CN1795863A - 河豚毒素衍生物的制备和戒毒镇痛用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种海洋天然产物河豚毒素各种以盐形式制备成的河豚毒素衍生物(包括河豚毒素的酒石酸盐，马来酸盐，磺酸盐，盐酸盐，硫酸盐，氢溴酸盐，甲磺酸盐，醋酸盐，枸缘酸盐的等当量衍生物)及其制备方法，各种衍生物的制剂形式，以及各种制剂在戒毒和镇痛方面的用途。
Description
技术领域：
本发明涉及河豚毒素的各衍生物的制备和制剂的戒毒和镇痛用途。
背景技术：
河豚毒素(Tetrodotoxin简称TTX)是从河豚鱼卵巢或肝脏中提取的一种小分子化合物，其分子式为：C11H17N3O8，分子量为319.27。生物学研究证实TTX是专一性强的钠离子通道阻断剂，临床应用涉及到内科、外科、皮肤科和眼科等领域，该毒素具有很强的镇痛和麻醉疗效，其镇痛效果是杜冷汀的四倍，镇痛时间可长达2-20小时，而无成瘾性，国外已有粗制剂可以代替吗啡、杜冷丁、阿托品和南美筒箭毒碱等用于治疗神经痛的临床报导，河豚毒素可用来替代现在通用的麻醉药品，且无任何副作用。
自古以来，河豚鱼就和人类结下不解之缘，有统计数字表明因贪食河豚者有数万人之多。19世纪就有人将之用于麻风病，50年代前后，“水煎剂”型的所谓[成药]已用作镇痛、镇静、镇惊。这种纯度不到1％的粗制品曾试销全世界。
1950年获得TTX结晶单体，1964年经美、日四个资深研究小组多年研究阐明了其化学结构。1972年在美国哈佛大学工作的日本学者岸义人小组合成了它。
虽然已经在两栖类、鱼类、软体类、棘皮类、节肢类等动物脏乱细菌和藻类等上百种生物中检测到河豚毒素，但具有提取和开发价值的仍然是河豚鱼及产毒的生物源弧菌。但利用弧菌发酵的生物工程技术尚待进一步完善。
1930-1940年，日本三共公司已把纯度为0.2-1％的粗制品用于临床，在内科、外科、皮肤和眼科广泛试用。这种也称为河豚毒的粗制品已作为[成药]，临床功效为镇静、镇痉和镇痛，一般皮下注射0.5ml。推算当时的商品安瓿每支中含毒素5-35.7ug，国内外众多文献报道粗品针剂的临床适应症有；
1.用作镇痛剂；对一般神经痛及关节炎、创伤、火伤、打斗伤、挫伤等所产生的疼痛均有显著的疗效，尤其是对及痛、脉管痛等症状的有效率近100％。对癌症、麻疯病患者的疼痛、肌肉痛以及户僵硬等疗效亦很好的疗效。
2.作镇静剂：对各种皮肤瘙痒、癣疥、止痒效果甚佳；对气喘和百日咳，遗尿症等均有效。
3.作镇静剂：对胃痉挛及其他肌肉痉挛，尤其是对于破伤风痉挛称为特效药。
4.作性兴奋剂：对阳瘘及妇女性欲缺乏诸症有疗效。
5.作戒毒剂：对海洛因、阿片等成瘾者手除毒瘾有良效。
我国历代本草对河豚鱼药用均有记载。从古对今研究河豚的历史悠久，具有广泛的民间基础和药用河豚鱼的正反两方面的经验。国内1982年以来对TTX临床应用进行了广泛的研究，包括TTX的三致、电生理、药物动力、解毒药、复方以及TTX的分析检测方法等等。在部分临床试验中已经发现有一定疗效的是晚期癌症镇痛和局麻手术及临床脱毒。
我国年产河豚鱼2万吨以上，占全世界的75％，除少数品种和规格出口日、韩外，其他急待开发、应用。河豚鱼(主要指东方豚)虽“毒”名在外，但并非全身含毒。河豚毒素(TTX)主要含于卵巢和肝脏，其肉基本不含毒，而且营养价值极高，肉味鲜美无比，正如民间所流传“不食河豚焉知鱼味，食不了河豚百味无。”而含毒脏正好是本题目的原料。
此外，TTX在分子生物学及生理学等领域已经成为一种不必不可少的工具药和分子探针。1992年Sigma公司的售价为115.75-127.30美圆/mg。我国生产的TTX在世界各国均已试用，随原来垄断世界市场的日本河豚资源的枯竭，我国TTX已经和正在逐渐占领国际市场。
自国内TTX分离成功后，国内多家单位先后对之临床应用及电生理应用等方面进行过初步研究。但终国为国内体制和经费的缘故而被搁置起来。
国内对河豚毒素(TTX)的分离纯化技术已经成熟，并有相关的专利保护(专利号02121463.8，01142658.6，03138706.3)，用河豚毒素于戒毒和镇痛治疗的专利有一项(02117928.x)，该发明涉及河豚毒素的醋酸盐和枸缘酸盐的戒毒和镇痛功效，但在实例中所用的酸为缓冲剂，制备用酸的mol数说明多数TTX仍然未形成盐，与本发明的等mol成盐衍生物无专利相关性。
发明内容：
本发明的目的是提供一种质量可控，使用安全，高效，低毒，非成瘾的TTX盐衍生物的制备，和TTX盐衍生物所形成的固体制剂和注射剂在临床上用于戒毒和镇痛的用途。
该发明的河豚毒素的化学结构如下：
河豚毒素的英文名：Tetrodotoxin
