CN1031995C

CN1031995C - N-炔丙基-1-氨基茚满的r-对映体的制法

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Publication number: CN1031995C
Application number: CN91100031.3A
Authority: CN
Inventors: 穆萨·B·H·尤丁姆; 约翰·P·M·芬伯格; 鲁思·莱维; 杰弗里·斯特林; 戴维·勒纳; T·贝格-帕斯金; 哈伊姆·叶林
Original assignee: Ovet GmbH
Current assignee: Ovet GmbH; Orvet BV
Priority date: 1991-01-02
Filing date: 1991-01-05
Publication date: 1996-06-12
Anticipated expiration: 2006-01-05
Also published as: MX9203732A; CN1062900A

Abstract

R(+)-N-炔丙基-1-氨基茚满，它的制备方法、应用及含有它的药物组合物。发现该新化合物可用于治疗帕金森氏病、记忆障碍、阿尔茨海默类型的痴呆(DAT)、抑郁症及多动综合症的患者。

Description

N-炔丙基-1-氨基茚满的R-对映体的制法

本发明涉及单胺氧化酶(下面简称MAO)的选择性不可逆的抑制剂，本发明是关于N-炔丙基-1-氨基茚满(以下简称PAI)的R(+)对映体，它是单胺氧化酶B形式(以下简称MAO-B)的选择性不可逆的抑制剂。本发明还涉及含有R(+)PAI的药物组合物，它们尤其可用于治疗帕金森氏病、记忆障碍和阿尔茨海默氏痴呆(DAT)、抑郁症以及儿童多动综合症。

人们广泛地认为帕金森氏病是脑中突触前多巴胺能神经元降解的结果，接着释放的神经传递介质多巴胺的量减少。因此，多巴胺释放不足导致帕金森氏病的症状—随意肌控制紊乱。

已有各种治疗帕金森氏病的方法，并且目前在广泛地应用，例如将L-多巴与脱羧酶抑制剂L-甲基多巴肼或羟苄丝肼一起服用。脱羧酶抑制剂保护L-多巴分子免遭外周脱羧作用，因此可以确保L-多巴被脑纹状体中其余多巴胺能神经元吸收。在纹状体L-多巴转变成多巴胺，从而导致在这些神经元中多巴胺含量增高。因此，随生理刺激，上述神经元能够释放大量的多巴胺，其量约为正常需要的水平。这样，上述疗法可以解除疾病的症状，并促进患者康复。

但是，上述L-多巴疗法有其缺点，主要的一点是只有在开始治疗的头几年其效果是最佳的。在初期阶段以后临床效果减退，并且伴有有害的副作用，包括运动障碍、白天效果的变化(开-关现象)和精神病学的症状如精神混乱的状态、妄想狂和幻觉。上述L-多巴治疗效果逐渐下降是由于许多因素造成的，其中包括该病固有的进展、由于产生的多巴胺的增加或多巴胺代谢产物含量的增加而引起多巴胺受体的改变、以及L-多巴吸收的药物代谢动力学的问题(见Youdim等，Progress in Medicinal Chemistry，第21卷，第4章，第138～167页(1984)，Eds.Ellisand West，Elsevier，阿姆斯特丹)。

为了克服L-多巴治疗的缺点，人们设计了各种治疗方法，其中有使L-多巴与MAO抑制剂并用，以减少新生成的多巴胺的代谢分解(例如参见U.S.4,826,875)。

MAO以两种形式存在，称为MAO-A和MAO-B，它们对不同的底物和抑制剂具有选择性。例如，MAO-B使底物如2-苯基乙胺更有效地代谢，可以被(-)-丙炔苯丙胺((-)-deprenyl)选择性和不可逆地抑制(见下面的叙述)。

然而，人们应该注意到，使L-多巴与MAO-A和MAO-B两者的抑制剂一起并用是不合需要的，这会导致与通过轴索的儿茶酚胺含量增加有关的有害副作用。此外，MAO的完全抑制也是不合需要的，因为这会加强拟交感神经的胺类如酪胺的作用，从而导致所谓的“干酪现象，Cheese effect”(见Youdim等，Hand bookof Experimental Pharmacology，第90卷，第3章(1988)Eds，Trendelenburg and Weiner，Springer-Verlag)。现在已阐明在脑中MAO-B是MAO的主要形式，因此该形式的选择性抑制剂一方面被认为是减少多巴胺分解的一个可能的方式，另一方面还可以减少总的MAO抑制的系统作用。

人们对上述选择性的MAO-B抑制剂之一，(-)-丙炔苯丙胺已经进行了广泛的研究，并将其用作为MAO-B抑制剂，以便增加L-多巴的作用，在MAO-B接近完全抑制的剂量下不会引起“于酪现象”，因此一般来讲，用(-)-丙炔苯丙胺治疗是满意的(Elsworth等，Physchopharmacology，57，33(1978))。此外，将(-)-丙炔苯丙胺与L-多巴和脱羧酶抑制剂并用治疗帕金森氏病，可以改进运动不能和总体机能，并能清除“开-关现象”类型的波动(见Birkmayer和Riederer“Parkinson′s Disease”，第138～149页，Springer-Verlag(1983))。

因此，(-)-丙炔苯丙胺可以提高和延长L-多巴的作用，并可以降低L-多巴的剂量，这样，就可以减少L-多巴治疗的有害作用。

但是(-)-丙炔苯丙胺也有它自身的有害副作用，这包括在胃肠道之前活化和偶然的高血压发作。此外，(-)-丙炔苯丙胺是苯丙胺衍生物，它代谢生成苯丙胺和甲基苯丙胺，它们可以导致不合需要的副作用，例如心跳速率增加(Simpson，BiochemicalPharmacology，27，1591(1978)；Finberg等，“Monoamine Oxidase Inhibitors-The State ofthe Art”，第31～43页，Eds.Youdim and Paykel，(1981)Wiley)。

