)属、日本壶菌(Japonochytrium)属或海壶菌(Haliphthoros)属的微生物。 
这些菌株都可以无限制地从大阪市财团法人发酵研究所(IFO)、美国典型菌种保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)及荷兰霉菌中心保藏所(Centrralbureau voor Schimmelcultures(CBS))获得。此外，也可以使用本发明研究组从土壤中分离得到的高山被孢霉1S-4菌株、长孢被孢霉SAM0219(Mortierella elongata SAM0219)(微工研菌寄第8703号)(于1986年12月22日保藏在日本国茨城县筑波郡谷田部町东1丁目1番3的通商通产省工业技术院微生物工业技术研究所，保藏编号FERM BP-1239，微工研条寄第1239号)菌株。 
为了培养本发明使用的菌株，首先将这些菌株的营养细胞、胞子及/或菌 丝、或由预培养得到的种培养液或种培养回收的营养细胞、胞子及/或菌丝接种到液体培养基或固体培养基中，进行培养。作为培养基的碳源，可采用通常使用的碳源，例如葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、糖蜜、甘油、甘露醇、糖化淀粉等，但并不限于这些。 
作为氮源，除蛋白胨、酵母提取物、麦芽提取物、肉膏、酪蛋白氨基酸、玉米浆、大豆蛋白、脱脂大豆、棉籽饼粉等天然氮源外，还可以使用尿素等有机氮源以及硝酸钠、硝酸铵、硫酸铵等无机氮源，特别是源自大豆的氮源，具体可列举大豆、脱脂大豆、大豆饼、食用大豆蛋白、豆腐渣、豆浆、熟豆面等，尤其是热变性后的脱脂大豆，更优选在约70～90℃下经热处理并除去乙醇可溶成分的脱脂大豆，其可单独或多种或与上述氮源组合使用。 
此外，可根据需要，使用磷酸根离子、钾离子、钠离子、镁离子、钙离子，还可使用铁、铜、锌、锰、镍、钴等金属离子和维生素等作为微量元素营养源。这些培养基成分只要其浓度不损害微生物的生长发育，其他无特别限制。实际使用时，一般来说，碳源总添加量为0.1～40重量％，优选1～25重量％，氮源总添加量为2～15重量％，优选2～10重量％，更优选初始碳源的添加量为1～5重量％，初始氮源的添加量为3～8重量％，培养过程中流加碳源及氮源进行培养，更优选只流加碳源进行培养。 
为了增加含有PUFA的油脂的产量，可单独或组合使用不饱和脂肪酸的前体，不饱和脂肪酸的前体例如：烃，比如十六烷或十八烷；脂肪酸，比如油酸或亚油酸或其盐或脂肪酸酯，比如乙酯、甘油脂肪酸酯、山梨糖醇酐脂肪酸酯；或油脂类，比如橄榄油、大豆油、菜籽油、棉籽油或椰子油。底物添加量是培养基的0.001～10％，优选0.05～10％。也可以将这些底物作为唯一的碳源，进行培养。 
产生含有PUFA的油脂的微生物的培养温度根据所用微生物的不同而不同，一般是5～40℃，优选20～30℃，也可以在20～30℃下培养，使菌体增殖后，在5～20℃下继续培养，使其产生含有PUFA的油脂。通过按此方式控制温度，也可提高PUFA在含有PUFA的油脂的组成脂肪酸中的比例。种培养采用通气搅拌培养、振荡培养、静置液体培养或固体培养，主培养采用通气搅拌培养。主培养开始时(种培养液接种时)，将培养基的pH值调至5～7，优选5.5～6.5。种培养各个阶段的培养时间一般为1～10天，优选1～5天，更优选1～3天。主培养的培养时间一般为2～30天，优选5～20天，更优选5～15天。 
已知属于被孢霉属被孢霉亚属的微生物能产生含花生四烯酸作为主要组成脂肪酸的化合物(油脂(含有花生四烯酸的甘油三酯)及/或含有花生四烯酸的磷脂)，本发明人等对上述菌株进行突变处理，获得了能产生含有双高-γ-亚麻酸作为主要组成脂肪酸的油脂的微生物(日本特开平5-91887)和能产生含有ω9系列多不饱和脂肪酸作为主要组成脂肪酸的油脂的微生物(日本特开平5-91888、日本特开平10-57085、日本特开平5-91886)。 