化学名：八氢-12-(羟甲基)-2-亚氨基-5，9：7，10a-二甲基-10aH-[1，3]二氧桥[6，5-d]嘧啶-4，7，10，11，12-五醇
系统命名：Octahydro-12-(hydroxymethyl)-2-imino-5，9，7，10a-dimethano-10aH-[1，3]dioxocino[6，5-d]pyrimidine-4，7，10，12-pentol
分子式：C11H17N3O8
含量测定：照高效液相色谱法(中国药典1995年版二部附表VD)测定。色谱条件与系统适用性试验用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂；磷酸二氨钾与磷酸氢二钠700mg加水稀释成1000ml，滤过)，流速为0.2ml/min，检测波长为210nm；取每1ml中含0.5μg的本品溶液20μgl，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主峰的峰面积满足准确测定的要求；另取本品溶液(每1ml中含有100μg的河豚毒素)，在100℃加热10分钟，进样分析，在与峰相对保留时间约1.1处出现的杂质峰与主峰的分离度不得小于1.5。
测定法取本品适量，精密稳定，加水溶解并制成每ml含100μg溶液。取20μgl注入液相色谱仪，记录色谱图；按归一化法以峰面积计算，即得。
河豚毒素定量方法改为峰面积归一化法，含量不得低于98.0％。
河豚毒素有关物质和含量结果如下(归一化法)
| 主峰(％) | 河豚毒素酯(％) | 未知杂质(％) | |
| 对照品 | 98.72 | 2.35 | 0.76 |
| 98.86 | 2.32 | 0.62 | |
| 98.79 | 2.13 | 0.84 | |
| 平均值 | 98.79 | 2.28 | 0.84 |
含量平均为：98.82％
有关物质为：河豚毒素酯：0.45％
未知杂质：0.63％
河豚毒素对照品是由河豚毒素原料经HPLC制备柱分离纯化而成，精制后立即进行HPLC分析，纯度达98％以上。
上述高纯度的河豚毒素一种以河豚毒素为原料的各种盐形式制备成的高水溶性的河豚毒素盐衍生物(包括酒石酸盐，马来酸盐，甲黄酸盐，盐酸盐，硫酸盐，氢溴酸盐，甲磺酸盐，醋酸盐，枸缘酸盐的等当量衍生物)，该类衍生物可制备成注射剂(包括水针，冻干粉针)，固体制剂(包括胶囊，片剂)。各种衍生物的制剂，每种制剂可用于戒毒和镇痛的治疗，治疗的给药量为每次1-10μg范围。各种衍生物的制剂用于戒毒和镇痛的治疗，药物应无药物依赖性。
具体实施例：
实施例1：
(1)河豚毒素酒石酸盐的制备：
取河豚毒素100mg(0.31mN)，溶解于1.0ml热蒸馏水(40-60℃)中，加等mN的酒石酸，充分超声振动，使溶液处于全溶解状态，静止数分钟，减压浓缩至0.3-0.5ml，在-5至5℃的冰箱中静止，形成结晶，或直接减压浓缩得白色结晶。
(2)河豚毒素马来酸盐的制备：
取河豚毒素100mg(0.31mN)，溶解于1.0ml热蒸馏水(40-60℃)中，加等mN的马来酸，充分超声振动，使溶液处于全溶解状态，静止数分钟，减压浓缩至0.3-0.5ml，在-5至5℃的冰箱中静止，形成结晶，或直接减压浓缩得白色结晶。
(3)河豚毒素磺酸盐的制备：
取河豚毒素100mg(0.31mN)，溶解于1.0ml热蒸馏水(40-60℃)中，加等mN的磺酸，充分超声振动，使溶液处于全溶解状态，静止数分钟，减压浓缩至0.3-0.5ml，在-5至5℃的冰箱中静止，形成结晶，或直接减压浓缩得白色结晶。
(4)河豚毒素盐酸盐的制备：
取河豚毒素100mg(0.31mN)，溶解于1.0ml热蒸馏水(40-60℃)中，加等mN的盐酸，充分超声振动，使溶液处于全溶解状态，静止数分钟，减压浓缩至0.3-0.5ml，在-5至5℃的冰箱中静止，形成结晶，或直接减压浓缩得白色结晶。
(5)河豚毒素硫酸盐的制备：
取河豚毒素100mg(0.31mN)，溶解于1.0ml热蒸馏水(40-60℃)中，加等mN的硫酸，充分超声振动，使溶液处于全溶解状态，静止数分钟，减压浓缩至0.3-0.5ml，在-5至5℃的冰箱中静止，形成结晶，或直接减压浓缩得白色结晶。
(6)河豚毒素氢溴酸的制备：
取河豚毒素100mg(0.31mN)，溶解于1.0ml热蒸馏水(40-60℃)中，加等mN的氢溴酸，充分超声振动，使溶液处于全溶解状态，静止数分钟，减压浓缩至0.3-0.5ml，在-5至5℃的冰箱中静止，形成结晶，或直接减压浓缩得白色结晶。
(7)河豚毒素甲磺酸盐的制备：
取河豚毒素100mg(0.31mN)，溶解于1.0ml热蒸馏水(40-60℃)中，加等mN的甲磺酸，充分超声振动，使溶液处于全溶解状态，静止数分钟，减压浓缩至0.3-0.5ml，在-5至5℃的冰箱中静止，形成结晶，或直接减压浓缩得白色结晶。
