CN1815222A

CN1815222A - 生物样品中胡黄连苷－i含量的测定方法

Info

Publication number: CN1815222A
Application number: CN 200510004888
Authority: CN
Inventors: 周亚伟
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2005-02-03
Filing date: 2005-02-03
Publication date: 2006-08-09

Abstract

本发明提供了一种利用高效液相色谱法快速测定生物样品中胡黄连苷－I含量的方法。采用内标法进行定量，以十八烷基硅烷健合硅胶柱为固定相，以乙腈－水为流动相，采用梯度洗脱方法。本发明所述的生物样品需要经抗氧化剂处理并用有机溶剂沉淀蛋白后再进行测定。该方法具有操作简单；灵敏度高，最低定量限为0.1μg·mL^－1；专属性强；回收率高，大于90％；重现性良好等优点，可用于生物样品中胡黄连苷－I含量的测定。

Description

生物样品中胡黄连苷-I含量的测定方法

技术领域

本发明属于药物分析领域，具体涉及生物样品中胡黄连苷-I的含量测定方法。

背景技术

胡黄连作为传统中药材具有消蒸退热功效，始载于唐《新修本草》，胡黄连苷-I是胡黄连的主要有效成分，属于环烯醚萜类化合物。目前虽然对该化合物的化学分析方法已经有论述，但对生物样品中胡黄连苷-I的含量分析方法仅在1997年有过一篇关于血浆中胡黄连苷-I的含量测定的报道(Joural Chromatography B，698(1997)317-320)，该法采用高效液相紫外检测法测定了口服给药100mg后兔血浆中胡黄连苷-I的浓度，血浆样品经甲醇沉淀蛋白、乙酸乙酯提取处理后，在275nm波长下进行检测，该法定量下限为50ng/mL，且仅测定给药后5小时血浆样品中胡黄连苷-I的含量，灵敏度较低，且该报道中所用预处理方法复杂，回收率低，重现性极差，不能用于生物体内胡黄连苷-I含量的测定。

发明内容

本发明的目的在于提供一种测定生物样品中胡黄连苷-I含量的方法。

本发明主要采用高效液相色谱法对胡黄连苷-I在生物样品中的含量进行测定，采用内标法进行定量。

本发明所测对象为胡黄连苷-I，其外观：浅黄色或类白色疏松块状物，结构式：C₂₄H₂₈O₁₁，化学结构见图1。

本发明采用内标法进行定量。内标的选用原则：选用理化性质与被测组分接近、与被测物有相近的水相和有机相分配行为，且与代谢物不反应、以及不影响待测物测定的化合物作为内标。本发明采用的内标为芍药苷。

本发明所用的对照品为胡黄连苷-I和内标，该对照品的溶解溶剂可为乙腈、甲醇或水等。

色谱条件可为：以十八烷基硅烷健合硅胶固定相，以乙腈-水溶液为流动相，采用梯度洗脱程序；紫外检测波长范围为250nm～290nm。

本发明所用仪器包括：紫外可见分光光度计，高效液相色谱仪，色谱柱，紫外检测器等。

本发明所需材料为：生物样品，胡黄连苷-I对照品，内标对照品，内标溶解溶剂，抗氧化剂，微孔滤膜等。

对照品溶液的制备：精密称取适量的胡黄连苷-I对照品，加溶解溶剂，配制成一定浓度的胡黄连苷-I对照品溶液，然后按倍比稀释得不同浓度的胡黄连苷-I对照品溶液；精密称取内标对照品，加溶解溶剂配制成一定浓度的内标对照品溶液。所有溶液于4℃储存备用。

上述溶解溶剂可以是乙腈，也可是甲醇和水等。

本发明所采用的技术方案的主要包括：生物样品的采集；生物样品的预处理；生物样品中胡黄连苷-I标准曲线的制备；生物样品中胡黄连苷-I含量的测定。为了更好地说明本发明的技术方案，现叙述如下：