还得到了对高浓度碳源具有耐性的微生物(WO98/39468)，这些微生物是被孢霉属被孢霉亚属的微生物，用本发明的制造方法可生产含有PUFA的菌体及/或含有PUFA的油脂。但本发明并不限于被孢霉属被孢霉亚属的微生物，将本发明的制造方法适用于能产生含有以组成脂肪酸形式存在的多不饱和脂肪酸的化合物的微生物(油脂(甘油三酯)及/或磷脂)，可得到菌体内包含含有PUFA的油脂及/或含有PUFA的磷脂的干燥菌体、该油脂(粗油及/或精制油脂)及/或该磷脂(粗磷脂及/或精制磷脂)。 
从油脂蓄积在菌体内的微生物中得到粗油及/或粗磷脂的方法为：培养结 束后，通过自然沉降、离心分离及/或过滤等常用的固液分离方法，对培养液或经过杀菌、浓缩、酸化等处理后的培养液进行固液分离，得到培养菌体。为了促进固液分离，可添加絮凝剂和助滤剂等。絮凝剂例如可使用氯化铝、氯化钙、藻胶(algin)、壳聚糖(chitosan)等。助滤剂可使用硅藻土等。 
对回收的培养菌体进行干燥。干燥可以防止在菌体保管过程中发生腐败、氧化变质、水解等。还可以提高从菌体中提取粗油的效率。 
干燥方法的特征为组合使用传导传热方式的一次干燥和对流传热方式的二次干燥。 
传导传热方式干燥只要是使用以传导传热为主要热源的干燥器，没有特别限制，可优选加热紧贴输送型，更优选鼓式干燥器(drum dryer)。传热面的加热温度为100～200℃，优选105～170℃，更优选120～150℃，进行加热干燥。用双鼓干燥器(double drum dryer)进行一次干燥时，因传导传热使一次干燥菌体的菌体表层呈干燥纸片状(sheet)，挠动使其呈不定形薄片状(flake)。更具体为，薄片的厚度是0.05～4mm，优选0.1～1mm，竖边及横边(外接四角形各边的边长)是1～100mm，优选1～40mm，更优选2～20mm。按上述方法制成菌体表层干燥的一次干燥菌体，可有效地进行下一步对流传热方式的二次干燥。 
经过传导传热方式一次干燥的微生物生物质(菌体表层干燥)，接着进行对流传热方式的干燥。对流传热方式干燥只要是使用以对流传热为主要热源的干燥器，没有特别限制，优选使用物料移送型、物料搅拌型或热风移送型，更优选使用通气带式的物料移送型、或流化床、振动流化床这样的物料搅拌型。对流传热的热风温度为40～200℃，优选60～170℃，更优选以温度为80～150℃的热风进行干燥。 
对流传热型干燥器通过供给热风，将蒸发的水分迅速从原料附近除去，因此水分蒸发的推动力大，在希望大幅度减少水分含量时，可认为是有效方法。但另一方面，存在这样的问题：因供给大量热风，造成干燥物料微粉飞散和送风机耗能，而且，高水分含量原料因原料间粘着而引起结块及热风接触面积降低。 
另一方面，传导传热型干燥器的热效率高，且几乎不需要风量，因此可大幅度减少送风机能耗和原料飞散。但另一方面，因为只通过传热方式加热，所以很难干燥至低水分含量。因此，设计了采用上述两种传热方式的优点的新型干燥方法，所述新型干燥方法在水分含量高的物料预热阶段至恒率干燥阶段，实施传导传热方式干燥，而在水分含量低的恒率干燥阶段至降率干燥阶段，实施对流传热方式干燥。 
例如，在传导传热方式之一的双鼓干燥器法(double drum dryer)中，一次干燥就可大幅度降低水分含量，并且因菌体表层被干燥，可防止二次干燥中因原料间粘着而结块和随之引起的与热风接触面积的减少。而且，与不进行一次干燥的以往方法相比，在对流传热方式干燥工序中，由于能减少热风风量及/或热风处理时间，所以可减少飞散量和电热消耗，被认为比以往方法更好。 