(8)河豚毒素醋酸盐的制备：
取河豚毒素100mg(0.31mN)，溶解于1.0ml热蒸馏水(40-60℃)中，加等mN的醋酸，充分超声振动，使溶液处于全溶解状态，静止数分钟，减压浓缩至0.3-0.5ml，在-5至5℃的冰箱中静止，形成结晶，或直接减压浓缩得白色结晶。
(9)河豚毒素枸缘酸盐的制备：
取河豚毒素100mg(0.31mN)，溶解于1.0ml热蒸馏水(40-60℃)中，加等mN的枸缘酸，充分超声振动，使溶液处于全溶解状态，静止数分钟，减压浓缩至0.3-0.5ml，在-5至5℃的冰箱中静止，形成结晶，或直接减压浓缩得白色结晶。
实施例2：河豚毒素酒石酸盐注射剂的镇痛活性
(1)大鼠甩尾法镇痛实验
大鼠随机分为四组，♂♀各半，每组8只。实验前禁食12小时，自由饮水。以55±1℃恒温水浴为热致痛源，大鼠固定后将其尾尖部以上5cm放入热水中，记录大鼠尾部入水到甩出水面的反应时间。试验前先挑选大鼠：间隔5min连测3次，挑选甩尾反应时间在3-7s以内的大鼠用于试验。试验时s.c给药30min后，测定甩尾反应时间，以给药后甩尾反应时间大于给药前1倍以上为镇痛有效。用Bliss法[2]计算ED50值。
(2)大鼠甲醛法镇痛试验[3](简称甲醛法)
选用♂大鼠，随机分为6组，一组为NS组其余为给药组。试验前禁食12小时，饮水不限。致痛源为2.5％的甲醛(40％甲醛，北京化工三厂生产，批号：930502，化学纯，用蒸馏水稀释成2.5％溶液作为化学致痛剂)。大鼠s.c不同剂量的受试药右后足背s.c2.5％甲醛0.05ml/只，立即观察记录5min内大鼠的疼痛反应，表现为添/咬、抽、抬右后足，并根据不同的痛反应评分，具体为舔/咬后足时间(sec)x3+抽动后足次数x2/3+抬后足时间(sec)然后将各给药组的痛反应分数与NS组的痛反应分数进行比较，以Logit法算出全氨啉在该模型上的ID50值。
(3)小鼠热板法镇痛实验
选取♀小鼠，随机分为四组，每组10只。实验前禁食12h，饮水不限。实验开始前将小鼠放在预先加热到55±1℃的测痛仪上(GJ-8402型板测痛仪)，以小鼠舔后足潜伏期为痛反应指标，去除痛反应过敏(反复跳跃)及痛反应迟钝(舔后足潜伏期＞20″)的小鼠。合格小鼠s.c给予不同剂量的受试药物，45min后测定小鼠的舔后足时间，与给药前比，潜伏期延长1倍以上为镇痛有效。用Bliss法计算ED50。
(4)小鼠醋酸扭体镇痛实验(简称扭体法)
将小鼠随机分为5组，1组为NS对照组，其余为给药组，每组20只。实验前禁食12小时，饮水不限。实验以0.6％醋酸为致痛剂(30％醋酸，北京化工厂生产，批号：940406)，i.p 0.1ml/10g。NS组20只小鼠先s.cNS，40min后i.p醋酸，5min后开始记录10min以内小鼠扭体数。以小鼠出现腰部肌肉反复收缩、拱背，臀部扭转和后肢伸展为扭体反应阳性。给药组小鼠s.c组药45min后i.p醋酸，观察方法同NS组。将给切组NS组小鼠扭体数进行比较，用Logit法计算半数抑制量ID50。
(5)河豚毒素酒石酸盐的镇痛时效关系
用小鼠扭体法，方法同6.4，测出ID50后，用2倍ID50剂量给小鼠s.c河豚毒素酒石酸盐，于给药后15，30，60，120，180，300，330分钟，各测定一次小鼠扭体反应，并用阿斯匹林作对照。将各时间点镇痛有效百分率绘制河豚毒素酒石酸盐的时效曲线。
(6).动物给药后反应
定量观察指标：计算大鼠甩尾、小鼠热板及大鼠甲醛法、小鼠扭体的镇痛ED50值及95％可信限。
(7).剂量设置
大鼠甩尾，小鼠热板，大鼠甲醛和小鼠醋酸扭体实验各设4-5个剂量组。
(8).给药方法
上述实验均采用sc给药方法，模拟推荐的临床给切方法。阿斯匹林为P.O给药，哌替喧和吗啡s.c给药。
(9).试验对照
空白对照：大鼠甩尾实验和小鼠热板实验均采用给药前后动物自身对照。小鼠扭体实验和大鼠甲醛实验均采用NS对照。
阳性对照：河豚毒素酒石酸盐具有较强的镇痛作用，但其镇痛机理还不太清楚，故在4种试验中分别采用了消炎止痛药阿斯匹林和麻醉性镇痛药哌替定、吗啡做为阳性对照药，以了解河豚毒素酒石酸盐的镇痛作用强度。
阿斯匹林粉剂，青海制药厂生产，批号：940305
盐酸哌替啶粉剂，青海制药厂生产，批号930412
硫酸吗啡，青海制药厂生产，批号：940701
1.试验结果
2.河豚毒素酒石酸盐注射液、哌替定和阿斯匹林对小鼠的镇痛效应河豚毒素酒石酸盐、哌替定和阿斯匹林用小鼠热板法和扭体法测定基镇痛效应，结果见表1和表2。
表1河豚毒素酒石酸盐、阿斯匹林和哌替定对小鼠的镇痛ED50(热板法)
