ES2613805T3 - Composición de bacillus resistente a la bilis - Google Patents
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Abstract
Composición de Bacillus subtilis, que comprende de 105 a 1012 CFU/g de células de espora de Bacillus subtilis, donde la composición de Bacillus subtilis se caracteriza por el hecho de que: (i): las esporas de Bacillus subtilis tienen una germinación y crecimiento rápidos de espora a célula vegetativa en presencia de un medio de sal de bilis que comprende 4 mM de sales de bilis y en presencia de un medio de sal de bilis que comprende 6 mM de sales de bilis, definido por el hecho de que las esporas de Bacillus subtilis alcanzan un punto de crecimiento de célula vegetativa de 0,4 OD630 dentro de menos de 18 y 19 horas, respectivamente, donde el punto de crecimiento de célula vegetativa es el punto en la curva de crecimiento donde el valor OD comienza a aumentar (debido a crecimiento de las células vegetativas) en un cierto sentido continuo y alcanza un OD630 de 0,4; (I): donde el medio de sal de bilis es el medio de Caldo de Infusión de Ternero no selectivo (VIB) del ejemplo 1 aquí suplementado con una mezcla de sal de bilis que comprende el taurodesoxicolato de sales de bilis conjugadas y glicodeoxicolato y el deoxicolato de sal de bilis desconjugada en las proporciones 60 % del taurodesoxicolato, 30 % del glicodeoxicolato y 10 % de deoxicolato; y (II): donde el análisis de ensayo OD se realiza por los pasos siguientes: (a): rellenar un pocillo en una placa de microtitulación con 0,150 ml medio de sal de bilis con 108 esporas de Bacillus subtilis por ml medio (es decir, este es tiempo cero); y (b): incubar la placa a 37 °C bajo condiciones atmosféricas y medir los valores OD630, utilizando un espectrofotómetro y con agitación antes cada lectura, para obtener una curva de crecimiento representativa a lo largo del tiempo; y (ii) las células vegetativas de Bacillus subtilis producen una enzima o un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en fenilalanina, valina, treonina, triptófano, isoleucina, metionina, leucina, lisina, cisteína, tirosina, histidina y arginina; y con la condición de que las células vegetativas de Bacillus subtilis no son células, como se describe en la reivindicación 1 de PCT/EP2008/057296 y la solicitud de prioridad de esta, EP07111 939.0, publicada como EP2011858A1, donde las células vegetativas de bacillus del punto (ii) según la reivindicación 1 de PCT/EP2008/057296 y EP2011858 A1 producen fitasa en una cantidad de al menos 1,25 veces más de la célula de Bacillus de referencia DSM 19467, donde la cantidad de fitasa producida se mide por el ensayo de fitasa del ejemplo 2 de PCT/EP2008/057296 y EP2011858A1 después de 4 horas de crecimiento a 37 °C en el medio de Caldo de Infusión de Corazón (HIB) no selectivo del ejemplo 2 de PCT/EP2008/057296 y EP2011858A1, y donde el análisis de ensayo de fitasa se realiza por los pasos siguientes: (a): hacer un cultivo de células vegetativas de bacillus durante toda la noche en un medio de cultivo enriquecido; y (b): transferir un 1 % de inóculo del cultivo a un medio HIB (es decir, este es tiempo cero) durante toda la noche e incubar a 37 °C hasta la medición de actividad de fitasa.
Description
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Composicion de bacillus resistente a la bilis
[0001] La presente invencion se refiere a una composicion de Bacillus subtilis caracterizada por una germinacion y crecimiento rapidos en las sales de bilis (ambiente intestinal simulado) y por la produccion de una enzima o un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en fenilalanina, valina, treonina, triptofano, isoleucina, metionina, leucina, lisina, cistefna, tirosina, histidina y arginina.
La composicion de Bacillus subtilis se puede utilizar como suplemento en el pienso para animales donde este tiene un efecto probiotico (promocion de salud y crecimiento) y aumenta la digestion y disponibilidad de nutrientes de piensos para animales.
Estado de la tecnica
[0002] Las bacterias probioticas tal como Bacillus subtilis y Bacillus licheniformis se usan en la industria de pienso para animales como suplemento a la dieta.
Su uso se refiere a la capacidad de bacillus para reemplazar o reducir el uso de antibioticos, que se usan como promotores de crecimiento en la industria de pienso para animales.
[0003] Cristiano Hansen A/S, Dinamarca comercializa un ejemplo de tal producto de promocion del crecimiento probiotico bajo el nombre comercial GalliPro® (depositado como DSM 17231).
GalliPro® es una composicion de celula de espora de Bacillus subtilis.
[0004] Ademas, el modo sugerido de las acciones (por ejemplo, modulacion inmunitaria, modificador de flora intestinal) bacillus probiotico son capaces de producir muchos componentes beneficiosos, tales como enzimas, que se excretan en el tracto gastro intestinal (GIT) cuando se usa como suplemento de pienso para animales.
Las enzimas tal como fitasa se excretan y mejoran la digestion y mejor absorcion de pienso para animales (digestibilidad mas alta).
La dieta (pienso) esta compuesta en su mayorfa de origen vegetal, tal como granos, mafz, soja, aceite de soja y aminoacidos.
En general, estos efectos contribuyen a la produccion de productos asequibles para animales.
[0005] Los bacilos probioticos son tambien capaces de producir otros componentes beneficiosos tales como aminoacidos acidos esenciales.
[0006] Las esporas de Bacillus pueden pasar la barrera gastrica acida y germinar y crecer en el (GIT) gastrointestinal de los animales.
Esto tiene grandes ventajas, ya que cuando se ingieren estos pueden excretar tipos numerosos de componentes beneficiosos, por ejemplo, bacteriocinas y tambien excretan aminoacidos esenciales utiles.
Ademas, las esporas de bacillus son termoestables durante un proceso de granulacion de pienso y son asf un sistema de entrega excelente para obtener ambas bacteriocinas y por ejemplo aminoacidos esenciales en el GIT.
[0007] En el proceso de supervivencia y de proliferacion de bacillus en el GIT, el papel de la bilis es importante.
La bilis se produce en el hfgado y se almacena en la vesfcula biliar.
