CN1793335A - 硒代蛋氨酸标记的蛋白高产表达培养基配方及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种含硒代蛋氨酸的蛋白高产表达培养基和应用，其由下述M9盐和氨基酸混合物、金属无机盐混合物、维生素和抗生素、氨基酸和L－硒代蛋氨酸混合物，以及异丙基硫代半乳糖苷的物质组成。用于大幅提高硒代蛋氨酸标记的目的蛋白表达量，如蛋白酪氨酸磷酸酯酶α、二肽酶IV、β分泌酶、糖原合成酶激酶3β、转录因子NF－kB激酶β、腺苷一磷酸(AMP)激活的蛋白激酶、甲硫氨酰氨肽酶、胰岛素样生长因子I、蛋白激酶Cθ等目的蛋白，可以提高1.3～2.1倍的表达量。

Description

硒代蛋氨酸标记的蛋白高产表达培养基配方及其应用
技术领域
本发明涉及硒代蛋氨酸标记的蛋白高产表达培养基配方及其应用；具体地说是一种含L-硒代蛋氨酸的高产培养基提高目的蛋白在大肠杆菌中的表达量及在蛋白晶体结构解析中起不可替代的作用。
背景技术
硒已被世界卫生组织确认为人体必需微量元素，具有较强的抗肿瘤和提高机体免疫力作用。与无机硒相比，有机硒毒性低，生物利用度高，药理活性强，硒代蛋氨酸是一种天然有机硒产物，其来源极少，因此，通过化学合成的方法制备显得尤其重要。在肿瘤对人类健康威胁日益严重的今天，使用硒代蛋氨酸来预防和治疗具有十分重要的意义。在美国，硒代蛋氨酸已作为药品广泛用于癌症预防和治疗。将硒添加到一些饮料和食品中作为微量元素，可用于提高机体的免疫能力以及防治各种缺硒病。本品可研制开发成药品、保健品及食品添加剂和动物饲料添加剂。
另外，在结晶学中常运用MAD(Multi-wavelength anomalous dispersion，多波长反常散射)推定相位。和硫原子相比，重原子硒的反常散射信号更加清晰，因此用硒代蛋氨酸标记蛋白在MAD解析相位实验中运用越来越广泛。
首先，硒的化学性质和硫非常接近；其次，硒代蛋氨酸能完全代替蛋氨酸而不改变被取代蛋白的性质；再者，大部分硒代蛋氨酸取代蛋氨酸的蛋白晶体与相应的天然蛋白晶体是同形晶体。培养硒代蛋氨酸的蛋白晶体步骤分为以下四步：表达、细胞生长、纯化和结晶。
在大肠杆菌中表达硒代蛋氨酸取代蛋氨酸的蛋白可以有以下三种选择：将含目的基因的质粒转化大肠杆菌蛋氨酸缺陷型(met-)菌株，制造能生产目的基因的大肠杆菌蛋氨酸缺陷型(met-)菌株，以及最近普遍运用的阻断蛋氨酸合成的通路。其中第三种方法的原理是：在大肠杆菌中，高浓度异亮氨酸、赖氨酸和苏氨酸能通过抑制天(门)冬氨酸激酶活性从而阻断蛋氨酸合成，且苯基丙氨酸和亮氨酸与赖氨酸起协同作用。因此，非营养缺陷型菌株能在无蛋氨酸却含足量硒代蛋氨酸和已知能抑制蛋氨酸合成的氨基酸。
除了疏水性稍强、可溶性略差外，纯化得到的含硒代蛋氨酸蛋白性质与天然蛋白相似。为避免硒代蛋氨酸氧化为硒氧化物，要对所有的缓冲液脱气，并加入DTT(5-20mM)，以及诸如EDTA(0.2mM)的螯合剂去除可能有助于氧化的金属离子，要尽量减少纯化时间，例如运用FPLC系统。
含硒代蛋氨酸蛋白结晶条件与天然蛋白也是相似的。通常含硒代蛋氨酸的蛋白可溶性稍差，所以应该相应地降低蛋白或沉淀剂的浓度。除了需要形成二硫键的蛋白，一般含硒代蛋氨酸的蛋白结晶培养需要DTT和EDTA。
发明内容
本发明目的是提供一种蛋白高产表达培养基配方，具体地说是一种含L-硒代蛋氨酸的蛋白高产表达培养基配方。
本发明另一目的是提供一种上述高产培养基配方的应用，该高产培养基不仅能够大幅提高蛋白表达量，且使目的蛋白中的蛋氨酸轻而易举地被硒代蛋氨酸取代，有利于后续晶体结构解析。
本发明的高产培养基配方由下述五类物质组成：
1.配方
A.M9 salt：磷酸氢二钠(Na2HPO4)3.0至15.0g，磷酸二氢钾(KH2PO4)1.0至8.0g，NaCl 0至3.0g，一水合葡萄糖(Glucose·H2O)2.0至9.0g，NH4Cl 0至4.0g，Na2SO40至1.5g；