| 组别 | 动物数(n) | 效应数(n) | 有效率(％) | ED50及95％可信限 |
| 河豚毒素酒石酸盐(ug/kg) | ||||
| 5101517.5 | 10101010 | 1479 | 10.040.070.090.0 | 10.39(8.11-13.30)ug/kg |
| 阿斯匹林(mg/kg) | ||||
| 400600800 | 101010 | 031 | 03010 | |
| 哌替定(mg/kg) | ||||
| 10152025 | 10101010 | 13510 | 103050100 | 16.5(13.9-19.7)mg/kg |
从表1可以看出，河豚毒素酒石酸盐的镇痛强度大大超过哌替定，是它的1650倍。在热板试验中，小鼠p.o阿斯匹林45min后，只有少数小鼠舔后足，多数小鼠不舔后足而是在热板上快速走动，或不断跳跃，表明阿斯匹林在引起小鼠行为明显异常的剂量下不能抑制热伤害刺激引起的痛反应。
表2.河豚毒素酒石酸盐、阿斯匹林和哌替定对小鼠的镇痛ED50(扭体法)
| 组别 | 动物数(n) | 扭体次数(n) | 抑制率(％) | ED50及95％可信限 |
| NS | 20 | 16.7 | ||
| 河豚毒素酒石酸盐(ug/kg) | ||||
| 1.02.55.010.0 | 20202020 | 12.58.96.92.8 | 25.246.758.782.7 | 2.68(2.32-3.53)ug/kg |
| 阿斯匹林(mg/kg) | ||||
| 100200300400 | 20202020 | 15.09.965.662.70 | 18.946.269.485.4 | 198.8(181.7-217.5)ug/kg |
| 哌替定(mg/kg) | ||||
| 1.02.03.04.05.0 | 2020202020 | 14.28.26.13.10.31 | 23.255.667.083.298.3 | 1.8(1.6-2.1)mg/kg |
从表2可以看出，河豚毒素酒石酸盐的镇痛强度远远超过阿斯匹林，比哌替定大670倍。
(10)河豚毒素酒石酸盐注射液对大鼠的镇痛效应
用大鼠甩尾法和甲醛法测定河豚毒素酒石酸盐的镇痛效应，结果见表3和表4。
表3河豚毒素酒石酸盐、阿斯匹林对大鼠的镇痛ED50(甩尾法)
| 组别 | 动物数(n) | 效应数(n) | 有效数(％) | ED50及95％可信限 |
| 河豚毒素酒石酸盐(ug/kg) | ||||
| 5.015.0 | 1010 | 14 | 10.040.0 | |
| 阿斯匹林(g/kg) | ||||
| 0.751.53.04.56.0 | 88888 | 00110 | 0012.512.50 | |
从表3可以看出，河豚毒素酒石酸盐和阿斯匹林在大鼠甩尾试验中对热刺激均不敏感，无时显镇痛作用.全氨啉在15ug/kg时个别大鼠出现中毒死亡现象。
表4.河豚毒素酒石酸盐、吗啡对大鼠的镇痛ID50(甲醛法)
| 组别 | 动物数(n) | 痛反应分值(X) | 抑制率(％) | ID50及95％可信限 |
| NS | 20 | 203.6 | ||
| 河豚毒素酒石酸盐(ug/kg) | ||||
| 0.250.502.505.010.0 | 1010101010 | 152.7116.057.248.545.9 | 25.043.071.976.277.5 | 0.93(0.56-1.56)ug/kg |
| 吗啡(mg/kg) | ||||
| 2.53.55.06.58.0 | 1010101010 | 131.251.630.122.75.2 | 35.674.685.288.991.0 | 2.74(2.24-3.35)mg/kg |
由表4可见，河豚毒素酒石酸盐和吗啡在大鼠甲醛模型上均有明显镇痛作用，河豚毒素酒石酸盐的镇痛作用比吗啡大2900倍。河豚毒素酒石酸盐在2.5ug/kg时，对痛反应的抑制率已达70％，但随剂量增加，镇痛效应没有明显增加。
(11)河豚毒素酒石酸盐和阿斯匹林的小鼠镇痛时—效曲线测定
采用小鼠醋酸扭体法测定了河豚毒素酒石酸盐的镇痛时—效曲线，并以阿斯匹林作为河豚毒素酒石酸盐和阿斯匹林的剂量均为2倍的小鼠扭体ID50值，为6ug/kg和400ug/kg。结果见5、6及图1、2。
表5.河豚毒素酒石酸盐在小鼠扭体镇痛试验中的时—效关系
| 给药后时间(min) | ||||||||
| 15 | 30 | 60 | 120 | 180 | 240 | 300 | 330 | |