用于菌体干燥的机器种类只要是传导传热方式及对流传热方式，没有其他特别限制，具体例子可列举以下机器。但本发明并不限于这些机器，任何具有相同干燥原理的机器都可以使用。 
作为传导传热方式的干燥器，可列举： 
(株)大川原制作所制造 圆锥型螺条式(ribbon)混合干燥器、 
(株)大川原制作所制造 传导传热干燥装置、 
山本技研工机(株)制造 鼓式干燥器(drum dryer)、 
(株)OKADORA制造 旋风干燥器(cyclone dryer)。 
另外，作为对流传热方式的干燥器，可列举： 
(株)DULTON制造 振动流化床干燥器、 
(株)DULTON制造 卧式连续式流化床干燥装置、 
(株)DULTON制造 回转型干燥器、 
(株)DULTON制造 箱型平行流干燥器、 
(株)DULTON制造 箱型通气干燥器、 
神钢电机(株)制造 振动干燥冷却装置、 
(株)大川原制作所制造 流化床干燥装置、 
(株)大川原制作所制造 带式通气干燥装置、 
(株)大和三光制作所制造 带式干燥器。 
菌体干燥后，进行含有PUFA的粗油及/或含有PUFA的粗磷脂的回收。粗油及/或粗磷脂的回收方法可采用有机溶剂提取法、压榨法等，优选在氮气流下用有机溶剂提取。有机溶剂可采用乙醇、己烷、甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、石油醚、丙酮等，也可采用甲醇与石油醚的交替提取、氯仿-甲醇-水单相溶剂。然而，粗油及/或粗磷脂的提取方法并不限于上述方法，任何能有效地提取菌体内油脂(甘油三酯)及/或磷脂的方法都可以使用。例如，可采用超临界CO2流体萃取法等有效方法。 
在减压等条件下，从用有机溶剂或超临界流体等提取得到的提取物中除去有机溶剂或超临界流体成分，可获得目标粗油及/或粗磷脂。 
本发明得到的干燥菌体、或粗油(含有PUFA的粗油脂)及/或粗磷脂(含有PUFA的粗磷脂)可添加到动物饲料中直接使用，所述干燥菌体的菌体内包含含有多不饱和脂肪酸的化合物(含有PUFA的油脂及/或含有PUFA的磷脂)， 所述多不饱和脂肪酸以组成脂肪酸的形式存在。但考虑使其适于食品的应用时，优选使用经过一般油脂精制工序得到的含有PUFA的精制油脂。油脂精制工序可采用脱胶、脱酸、脱臭、脱色、柱处理、分子蒸馏、脱蜡等常用方法。 
关于本发明的微生物生物质、菌体内包含油脂(甘油三酯)及/或磷脂的干燥菌体、粗油、精制油脂(甘油三酯)、粗磷脂、精制磷脂的用途，有无限的可能性，可用作食品、饮料、化妆品、医药品的原料及添加剂。并且其使用目的及使用量不受任何限制。 
例如，作为食品组合物，除普通食品外，还可以列举功能性食品、营养补助食品、早产儿配方奶粉、足月儿配方奶粉、婴儿配方奶粉、婴儿食品、孕产妇食品或老年人食品等。作为含有油脂的食品，可列举肉、鱼或坚果等含有天然油脂的天然食品；烹调汤等时加入油脂的食品；炸面圈等以油脂作为加热介质的食品；黄油等油脂食品；加工曲奇饼干等时加入油脂的加工食品；或硬饼干等在加工完成时喷雾或涂布油脂的食品等。也可以添加到不含油脂的农产食品、发酵食品、畜产食品、水产食品或饮料中。还可以是功能性食品·医药品的形态，例如可以是经肠营养剂、粉末、颗粒、片剂(troche)、内服液、悬浮液、乳浊液、糖浆等加工形态。 
实施例 
下面，通过实施例，更具体地说明本发明。但本发明不限于实施例。 
实施例1  干燥菌体的流化床冷却
将高山被孢霉(Mortierella alpina)1S-4株的孢子悬浮液以0.1vol.％接种于含有酵母提取物1.0％、葡萄糖2.0％、pH值为6.3的培养基中，在往复振荡100rpm、温度28℃的条件下，开始种培养(第一阶段)，培养三天。 
然后，在容量为50L的通气搅拌培养槽中，制备30L含有酵母提取物1％、葡萄糖2％、大豆油0.1％、pH值为6.3的培养基，将种培养(第一阶段)液接种到该培养基中，在搅拌回转数200rpm、温度28℃、槽内压150kPa的条件下，开始种培养(第二阶段)，培养2天。 