1.生物样品的采集

取健康动物，隔夜禁食，自由饮水，给予一定浓度的胡黄连苷-I药物溶液。药后取血；胆管插管术进行胆汁引流，收集胆汁。代谢笼收集尿粪，取心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、肠、子宫、睾丸、脂肪、肌肉等组织器官。

上述动物包括啮齿类动物和非啮齿类动物，如犬、兔、鼠等。

该发明也适用于人，即给予一定浓度的胡黄连苷-I药物溶液后，采集血液，收集尿液，粪便等。

上述生物样品包括：血液，胆汁，尿，粪，及心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、肠、子宫、睾丸、脂肪、肌肉等组织器官。

上述胡黄连苷-I可以原料药形式存在，也可以不同制剂形式存在。其剂型可包括单体制剂和复方制剂，可以是冻干粉针剂、注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、贴剂、丸剂等。

上述胡黄连苷-I制剂可以不同形式的途径给药，包括口服、静脉滴注、静脉注射、经皮等。

2.生物样品的预处理

血液离心后制备成血浆；组织用匀浆机研磨制成匀浆；胆汁用双蒸水稀释4-6倍；尿液用双蒸水稀释；粪烘干后用双蒸水稀释。

取经上述处理过的生物样品，加入一定量的抗氧化剂，对生物样品进行抗氧化处理。

对血浆、胆汁、组织等生物样品进行除蛋白处理：取已加入抗氧化剂的血浆、胆汁、组织等生物样品，置含有内标的试管中，加入蛋白质沉淀剂，混匀后吸取上清置另一试管中；于残渣中再加入蛋白质沉淀剂，混匀，合并两次上清液，挥干；于残留物中加入乙腈或甲醇或水，或其混合物，混匀，离心，吸取上清，微孔滤膜过滤。

对尿液的进一步处理：取一定体积的内标溶液，挥干；加入等体积经过滤且已加入抗氧化剂的尿液，混匀，注入已活化的固相萃取柱中；依次用水、2.5％乙腈-水溶液洗脱除杂，再用50％～100％乙腈-水溶液洗脱，收集洗脱液；挥干，用乙腈或甲醇或水，或其混合物复溶，混匀，微孔滤膜过滤。

上述抗氧化剂可以是抗坏血酸等。

蛋白质沉淀剂可以为有机溶剂，包括乙腈、甲醇、丙酮、乙醇等。

3.生物样品中胡黄连苷-I标准曲线的制备

本发明所用的对照品为胡黄连苷-I和内标，其溶解溶剂为乙腈，也可是甲醇和水等。

本发明采用高效液相色谱法测定胡黄连苷-I在生物样品中的含量，其色谱条件可为：以十八烷基硅烷健合硅胶为固定相；以乙腈-水溶液为流动相；采用梯度洗脱程序。

生物样品中胡黄连苷-I标准曲线的制备过程：

(1)取一定体积的内标溶液，分别加入等体积不同浓度的胡黄连苷-I溶液，挥干；

(2)于残渣中加入等同胡黄连苷-I溶液体积的空白生物样品，加入蛋白质沉淀剂，混匀，吸取上清置另一试管；于残渣中加入蛋白质沉淀剂，混匀；合并两次的上清，挥干；

(3)于残留物中加入等同于空白生物样品溶液体积的流动相，混匀，离心，吸取上清，微孔滤膜过滤；

(4)精密吸取滤液，注入高效液相色谱仪，记录胡黄连苷-I和内标的峰面积；

(5)分别以胡黄连苷-I的浓度为横坐标，以胡黄连苷-I与内标的峰面积比为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归计算，求得线性方程即为标准曲线。