La bilis contiene agua, lecitina, bilirrubina y biliverdina y sales de bilis.
[0008] Se sabe de la literatura que la bilis tiene algunas influencias negativas en la supervivencia y germinacion, y crecimiento de celulas de espora de bacillus a celulas vegetativas en el GIT de animales.
Por lo tanto, se esta realizando una investigacion para encontrar cepas de Bacillus resistentes a la bilis probiotica.
[0009] El artfculo (Antonie Van Leeuwenhoek. 2006 Aug; 90(2): 139-46. Epub 2006 Jul 4) describe el aislamiento de un numero de muestras Bacillus/celula directamente desde el intestino de pollos.
Las celulas de bacillus aisladas se evaluaron para una actividad probiotica.
Los seis bacilos con maxima actividad probiotica fueron evaluados para resistencia de sal de bilis y se ha observado que un bacillus probiotico altamente especffico tiene un nivel relativamente alto de resistencia a sal de bilis.
[0010] En este artfculo no hay foco especial en cualquier periodo temporal para la prueba de resistencia a la bilis.
En la parte experimental, las celulas de espora de bacillus son sencillamente evaluadas para resistencia despues de 5 dfas de presencia en la sal de bilis (ver parrafo "prueba simulada de tolerancia al lfquido del intestino delgado" en la pagina 141).
[0011] US2003/0124104A describe que las endoesporas de bacillus convencionales probioticas son sensibles a la concentracion baja de sales de bilis, es decir, la germinacion de espora y/o rehidratacion se inhibe por la presencia de concentraciones incluso bajas de sales de bilis.
Esto es contrario a otras bacterias tales como patogenos entericos, tal como E. coli o S. aureus (ver seccion [0014] A [0015]).
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En vista de esto, se sugiere filtrar/seleccionar para esporas de bacillus que son resistentes a la actividad inhibidora de sales de bilis, y como resultado, germinar en celulas vegetativas, que luego colonizan el colon (ver [0019]).
[0012] Los ejemplos practicos estan todos presentes y datos experimentales no reales de celula de Bacillus especffica realmente seleccionada se proporcionan en la descripcion.
[0013] Ademas, las condiciones de seleccion de sal de bilis estan relativamente descritas de forma generica.
En particular, no hay indicaciones de cualquier periodo temporal para las selecciones de resistencia a la bilis.
Dicho en otras palabras, basandose en la unica instruccion amplia/generica de este documento, uno puede seleccionar celulas de Bacillus que solo pueden crecer (germinar) lentamente, es decir, son capaces de germinar de esporas a celulas vegetativas despues de por ejemplo 20 horas en presencia de la cantidad pertinente de sal de bilis.
[0014] En este documento, no hay descripcion o sugerencia para seleccionar celulas de bacillus que puedan crecer (germinar) rapidamente, es decir, capaces de germinar y crecer de esporas a celulas vegetativas, de forma que se alcanza un punto de crecimiento definido dentro de un determinado intervalo temporal en la presencia de una cantidad pertinente de sal de bilis.
[0015] En resumen, las referencias del estado de la tecnica acerca de la seleccion/filtrado de celulas de bacillus resistentes a la bilis no focalizan en el crecimiento/germinacion rapidos de celulas de espora a celulas de bacillus vegetativas.
[0016] La solicitud internacional PCT con numero de solicitud PCT/EP2008/057296 fue solicitada el 11/06/2008.
El solicitante es Chr. Hansen A/S y no se publico en la fecha de prioridad de esta presente solicitud.
[0017] La solicitud de prioridad de PCT/EP2008/057296, EP07111939.0 fue publicada en como EP2011858A1 y PCT/EP2008/057296 fue publicada en como WO2009/007192, despues de la fecha de prioridad de esta presente solicitud () pero antes de la fecha de deposito de esta presente solicitud (1612-2009)
[0018] PCT/EP2008/057296 y EP2011858A1 describen esporas de bacillus nuevas caracterizadas por el hecho de tener una velocidad de germinacion mejorada/rapida y un crecimiento de espora a celula vegetativa en presencia de un medio de sal de bilis.
[0019] Las esporas de bacillus como se describen en este caso tienen la misma velocidad de germinacion y crecimiento mejorada/rapida de espora a celula vegetativa como se describe en PCT/EP2008/057296 y EP2011858A1.
[0020] PCT/EP2008/057296 y EP2011858A1 solo describen celulas vegetativas de bacillus que producen fitasa en una cantidad aumentada en comparacion con la celula de Bacillus de referencia DSM 19467.
[0021] Como se puede observar abajo, en el primer aspecto y reivindicacion 1 aquf se niegan tales celulas de bacillus fitasa de alta produccion de pCt/EP2008/057296 y EP2011858A1.
[0022] Cuando abajo se refiere al estado de la tecnica, debe entenderse como estado de la tecnica disponible al publico (por ejemplo artfculos/patentes publicadas) en la fecha de deposito de esta presente solicitud.
Resumen de la invencion
[0023] El problema por resolver de la presente invencion es proporcionar una composicion de Bacillus subtilis que pueda excretar altas cantidades de compuestos beneficiosos en el tracto gastro intestinal (GIT) de un animal.
[0024] La solucion se basa en que los presentes inventores han desarrollado un metodo de seleccion para la identificacion de composiciones de Bacillus subtilis mejoradas.
Un paso importante del metodo de seleccion descrito aquf es especfficamente filtrar/seleccionar celulas de espora de Bacillus subtilis con velocidad de germinacion y crecimiento mejorada/rapida de esporas a celulas vegetativas en presencia de sales de bilis.
[0025] Como se ha descrito anteriormente, el estado de la tecnica ha descrito metodos para la seleccion de celulas de bacillus capaces del crecimiento en presencia de sales de bilis, pero los metodos de filtrado/seleccion del estado de la tecnica no focalizan en la velocidad de germinacion y crecimiento en presencia de sal de bilis.
Por consiguiente, ambas celulas de bacillus resistentes a la bilis seleccionadas del estado de la tecnica no germinan y crecen suficientemente rapido para cumplir con los criterios de velocidad de germinacion y crecimiento como se describe en este caso.