11种氨基酸：L-谷氨酸(L-glutamic acid)、L-天(门)冬氨酸(L-aspartic acid)、L-精氨酸(L-arginine)、L-组氨酸(L-histidine acid)、L-丙氨酸(L-alanine acid)、L-脯氨酸(L-proline acid)、L-甘氨酸(L-glycine acid)、L-丝氨酸(L-serine acid)、L-谷氨酰胺(L-glutamine acid)、L-天冬酰胺(L-asparagine acid)、L-色氨酸(L-tryptophan acid)各0至0.5g；
B.金属无机盐混合物：MgCl2 0.75至1.45g，一水合硫酸锰(MnSO4·H2O)0至0.3g，七水合硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)0至0.25g，CaCl2(anhydrous)0至0.5g，七水合硫酸锌(ZnSO4·7H2O)0至0.35g，五水合硫酸铜(CuSO4·5H2O)0至0.2g以及六水合氯化镍(NiCl2·6H2O)0至0.15g；
C.维生素：维生素B1 0至0.2g，维生素B12 0至0.2g；
抗生素：根据需要可以添加以下相应的一种或多种抗生素：
氨苄青霉素0至0.5g，卡那霉素0至0.5g，氯霉素0至0.5g.
D.氨基酸、L-硒代蛋氨酸混合物：L-异亮氨酸(L-isoleucine)、L-亮氨酸(L-leucine)、L-赖氨酸(L-lysine)、L-缬氨酸(L-valine)、L-苏氨酸(L-threonine)、L-苯丙氨酸(L-phenyalanine)各0至0.5g；L-硒代蛋氨酸混合，0至0.35g。
E.IPTG(Isopropyl-1-thio-b-D-galactopyranoside，异丙基硫代半乳糖苷)：0至0.9g。
本发明的高产培养基可以用于蛋白表达的高产培养，尤其适用于用于含L-硒代蛋氨酸的高产培养，该方法如下：
1).由磷酸氢二钠(Na2HPO4)3.0至15.0g，磷酸二氢钾(KH2PO4)1.0至8.0g，NaCl 0至3.0g，一水合葡萄糖(Glucose·H2O)2.0至9.0g，NH4Cl 0至4.0g，Na2SO4 0至1.5g组成的M9盐和由L-谷氨酸(L-glutamic acid)、L-天(门)冬氨酸(L-aspartic acid)、L-精氨酸(L-arginine)、L-组氨酸(L-histidine acid)、L-丙氨酸(L-alanine acid)、L-脯氨酸(L-proline acid)、L-甘氨酸(L-glycine acid)、L-丝氨酸(L-serine acid)、L-谷氨酰胺(L-glutamine acid)、L-天冬酰胺(L-asparagine acid)、L-色氨酸(L-tryptophan acid)各0至0.5g组成的11种氨基酸混合物中加入950ml水；
2).1)的溶液中加入由MgCl2 0.75至1.45g，一水合硫酸锰(MnSO4·H2O)0至0.3g，七水合硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)0至0.25g，CaCl2(anhydrous)0至0.5g，七水合硫酸锌(ZnSO4·7H2O)0至0.35g，五水合硫酸铜(CuSO4·5H2O)0至0.2g，六水合氯化镍(NiCl2·6H2O)0至0.15g组成的金属无机盐混合物；
3).2)的溶液中加入由维生素：维生素B1 0至0.2g，维生素B12 0至0.2g；
根据自身需要添加以下相应的一种或多种抗生素：
氨苄青霉素0至0.5g，卡那霉素0至0.5g，氯霉素0至0.5g.