所述蛋白质沉淀剂可以是乙腈、甲醇、丙酮、乙醇等。

4.生物样品中胡黄连苷-I含量的测定

生物样品经上述预处理后，吸取滤液10μL注入色谱仪中。将峰面积比代入标准曲线，计算即得该生物样品中胡黄连苷-I的含量。

以上为实现定量测定胡黄连苷-I在生物体内含量的总技术方案。

本发明的重点：利用抗氧化剂对生物样品进行预处理，解决了药物结构的不稳定性问题；通过比较液液萃取和沉蛋白方法，优化了预处理方法；利用梯度洗脱有效地控制了内标和胡黄连苷-I的保留时间；在单纯采用沉蛋白方法不能解决内源性物质对内标和药物的干扰时，采用固相萃取柱对生物样品先除杂后测定，收到了较好的效果。

本发明的主要优点：灵敏度好，专属性强，重现性好，回收率高。操作简单，所用仪器、药品、试剂均常见易得，在普通实验室即可实施。生物样品预处理方法简便，快速，回收率大于90％。采用梯度洗脱程序有效地缩短了测定时间。

附图说明

图1胡黄连苷-I的化学结构

图2利用高效液相色谱法检测胡黄连苷-I的典型色谱图

a)空白生物样品色谱图；

b)胡黄连苷-I对照品色谱图；

c)内标(芍药苷)对照品色谱图；

d)空白血浆中加入胡黄连苷-I和内标色谱图；

e)静脉注射胡黄连苷-I 2min后血浆样品色谱图。

具体实施例

用以下的实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于下列实施例包含的内容。

实施例1注射用胡黄连苷-I冻干粉针剂在大鼠体内血药浓度测定

1.仪器与材料

1.1仪器Shimadzu SPD-10AT_VP双泵液相色谱仪；保护柱：Shim-packGVP-ODS(10mm×4.6mm，5μm)(日本岛津公司)；N2000色谱工作站

1.2材料胡黄连苷I对照品(北大世佳研究中心提供，批号：010114)；内标对照品：芍药苷(中国药品生物制品检定所，批号：0736-200219)；胡黄连苷I冻干粉针剂(北大世佳研究中心提供，批号：020912规格60mg/支，纯度：96.63％)；乙腈(色谱纯，DIKMA公司)；甲醇(色谱纯)；抗坏血酸、四氯化碳(均由北京化学试剂公司提供)；三蒸水(北京大学化学系提供)；0.22μm微孔滤膜(国产)；Wistar大鼠，雌雄各半，体重200～240g，中国医学科学院实验动物研究所，合格证号：scxk京11-00-0006。

2.实验方法

2.1色谱条件

色谱柱：Agilent XDB C₁₈柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：A相∶乙腈，B相∶水；梯度洗脱程序为A∶B(0-1min)20∶80，(1-2min)24∶76，(2-6min)24∶76，(6-8min)20∶80，(7-14)20∶80；流速：1.0mL·min^-1；柱温：室温；检测波长：277nm；灵敏度：0.0100AUFS，进样量：10μL。

2.2对照品溶液的配制

精密称取胡黄连苷-I对照品15mg，置100mL容量瓶中，加乙腈溶解，定容至刻度，得浓度为150μg·mL^-1的胡黄连苷-I乙腈溶液，然后倍比稀释，得系列浓度的胡黄连苷-I对照品储备溶液。精密称取芍药苷对照品50mg，置50mL容量瓶中，加乙腈溶解，定容至刻度，得浓度为1000μg·mL^-1的内标储备溶液。所有储备溶液于4℃储存备用。

2.3血浆样品的采集

分别取成年健康Wistar大鼠30只，随机分为3组，雌雄各半，隔夜禁食12h，自由饮水，将胡黄连苷-I冻干粉针剂以生理盐水溶解，按7、14、40mg/kg尾静脉注射给药。分别于给药前及药后0.5、2、10、15、20、30、45、60、90、120、150、180min取血0.5～1mL，置肝素化具塞试管中，离心，取血浆195μL，并加入25％抗坏血酸水溶液5μL，混匀，于-20℃冷藏备用。