Por ejemplo, las celulas de bacillus aisladas directamente desde el intestino de por ejemplo pollos (como por ejemplo descrito en el artfculo mencionado anteriormente Antonie van Leeuwenhoek) en el ambiente intestinal no
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estan seleccionados (bajo presion natural) para germinar y crecer rapidamente en el intestino.
[0026] Como se muestra en ejemplos practicos aqrn, esto tambien es real para la composicion de Bacillus GalliPro® disponible comercialmente, que germina sencillamente y crece mas demasiado lentamente y no alcanza el punto de crecimiento definido en las primeras 20 horas en la presencia de niveles fisiologicos de sales de bilis para cumplir los criterios de velocidad de germinacion y crecimiento, como se describe en este caso.
GalliPro® es una composicion de Bacillus subtilis que es exitosa comercialmente.
[0027] La cepa descrita aqrn depositada como DSM 19467 fue seleccionada usando GalliPro® como una cepa de inicio y un metodo de presion selectiva y un aislamiento posterior para germinacion y crecimiento rapidos de esporas a celulas vegetativas en presencia de sal de bilis, como se describe en este caso.
[0028] Ver por ejemplo tabla 1 para detalles adicionales (GalliPro® pueden aqrn tambien ser denominadas DSM 17231).
En la figura 1 aqrn, este se ilustra esquematicamente.
[0029] En resumen, se cree que ningun estado de la tecnica describe una composicion de Bacillus subtilis aislada, que comprende de 105 a 1012 CFU/g de celulas de bacillus, donde las celulas de la composicion de bacillus cumplen con la germinacion y crecimiento rapidos en presencia del criterio de sal de bilis, como se describe en este caso.
[0030] Sin estar limitado a la teona, los presentes inventores han identificado que la germinacion y crecimiento rapidos es un aspecto muy importante de la invencion como esporas de bacillus, que son resistentes a la bilis pero no germinan y crecen suficientemente rapido, seran excretadas antes de cualquier caractenstica positiva, tal como produccion de aminoacido esencial, puede hacerse en cantidades significativas por las celulas de bacillus vegetativas.
[0031] Las esporas de Bacillus que germinan demasiado lentamente pasaran sencillamente al tracto gastro intestinal (GIT) antes de que la bacteria pueda producir cualquier cantidad significante de, por ejemplo, aminoacidos esenciales.
[0032] Despues de un numero detallado de pruebas y analisis, los inventores por lo tanto eligen trabajar con un rango temporal de hasta 20 horas y seleccionan las esporas de germinacion y crecimiento mas rapido dentro de este penodo de tiempo en presencia de altas concentraciones fisiologicas de sales de bilis.
Sin estar limitado a la teona y basandose en el trabajo experimental detallado descrito aqrn, los presentes inventores han identificado que resulta importante tener una germinacion y crecimiento rapidos en las primeras 18 y 19 horas en presencia de 4 y 6 mM de sal de bilis, respectivamente.
[0033] Los presentes inventores luego identificaron que una vez que las celulas de Bacillus subtilis, con germinacion y crecimiento rapidos en el medio de sal de bilis se hayan seleccionado, estas celulas son altamente utiles como celulas de inicio para mutagenesis para obtener celulas nuevas con produccion de aminoacido mejorada.
[0034] Como se ilustra esquematicamente en la figura 1 y ejemplo 4, la bilis de crecimiento rapido resistente a la cepa seleccionada, DSM 19467 se uso como cepa de inicio para mutacion tradicional y las cepas que producen altas cantidades de aminoacidos fueron seleccionadas.
Como se puede observar en el ejemplo 4, algunas de las cepas seleccionadas producen al menos 5 veces mas de leucina de aminoacido que DSM 19467 y GalliPro®.
[0035] Como se ha mencionado anteriormente, en nuestras aplicaciones anteriores PCT/EP2008/057296 y EP2011858A1, DSM 19467 se usaron para hacer nuevas cepas de alta produccion de fitasa, ver por ejemplo, el ejemplo 4 de PCT/EP2008/057296 y EP2011858A1.
[0036] Por consiguiente, uno puede ver DSM 19467 como un tipo muy util por ejemplo de "intermediar" para hacer nuevas celulas de bacillus con propiedades mejoradas tal como, por ejemplo, fitasa mas alta o produccion de aminoacidoa o cualquier otro compuesto pertinente de interes.
[0037] Ademas, es evidente para la persona experta que una vez que los inventores aqrn hayan descrito el ensayo de prueba para probar la germinacion y crecimiento rapidos del ejemplo 1 mas la cepa identificada DSM 19467 sera trabajo de rutina para la persona experta seleccionar otras celulas de Bacillus subtilis que cumplan con el criterio del primer aspecto de este documento, es decir, otras celulas de Bacillus subtilis alternativas con caractensticas similares a DSM 19467.