| 平均扭体数抑制(％)P值* | 9.9±9.464.9＜0.01 | 8.7±4.069.1＜0.01 | 6.0±5.578.7＜0.01 | 16.9±14.440.1＜0.05 | 7.6±11.772.5＜0.01 | 18.5±13.434.0＜0.05 | 18.6±11.134.0＜0.05 | 22.8±10.119.1＜0.05 |
*与NS组的平均扭体数比(28.2±12.4)。
表6.阿斯匹林在小鼠扭镇痛试验中的时—效关系
| 给药后时间(min) | |||||||
| 10 | 20 | 30 | 40 | 70 | 100 | 130 | |
| 平均扭体数抑制(％)P值* | 11.4±9.938.4＞0.05 | 10.9±10.141.1＜0.05 | 1.98±0.289.2＜0.01 | 4.8±1.174.1＜0.01 | 6.3±1.465.9＜0.01 | 11.6±2.537.1＜0.05 | 11.8±9.536.2＜0.05 |
*与NS组的平均扭体数比(18.4±6.4)。
(12).实验结论
采用热刺激法(大鼠甩尾法、小鼠热板)和化学刺激法(大鼠甲醛法、小鼠扭体法)测定了河豚毒素酒石酸盐注射液的镇痛效应并与消炎止痛药阿斯匹林和麻醉镇痛药哌替定\吗啡进行了对比.结果表明，河豚毒素酒石酸盐在大鼠甩尾镇痛试验中无镇痛作用，说明它对热刺激不敏感。大鼠甲醛法镇痛ID50为0.93ug/kg，小鼠扭体法镇痛ID50为2.86ug/kg，小鼠热板法镇痛ED50为10.39ug/kg。在大鼠甲醛法的镇痛试验中，河豚毒素酒石酸盐的镇痛强度是吗啡的2900倍。在小鼠扭体法的镇痛实验中，河豚毒素酒石酸盐的镇痛强度大大超过阿斯匹林，比哌替定大670倍。在小鼠热板法的镇痛试验中，河豚毒素酒石酸盐的镇痛强度比哌替定大1650倍。
河豚毒素酒石酸盐的镇痛时—效测定结果表明，其镇痛起效时间为给药后15min，1h达高峰，镇痛作用持续5h。阿斯区林的镇痛起效时间为给药后20min，30min达高峰，镇痛持续时间为100min。
在四种镇痛实验中，河豚毒素酒石酸盐的镇痛效果以大鼠甲醛法的镇痛效果最好，其次为小鼠扭体的镇痛效果，提示河豚毒素酒石酸盐可对化学性伤害刺激较为敏感。
以小鼠扭体法测定河豚毒素酒石酸盐注射剂的镇痛作用时—效关系，结果表明：S.C给全氨啉后15min开始起效，起效后1h达高峰，镇痛作用持续约5h，其镇痛作用时间明显比阿司匹林长。
实施例3：河豚毒素酒石酸盐注射剂的戒毒活性和依赖性试验
以3种动物5种模型进行河豚毒素酒石酸盐注射剂的身体依赖性试验，结果表明，河豚毒素酒石酸盐注射剂两个剂量组，对大、小鼠s.c恒量给药7天，然后以催促，进行小鼠催促跳跃和大鼠催促戒断试验，同吗啡对照组比，小鼠未出现的跳跃反应，大鼠未出现明显戒断反应和体重下降；大鼠组继续恒量给药至第22天做自然戒断试验，停药后观察4天，未见体重明显下降或其它戒断反应，猴i.m剂量递增给药，无论是一个月用纳洛酮催促戒断还是三个月自然戒断，均未出现吗啡样戒断症状和体重下降。这些结果表明该药不具备阿片类身体依赖性，提示该药在临床应用中不会出现依赖性问题。
1.试验目的
了解河豚毒素酒石酸盐注射剂的依赖性潜力，预测的临床应用中可能出现的依赖性问题。
2.受试药物
名称：河豚毒素酒石酸盐注射剂
3.对照品
阳性对照：盐酸吗啡、青海制药厂生产，批号940701
阴性对照：生理盐水
4.动物
来源及种属：wistar大鼠，合格证书号：01-3056。昆明种小鼠，合格证书号：01-3049。北京医科大学实验动物部提供，符合国家一级实验动物标准。
广西猴(恒河猴亚种)，由实验动物部外购，体验合格，驱虫治疗，饲养两周后用于实验。
体重：大鼠190-230g，小鼠20-25g，猴3-6。
性别：大、小鼠♂♀各半，猴♂♀搭配。
组动物数：小鼠20只，大鼠10只，猴3-6只。
给药容量：小鼠0.1ml/10g；大鼠0.2ml/10g，
猴0.1ml/kg
6.试验方法的选择
参照新药临床前研究指导原则汇编(1)有关药物依赖性试验一章中身体依赖性试研方法，选择以下试验方法：
(1)小鼠催促跳跃试验
(2)大鼠催促戒断试验
(3)大鼠自然戒断试验
(4)猴催促戒断试验
(5)猴自然戒断试验
7.剂量设置
(1)小鼠设置催促跳跃试验
由于河豚毒素酒石酸盐注射剂应用中是恒量给药，故本实验取最大耐受剂量，两组恒量给药。
河豚毒素酒石酸盐注射剂大量剂量组：11.5ug/kg(2/3LD50)
河豚毒素酒石酸盐注射剂小剂量组5.5ug/kg(1/3LD50)
阳性对照组：吗啡20mg/kg恒量给药
阴性对照组：等容量的生理盐水(NS)
(2)大鼠催促戒断试验
河豚毒素酒石酸盐注射剂大剂量组：由3ug/kg(1/5LD50)增至12ug/kg(4/5LD50