然后，将4500L培养基(培养基A：大豆粉336kg、KH2PO4 16.8kg、MgCl2·6H2O 2.8kg、CaCl2·2H2O 2.8kg、大豆油5.6kg)的pH值调至4.5，在121℃下，灭菌20分钟。将1000L的另一培养基(培养基B：含水葡萄糖112kg)在140℃下灭菌40秒，将其加入到上述培养基A中，制成培养基C。在培养基C中，加入经灭菌的氢氧化钠水溶液，调pH值至6.1后，接种28L种培养液(第二阶段)，合计制成5600L初始培养液量(培养槽容积为10kL)。在温度26℃、通气量49Nm3/hr、内压200kPa下，开始培养。在培养过程中流加培养基，流加方法如下所示，进行306个小时的主培养。培养结束时，培养液受到由流加培养基引起的增加和由蒸发引起的减少的影响，培养液量变为7730L。 
主培养时间  流加培养基 
19小时后    含水葡萄糖280kg/460L 
43小时后    含水葡萄糖280kg/450L 
67小时后    含水葡萄糖252kg/390L 
91小时后    含水葡萄糖252kg/410L 
120小时后   含水葡萄糖224kg/370L 
140小时后   含水葡萄糖168kg/280L 
163小时后   含水葡萄糖168kg/270L 
培养结束后，在120℃下，杀菌20分钟，再用连续式脱水机回收湿菌体， 将其破碎后，在振动流化床干燥器中通过热风干燥(热风温度为120℃)，干燥至水分含量为1wt％。将干燥后的菌体在流化床中通过供给室温空气冷却至40℃后，用空气输送机将干燥菌体输送至充填场所。将得到的干燥菌体与氮气一起充填到容积约为1m3的铝制包装袋中，袋口热封后，在10℃或10℃以下的冷藏室中保管。 
对从包装袋取出的干燥菌体实施己烷提取，过滤己烷溶液除去含有的固形物后，在减压下加热除去己烷，得到含有花生四烯酸的粗油，所述花生四烯酸以组成脂肪酸的形式存在。 
实施例2  干燥菌体的静置冷却
采用与实施例1相同的方法，培养、杀菌后，菌体回收与干燥也采用与实施例1相同的方法进行。将干燥菌体移至平盘(vat)并均匀铺开，使层压为1cm或1cm以下，在室温下，静置冷却。冷却至50℃后，与氮气一起充填到容积约为200L的铝制包装袋中，袋口热封后，在10℃或10℃以下的冷藏室中保管。 
比较例1  干燥菌体不经冷却直接充填
采用与实施例1相同的方法，培养、杀菌后，菌体回收与干燥也采用与实施例1相同的方法进行。干燥菌体在干燥后立即与氮气一起充填到容积约为200L的铝制包装袋中，袋口热封后，在10℃或10℃以下的冷藏室中保管。 
实施例3  干燥菌体的分析
充填后一周，将实施例1、实施例2及比较例1的充填包装袋开封，观察干燥菌体的外观。然后，以正己烷为溶剂，用索氏提取法(Soxhlet extraction)提取粗油，求得油分。还分析了用实施例1的方法提取得到的粗油的过氧化物价(POV)。 
证实：如比较例1所示，如果不经冷却直接充填，会导致菌体及油分的急剧变质。 
[表1] 
   实施例1的菌体  实施例2的菌体   比较例1的菌体
  菌体的外观   与充填时一样  (褐色粉碎状)   与充填时一样  (褐色粉碎状)   与充填时不一样  (浓褐色结块)
  油分(wt％)   55％   53％   20％
  粗油的外观   黄色   黄色   茶褐色
  粗油的POV  (meq/kg)   0.7meq/kg   1.0meq/kg   200meq/kg
实施例4  微生物生物质造粒后干燥的以往方法与用传导传热方式及对流传热方式干燥微生物生物质的本发明的比较