[0038] Por consiguiente. un primer aspecto de la invencion se refiere a una composicion de Bacillus subtilis, que comprende de 105 a 1012 CFU/g de celulas de espora de Bacillus subtilis, donde la composicion de Bacillus subtilis se caracteriza por el hecho de que:
(i): las esporas de Bacillus subtilis tienen una germinacion y crecimiento rapidos de espora a celula vegetativa en
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presencia de un medio de sal de bilis que comprende 4 mM de sales de bilis y en presencia de un medio de sal de bilis que comprende 6 mM de sales de bilis, definido por el hecho de que las esporas de Bacillus subtilis alcanzan un punto de crecimiento de celula vegetativa de 0,4 OD630 dentro de menos de 18 y 19 horas, respectivamente, donde el punto de crecimiento de celula vegetativa es el punto en la curva de crecimiento donde el valor OD comienza a aumentar (debido al crecimiento de las celulas vegetativas) en un sentido continuo y alcanza un OD630 de 0,4;
(I) : donde el medio de sal de bilis es el medio no selectivo de Caldo de Infusion de Ternera (VIB) del ejemplo 1 aquf suplementado con una mezcla de sal de bilis que comprende sales de bilis conjugadas taurodesoxicolato y glicodeoxicolato y la sal de bilis desconjugada deoxicolato en las proporciones 60 % de taurodesoxicolato, 30 % de glicodeoxicolato y 10 % de deoxicolato; y
(II) : donde el analisis de ensayo OD se realiza por los pasos siguientes:
(a) : rellenar un pocillo en una placa de microtitulacion con 0,150 ml de medio de sal de bilis que tiene 108 esporas Bacillus subtilis por ml de medio (es decir, este es tiempo cero); e
(b) : incubar la placa a 37 °C bajo condiciones atmosfericas y medir los valores OD630, utilizando un espectrofotometro y con agitacion antes cada lectura, para obtener una curva de crecimiento representativa a lo largo del tiempo;
y
(ii) las celulas vegetativas de Bacillus subtilis producen una enzima o un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en fenilalanina, valina, treonina, triptofano, isoleucina, metionina, leucina, lisina, cistefna, tirosina, histidina y arginina;
y con la condicion de que las celulas vegetativas de Bacillus subtilis no son celulas, como se describe en la reivindicacion 1, de PCT/EP2008/057296 y la solicitud de prioridad de las mismas,
EP07111939.0, publicada como EP2011858A1, donde las celulas vegetativas de bacillus del aspecto (ii) segun la reivindicacion 1 de PCT/EP2008/057296 y EP2011858 A1
producen fitasa en una cantidad de al menos 1,25 veces mas que la celula de Bacillus de referencia DSM 19467, donde la cantidad de fitasa producida se mide por el ensayo de fitasa del ejemplo 2 de PCT/EP2008/057296 y EP2011858A1 despues de 4 horas de crecimiento a 37 °C en el medio de Caldo de Infusion de Corazon (HIB) no selectivo del ejemplo 2 de PCT/EP2008/057296 y EP2011858A1 y donde el analisis de ensayo de fitasa se realiza por los pasos siguientes:
(a) : hacer un cultivo de celulas vegetativas de bacillus durante toda la noche en un medio de cultivo enriquecido; y
(b) : transferir un 1 % de inoculo del cultivo durante toda la noche al medio HIB (es decir, este es tiempo cero) e incubar a 37 °C hasta medir la actividad de fitasa.
[0039] Como se ha mencionado anteriormente, las celulas de Bacillus subtilis con esporas que cumplen con el criterio (i) del primer aspecto pueden usarse en principio por ejemplo como una cepa de inicio para filtrar celulas vegetativas de Bacillus subtilis que pueden por ejemplo tener una produccion mas alta/mejorada de cualquier compuesto de interes, tal como por ejemplo una enzima de interes.
[0040] Como se ha mencionado anteriormente, la celula de Bacillus de referencia DSM 19467 se selecciona para una germinacion y crecimiento rapidos en presencia de sal de bilis usando GalliPro® como cepa de inicio.
La DSM 19467 no se selecciona para la produccion mejorada de un compuesto de interes (por ejemplo un aminoacido).
Sin estar limitado a la teorfa, se cree que la produccion pertinente aquf de la gran mayorfa de compuestos pertinentes de interes comercial (por ejemplo fitasa o un aminoacido) de DSM 19467 corresponde a la produccion de GalliPro® del mismo compuesto.
[0041] En relacion con el punto (i) el punto de crecimiento de celula vegetativa para GalliPro® es al menos 20 horas tras la incubacion en 4 y 6 mM de sal de bilis y para la nueva cepa DSM 19467, como se describe en este caso, es despues 14 y 15 horas en 4 y 6 mM de sales de bilis, respectivamente (ver figura 2 y ejemplo practico 3 de este documento).
[0042] Aquf es pertinente darse cuenta de que los presentes inventores tambien evaluaron el producto disponible comercialmente CALSPORIN® (Calpis Co., Ltd., Japon) para determinar el punto de crecimiento de celula vegetativa bajo las condiciones del punto (i) del primer aspecto.
En cuanto a GalliPro®, el producto comercial CALSPORIN® es una composicion de Bacillus subtilis usada como un aditivo de pienso probiotico.
El punto de crecimiento de celula vegetativa bajo las condiciones del punto (i) de primer aspecto para CALSPORIN® fue mas de 20 horas a 4 y 6 mM de sales de bilis, respectivamente.
Esto es considerablemente mas de 18 y 19 horas requeridas bajo el punto (i) y esto ilustra que productos disponibles comercialmente hasta ahora no han sido seleccionados para una germinacion y crecimiento rapidos.
Como se ha mencionado anteriormente, las celulas de bacillus "naturales" no han estado bajo ninguna presion selectiva para obtener una germinacion y crecimiento rapidos.
Sin estar limitado a la teorfa, se cree por lo tanto que las celulas de bacillus "naturales" no cumplen con las condiciones del punto (i) del primer aspecto.
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[0043] La resistencia a la bilis [del punto (i)] y ensayo de aminoacidos esenciales [del punto (ii)] se basan en elementos estandar disponibles comercialmente (tales como, por ejemplo medios estandar, sales de bilis; mediciones OD estandar y pruebas estandar).
[0044] La celula de Bacillus de referencia se deposita como DSM 19467 y, por lo tanto, esta disponible publicamente.
[0045] La celula de Bacillus subtilis GalliPro® se deposita como DSM 17231 (nombrado "GalliPro®") y, por lo tanto, esta disponible publicamente.
[0046] Por consiguiente, basandose en la descripcion de ensayo detallada aquf (ver por ejemplo ejemplo 1 de este documento para el ensayo de resistencia a la bilis y ejemplo 2 de aquf para el ensayo de aminoacido) la persona experta es capaz de repetir rutinariamente estos ensayos para determinar objetivamente si una celula de Bacillus subtilis especffica de interes cumple con la resistencia a la bilis [del punto (i)] y los niveles de aminoacido [del punto (ii)] del primer aspecto de la invencion.
[0047] La composicion de Bacillus subtilis nueva, como se describe en este caso, se puede utilizar como un suplemento probiotico para alimentos de animales.
La dosis y administracion puede realizarse segun la tecnica, como ha ocurrido por ejemplo en cuanto a las composiciones de bacillus GalliPro® del estado de la tecnica.
[0048] Por consiguiente, un segundo aspecto de la invencion se refiere a un metodo para alimentar un animal que comprende administrar la composicion de Bacillus subtilis del primer aspecto y formas de realizacion relacionadas aquf descritas con un animal conjuntamente con otros ingredientes de pienso para animales.