阳性对照组：吗啡剂量递增给药，从15mg/kg增至35mg/kg
阴性对照组：等容量的生理盐水(NS)
(3)大鼠自然戒断试验
第一周剂量同大鼠催促戒断试验，后两周维持催促实验的最大全氨啉剂量(接近2/3LD50，为最大耐受剂量)。
阳性对照组：吗啡剂量递增至70mg/kg。
阳性对照组：等容量的生理盐水(NS)。
(4)猴催促戒断试验
河豚毒素酒石酸盐TTX组：由1.5ug/kg(1/10LD50)增至9ug/kg(6/10LD50)
剂量递增给药，从开始1ug/kg3ug/kg。
阳性对照组：吗啡剂量递增给药，从每天3ug/kg增至15ug/kg。
(5)猴自然戒断试验
开始同猴催促戒断试验，从第三周维持最大耐受剂量(3ug/kg)。
8.给药期：
大、小催促试验一周：大鼠自然戒断3周，猴催促戒断1个月和自然戒断3个月。
9.给药途径
大、小鼠s.c给药(因大、小鼠肢体肌肉少，连续i.m有困难)，猴I.m给药，摸似临床给药途径。
10.试验方法
10.1小鼠催促跳跃试验：
给药方案：吗啡组恒量20mg/kg；河豚毒素酒石酸盐TTX组：由1.5ug/kg(1/10LD50)增至9ug/kg(6/10LD50)设置两组，其剂量分别为5.5ug/kg、11.5ug/kg，恒量给药7天，NS。第8天早8:30末次给药后2小时用10mg/kgM50(s.c)催促，记录跳跃发生率和跳跃次数。
10.2大鼠催促戒断试验：
给药方案：吗啡组5、10、15、20、25、30、35mg/kg各1天；河豚毒素酒石酸盐TTX组：由1.5ug/kg(1/10LD50)增至9ug/kg(6/10LD50)设两个剂量组，其剂量分别为1.5ug/kg、3.0ug/kg，递增剂量给药7天，分别达9和12ug/kg。第8天早：30末次给药后2小时用2mg/kgM50(s.c催促，按观察表(附1)记录戒断反主尖和体重下降程度，并评分。
10.3大鼠自然戒断试验(3周)：
河豚毒素酒石酸盐TTX组：由1.5ug/kg(1/10LD50)增至9ug/kg(6/10LD50)第一周给药剂量同大鼠催促戒断试验，以后继续给药2周，吗啡组剂量依次为5、10、15、20、25、30、35mg/kg各1天；40、50、60mg/kg各3天，70mg/kg4天，于第21天停药观察体重变化，每天称重3次，至体重恢复。
10.4猴催促戒断试验
将猴分为吗啡阳性对照组，NS阴性对照组和河豚毒素酒石酸盐TTX组：由1.5ug/kg(1/10LD50)增至9ug/kg(6/10LD50)组，每天给药3次(8:30，14:30，20:30)。以剂量递增法形成吗啡依赖模型。剂量为3、6mg/kg个3天，9、12mg/kg各4天，第3周15mg/kg维持至1个月。河豚毒素酒石酸盐TTX组：由1.5ug/kg(1/10LD50)增至9ug/kg(6/10LD50)剂量为1、2、3ug/kg，各一周，第4周增至4ug/kg时发现明显毒性反应(呕吐)，又降至3ug/kg，共给药1个月。第31天早上8:30末次给药1小时，sc纳洛酮13mg/kg.立即观察给药后1小时内猴的戒断症状及体重便化百分率，并按观察表(附2)评分。
10.5猴自然工业断试验将猴分为吗啡阳性对照组、NS阴性对照组和河豚毒素酒石酸盐TTX组：由1.5ug/kg(1/10LD50)增至9ug/kg(6/10LD50)组，试验步骤和给药方法同催促试验。30天后维持催促试验大剂量至90天时停止给吗啡、河豚毒素酒石酸盐TTX组：由1.5ug/kg(1/10LD50)增至9ug/kg(6/10LD50)和NS，然后观察停药一周内各组猴戒断症状和体重变化情况，每天3次，并按观察表(附2)评分。
11.观察指标：
小鼠催促跳跃试验：以跳跃发生率及次为指标；
大鼠催促戒断试验：以体重下降和戒断症状为观察指标；
大鼠自然戒断试验：以体重下降和戒断症状为观察指标；
猴催促戒断试验：以体重下降和戒断症状为观察指标；
猴自然戒断试验：以体重下降和戒断症状为观察指标。
12.结果
12.1小鼠催促跳跃试验：结果见表1
表1.河豚毒素酒石酸盐、吗啡和NS组小鼠跳跃结果比较
| 组别 | 小鼠数(n) | 跳跃率(％) | 跳跃次数(X±SD) |
| 吗啡组注射剂量(大)注射剂量(小)NS组 | 20202010 | 90.0*10.010.020.0 | 20.7±16.3*0.69±2.701.35±3.900.80±2.20 |
*与注射剂量、NS组比较P＜0.05
经单因素方差分析。吗啡组与TTX组和NS对照组均有显著性差异，而TTX组与NS对照组则无显著性差异。这表明，在所用剂量下，注射剂量对小鼠s.c上周恒量给药后与NS结果一样，均未出现身体依赖性指症。
12.2大鼠催促戒断试验：结果见表2