作为MAO-B的选择性不可逆抑制剂，并且没有(-)-丙炔苯丙胺的不合需要的副作用的其他化合物已有报道。一种这样的化合物是N-炔丙基-1-氨基茚满盐酸盐(外消旋的PAI·HCl)，见CB1,003,686，GB1,037,014和US3,513,244。它是MAO-B的有效的、具有选择性的、不可逆的抑制剂，不会代谢生成苯丙胺，并且不产生不希望有的拟交感神经作用。

动物试验比较的结果表明，与(-)-丙炔苯丙胺相比，外消旋的PAI具有相当大的优点，例如，外消旋的PAI不会产生严重的心动过速，不增高血压((-)-丙炔苯丙胺在剂量5mg/kg时产生上述作用)，并且不会引起眨眼膜的收缩，在剂量直到5mg/kg也不会引起心率增加((-)-丙炔苯丙胺在剂量0.5mg/kg时产生该作用)。此外，外消旋的PAI·HCl不会加强酪胺的心血管作用(Finberg等，“Enzymes and Neurotransmittersin Mental Disease”，第205～219页，(1980)，Eds.Usdin等，Pub.John Wiley and sons，NY；Finberg等(1981)，“Monoamine OxidaseInhibitors-The State of the Art”，同上；Finberg and Youdim，British Journal Pharmacol.85，451(1985))。

本发明的一个目的是分离外消旋的PAI化合物，制备具有抑制MAO-B作用的对映体。

由于丙炔苯丙胺与PAI具有类似的结构，并且已知丙炔苯丙胺的(-)对映体，即(-)-丙炔苯丙胺与其(+)对映体相比具有更强的药学活性，因此熟悉本专业领域的技术人员预计，只有PAI的(-)对映体是有效的MAO-B抑制剂。

然而，与上述预测相反，本发明在对映体的拆分中发现，事实上(+)-PAI对映体是有效的MAO-B抑制剂，而(-)对映体具有很低的抑制MAO-B的作用。此外，与相应的外消旋形式相比，(+)-PAI对映体具有令人惊奇的更高程度的对MAO-B抑制的选择性，因此在所述疾病的治疗中(+)-PAI对映体具有较小的不合需要的副作用。这些结果是以后面更详细叙述的体外和体内试验为基础的。

因此，已经表明(+)-PAI具有R绝对构型。这也是根据它与丙炔苯丙胺和苯丙胺预期具有相似的结构得出的意外结果。

在R(+)-PAI和S(-)对映体之间药理学活性的立体选择性差异是十分显著的。对MAO-B的抑制作用，化合物R(+)-PAI几乎比S(-)对映体要高4个数量级。该比例明显地高于2个丙炔苯丙胺对映体之间所观察到的差别(Knoll和Magyar，Adv.Biochem.Physchopharmacol.，5，393(1972)；Magyar等，Acta Physiol.Acad.Sci.Hung.，32，377(1967))。此外，根据报道在一些生理试验中，(+)丙炔苯丙胺与(-)对映体相比具有相等的或更高的活性(Tekes等，Pol.J.Pharmacol.Pharm.40，653(1988))。

N-甲基-N-炔丙基氨基茚满(MPAI)是MAO更有效的抑制剂，但与MAO-A相比，对MAO-B选择性较低(Tipton等，Biochem.Pharmacol.，31，1250(1982))。在上述情况下我们意外地发现，2个拆分了的对映体其相对活性仅有很小的差别。因此，仍要强调R(+)-PAI的突出之处(见表1A)。

另一方面，本发明的目的是提供首次单独应用药学上有效的PAI-对映体(没有用L-多巴)来治疗帕金森氏病、痴呆和抑郁症(见Youdim等，“Handbook of ExpermentalPharmacology，第90/I卷，(1988)，第3章，Eds.Trendelenberg and Wiener)。

又一方面，本发明的目的是提供应用药学上有效的PAI对映体单独地或与协同剂一起初步治疗帕金森氏病，以便延长L-多巴的作用和减轻它的有害副作用。对于早期帕金森氏病，单独地服用(-)-丙炔苯丙胺是有效的，当与α-生育酚(维生素E衍生物)一起服用时，对上述患者也具有协同作用(帕金森氏病研究组，NewEngland J.Med.321(20)，1364～1371，(1989))，根据(-)-丙炔苯丙胺的结果，对上述设想进行了研究。

除了用于治疗帕金森氏病以外，(-)-丙炔苯丙胺还可用于治疗阿尔茨海默类型的痴呆(DAT)患者(Tariot等，Psychopharmacology，91，489～495，1987)，治疗抑郁症(Mendelewicz和Youdim，Brit.J.Psychiat.142，508～511，1983)。因此，本发明的R(+)-PAL化合物具有恢复记忆的作用，用于治疗记忆障碍、痴呆是有效的，尤其可用于治疗阿尔茨海默氏疾病以及儿童多动综合症。

因此，本发明提供下式新的化合物，N-炔丙基-1-氨基茚满的R(+)-对映体〔R(+)PAI〕，及其药学上可用的酸加成盐。本发明还涉及R(+)PAI的制备方法、含有化合物R(+)PAI和合适载体的药物组合物，以及用本发明化合物R(+)PAI治疗人帕金森氏病、记忆障碍、阿尔茨海默氏类型的痴呆及儿童多动综合症。

将PAI的R和S-对映体的外消旋混合物进行光学拆开，可以得到R(+)PAI。可以按照本技术领域专业人员熟知的方法进行上述拆分，如可参见“Enantiomers，Racemates andResolutions”，J.Jacques，A.Collet和S.Wilen，Pub.John Wiley and Sons，NY，1981。例如，可以在手性柱上用制备层析进行拆分。合适拆分方法的另一实例是与手性酸(如酒石酸、苹果酸、扁桃酸，或氨基酸的N-乙酰基衍生物，如N-乙酰基亮氨酸)作用生成非对映异构的盐，然后通过重结晶分离出所需要的R对映体的非对映异构的盐。

可以制备PAI的R和S外消旋混合物，例如按GB1,003,676和CB1,037,014所述方法。PAI的外消旋混合物也可以通过1-氯茚满或1-溴茚满与炔丙基胺反应制备。另外，上述外消旋体可以由炔丙基胺与1-茚满酮反应首先生成相应的亚胺、然后用合适的试剂如硼氢化钠还原亚胺的碳-氮双键制备。