[0049] Un tercer aspecto de la invencion se refiere a un metodo para la seleccion y aislamiento de una celula de Bacillus subtilis que comprende los pasos siguientes:
(a) : seleccion y aislamiento de una agrupacion de celulas de espora Bacillus subtilis individuales de una celula de espora de Bacillus subtilis que es capaz de germinar y crecer tan rapidamente que esta alcanza un punto de crecimiento de celula vegetativa dentro de menos de 18 y 19 horas bajo las condiciones del punto (i) del primer aspecto;
(b) : realizacion de una celula de Bacillus subtilis vegetativa de la celula de espora aislada del paso (a) y mutacion de la celula seleccionada y aislada para obtener una agrupacion de celulas vegetativas de Bacillus subtilis individuales;
(c) : seleccion y aislamiento de la agrupacion de celulas vegetativas de Bacillus subtilis individuales del paso (b) una celula vegetativa de Bacillus subtilis que es capaz de la produccion de una enzima o un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en fenilalanina, valina, treonina, triptofano, isoleucina, metionina, leucina, lisina, cistefna, tirosina, histidina y arginina; y
(d) : analisis de la celula de Bacillus subtilis vegetativa del paso (c) para confirmar que esta ha mantenido la germinacion y crecimiento rapidos del paso (a) y aislamiento de la celula de Bacillus subtilis seleccionada.
[0050] Es evidente para la persona experta que una vez que los inventores aquf hayan descrito los ensayos de prueba pertinentes (en particular, el ensayo para probar la germinacion y crecimiento rapidos del ejemplo 1) mas la cepa de referencia DSM 19467 sera trabajo de rutina para la persona experta seleccionar otras celulas de Bacillus subtilis que cumplan con el criterio del primer aspecto de este documento.
[0051] Como se ha discutido aquf, usando el metodo de filtrado/seleccion como se describe en este caso, los inventores han seleccionado y han aislado un numero de celulas de Bacillus subtilis mejorada.
[0052] La forma de realizacion de la presente invencion esta descrita abajo, solo por medio de ejemplos.
Definiciones
[0053] Todas las definiciones de terminos pertinentes aquf estan en concordancia con lo que entenderfa la persona experta en relacion al contexto tecnico aquf pertinente.
[0054] El termino "celula bacillus" o "ceula de Bacillus subtilis" se refiere aquf a ambos una celula de espora de bacillus o de Bacillus subtilis y una celula vegetativa bacillus o de Bacillus subtilis.
[0055] El termino "espora bacillus" o "espora Bacillus subtilis" en relacion a la celula de espora de bacillus o Bacilllus subtilis se refiere aquf a una espora que segun la tecnica se puede caracterizar por una estructura aletargada, resistente, no reproductiva producida por la bacterias de bacillus.
La funcion primaria de esporas es generalmente asegurar la supervivencia de una bacteria en los periodos de estres ambiental.
Estas son por lo tanto resistentes a la radiacion ultravioleta y gamma, desecacion, lisozima, temperatura, inanicion y desinfectantes qufmicos.
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Las esporas se encuentran comunmente en tierra y agua, donde estas pueden sobrevivir por periodos largos de tiempo.
El revestimiento de espora es impermeable a muchas moleculas toxicas y tambien puede contener enzimas que se implican en la germinacion.
El nucleo tiene estructuras celulares normales, tal como ADN y ribosomas, pero es inactivo metabolicamente.
Cuando una bacteria detecta que las condiciones medioambientales se vuelven desfavorables, esta puede iniciar el proceso de esporulacion, que lleva cerca de ocho horas.
[0056] El termino "celula vegetativa bacillus" o "celula vegetativa Bacillus subtilis" se refiere a celulas bacillus vegetativas funcionales o celulas de Bacillus subtilis, que se pueden dividir para producir celulas mas vegetativas.
[0057] El termino "germinacion y crecimiento" se refiere a que las esporas de bacillus germinan y crecen a celulas vegetativas de bacillus.
Como sabe la persona experta, la reactivacion de la espora se produce cuando las condiciones son favorables e implican la germinacion y crecimiento.
La germinacion implica el inicio de la actividad metabolica de la espora latente y asf la entrada de la hibernacion.
Es comunmente caracterizado por la rotura o absorcion del revestimiento de espora, inflamacion de la espora, un aumento de la actividad metabolica y perdida de resistencia para estres ambiental.
El crecimiento le sigue a la germinacion e implica al nucleo de la espora en la fabricacion de nuevos componentes qufmicos y se retira el revestimiento de espora vieja para desarrollarse en una celula bacteriana vegetativa funcional, que se pueden dividir para producir mas celulas.
Las curvas de crecimiento (OD contra tiempo) de celulas de bacillus muestran fases de crecimiento diferentes.
Como las esporas se transfieren a un medio rico en nutrientes, la germinacion se inicia seguida de una reduccion temporal en OD (fase I), que se debe a la liberacion de acido dipicolfnico y consecuentemente la hidratacion del revestimiento de espora.
En la segunda fase (fase II = fase de crecimiento) hay un periodo con un cambio relativamente pequeno en OD, hasta que las esporas se desarrollan en unas celulas bacterianas vegetativas funcionales, que se pueden dividir para producir mas celulas y proporcionar asf un aumento continuo en el valor OD.
El punto cuando uno comienza a obtener el aumento continuo en los valores OD que alcanzan un OD de 0,4 aquf se denomina "punto de crecimiento celular vegetativo".
[0058] El termino "densidad optica" se define como una medida de absorbancia optica que utiliza un espectrofotometro.
La densidad optica (OD) es la absorbancia de un elemento optico para una longitud de onda determinada L por distancia de unidad.
Si OD se mide por ejemplo a una longitud de onda de 630 nm se puede referir como OD630.
Dibujos
[0059]
La Figura 1: en esta figura, se ilustran los pasos para obtener a las cepas mejoradas nuevas aquf.
Los ejemplos practicos aquf se comenzaron de DSM 17231 (GalliPro®), que fueron mutados clasicamente y fitrados/seleccionados para una germinacion y crecimiento rapidos en presencia de sal de bilis para obtener la nueva cepa seleccionada DSM 19467.