表2注射剂量、吗啡和NS催促戒断分值比较
| 组别 | 大鼠数n | 戒断症状分(X±SD) | 体重下降(X±SD) |
| 吗啡组注射剂量(大)注射剂量(小)NS | 871010 | 7.38±1.16**0.30±0.900.20±0.600.40±1.20 | 10.00±2.60**0.00±0.000.00±0.000.00±0.00 |
**与TTX组和NS组比P＜0.01
注射剂量两个剂量组的戒断症状分和体重下降分均与NS组相近，都明显低于吗啡组并有非常显著性差异(P＜0.01)。这表明，注射剂量对大鼠s.c在所试用剂量下未产生身体依赖性反应。
12.3大鼠自然戒断试验(3周)：
各组大鼠连续给药3周后停药观察体重变化情况，每天3次(8:30，14:30，20:30)。第4天时注射剂量两个剂量组的体重已恢复并超过停药前，故未再继续观察。表3所示为4天内各组大鼠体重减轻最明显时各时间点的体重变化情况。
表3注射剂量、吗啡组体重变化情况比较(X±SD)。体重下降百分率
| 组别 | n | 12h | 30h | 36h | 48h |
| 吗啡组注射剂量(小)注射剂量(大)NS | 1010910 | -7.82±2.57**-3.04±2.49-4.83±1.80-2.57±3.12 | -13.0±2.90**-0.58±1.43-3.99±2.19-4.77±5.18 | -10.76±3.67**-1.79±1.82-4.45±3.32-2.92±5.13 | -9.37±4.13**4.05±1.82-0.79±4.21-1.17±4.04 |
**与TTX组及NS组比P＜0.01
从表3结果看，注射剂量两个剂量组连续给药3周停药后体重变化不大，各时间点体重与NS比较均显著性差异(P＜0.05)，且第48小时的体重均比NS组高，注射剂量小剂量组的体重已恢复并超过停药前。而吗啡组的体重明显下降，与NS组及TTX组的体重下降比有非常显著性差异(P＜0.01)。这表明，注射剂量该药在大鼠自然戒断试验中，没有使鼠体重明显下降，即没有产生身体依赖性指征。
12.4猴催促戒断试验
各组猴连续给药30天后，次日早8:30末次给药后1小时，s.c，纳洛酮1mg/kg，立即观察1小时内各组猴的戒断症状及体重下降变化百分率，结果见表4。
戒断症状和体重下降百分率均与NS组非常接近，说明注射剂量长期给药后用吗啡拮抗剂纳洛酮催促未出现吗样戒断症状，即说明无阿片类身体依赖特性。
12.5猴自然戒断试验
各组在连续给药90天后停药，观察各组猴在一周内的戒断症状和体重变化情况，结果见表5。
表5各组猴自然戒断期间戒断症状分值比较(X±SD)
表6.各组猴自然戒断期间体重变化百分率(X±SD)
**与注射剂量和NS组比P＜0.01
从表5、6结果可以看出，注射剂量在连续给药三个月后停药观察一周，未出现任何戒断症状。停药的前3天个别猴有时有些兴奋多动现象，但很快消失。体重非但没有减轻反而比给药期间增加。吗啡对照则出现明显的戒断症状，说明注射剂量长期给药没有出现身体依赖性指征。
13.结论
河豚毒素酒石酸盐注射剂对小鼠s.c恒量给药一周，在所试剂量下，小鼠催促跳跃试验中，未出现明显跳跃反应。
河豚毒素酒石酸盐注射剂对大鼠s.c递增剂量给药一周，催促戒断试验中未出现明显戒断反应和体重下降。河豚毒素酒石酸盐注射剂先递增给药三周停药后观察4天未见体重明显下降。
河豚毒素酒石酸盐注射剂对猴i.m剂量递增给药一个月后，纳洛酮催促戒断还是给药3个月后自然戒断试验，均未出现吗啡样戒断症状和体重下降。
以上试验结果表明，河豚毒素酒石酸盐注射剂不是具有阿片类身体依赖特性，提示河豚毒素酒石酸盐注射剂在临床应用中不可能出现阿片类依赖问题。
实施例4：河豚毒素酒石酸盐注射剂的急性毒性
河豚毒素酒石酸盐对动物一次性注射后，观察7天，测得该药对小鼠的静脉毒性LD50为17.25ug/kg(14.55-20.45)，对大鼠的皮下毒性LD50为17.21ug/kg(13.43-22.07)，对大鼠的肌肉毒性LD50为15.82ug/kg(8.96-27.95).主要中毒症状有注射后1-2分钟动物表现安静\行动缓慢\5-10分钟，后肢低步太及扭体样动用.并有呼吸减慢，静脉注射的动物死得较快，死前有惊厥.皮下和肌肉注射的动物比静脉注射的死得慢，低剂量时惊厥不明显，安静地死去。
1.试验目的
观察河豚毒素酒石酸盐一次给予动物后所产生的急性毒性反应和死亡情况，为临床安全用药提供参考。
2.受试药物
名称：河豚毒素酒石酸盐
配制方法：生理盐水配制所需浓度
溶剂：生理盐水
3.动物
来源、种属：wistar大白鼠，合格证号：01-3056。昆明种小鼠，合格证号：01-3049。由北京医科大学实验动物中心提供，符合国家一级实验动物标准。