按照本发明，PAI的R对映体还可以在有机碱或无机碱存在下，以及可任意地在合适溶剂存在下，直接由具有旋光性的1-氨基茚满的R-对映体与炔丙基溴或炔丙基氯反应制备。

用于上述反应的合适有机碱或无机碱有例如三乙胺、吡啶、碱金属碳酸盐或碳酸氢盐等。如果反应是在溶剂存在下进行，那么溶剂可以选自例如甲苯、二氯甲烷和乙腈。制备上述化合物较好的方法是应用碳酸氢钾作为碱，以乙腈作为溶剂，使R-1-氨基茚满与炔丙基氯进行反应。

上述1-氨基茚满的反应通常生成由未反应的伯胺、所需要的仲胺及叔胺N，N-双炔丙基氨基产物组成的混合物。所需要的仲胺，即N-炔丙基-1-氨基茚满可以由上述混合物通过普通的分离方法，例如层析、蒸馏、有选择的萃取等分离出。

起始原料R-1-氨基茚满可以按文献已知的方法(例如Lawson和Rao，Bichochemistry(1980)19，2133、本申请所引参考文献及欧洲专利235,590)进行制备。

R-1-氨基茚满还可以通过R和S对映体的外消旋混合物拆分制得，例如通过与手性酸生成非对映异构的盐，或通过任何其他已知的方法，如在上述文献“Enantiomers，Racemates andResolutions”J.Jacques等，Pub.John Wiley andSons，NY，1981中所报导的方法。另外，起始原料R-1-氨基茚满可以由下法制备：使1-茚满酮与有旋光活性的胺反应，接着用合适催化剂(如钯-炭、氧化铂、阮内镍等)进行氢化，使生成的亚胺的碳-氮双键还原。合适的有旋光活性的胺有例如氨基酸(如缬氨酸或苯基丙氨酸)的酯或苯乙基胺的一个对映体。然后在非激烈的条件下进行氢化，使苄基的N-C键裂开。

制备R-1-氨基茚满的其它方法是按以上所述氢化方法将茚满-1-酮肟醚(其中醚的烷基部分含有旋光纯的手性中心)进行氢化。另外的方法是可以用手性还原剂(如氢化锂铝和麻黄碱的复合物)将含有碳-氮双键的茚满-1-酮的非手性衍生物(例如亚胺或肟)进行还原。

为了制备化合物R(+)PAI的药学上可用的酸加成盐，在合适溶剂存在下，用普通的方法使游离碱与所需要的酸反应。同样，按已知的方法可以将酸加成盐转化成游离碱。

按照本发明，可以将化合物R(+)PAI配制成药物组合物，该组合物尤其适用于治疗帕金森氏病、阿尔茨海默类型痴呆(DAT)或抑郁症。该组合物可以包括化合物R(+)PAI或其药学上可用的酸加成盐，以及药学上可用的载体和/或赋形剂。例如，上述组合物可以制成口服给药、非经胃肠道给药、直肠给药或经皮肤给药的药物。口服的合适剂型有片剂、压制的小丸剂或包衣小丸剂、糖衣丸、香囊剂、硬明胶胶囊或软明胶胶囊、舌下片剂、糖浆剂或悬浮剂；对于非经胃肠道给药，本发明提供了含水或非水溶液或乳剂的药瓶或安瓿剂；对于直肠给药，本发明提供了有亲水或疏水载体的栓剂；对于局部应用，本发明提供了本技术领域内已知的合适给药系统的软膏剂或经皮肤给药的剂型。

上述组合物可以单独用来治疗帕金森氏病、阿尔茨海默氏病或抑郁症，或者另一方面，对于帕金森氏病的情况，它们可以用作为一般的L-多巴疗法的辅助剂。

上述组合物中有效成分，即化合物R-PAI的优选的剂量在下述范围内：口服或栓剂，每天服用含有效成分2～20mg的剂量单位，最好每天服用含有效成分5～10mg的剂量单位；对于注射剂，每天服用含有效成分1～10mg/ml的剂量单位，最好每天服用含有效成分2～5mg/ml的剂量单位。

附图的简要说明

图1为实例19结果的图解

图2为实例19结果的图解

图3为实例19结果的图解

图4为实例20结果的图解

图5为实例20结果的图解

图6为实例20结果的图解

图7为实例20结果的图解

图8为实例20结果的图解

图9为实例20结果的图解

图10为实例20结果的图解

图11为实例20结果的图解

图12为实例21结果的图解

图13为实例21结果的图解

图14为实例21结果的图解

图15为实例21结果的图解

图16为实例22结果的图解

下面本发明详细地叙述非限制性的实例及其附表和附图。

实例1

外消旋的N-炔丙基-1-氨基茚满盐酸盐

向75ml乙腈中加入外消旋的1-氨基茚满(10.0g)和10.4g碳酸钾。将形成的悬浮液加热至60℃，并滴入4.5g炔丙基氯。

混合物于60℃搅拌16小时，然后经真空蒸馏除去大部分挥发性物质。残余物在10％氢氧化钠水溶液和二氯甲烷之间进行分配。

有机相经干燥，并蒸馏除去溶剂。残余物经硅胶闪式层析，用40％乙酸乙酯/60％己烷洗脱。将含标题化合物(游离碱的部分合并，洗脱物用乙醚溶解。醚溶液用氯化氢气体处理，析出的沉淀经抽滤分出，用异丙醇重结晶，得7.3g标题化合物，m.p.182～184℃。

色谱和光谱数据与文献(US3,513,244)一致，为可信的样品。

NMR(δ，CDCl₃)：2.45(2H，m)，2.60(1H，t)，2.90(1H，m)，3.45(1H，m)，3.70(2H，d)，4.95(1H，t)，7.5(4H，m)ppm。