DSM 19467 fue usado como cepa de inicio para mutacion tradicional y cepas que producen altas cantidades de aminoacidos fueron seleccionadas.
La Figura 2a y 2b: estas figuras muestran claramente la germinacion y crecimiento rapidos mejorados de DSM 19467 esporas de bacillus de la presente invencion en comparacion con DSM 17231 en presencia de 4 y 6 mM de sal de bilis como se describe en este caso.
Descripcion detallada de la invencion
Un compuesto pertinente de interes:
[0060] Como se ha mencionado anteriormente, el termino "un compuesto relevante de interes" del punto (ii) deberfa entenderse en terminos generales.
Como se ha mencionado anteriormente, celulas de bacillus con esporas que cumplen con el criterio (i) del primer aspecto (tal como por ejemplo DSM 19467) en principio, por ejemplo, se pueden utilizar como una cepa de inicio para filtrar celulas vegetativas de bacillus que pueden por ejemplo tener una produccion mas alta/mejorada de cualquier compuesto de interes, tal como por ejemplo una enzima de interes.
[0061] Ejemplos adecuados de un compuesto de interes pueden ser enzimas tales como por ejemplo mananasa.
Un compuesto de interes podrfa ser tambien un aminoacido tal como leucina.
[0062] En una forma de realizacion preferida del punto (ii) del primer aspecto, las celulas vegetativas de Bacillus subtilis producen el compuesto de interes en una cantidad que es superior a la celula de Bacillus de referencia DSM
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19467, donde la celula vegetativa y celula de Bacillus de referenda DSM 19467 han crecido bajo condiciones identicas.
[0063] En el ejemplo 4 aqrn, uno puede ver un ejemplo de esta forma de realizacion, en el ejemplo 4 aqrn se describen celulas vegetativas con una produccion de un mmimo de 5 veces mas alta de leucina de aminoacido en comparacion con DSM 19467.
[0064] Ademas, como se ha discutido arriba, en el ejemplo 4 de PCT/EP2008/057296 y EP2011858A1 se describe de forma similar para fitasa, es decir, celulas vegetativas con una produccion mas alta de fitasa en comparacion con DSM 19467.
Composicion de Bacillus:
[0065] El termino "composicion de bacillus" o composicion de Bacillus subtilis" debe entenderse segun la tecnica. Aqrn se entiende como una composicion de Bacillus o de Bacillus subtilis que comprende un numero de celulas de espora bacillus o de Bacillus subtilis con una caractenstica de interes.
[0066] La composicion de bacillus o de Bacillus subtilis comprende B. subtilis.
En la esencia de la composicion debe sencillamente comprender la cantidad de celulas de espora de Bacillus subtilis dada en el primer aspecto aqrn, donde las celulas de Bacillus subtilis cumplen el criterio dado en el primer aspecto.
[0067] Como sabe la persona experta, las composiciones de celula de espora de bacillus pertinentes comercialmente en este documento se han hecho generalmente por fermentacion.
Las celulas de espora obtenidas estan generalmente concentradas, secas, mezcladas con un portador y empaquetadas en un contenedor adecuado.
[0068] Las celulas de Bacillus subtilis pertinentes, por ejemplo, 105 a 1012 CFU/g de la composicion pueden estar presentes en una forma comercialmente relevante conocida por la persona experta.
[0069] Por consiguiente, en una forma de realizacion 105 a 1012 CFU/g de celulas de espora de Bacillus subtilis de la composicion estan presentes como celulas secas (por ejemplo, secadas por atomizacion) o como celulas de espora congeladas.
[0070] En una forma de realizacion preferida, la composicion de Bacillus subtilis comprende de 106 a 1012 CFU/g de celulas de espora de Bacillus subtilis, mas preferiblemente, de 107 a 1012 CFU/g de celulas de espora de Bacillus subtilis.
El termino "CFU/g" se refiere al peso en gramos de la composicion como tal, incluyendo aditivos pertinentes adecuados presentes en la composicion.
No incluye el peso de un contenedor adecuado usado para el empaquetado de la composicion de Bacillus subtilis.
[0071] Una forma de realizacion, se refiere a que la composicion de Bacillus subtilis se empaqueta en un contenedor adecuado.
[0072] Como sabe la persona experta, una composicion bacteriana pertinente comercialmente generalmente tambien comprende otros aditivos pertinentes, tales como por ejemplo un portador/ingrediente del grupo de suero de leche, permeato de suero de leche, carbonato/piedra caliza de calcio y anti agentes de apelmazamiento tales como silicatos de aluminio y kieselgur (diatomeas tierra).
[0073] Ademas de las celulas de bacillus pertinentes aqrn, la composicion tambien puede comprender otros microorganismos pertinentes de interes tales como por ejemplo bacterias de acido lactico de interes.
Celula de Bacillus
[0074] La celula de Bacillus es una celula B. subtilis.
Ensayo para seleccionar para germinacion y crecimiento rapidos en presencia de sal de bilis
[0075] Como se ha mencionado anteriormente, el ensayo de resistencia a la bilis del punto (i) del primer aspecto se basa en elementos estandar disponibles comercialmente (tales como por ejemplo medios estandar, sales de bilis; mediciones OD estandar).
[0076] Por consiguiente, basandose en la descripcion del ensayo detallado aqrn (ver por ejemplo, el ejemplo 1 de aqrn), la persona experta es capaz de repetir rutinariamente este ensayo para determinar objetivamente si una celula de espora de Bacillus subtilis espedfica de interes cumple con el criterio de la germinacion y crecimiento rapidos de espora a celula vegetativa como se describe en el punto (i).
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[0077] En el punto (i) se explica que el punto de crecimiento de celula vegetativa es el punto en una curva de crecimiento que parte con 108 esporas/ml que correspondem con OD de alrededor de 0,2-0,3 hasta que el tiempo donde el valor OD haya aumentado (debido al crecimiento de las celulas vegetativas) en un cierto sentido continuo y haya alcanzado OD 0,4.
Esto es conforme a como una persona experta entenderfa tal punto de crecimiento de celula vegetativa y basandose en una curva de crecimiento, la persona experta puede determinar esto rutinariamente, dentro de una variabilidad limitada de alrededor de ± 30 minutos, como se ha explicado aquf.