2.4血浆样品预处理

取芍药苷乙腈溶液200μL，置5mL试管，40℃水浴中N₂气吹干；加入25％抗坏血酸水溶液5μL和空白血浆195μL，置含内标的试管中，加入500μL乙腈，涡旋混匀1min，吸取上清置另一试管，于残渣中再加入500μL乙腈，涡旋1min，合并两次的上清，40℃水浴中N₂气吹干；于残留物中加入200μL流动相，涡旋混匀，离心，吸取上清，0.22μm微孔滤膜过滤；取滤液10μL，注入色谱仪中。

3.实验结果

3.1方法学确证

3.1.1分析方法的专属性：分别将大鼠空白血浆色谱图与血浆中胡黄连苷-I、芍药苷及药后血浆样品色谱图进行比较。结果表明：含胡黄连苷-I和芍药苷的血浆样品经预处理后，在上述色谱条件下能被检测到，且血浆中内源性物质及药物在体内代谢产物不干扰胡黄连苷-I与芍药苷的测定。胡黄连苷-I保留时间为9.9min，内标芍药苷的保留时间为5.9min。结果见图2。

3.1.2灵敏度及标准曲线性关系考察

取芍药苷乙腈溶液200μL，分别加入200μL胡黄连苷-I系列浓度的乙腈储备溶液，40℃水浴中N₂气吹干；加入空白血浆195μL和25％抗坏血酸水溶液5μL，使大鼠血浆中胡黄连苷-I的浓度分别为0.1、0.5、5、50、100、150μg/mL，其余步骤按照2.4“血浆样品的预处理”项下操作，建立标准曲线。分别以血浆中胡黄连苷-I的浓度为横坐标，以胡黄连苷-I与内标的峰面积比为纵坐标，用加权最小二乘法(权重W＝1/X²)进行回归计算，求得线性方程为：Y＝4.47×10^-4+1.77×10^-2X(r＝0.9994)胡黄连苷-I最低检测限为0.025μg/mL。

3.1.3方法回收率

制备胡黄连苷-I高、中、低三个浓度的样品(其中胡黄连苷-I浓度为0.5、50、100μg/mL)，每个浓度平行制备6份，依上述方法测定。分别记录胡黄连苷-I的峰面积，与相应浓度的胡黄连苷-I对照品溶液直接进样的峰面积(三次测定的平均值)相比，计算胡黄连苷-I的绝对回收率(n＝6)。结果分别为94.70±3.27％、95.09±0.78％、95.91±0.83％，平均值为95.23±0.62％。内标三个浓度的回收率分别为95.25±2.56％、90.87±3.81％、93.72±3.21％，平均值为93.28±2.22％。

3.1.4日内、日间精密度准确度

制备胡黄连苷-I高、中、低三个浓度的样品，每个质控浓度平行制备6份样品，重复测定3日，以当日的标准曲线计算质控样品的浓度。计算日内精密度RSD和日内准确度RE，及日间RSD和日间RE。结果高、中、低浓度日内RSD分别为3.21％、1.65％、2.08％。日内RE分别为1.47％、3.01％、7.11％。日间RSD分别为3.68％、3.82％、4.96％，日间RE分别为0.44％、2.95％、4.32％。

3.2血浆中胡黄连苷-I的测定结果

血浆中胡黄连苷-I的浓度＝(胡黄连苷-I峰面积/芍药苷峰面积-标准曲线A值)/标准曲线B值。结果见下表：

表血浆中胡黄连苷-I的测定结果

时间(min)	x±S(μg/mL)
	x±S(μg/mL)			7mg/kg	14mg/kg	40mg/kg
	0.5min2min5min10min15min20min30min45min60min90min120min150min180min	37.12±11.1715.88±6.026.77±3.593.34±2.251.94±1.041.34±1.150.86±0.670.41±0.230.25±0.120.14±0.07------	80.59±17.6830.21±10.4514.08±5.286.08±2.463.76±1.862.56±1.421.56±0.990.87±0.450.57±0.370.34±0.260.16±0.110.12±0.03---	7mg/kg	14mg/kg	40mg/kg	234.75±75.4696.97±38.4738.39±16.5314.50±7.75---5.52±2.193.43±1.372.22±0.921.50±0.580.81±0.310.46±0.210.29±0.190.14±0.017