4).取10ml LB培养基菌液培养物接种入上述3)的溶液中，37℃培养至OD值达0.6～1.5；
所述的LB培养基菌液培养物是采用通常的方法，将待表达的目的蛋白基因构建于合适的质粒载体，如pET系列，并转化入合适的大肠杆菌菌株，如BL21(DE3)；挑单克隆菌接种入适量Luria-Bertani(LB)培养基37℃培养过夜，8～12小时而成。
5).再加入氨基酸和L-硒代蛋氨酸混合物。即再加入异亮氨酸(L-isoleucine)、L-亮氨酸(L-leucine)、L-赖氨酸(L-lysine)、L-缬氨酸(L-valine)、L-苏氨酸(L-threonine)、L-苯丙氨酸(L-phenyalanine)各0至0.5g；L-硒代蛋氨酸混合，0至0.35g；
6).再加入0至0.9g的IPTG(Isopropyl-1-thio-b-D-galactopyranoside，异丙基硫代半乳糖苷)。
然后10至30℃下培养8～12小时。
采用通常的如下的方法，可以将目的蛋白纯化：收获菌体，加入破胞液破菌，离心取上清；通过合适的方法，如通常的亲和层析方法等，将目的蛋白从上清中纯化出来。
上述的蛋白基因是PTPα(Protein Tyrosine Phosphataseα)蛋白酪氨酸磷酸酯酶α、DPPIV(Dipeptidyl Peptidase IV)二肽酶IV、BACEl(beta-Secretasel)β分泌酶、GSK3β(Glycogen Synthase Kinase 3β)糖原合成酶激酶3β、IKKβ(IKappa-BKinase Beta)转录因子NF-kB激酶β、AMPK(AMP-activated Protein Kinase)腺苷一磷酸(AMP)激活的蛋白激酶、MetAPs(Methionine Aminopeptidases)甲硫氨酰氨肽酶、IGF-I(Insulin-like Growth Factor-I)胰岛素样生长因子I、PKCθ(ProteinKinase C-theta)蛋白激酶Cθ等。
在本发明中采用的对比配方是原M9基本培养基配方，其配方如下：Na2HPO46.8g，KH2PO4 3.0g，NaCl 0.5g，NH4Cl 1.0g，MgSO4 0.24g，CaCl20.01g，Glucose·H2O 4g。
采用本发明的蛋白高产表达培养基可以提高蛋白表达量，如蛋白酪氨酸磷酸酯酶α(PTPα，Protein Tyrosine Phosphatase α)、二肽酶IV(DPPIV，DipeptidylPeptidase IV)、β分泌酶(BACE1，beta-Secretasel)、糖原合成酶激酶3β(GlycogenSynthase Kinase 3β)、转录因子NF-kB激酶β(IKappa-B Kinase Beta)、腺苷一磷酸(AMP)激活的蛋白激酶(AMP-activated Protein Kinase)、甲硫氨酰氨肽酶(Methionine Aminopeptidases)、胰岛素样生长因子I(Insulin-like Growth Factor-I)、蛋白激酶Cθ(Protein Kinase C-theta)等，分别可以比原M9基本培养基配方所获得的结果提高1.3～2.1倍。
具体实施方式
通过下述实施例将有助于理解本发明，但并不限制本发明的内容。
                            实施例
(一)方法
1.将待表达的目的蛋白基因构建于合适的质粒载体，如pET系列，并转化入合适的大肠杆菌菌株，如BL21(DE3)；
2.挑单克隆菌接种入适量Luria-Bertani(LB)培养基37℃培养过夜，8～12小时；
3.将“A”加入950ml水；
4.加入“B”；
5.加入“C”；
6.取上述10ml LB培养基菌液培养物接种入上述溶液，37℃培养至OD值达0.6～1.5；
7.加入“D”，培养温度降至较低温度，如10至30℃；
8.加入“E”；
9.较低温度，10至30℃下培养过夜，约8～12小时；
10.收获菌体，加入破胞液破菌，离心取上清；
11.通过合适的方法，如通常的亲和层析方法等方法，将目的蛋白从上清中纯化出来。
其中，所述的A，B，C，D和E如前所述。
(二)结果
采用对比配方是原M9基本培养基配方，其配方如下：Na2HPO4 6.8g，KH2PO4 3.0g，NaCl 0.5g，NH4Cl 1.0g，MgSO4 0.24g，CaCl2 0.01g，Glucose·H2O 4g。
变更目的蛋白的蛋白表达量如下：
  目的蛋白名称  使用1L M9基本   使用1L高产培养   使用高产培
  培养基蛋白表达量(mg)   基后蛋白表达量(mg)   养基后蛋白表达量提高倍数
  PTPα(Protein TyrosinePhosphataseα)，蛋白酪氨酸磷酸酯酶α 19.2 36.5 1.9
  BACEl(beta-Secretasel)，β分泌酶 10.6 13.8 1.3
  DPPIV(DipeptidylPeptidase IV)，二肽酶IV 15.6 25.0 1.6
  GSK3β(Glycogen SynthaseKinase 3β)，糖原合成酶激酶3β 16.8 30.2 1.8