[0078] El ejemplo practico 1 aquf proporciona una descripcion detallada de un ensayo de resistencia a la bilis adecuada para seleccionar la germinacion y crecimiento rapidos en presencia de sal de bilis.
Las condiciones detalladas aquf en este ejemplo 1 son un ensayo preferido para determinar si una celula de espora de Bacillus subtilis de interes cumple con el criterio del punto (i) del primer aspecto.
[0079] El termino "sal de bilis" se refiere a la sal de acidos biliares.
Acidos biliares son acidos esteroides descubiertos predominantemente en la bilis de mamfferos.
Estos se producen en el hfgado por la oxidacion de colesterol y se almacenan en la vesfcula biliar y se segregan en el intestino en forma de sales.
Estos hacen de surfactantes, lfpidos emulsionantes y asistencia con su absorcion y digestion.
Las sales de bilis usadas en el ejemplo 1 se prepararon imitando las concentraciones fisiologicas y composiciones de sales de bilis porcina.
Como sabe la persona experta, las composiciones de sales de bilis porcina pueden aquf estar consideradas como condiciones relativamente "fuertes" en comparacion con composiciones de sal de bilis aviar.
[0080] El termino "medio de sal de bilis" se refiere al medio que comprende ingredientes de crecimiento de bacillus pertinentes tales como nutrientes pertinentes y sal de bilis.
Punto de crecimiento de celula vegetativa - en el ensayo de sal de bilis - punto (i) del primer aspecto
[0081] Como se ha dicho anteriormente, en relacion con el punto (i) del primer aspecto, las celulas de espora de Bacillus subtilis, como se describe en este caso, tienen una germinacion y crecimiento de espora a celula vegetativa que es tan rapido que estas alcanzan un punto de crecimiento de celula vegetativa de 0,4 Od dentro de menos de 18 y 19 horas a 4 y 6 mM de sales de bilis, respectivamente.
Como se ha dicho anteriormente, la nueva cepa DSM 19467 alcanza el punto de crecimiento de celula vegetativa despues de 14 y 15 horas de incubacion en 4 y 6 mM de sal de bilis, respectivamente.
[0082] Por consiguiente, en una forma de realizacion preferida, las esporas de Bacillus subtilis alcanzan el punto de crecimiento de celula vegetativa despues de 17 y 18 horas de incubacion en 4 y 6 mM de sal de bilis bajo las condiciones del punto (i) del primer aspecto, mas preferiblemente, las esporas de Bacillus subtilis alcanzan el punto de crecimiento de celula vegetativa despues de 15 y 16 horas de incubacion en 4 y 6 mM de sal de bilis bajo las condiciones del punto (i) del primer aspecto.
[0083] Como se ha explicado arriba y se ha mostrado esquematicamente en la figura 1, la cepa aquf descrita DSM 19467 fue seleccionada usando el GalliPro® disponible comercialmente como una cepa de inicio para mutagenesis y seleccion para crecimiento rapido en presencia de sal de bilis como se describe en este caso.
[0084] GalliPro® es una composicion que comprende celulas de Bacillus subtilis y el Bacillus subtilis se deposita como DSM 17231.
Por consiguiente, GalliPro® puede verse aquf como una cepa de referencia.
[0085] Como se ha dicho anteriormente, el punto de partida de crecimiento de celula vegetativa para GalliPro® es despues de 20 horas de incubacion en 4 y 6 mM de sales de bilis bajo las condiciones del punto (i) del primer aspecto.
Por consiguiente, en una forma de realizacion, las esporas de Bacillus subtilis alcanzan el punto de crecimiento de celula vegetativa, al menos 3 horas antes que las celulas de esporas de Bacillus subtilis de referencia depositadas como DSM 17231 ("GalliPro®") bajo las condiciones del punto (i) del primer aspecto, mas preferiblemente, las esporas de Bacillus subtilis alcanzan el punto de crecimiento de celula vegetativa de al menos 4 horas antes que las celulas de esporas de Bacillus subtilis de referencia depositadas como DSM 17231 ("GalliPro®") bajo las condiciones del punto (i) del primer aspecto y, de la forma mas preferible, las esporas de Bacillus subtilis alcanzan el punto de partida de crecimiento de celula vegetativa al menos 5 horas antes que las de celulas de esporas de Bacillus subtilis de referencia depositadas como DSM 17231 ("GalliPro®") bajo las condiciones del punto (i) del primer aspecto.
Aminoacidos esenciales
[0086] Como sabe la persona experta, un aminoacido puede ser un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: fenilalanina, valina, treonina, triptofano, isoleucina, metionina, leucina, lisina, cistefna, tirosina, histidina y
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arginina.
[0087] En una forma de realizacion preferida, el aminoacido es al menos un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: fenilalanina, valina, treonina, triptofano, isoleucina, metionina, leucina y lisina.
[0088] En la forma de realizacion mas preferida, el aminoacido es al menos un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en: valina, isoleucina y leucina.
[0089] Un amino muy pertinente aquf es leucina.
[0090] Como sabe la persona experta, las celulas vegetativas de bacillus pueden producir una cantidad mas alta de mas de un aminoacido, tal como por ejemplo una cantidad mas alta de dos o tres o mas aminoacidos diferentes.
Ensayo de aminoacido
[0091] Como se ha mencionado anteriormente, el ensayo de aminoacido del punto (ii) del primer aspecto se basa en elementos estandar disponibles comercialmente (tales como por ejemplo medios estandar, prueba estandar).
[0092] Por consiguiente, basandose en la descripcion del ensayo detallado aquf (ver por ejemplo, el ejemplo 2 aquf), la persona experta es capaz de repetir rutinariamente este ensayo para determinar objetivamente si una celula vegetativa especffica de Bacillus subtilis de interes cumple con la cantidad de aminoacidos producidos como se describe en el punto (ii).
[0093] Ejemplo practico 2 aquf proporciona una descripcion detallada de un ensayo de aminoacidos.
Las condiciones detalladas de este ejemplo 2 son aquf un ensayo de aminoacido preferido para determinar si una celula vegetativa de bacillus de interes cumple con el criterio del punto (ii) del primer aspecto.