4.结论

本发明人采用高效液相色谱法检测血浆样品中胡黄连苷-I的含量，该方法专属性强，无代谢产物及内源性物质干扰胡黄连苷-I的测定；重现性好，日内、日间精密度均小于10％；回收率高，绝对回收率大于90％。同时对静脉注射胡黄连苷-I三个剂量后药物在大鼠血浆中的浓度进行测定，结果显示：药后血浆中能够检测到胡黄连苷-I，最低检测极限为0.1μg·mL^-1。

实施例2胡黄连苷-I冻干粉针剂在Beagle犬体内血药浓度测定

实验动物为非啮齿类动物Beagle犬。按实施例1所述相同步骤进行操作。

结果显示：胡黄连苷-I在Beagle犬血浆中测定，方法学中日内及日间精密度分别为5.23％、6.19％，回收率为91.73％-95.87％。犬静脉注射胡黄连苷-I 2.5mg/kg后，血浆中能够检测到胡黄连苷-I，药后2min血中平均浓度为17.05μg/mL。

实施例3胡黄连苷-I冻干粉针剂在大鼠组织中的浓度测定

对大鼠尾静脉注射胡黄连苷-I 7mg/kg后，取心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、肠、子宫、睾丸、脂肪、肌肉等组织器官，生理盐水制备组织匀浆，以乙腈沉蛋白后进行测定。色谱条件同实施例1。结果显示：胡黄连苷-I在各组织中均能被检测到，药后5min肾组织中平均药物浓度最高，为66.61μg/mL；脑组织浓度最低，为0.65μg/mL。

实施例4胡黄连苷-I冻干粉针剂在大鼠尿中的浓度测定

大鼠尾静脉注射胡黄连苷-I 7mg/kg后，以代谢笼收集药后不同时间段的尿，加入抗坏血酸，并用固相萃取柱进行固相萃取，除杂后测定。结果显示：方法学中胡黄连苷-I绝对回收率大于90％。药后2小时尿中药物平均浓度为124μg/mL。

实施例5注射用胡黄连苷-I冻干粉针剂在大鼠胆汁中的浓度测定

大鼠以10％乌拉坦按1mL/100g的量腹腔麻醉后进行胆管插管术，尾静脉注射胡黄连苷-I7mg/kg，收集给药后不同时间的胆汁，加入抗坏血酸抗氧化，加入乙腈沉淀蛋白，测定。结果显示：方法学中胡黄连苷-I绝对回收率大于90％。药后半小时胆汁中药物平均浓度约为583μg/mL。

实施例6胡黄连苷-I片剂口服给药后大鼠体内血药浓度测定

分别取健康成年Wistar大鼠30只，随机分为3组，雌雄各半，隔夜禁食12h，自由饮水，将胡黄连苷-I片剂研磨，以生理盐水溶解，按10、20、40mg/kg灌胃给药。其它过程均按照实施例1进行操作。

结果表明：该方法专属性强，无代谢产物和内源性物质干扰胡黄连苷-I的测定；重现性好，日内、日间精密度均小于10％；回收率高，绝对回收率大于90％。同时对胡黄连苷-I片剂三个剂量灌胃给药后，对胡黄连苷-I在大鼠血浆中的浓度进行测定，结果显示：药后血浆中能够检测到胡黄连苷-I。