实例2

S-(-)-N-炔丙基-1-氨基茚满盐酸盐

用手性OJ(纤维素三〔对甲基苯甲酸酯〕)制备性HPLC柱，用10％异丙醇/90％己烷洗脱，并收集首先洗脱出的主要峰，将实例1游离碱的外消旋混合物拆分，分离出游离碱形式的标题化合物。用HCl气体处理所生成的油状物在10％乙醚中的溶液，使所生成的油状物转变成标题化合物(盐酸盐)，生成的沉淀经抽滤收集。〔α〕_D-29.2°(1％，乙醇)，m.p.182～184℃，其它色谱与光谱数据与实例1盐酸盐相一致。

实例3

R-(+)-N-炔丙基-1-氨基茚满盐酸盐

标题化合物按上述实例2的方法制备，但从制备性HPLC收集第二个洗脱峰。〔α〕_D+29.1°(0.8％，乙醇)，m.p.179～181℃。其它色谱与光谱数据与实例1盐酸盐相一致。

实例4

R-(+)-N-炔丙基-1-氨基茚满盐酸盐

将R-(-)-1-氨基茚满(12.4g)和12.9g碳酸钾加到95ml乙腈中。生成的悬浮液加热到60℃并滴入5.6g炔丙基氯。于60℃将混合物搅拌16小时，然后经真空蒸馏除去大部分挥发性物质。残余物在10％氢氧化钠水溶液和二氯甲烷之间进行分配。

有机相经干燥并真空除去溶剂，残余物经硅胶闪式层析，用40％乙酸乙酯/60％己烷洗脱。将含标题化合物的游离碱部分合并，并用乙醚代替溶剂。用HCl气体处理乙醚溶液，生成的沉淀经抽滤收集，用异丙醇重结晶，得到6.8g标题化合物。m.p.183～185℃。〔α〕_D+30.90(2％，乙醇)。光谱数据与实例1化合物报道的一致。

实例5

S-(-)-N-炔丙基-1-氨基茚满盐酸盐

按实例4的方法制备标题化合物，但以S-(+)-1-氨基茚满为起始原料。产物的〔α〕_D-30.3(2％，乙醇)，m.p.183～185℃。光谱数据与实例1所报道的一致。

实例6

二(R-(+)-N-炔丙基-1-氨基茚满)L-酒石酸盐

向L-酒石酸(4.4g)的在8ml沸腾的甲醇中的溶液中加入R-(+)-N-炔丙基-1-氨基茚满(游离碱)(5.0g)在甲醇(48ml)中的溶液。将溶液加热回流，20分钟内加入284ml叔丁基甲基醚。再将混合物加热30分钟，冷却，生成的沉淀经减压抽滤分离，得到6.7g标题化合物。m.p.175～177℃。

〔α〕_D(1.5，H₂O)＝+34.3；元素分析，C₂₈H₃₂O₆N₂，计算值：C，68.26；H，6.56；N，5.69；实测值：C，68.76；H，6.57；N，5.61。

实例7

R-(+)-N-甲基-N-炔丙基-1-氨基茚满盐酸盐

将实例4得到的R-(+)-N-炔丙基-1-氨基茚满(游离碱)(1.2g)、碳酸钾(0.97g)和甲基碘(1g)一起加到15ml丙酮中，在氮气流下将生成的混悬液加热回流8小时。然后减压除去挥发性物质，残余物在10％氢氧化钠水溶液(30ml)和二氯甲烷(30ml)之间进行分配。有机相经干燥，减压除去溶剂。将残余物经硅胶闪式层析，用40％乙酸乙酯/60％己烷洗脱。合并含标题化合物(游离碱)的部分，并用乙醚代替溶剂。用HCl气体处理乙醚溶液，减压除去挥发性物质，残余物用异丙醇重结晶，得到400mg标题化合物，为白色结晶。m.p.134～136℃。〔α〕_D＋31.40(乙醇)。NMR(δCDCl₃)：2.55(2H，m)；2.7(1H，br.s)；2.8(3H，S)；3.0(1H，m)；3.4(1H，m)；3.9(2H，br.s)；5.05(1H，m)；7.7(4H，m)ppm。

实例8

S-(-)-N-甲基-N-炔丙基-1-氨基茚满盐酸盐

标题化合物按上述实例7的方法制备，但以实例5的S-(-)-N-炔丙基-1-氨基茚满(游离碱)为起始原料。标题化合物所有的物理和光谱数据与实例7化合物相一致，但〔α〕_D为-34.9℃(乙醇)。

实例9

片剂组合物R(+)-N-炔丙基-1-氨基茚满盐酸盐 5.0mg预凝胶的淀粉 47.0mg水合乳糖 66.0mg微晶纤维素 20.0mg淀粉羟基乙酸钠 3.0mg滑石粉 1.5mg硬脂酸镁 0.7mg按制粒需要加纯化水

实例10

片剂组合物R-(+)-N-炔丙基-1-氨基茚满盐酸盐 1.0mg水合乳糖 50.0mg预凝胶的淀粉 36.0mg微晶纤维素 14.0mg淀粉羟基乙酸钠 2.2mg滑石粉 1.0mg硬脂酸镁 0.5mg按制粒的需要加纯化水

实例11胶囊剂组合物R(+)-N-炔丙基-1-氨基茚满盐酸盐 5.0mg预凝胶的淀粉 10.0mg淀粉 44.0mg微晶纤维素 25.0mg乙基纤维素 1.0mg滑石粉 1.5mg按制粒需要加纯化水

实例12

注射剂组合物R(+)-N-炔丙基-1-氨基茚满盐酸盐 5.0mg无水葡萄糖 44.0mg加盐酸调至pH5按需要加纯化水至1ml

实例13

注射剂组合物R(+)-N-炔丙基-1-氨基茚满盐酸盐 1.0mg氯化钠 8.9mg加盐酸调至pH5按需要加纯化水至1ml

实例14

注射剂组合物R (+)-N-炔丙基-1-氨基茚满盐酸盐 2.0mg氯化钠 8.9mg加盐酸调至pH5按需要加纯化水至1ml

实例15

糖浆剂组合物R(+)-N-炔丙基-1-氨基茚满盐酸盐 5.0mg蔗糖 2250.0mg糖精钠 5.0mg对羟苯甲酸甲酯 6.0mg对羟苯甲酸丙酯 1.0mg食用香料 20.0mg甘油(USP) 500mg95％乙醇(USP) 200mg按需要加纯化水至5.0ml