采用与实施例1相同的方法，培养花生四烯酸生产菌Mortierella alpine 1S-4株后，用连续式脱水机(YANAGAWA ENGINEERING制造，积水CS-1型)过滤，得到湿菌体块。采用干燥减量法(温度为105℃)测定湿菌体的水分含量，测得水分含量为52％。将该湿菌体块在以下各条件下干燥(实验4-1～实验4-2)。因实验4-1在室温下造粒成型，所以水分含量在成型前后没有变化。 
实验4-2在双鼓干燥器中进行一次干燥。 
然后，将这些造粒菌体及一次干燥菌体提供给流化床干燥器，干燥至水分含量接近2％。采用实施例2的方法将干燥后的菌体冷却，再提取油脂，观察外观并测定过氧化物价，结果发现：外观均良好、POV均在10meq/kg或 10meq/kg以下，均可得到良好的精制油脂的原料粗油。实验4-2实施两步干燥，在干燥时间及干燥收率上，实验4-2的结果比实施一步干燥的实验4-1好。 
[表2] 
Figure G06106488420060215D000211
※干燥收率(％)＝所得干燥物量(干燥物换算)/原料投入量(干燥物换算)×100 

Claims (13)

1.从在菌体内生产含有以花生四烯酸、二高-γ-亚麻酸、Mead酸或二十碳五烯酸为组成脂肪酸的甘油三酯和/或磷脂的属于被孢霉属的微生物生物质获得干燥菌体的方法，该方法包括以下步骤：
(a)用培养液培养微生物；
(b)从培养液回收菌体，准备或取得平均水分含量为30％到80％的湿菌体；
(c)将湿菌体用100～200℃的加热紧贴输送型干燥器作为传导传热方式进行一次干燥，得到平均水分含量为5％到50％的一次干燥菌体；
(d)将上述(c)得到的一次干燥菌体供给40-200℃的使用对流热方式进行的二次干燥，得到平均水分含量为10％或10％以下的二次干燥菌体。
2.权利要求1的方法，其中步骤(c)中所述传导传热方式为圆锥型螺条式混合干燥器、传导传热干燥器、鼓式干燥器或旋风干燥器。
3.权利要求2的方法，其中步骤(c)中的传导传热方式为双鼓式干燥器。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中步骤(c)中的传导传热方式的传热面的加热温度为105-170℃。
5.权利要求1的方法，其中步骤(d)中所述对流传热方式为振动流化床干燥器、卧式连续式流化干燥装置、回转型干燥器、箱型平行流干燥器、箱型通气干燥器、振动干燥冷却装置、流化床干燥装置、带式(band)通气干燥装置或带式干燥器。
6.权利要求1的方法，其中步骤(d)中的对流传热方式的热风温度为60-170℃。
7.权利要求1的方法，其中，所述(b)的湿菌体通过对培养液进行固液分离而得到。
8.权利要求7的方法，其中，所述固液分离与机械脱水并用。
9.权利要求1的方法，其中，所述被孢霉属微生物为高山被孢霉(Mortierella alpina)。
10.权利要求1的方法，其特征为，用以下任一种方法冷却处理上述工序(d)得到的二次干燥菌体：
(i)通过供给含氧浓度为21％或21％以下的气体，至少冷却至60℃；或
(ii)在含氧浓度为21％或21％以下的气体中，静置冷却，至少冷却至60℃。
11.权利要求10的方法，其中冷却后的二次干燥菌体通过以下任意一种方法保藏：
(I)将上述菌体与氮气一起充填到可密闭的容器中，至少在15℃或15℃以下保藏；或
(II)将上述菌体与氧浓度为20％或20％以下的气体一起充填到可密闭的容器中，至少在15℃或15℃以下保藏。
12.一种制造动物饲料的方法，其使用根据权利要求1～9中任一项的方法获得的干燥菌体。
13.一种制造鱼饲料的方法，其使用根据权利要求1～9中任一项的方法获得的干燥菌体。
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