体重：大鼠170-240g；小鼠18-22g
性别：雌雄各半
每组动物数：大鼠每组10只，小鼠每组20只。
4.剂量
剂量设量：小鼠分5个剂量组，分别为10、15、20、25、30ug/kg。大鼠皮下给药分5个剂量组，分别为10、15、20、25u g/kg。大鼠肌肉给药分4个剂量组，分别为10、15、20、25u g/kg。
每只动物接受容量：小鼠i.v＜0.2ml
大鼠s.c＜1ml
大鼠i.m＜0.4ml
5.给药途径
小鼠i.v，大鼠s.c和i.m，(模拟推荐的临床给药途径)
1.试验方法
按照卫生部新药审批办法(1992)中有关毒理研究的技术标，将受试物一次给药后，观察7天。每天记录动物中的毒症状及死亡数。对死亡动物和未死亡动物进行尸检，必要时进行检查，最后根据所给剂量和死亡率，用Bliss法(2)求出动物各种给药途径的LD50值及其95％可信息。
2.观察指标
观察期：一次给药后观察7天
毒性反应：小鼠i.v河豚毒素酒石酸盐后，很快出现毒性反应，大剂量时注射完后立即死亡，一般在30min内死亡，30min内不死者，基本不会死亡。死亡前的主要中毒症状为，注射后1-2分钟动物表现安静、行动缓慢、5-10分钟，后肢低步态及扭体样动物，并有呼吸减慢，死前有惊厥。
大鼠s.c和i.m后，死亡时间略比小鼠慢，所出现的症状与小鼠基本相似，但惊厥现象只在高剂量时才出现，低剂量时是安静地死去。死亡动物尸检，各脏器未见异常。观察一周后，存活动物解剖，各脏器均为正常。
3.结果
剂量-反应数据表：对大鼠、小鼠的急性毒性试验结果进行统计处理，用Bliss法求出大量鼠、s.c、i.m和iv对河豚毒素酒石酸盐的LD50值，试验中未发现动物性别与中毒症状及死亡率有明显差别。结果见表1、2、3。
表1：小鼠一次I.v河豚毒素酒石酸盐的急性试验结果
| 剂量(ug/kg) | 动物数(只) | 死亡数(只) | 死亡率(％) | LD50及95％楞信限 |
| 30251510 | 20202020 | 201752 | 100852510 | 17.25ug/kg(14.55-20.45) |
表2：大鼠一次s.c河豚毒素酒石酸盐的急性毒性试验结果
| 剂量(ug/kg) | 动物数(只) | 死亡数(只) | 死亡率(％) | LD50及95％可信限 |
| 252015105 | 1010101010 | 105310 | 1005030100 | 17.21ug/kg(13.43-22.07) |
表3：大鼠一次i.m河豚毒素酒石酸盐的急性毒性试验结果
| 剂量(ug/kg) | 动物数(只) | 死亡数(只) | 死亡率(％) | LD50及95％可信限 |
| 25201510 | 10101010 | 9543 | 90504030 | 15.82ug/kg(8.95-27.95) |
死亡原因和毒性反应分析：全氨啉对大\小鼠的毒性反应其本相似，其特点是作用迅速，一般死亡出现在给药后30分钟内，静脉给药途径死得更快。给药后有中枢作用症状，如：安静、低步态、扭体样动作、呼吸减慢、大剂量时有惊厥现象。解剖死亡动物，各脏器未见明显变化。因此，其死亡原因是由于中枢抑制作用引起的，特别是抑制呼吸作用。
Claims (5)
- 本发明涉及一种海洋天然产物河豚毒素各种以盐形式制备成的河豚毒素衍生物，各种衍生物在戒毒和镇痛方面的功效，以及各种衍生物的制剂形式。1.一种以河豚毒素为原料的各种盐形式制备成的高水溶性的河豚毒素盐衍生物，该类衍生物可制备成注射剂(包括水针，冻干粉针)，固体制剂(包括胶囊，片剂)，用于戒毒和镇痛治疗。
- 2.根据权利1所述的衍生物，可制成河豚毒素的酒石酸盐，马来酸盐，磺酸盐，盐酸盐，硫酸盐，氢溴酸盐，甲磺酸盐，醋酸盐，枸缘酸盐的等当量衍生物。
- 3.根据权利2所述的各种衍生物，每种衍生物可制备成注射剂和固体制剂。
- 4.根据权利3所述的各种衍生物的制剂，每种制剂可用于戒毒和镇痛的治疗，治疗的给药量为每次1-10μg范围。
- 5.根据权利4所述的各种衍生物的制剂用于戒毒和镇痛的治疗，药物应无药物依赖性。
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|---|---|---|---|---|
| CN107349206A (zh) * | 2017-07-11 | 2017-11-17 | 东新皓特（北京）生化科技有限公司 | 河豚毒素在制备治疗新型毒品不良症状及复吸的药物组合物中的应用 |
-
2004
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