实例16

舌下片R(+)-N-炔丙基-1-氨基茚满盐酸盐 2.5mg微晶纤维素 20.0mg水合乳糖 5.0mg预凝胶的淀粉 3.0mg吡咯烷酮 0.3mg着色剂适量食用香料适量甜味剂适量滑石粉 0.3mg将赋形剂与有效成分混合，并与吡咯烷酮的乙醇溶液一起制粒。干燥和称重后与滑石粉混合并压片。

实例17

PAI舌下片R(+)-N-炔丙基-1-氨基茚满盐酸盐 5.0mg微晶纤维素 15.0mg预凝胶的淀粉 12.0mg乙基纤维素 0.3mg滑石粉 0.3mg按制粒需要加纯化水

实例18

片剂组合物R(+)-N-炔丙基-1-氨基茚满盐酸盐 5.0mg左旋多巴 100.0mg甲基多巴肼 25.0mg预凝胶的淀粉 24.0mg淀粉 40.0mg微晶纤维素 49.5mg10号D&C黄色着色剂 0.5mg6号D&C黄色着色剂 0.02mg按制粒需要加乙醇(USP)

下述实例及附表和附图是关于本发明的生物试验。

实例19

在体外抑制MAO活性

实验设计：

MAO酶源是大白鼠脑在0.3M蔗糖中的匀浆，将其在600g下离心15分钟。上清液用0.05M磷酸盐缓冲液适当稀释，并与系列稀释的通式I化合物一起于37℃预保温20分钟，通式I化合物为R(+)-PAI，S(-)-PAI和外消旋的PAI(其中A是氢)。然后加入¹⁴C标记的底物，2-苯基乙胺(下面简称PEA)； 5-羟色胺(以下简称5-HT)，再继续保温20分钟(PEA)或30～45分钟(5-HT)。所用的底物浓度为50μM(PEA)和1mM(5-HT)。在PEA的情况下选择酶浓度，以便使反应过程中代谢的底物不多于10％。通过加入苯环丙胺(至最终浓度1mM)使反应停止，经Amberlite CG-50的小柱过滤保温液，并调至pH6.3。用1.5ml水清洗柱，合并流出液，用液体闪烁分光仪测定放射性含量。由于胺底物全部保留在柱子上，因此流出液的放射性表示由于MAO活性所形成的中性和酸性代谢产物。样本中MAO的活性以减去适当空白值后相当于没有抑制剂存在下对照组活性的百分比表示。用PEA作为底物测得的活性被认为是对MAO-B的抑制作用，用5-HT作为底物测得的活性被认为是对MAO-A的抑制作用。

结果：

在体外分别测定式I化合物R(+)-pAI、S(-)-PAI和外消旋的PAI的抑制活性，具有代表性的试验结果见图1和2。全部试验重复三次。使底物代谢产生50％抑制的抑制剂的浓度(IC-50)由抑制曲线计算，并列于表1。从该数据可以看出：

(a)R(+)-PAI对MAO-B的抑制作用为外消旋物的2倍；

(b)R(+)-PAI对MAO-B的抑制作用比对MAO-A的抑制作用要大29倍；

(c)对MAO-B的抑制作用，S(-)-PAI仅是R(+)-PAI活性的

，这说明S(-)-PAI在MAO-B对MAO-A之间仅有很小的选择性，或者无选择性。

表1

在体外，外消旋的PAI、R(+)和S(-)对映体对

大鼠脑匀浆中MAO-A和MAO-B抑制作用的

IC₅₀值(nM)

IC-50(nM)

MAO-A MAO-B化合物：S(-)PAI R(+)PAI外消旋 S(-)PAI R(+)PAI外消旋

26000 73 140 17000 2.5 5

用R(+)和S(-)MPAI(N-甲基-N-炔丙基-1-氨基印满)进行相同试验时的结果见表1A。与R(+)PAI相比，MPAI各个对映体在MAO-B和MAO-A抑制作用之间的选择性较小。此外，对MAO-B的抑制作用，R(+)MPAI仅为S(-)MPAI的5倍，而在该试验中R(+)PAI约为S(-)PAI的7000倍。

表1A

在体外，MPAI的R(+)和S(-)对映体对大鼠脑

匀浆中MAO-A和MAO-B抑制的IC-50值(nM)

IC-50(nM)

MAO-A MAO-B化合物：S(-)MPAI R(+)MPAI S(-)MPAI R(+)MPAI

70 3 50 10

还用死后6小时得到的人大脑皮层组织进行了一些试验，并按上述方法处理。试验结果见图3(这里化合物R(+)PAI.S(-)PAI和外消旋的PAI为式I化合物)。

实例20

体内MAO活性的抑制：急性处理

实验设计：

雄性Sprague-Dawley种系大鼠，体重250±20g，腹腔注射(ip)或灌服(po)PAI的对映体或外消旋体中的一种，并分别在ip后1小时或po后2小时断头处死。每个抑制剂量水平用3只鼠为一组。用上面阐述的常规技术测定大鼠脑和肝中MAO活性。用Folin-Lowry氏法测定每一种保温反应液中的蛋白量，酶活力以每mg蛋白每小时保温所消耗基质的nmol数表示。经抑制剂处理过的动物组织中MAO活性以相当于给赋形剂(灌服时为水，ip注射时为0.9％生理盐水)和按上述方法处死的对照组大鼠MAO活性的百分比表示。

结果：

所用抑制剂的各个剂量水平均未产生任何明显的行为改变。实验结果在图4～11中加以说明。化合物R(+)-PAI在0.5mg/kg剂量下，ip给药能使鼠脑MAO-B活性抑制90％，而在相同剂量下，MAO-A活性只抑制20％。R(+)-PAI以0.5mg/kg剂量灌服给药能使MAO-B活性抑制80％，而对MAO-A的抑制未能检查出。结果表明，R(+)PAI对肝MAO的抑制，与对脑MAO的抑制基本相似。从抑制曲线计算出使MAO-A和MAO-B产生50％抑制所需要的剂量(IC₅₀)，并列于表2。这些数据表明：