Claims

1.胡黄连苷-I在生物样品中的含量测定方法，其特征在于：采用高效液相色谱法对胡黄连苷-I在生物样品中的含量进行测定。具体包括如下步骤：

(1)生物样品的采集；

(2)生物样品的预处理；

(3)生物样品中胡黄连苷-I标准曲线的制备；

(4)生物样品中胡黄连苷-I含量的测定。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：以内标法进行定量。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于生物样品经预处理后，要选择合适的色谱条件进行测定，色谱条件可为：以十八烷基硅烷健合硅胶为固定相，以乙腈-水溶液为流动相，采用梯度洗脱程序；紫外检测波长范围为250nm～290nm。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于可选用理化性质与被测组分接近、与被测物有相近的水相和有机相分配行为，且与代谢物不反应、以及不影响胡黄连苷-I测定的化合物作为内标。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于内标可为芍药苷。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于胡黄连苷-I对照品和内标对照品的溶解溶剂可为乙腈、甲醇或水等。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述生物可以包括人、犬、鼠、兔等动物。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于生物样品包括血浆、胆汁、尿、粪、以及心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、肠、子宫、睾丸、脂肪、肌肉等组织器官。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于胡黄连苷-I可以不同制剂形式存在。

10.根据权利要求10所述的方法，其特征在于胡黄连苷-I制剂包括单体制剂和复方制剂。

11.根据权利要求11所述的方法，其特征在于制剂可以是冻干粉针剂、注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、贴剂、丸剂等。

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于胡黄连苷-I可以不同形式的途径给药，包括口服、静脉、经皮等。

13.根据权利要求1所述的生物样品的预处理，其特征在于：血液经离心后制备成血浆；组织用匀浆机研磨成匀浆；胆汁、尿液用双蒸水稀释；粪烘干后用双蒸水稀释。

14.根据权利要求13所述生物样品的预处理，其特征在于使用抗氧化剂对生物样品进行预处理。

15.根据权利要求14所述生物样品的预处理，其特征在于抗氧化剂可以是抗坏血酸。

16.根据权利要求13所述生物样品的预处理，其特征在于对血浆、胆汁、组织等生物样品进行去蛋白处理：取已加入抗氧化剂的血浆、胆汁、组织等生物样品，置含有内标的试管中，加入蛋白质沉淀剂，混匀后吸取上清置另一试管中；于残渣中再加入蛋白质沉淀剂，混匀，合并两次上清液，挥干；于残留物中加入乙腈或甲醇或水，或其混合物，混匀，离心，吸取上清，微孔滤膜过滤。

17.据权利要求13所述生物样品的预处理，其特征在于对尿液的预处理包括：取一定体积的内标溶液，挥干；加入等体积经过滤且已加入抗氧化剂的尿液，混匀，注入已活化的固相萃取柱中；依次用水、2.5％乙腈-水溶液洗脱除杂，再用50％～100％乙腈-水溶液洗脱，收集洗脱液；挥干，用乙腈或甲醇或水，或其混合物复溶，混匀，微孔滤膜过滤。

18.根据权利要求1所述生物样品中胡黄连苷-I标准曲线的制备，其特征在于包含如下步骤：

(2)于残渣中加入等同胡黄连苷-I体积的空白生物样品，加入蛋白质沉淀剂，混匀，吸取上清置另一试管；于残渣中加入蛋白质沉淀剂，混匀；合并两次的上清，挥干；

(3)于残留物中加入等同于空白生物样品体积的流动相，混匀，离心，吸取上清，微孔滤膜过滤；

(4)精密吸取滤液，注入高效液相色谱仪，记录内标和药物的峰面积；

19.根据权利要求16和18所述的方法，其特征在于蛋白质沉淀剂可以是乙腈、甲醇、丙酮、乙醇等。

20.根据权利要求1所述生物样品中胡黄连苷-I含量的测定，其特征在于生物样品经预处理后，取滤液测定，将峰面积比代入标准曲线即得该生物样品中胡黄连苷-I含量。