  IKKβ(IKappa-B KinaseBeta)，转录因子NF-kB激酶β 17.5 36.8 2.1
  AMPK(AMP-activatedProtein Kinase)，腺苷一磷酸(AMP)激活的蛋白激酶 12.7 17.8 1.4
  MetAPs(MethionineAminopeptidases)，甲硫氨酰氨肽酶 15.1 22.7 1.5
  IGF-I(Insulin-like GrowthFactor-I)，胰岛素样生长因子I 10.9 16.4 1.5
  PKCθ(Protein KinaseC-theta)，蛋白激酶Cθ 11.2 22.4 2.0

Claims (6)

1，一种含L-硒代蛋氨酸的蛋白高产表达培养基，其由下述M9盐、金属无机盐混合物、维生素和抗生素、氨基酸和L-硒代蛋氨酸混合物、以及IPTG的物质组成：
所述的M9盐是由磷酸氢二钠  3.0至15.0g、磷酸二氢钾1至7g、NaCl0至3.0g、一水合葡萄糖  2.0至9.0g、NH4Cl  0至4.0g和Na2SO4  0至1.5g组成；
所述的氨基酸混合物是由L-谷氨酸、L-天(门)冬氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸、L-甘氨酸、L-丝氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、以及L-色氨酸  各0至0.5g组成；
所述的金属无机盐混合物是由MgCl2  15.0至30.0g、一水合硫酸锰  0至2.0g、七水合硫酸亚铁  0至2g、无水CaCl2  0至3.0g、七水合硫酸锌0至1.5g、五水合硫酸铜0至1.0g和六水合氯化镍  0至1.0g组成；
所述的维生素是由维生素B1  0至1.0g和维生素B12  0至1.0g；
所述的抗生素是下述的一种或多种：氨苄青霉素  0至0.5g、卡那霉素  0至0.5g或/和氯霉素  0至0.5g。
所述的氨基酸和L-硒代蛋氨酸混合物是L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-缬氨酸、L-苏氨酸或/和L-苯丙氨酸各0至0.5g，L-硒代蛋氨酸0至0.35g的混合物；
所述的IPTG是0至0.9g的异丙基硫代半乳糖苷。
2，如权利要求1所述的一种含L-硒代蛋氨酸的蛋白高产表达培养基的应用，其特征是用于在大肠杆菌中蛋白的表达。
3，如权利要求2所述的一种含L-硒代蛋氨酸的蛋白高产表达培养基的应用，其特征是采用下述逐步方法：
1).由磷酸氢二钠  3.0至15.0g、磷酸二氢钾  1.0至8.0g、NaCl  0至3.0g、一水合葡萄糖  2.0至9.0g、NH4Cl  0至4.0g，Na2SO4  0至1.5g组成的M9盐和由L-谷氨酸、L-天(门)冬氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸、L-甘氨酸、L-丝氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、L-色氨酸各0至0.5g组成的氨基酸混合物中加入950ml水；
2).1)的溶液中加入由MgCl2  0.75至1.45g、一水合硫酸锰  0至0.3g、七水合硫酸亚铁0至0.25g、无水CaCl2  0至0.5g、七水合硫酸锌0至0.35g、五水合硫酸铜  0至0.2g、六水合氯化镍  0至0.15g组成的金属无机盐混合物；
3).2)的溶液中加入下述维生素和抗生素：
维生素B1  0至0.2g、维生素B12  0至0.2g、氨苄青霉素  0至0.5g、卡那霉素  0至0.5g以及氯霉素  0至0.5g；
4).取10ml LB培养基菌液培养物接种入上述3)的溶液中，37℃培养至OD值达0.6～1.5；
5).上述溶液中再加入L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-缬氨酸、L-苏氨酸和L-苯丙氨酸各0至0.5g；并和0至0.35g L-硒代蛋氨酸混合；
6).上述溶液中再加入0至0.9g的异丙基硫代半乳糖苷；在10至30℃下培养8～12小时。
4.如权利要求3所述的一种含L-硒代蛋氨酸的蛋白高产表达培养基的应用，其特征是所获得的菌体，加入破胞液破菌，离心取上清；通过通常的亲和层析方法将目的蛋白从上清中纯化出来。
5.如权利要求3所述的一种含L-硒代蛋氨酸的蛋白高产表达培养基的应用，其特征是所述的LB培养基菌液培养物是将待表达的目的蛋白基因构建于合适的质粒载体，并转化入大肠杆菌菌株；挑单克隆菌接种入LB培养基37℃培养8～12小时。
6.如权利要求3所述的一种含L-硒代蛋氨酸的蛋白高产表达培养基的用途，其特征是所述的目的蛋白是蛋白酪氨酸磷酸酯酶α、二肽酶IV、β分泌酶、糖原合成酶激酶3β、转录因子NF-kB激酶β、腺苷一磷酸激活的蛋白激酶、甲硫氨酰氨肽酶或胰岛素样生长因子I、蛋白激酶Cθ。
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