(a)在大鼠体内化合物R(+)-PAI对MAO活性具有抑制作用；

(b)与MAO-A不同，R(+)PAI在体内对MAO-B具有选择性抑制作用；

(c)与(-)-对映体不同，(+)-对映体在体内具有大得多的抑制活性；

(d)该化合物口服给药后吸收良好；

(e)该化合物可有效地通过血脑屏障，并有效地抑制脑MAO。R(+)-PAI对MAO-B的抑制活性约为外消旋化合物的2倍，这一事实反映了S(-)-PAI对MAO-B的抑制活性非常低。

表2

大鼠腹腔注射(ip)或口服(po)R(+)-PAI、

S(-)-PAI或外消旋体后对MAO-A和MAO-B

抑制的IC₅₀值(mg/kg)

IC-50(mg/kg)

MAO-A MAO-B化合物：S(-)PAI R(+)PAI外消旋 S(-)PAI R(+)PAI外消旋IP脑＞10 1.2 2.5 ＞10 0.07 0.22IP肝＞10 5 5 ＞10 0.06 0.11Po脑＞10 ＞5 ＞5 ＞10 0.17 0.29Po肝＞10 ＞5 ＞5 ＞10 0.05 0.09

实例21

在体内对MAO活性的抑制：慢性处理实验设计：

对大鼠(规格同实例20：每个剂量组4只动物)灌服化合物R(+)-PAI或外消旋体，设0.05、0.1和0.5mg/kg3个剂量水平。每天灌服一次，连续21天，最后一次灌服后2小时断头处死。按实例20中叙述的方法测定脑和肝中MAO-A和MAO-B活性。

结果：

以0.1mg/kg剂量每天灌服化合物R(+)-PAI，产生良好的选择性抑制作用，表现在对脑MAO-B的抑制率达80％以上，而对脑MAO-A的抑制率只有20％或更少。在每天灌服高于0.5mg/kg剂量的条件下，MAO-A的抑制率仍低于50％(图12和13)。肝MAO显示相似程度的选择性抑制(图14和15)。化合物R(+)-PAI对肝MAO的抑制作用还是比该抑制剂的外消旋体强，前者比后者约强二倍。在脑MAO的情况下，R(+)-PAI对MAO-B的选择性抑制程度比其外消旋体好。

这些结果表明，用上述化合物慢性处理后能产生对MAO-B的选择性抑制。如同其他不可逆抑制剂一样，慢性处理后产生的酶抑制程度比单次给药大。化合物R(+)-PAI对脑MAO-B选择性抑制程度比其外消旋体大。

实例22

MAO抑制的不可逆性质

实验设计：

给大鼠腹腔注射单一剂量化合物R(+)-PAI(mg/kg)，每个时间组4只鼠，分别于注射后2、6、18、24、48和72小时处死。按本文前面叙述的方法测定全脑组织中的MAO活性。

结果：

实验结果以图16表示。注射后6小时，MAO的抑制程度最大。注射后72小时，MAO活性只能恢复到对照组MAO活性的30％。这一实验证明，化合物R(+)-PAI引起的MAO抑制具有不可逆性质。

实例23

在清醒大鼠中酪胺加压作用的增强

实验设计：

大鼠用苯巴比妥(30mg/kg)和水合氯醛(120mg/kg)的合剂通过ip注射进行麻醉。左颈动脉插入细聚乙烯导管，颈静脉插入细硅橡胶管，后者与聚乙烯管相连，该聚乙烯管远侧的末端置于颈后固位凹点的皮肤下面。导管中充满含肝素的生理盐水溶液，并用细钢棒塞住。在手术前一天的晚上给动物肌注20mg氯霉素，并让其恢复。第二天将鼠放入能让其自由活动的高壁容器中。动脉插管通过一条长100cm、充满生理盐水的细孔聚乙烯管与压力传感器相连。静脉插管则通过一条相近长度的聚乙烯管与1ml注射针筒相连，聚乙烯管和针筒中含有酪胺盐酸盐的生理盐水溶液(1mg/ml)。

30～40分钟的平衡期后，注入50～100μg酪胺，并记录血压反应。待血压恢复到对照值后，作下一次注入，二次注入至少相隔15分钟。确定对照的加压反应，然后腹腔注射二药中的一种，在后来的4小时内，反复测定酪胺的加压反应。估计血压反应曲线下的面积，计算出药物治疗后的面积与药物治疗前的面积之比值，药物治疗前的面积采用对照期中取得的3-4个数值的平均值，药物治疗后的面积则采用注射化合物后1-3小时内的平均面积。

结果：

结果列于表3。化合物R(+)-PAI在1mg/kg剂量下(该剂量引起脑和肝MAO-B的完全抑制，并且抑制这些组织中MAO-A40～50％)，对酪胺加压作用无明显增强。R(+)-PAI剂量提高到5mg/kg(该剂量可引起脑和周围组织中MAO-A更广泛的抑制)，酪胺的加压反应明显增强，这种增强作用与相同剂量的丙炔苯丙胺所产生的升压反应增强程度接近，而比氯吉灵(在抑制肝MAO-A活性达85％以上的剂量下)所产生的升压反应增强作用弱。

表3

在清醒鼠中MAO抑制剂对

酪胺加压反应的增强作用抑制剂剂量鼠数加压反应曲线下的面 SEN

(mg/kg) (n) 积比率；药后/药前生理盐水 12 1.25 0.28氯吉灵 2 6 10.39 2.13(-)丙炔苯丙胺 1 2 1.15(-)丙炔苯丙胺 5 3 2.36 0.16R(+)PAI 1 3 1.38 0.7R(+)PAI 5 3 3.49 0.98

从这一实验可以得出下述结论：化合物R(+)-PAI在能有效抑制MAO-B的剂量下，不能增强酪胺加压反应。

实例24

R(+)-PAI对MPTP引起的多巴胺能毒性的抑制

1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)是一种神经毒，它能损害包括小鼠在内的几种哺乳动物的黑纹状体多巴胺能神经元，能使人和灵长目患帕金森氏综合症。在MPTP神经毒的机制中，决定性的开始一步涉及MPTP转变成它的毒性代谢产物1-甲基-4-苯基吡啶鎓离子(MPP+)。该反应由酶MAO-B催化，并且很可能发生在多巴胺能神经元的外部，主要在神经胶质。已经知道，MPTP既是MAO-B的底物又是MAO-B的不可逆抑制剂。预先给予试验动物如丙炔苯丙胺、优降宁一类的MAO-B抑制剂，能够保护和防止MPTP引起的对黑纹状体神经元的损害，因为由MPTP到MPP+的氧化转化途径被阻断了。目前主要学说中一种学说认为，帕金森氏病患者进行性的黑纹状体降解可能是由于接触周围环境产生的外源性MPTP样神经毒。在这种情况下提供了一个另外的重要信息，即从早期帕金森氏病开始，长期用MAO-B抑制剂治疗，以期它能中和这种至今还是假定的MPTP样毒素的损害作用，从而阻止或减慢该病的发展。一种成功的MAO-B抑制剂的评判标准，目前一般是根据它在体内对MPTP引起的黑纹状体多巴胺能神经元损害的阻断能力。所以，我们试验了PAI(-)和(+)对映体阻止或减弱MPTP引起的小鼠纹状体多巴胺耗竭的能力。

实验设计：

雄性C₅₇种系黑色小鼠(20～25g)单独皮下注射MPTP·HCl(30mg/kg，溶于蒸馏水中)或赋形剂，或在注射MPTP·HCl前1小时，先腹腔注射PAI的(+)或(-)异构体(2.5mg/kg)或丙炔苯丙胺(5mg/kg)，5天后断头处死。取出大脑，在冰镇玻璃板上切下纹状体，置于干冰上冻结。将纹状体组织以0.1M过氯酸制成匀浆，用配备电子-化学检测器的高效液相色谱(HPLC)分析含有二羟基苄胺作为内标的去蛋白等分试样，检查多巴胺及其主要代谢物3，4-二羟基-苯乙酸(DOPAC)。

结果：

表4表示该实验的结果。单独用MPTP处理产生显著的纹状体多巴胺(DA)和DOPAC耗竭。用PAI的(-)和(+)对映体或(-)丙炔苯丙胺处理，不影响纹状体DA浓度。预先用PAI的(-)异构体处理对纹状体中由MPTP引起的DA和DOPAC水平没有影响。在给MPTP前先给PAI的(+)异构体，可以完全消除上述毒素引起的纹状体DA和DOPAC水平的降低。PAI的(+)异构体在剂量为2.5mg/kg时的保护作用与(-)丙炔苯丙胺(5mg/kg)等效。

表4

预先用MAO-B抑制剂PAI的(-)和(+)对

映体处理对小鼠体内由MPTP引起的纹状体DA和

DOPAC耗竭的影响

DA DOPAC

mg/mg蛋白)对照组 162.8±7.2 8.4±0.5MPTP 53.1±6.2 3.2±0.3(-)-PAI 174.0±4.8 7.5±0.2(-)-PAI +MPTP 53.4±6.9 7.0±0.6(+)-PAI 185.0±6.9 3.3±0.3(+)-PAI +MPTP 177.8±14.4 6.0±0.3(-)丙炔苯丙胺 170.6±7.1 5.6±0.3(-)丙炔苯丙胺 +MpTP 197.0±8.0 6.4±0.5以上DA和DOPAC数据以Mean±S.E.M.表示，并且每组小鼠数7-11只。

这些结果表明，在体内R(+)-PAI是优良的MAO-B抑制剂，尤其对帕金森氏病的治疗具有很好的效果。

虽然前面已经叙述了本发明的实例及其相应的图表，但本发明并不局限于此。本发明的各种修改方案和应用是可能的，例如，式I化合物可以以协同增效的方式与α-生育酚(维生素E衍生物)组成复方，用于帕金森氏病的治疗。

实例25

PAI对映体对于苯丙胺诱导的衰老大鼠刻板症行为的影响

已知苯丙胺通过调动内源性多巴胺，产生刻板症行为(Sulser，F.&Sanders-Bush，E.Ann.Rev.Pharmacol.11：209-230(1971))。苯丙胺不能被MAO-B代谢。有效抑制剂对MAO-B的抑制作用和服用苯丙胺可以引起多巴胺的释放，而被抑制的MAO-B不能使多巴胺降解。这样，可以预料，服用苯丙胺和有效的MAO-B抑制剂后，突触的多巴胺含量增加，从而导致刻板症行为的加重，即苯丙胺效应的增强。根据1分钟内头侧向运动的次数评定刻板症行为的程度。

实验设计：

对大鼠进行低氧(92％氮气，8％氧气，6小时)处理前24小时，将试验化合物以0.5mg/kg/天的剂量投放在饮水中，给大鼠服用。接着皮下注射苯丙胺(0.5mg/kg)，45分钟后，计数头侧向运动的次数。

结果：

这些实验的结果列于表5。

表5

PAI异构体对苯丙胺诱发的衰老大鼠

(对照和低氧损伤)刻板症行为的影响组别治疗刻板症行为

的程度评定对照组(6) - 87±10对照组(5) (+)PAI 126±16-对照组(4) (-)PAI 94±18低氧损伤(5) - 93±12低氧损伤(6) (+)PAI 143±6-

括号内数字为试验动物数

就相应的未处理的低氧组或未处理的对照组而言，P＜0.001

表5的结果表明，(+)PAI能显著增强苯丙胺诱导的低氧损伤大鼠和对照大鼠的刻板症行为。(-)PAI在这方面则完全不起作用。在体内这些行为方面的实验结果证实了先前的生物化学发现，即(+)PAI是大脑中MAO-B的活性抑制剂，而(-)PAI在这方面是无活性的。

实例26

R(+)PAI对记忆改善或恢复的影响

新生大鼠幼仔先经受短期的缺氧症，然后让其以正常方式继续生长，结果可导致长期的记忆损害(Speiser等，Behav.BrainRes.30：89-94，1988)。这种记忆不良以被动躲避试验中表现差来表达。

在被动躲避试验中观察了R(+)-PAI和S(-)PAI对记忆改善和恢复的影响。如果该药是有效的，则大鼠对进入暗室的反应等待时间延长，在这里被试大鼠早些时候已经历过一次电休克。最大反应等待时间为300秒。

实验设计：

按实例27中叙述的方法，将幼年大鼠造成出生后缺氧症。按下面二个方案中的一种给予R(+)PAI或S(-)PAI：

方案A：两种旋光异构体中的一种以1～1.5mg/kg/天的剂量放在饮水中，给哺乳母鼠饮用，直至21天断奶时为止。然后以相同剂量直接给予断奶幼鼠，连续20天。40天时药物治疗停止，60天时，也就是最后一次给药后20天，进行被动躲避试验。

方案B：将剂量减少到0.5mg/kg/天，给予哺乳母鼠，直至21天断奶时为止，然后直接给予断奶幼鼠至60天，此时进行被动躲避试验。

被动躲避试验：实验装置由照明室和暗室组成，二室相联，中间有隔开二室的滑动门。训鼠时，大鼠放入照明室30秒，然后把门打开。经过一延迟时间(记录该延迟时间)后大鼠走入暗室。大鼠一进入暗室，门就关闭，大鼠脚趾经受0.3mA电击3秒。

48小时后重复该试验，记录从光亮进入暗室的延迟时间，任意设定延迟时间最长为300秒，用此方法来检查(大鼠对电击的)信号保留(记忆)。

结果：

这些实验的结果列于表6。

表6

PAI异构体对幼年大鼠

(60天龄)被动躲避反应的影响

方案A组别治疗电击前电击后对照组 - 49±13 201±111对照组 (+)PAI 49±19 220±100(+9％)^*对照组 (-)PAI 48±13 192±116缺氧损伤 - 45±11 183±109缺氧损伤 (+)PAI 49±10 239±99(+19％)^*缺氧损伤 (-)PAI 55±27 179±123

方案B组别治疗电击前电击后对照组 - 53±20 104±101对照组 (+)PAI 48±11 128±119(+23％)^*缺氧损伤 - 45±8 119±105缺氧损伤(+)PAI 52±12 137±126(+15％)^*缺氧损伤(-)PAI 48±19 112±112—数字表示受试大鼠进入已先经受过电击的暗室所需要的延迟时间(秒)^*表示与相应的低氧损伤组或对照组相比，延迟时间增加的百分比。

实验结果表明，(+)PAI，而不是(-)PAI，对改善缺氧损伤和对照大鼠的记忆功能是有效的。我们认为，本试验中的有效药物对各种记忆不良性疾病、痴呆，尤其是阿尔茨海默氏老年性痴呆的治疗是十分有用的。

实例27

R(+)-PAI对缺氧引起的幼年大鼠多动综合症的影响

大鼠出生后暴露于缺氧环境中，然后让其在正常条件下生长，这样处理的大鼠在10～42天龄时在开放场所的肢体运动增多(Hertshkowitz等，Dev.Brain Res.7：145～155(1983))。

研究了R(+)-PAI和R(-)-PAI对上述多动综合症的影响

实验设计：

给乳鼠于出生当天作缺氧处理。将乳鼠置于一玻璃罩内，暴露于100％氮气中，持续25分钟。然后通过间断性地轻轻按摩胸部，使其恢复正常呼吸，并将它们送回各自的母鼠身边。对照大鼠接受同样的处理，只是用空气代替氮气。

化合物R(+)-PAI或S(-)-PAI(0.5mg/kg/天)放在饮水中给哺乳母鼠饮用，借此通过奶将化合物导入乳鼠。

通过记录在规定时间内的跨越次数，测量6个完全由计算机控制的笼子(28×28cm)中大鼠的运动量。笼子中的各红外线栅格相距4cm，由配备计数器的电脉冲触发。记录15和20天龄大鼠在15分钟内的肢体运动。

结果：

实验结果列于表7。

表7

两种PAI对映体中的每一种对

缺氨引起的多动综合症的影响组别治疗 15天龄大鼠 20天龄大鼠对照组 - 414±192(11) 808±212(12)对照组 (+)PAI 254±149(11)c 719±110(13)缺氧损伤 - 482±119(7) 858±96(9)缺氧损伤(+)PAI 276+186(15)a 737±150(16)c缺氧损伤(-)PAI 334±196(5) 778±232(6)括号内数字为受试动物数。-表内数字表示15分钟内笼中大鼠跨越红外线束栅格的数目。a：与缺氧未治疗组相比，P＜0.001。b：与缺氧未治疗组相比，P＜0.05。c：与对照组相比，P＜0.05。上述结果表明，R(+)-PAI以0.5mg/kg的剂量给哺乳母鼠长疗程口服，使药物进入喂奶的乳鼠体内，可以明显减轻多动综合症。因此，化合物R(+)PAI对儿童多动综合症的治疗，是十分有用的。

Claims

1.制备R(+)-N-炔丙基-1-氨基茚满及其酸加成盐的方法，

该方法包括在有机碱或无机碱存在下，可任意地在合适溶剂中，使1-氨基茚满的R(-)-对映体与炔丙基溴或炔丙基氯反应，并通过层析、蒸馏、选择萃取分离出N-炔丙基-1-氨基茚满的R(+)-对映体，如果需要，将得到的游离碱转变成其酸加成盐。

2.制备R(+)-N-炔丙基-1-氨基茚满及其酸加成盐的方法，该方法包括在有机碱或无机碱存在下，可任意地在合适溶剂中，使外消旋的1-氨基茚满与炔丙基溴或炔丙基氯反应，并且通过层析、蒸馏、选择萃取分离出N-炔丙基-1-氨基茚满的R(+)-对映体，如果需要，将得到的游离碱转变成其酸加成盐。

3.按照权利要求2所述的方法，该方法包括使得到的游离碱与光学活性的酸反应，得到2个非对映异构的盐，然后分离出所需要的R(+)-N-炔丙基-1-氨基茚满盐，并且如果需要，可以使游离碱再生。

4.按照权利要求3所述的方法，其中R(+)-N-炔丙基-1-氨基茚满盐的分离是通过分级结晶进行的。