Cantidad producida de aminoacido esencial, punto (ii) del primer aspecto
[0094] En relacion con el punto (ii) del primer aspecto, las celulas vegetativas de Bacillus subtilis preferiblemente producen al menos un aminoacido esencial en una cantidad de al menos 2 veces mas de la celula de Bacillus de referencia DSM 19467 bajo las condiciones del punto (ii) del primer aspecto.
[0095] En una forma de realizacion mas preferida, en relacion con el punto (ii) del primer aspecto, las celulas vegetativas de Bacillus subtilis preferiblemente producen al menos un aminoacido esencial en una cantidad de al menos 4 veces mas de la celula de Bacillus de referencia DSM 19467 bajo las condiciones del punto (ii) del primer aspecto.
Metodo para alimentar/administrar esporas de bacillus a un animal
[0096] Como se ha dicho anteriormente, un segundo aspecto de la invencion se refiere a un metodo para alimentar un animal que comprende administrar la composicion de Bacillus subtilis del primer aspecto y formas de realizacion aquf descritas relacionadas con un animal conjuntamente con otros ingredientes de pienso para animales.
[0097] El animal puede ser cualquier animal de interes.
Preferiblemente, el animal es un animal seleccionado del grupo que consiste en aves, rumiantes, terneros, cerdos, conejos, caballos, pescado y animales domesticos.
[0098] Cuando se administra el GalliPro® segun la tecnica, normalmente se hace en una dosis de alrededor de 104108 CFU/g de pienso, comunmente 105-106 CFU/g de pienso o en dosis equivalentes a la ingesta normal de pienso/kg de peso del animal vivo.
[0099] Alternativamente, las esporas de bacillus se pueden administrar al animal en una de las siguientes vfas:
(1) : poner en el agua potable para animales;
(2) : pulverizar sobre animales; o
(3) : aplicar via pasta, gel o bolo.
Metodo para la seleccion y aislamiento de una celula de bacillus nueva
[0100] Como se ha dicho anteriormente, el tercer aspecto se refiere a un metodo para la seleccion y aislamiento de una celula de Bacillus subtilis nueva.
[0101] En el metodo del tercer aspecto, se selecciona para una celula de Bacillus subtilis capaz de satisfacer las condiciones del punto (i) y (ii) del primer aspecto.
[0102] Como sabe la persona experta, la resistencia a la bilis descrita aquf detallada especffica y los parametros de
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ensayo de cantidad de aminoacido (ver por ejemplo, el ejemplo 1 aquf para el ensayo de resistencia a la bilis y ejemplo 2 aquf para el ensayo de aminoacidos) se pueden cambiar para hacer un metodo de filtracion alternativo que aun asf consigue los objetivos principales como se describe en este caso, es decir, una celula de Bacillus subtilis que es capaz de satisfacer las condiciones del punto (i) y (ii) del primer aspecto.
[0103] En una forma de realizacion preferida, el ensayo de resistencia a la bilis del ejemplo 1 se usa en el paso (a) del metodo de seleccion del tercer aspecto y el ensayo de aminoacido esencial del ejemplo 2 se usa en el paso (c) del metodo de seleccion del tercer aspecto.
[0104] En el paso (d) del metodo de seleccion del tercer aspecto, se aisla una celula de Bacillus subtilis vegetativa. Esta celula de Bacillus subtilis vegetativa se puede utilizar para hacer esporas de bacillus.
[0105] Por consiguiente, el metodo de seleccion del tercer aspecto se puede seguir por un paso extra (e), donde la celula vegetativa de Bacillus subtilis aislada del paso (d) se fermenta para hacer de 105 a 1012 celulas vegetativas de Bacillus subtilis y estas 105 a 1012 celulas vegetativas de Bacillus subtilis se usan para hacer 105 a 1012 celulas de espora de Bacillus subtilis, que se aislan para dar una composicion de Bacillus subtilis, que comprende de 105 a 1012 CFU/g de celulas de espora de Bacillus subtilis.
El resultado final de la etapa (e) es una composicion de Bacillus subtilis nueva, que comprende de 105 a 1012 CFU/g de celulas de espora de Bacillus subtilis y donde las celulas de Bacillus subtilis son capaces de satisfacer las condiciones del punto (i) y (ii) del primer aspecto.
[0106] Por consiguiente, una composicion de Bacillus subtilis, que comprende de 105 a 1012 CFU/g de celulas de espora de Bacillus subtilis capaces de satisfacer las condiciones del punto (i) y (ii) del primer aspecto puede ser obtenida por el metodo de seleccion del tercer aspecto.
[0107] En el paso (b) del metodo de seleccion del tercer aspecto se hacen mutaciones de celula de Bacillus subtilis anteriormente seleccionadas resistentes a la bilis para seleccionar cepas que producen altas cantidades de aminoacidos en el paso (c).
Como entiende la persona experta, esta puede por ejemplo por mutacion tradicional (por ejemplo, por tratamientos qufmicos o UV) de intercambio especffico de genes hacer un denominado organismo geneticamente modificado (GMO).
Cepas depositadas
[0108] Una muestra de la cepa de Bacillus subtilis ha sido depositada en la coleccion alemana DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Maschroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig) bajo el numero de registro DSM 19467 con una fecha de deposito de 27 de junio de 2007.
El deposito se ha realizado bajo las condiciones del tratado de Budapest en el reconocimiento internacional del deposito de microorganismos para los fines de procedimiento de patente.
Ejemplos
Ejemplo 1: ensayo de resistencia a la bilis Medio:
[0109] El medio fue un medio de Caldo de Infusion de Ternera (VIB) disponible comercialmente no selectivo estandar (Difco, 234420).
En la fecha de deposito de la presente solicitud, el catalogo de producto ("Difco™/BBL™ Manual) del proveedor BD Diagnostic Systems (ww.bd.com) indica en relacion al Caldo de Infusion de Ternera:
"Infusion de magro de ternera y peptona proporciona nitrogeno, vitaminas, carbon y aminoacidos al medio de infusion de ternera. El cloruro sodico mantiene el equilibrio osmotico de las formulaciones"; y El medio se preparo segun la produccion de instrucciones por la suspension de 25 g del polvo de Caldo de Infusion de Ternera en 1 L de agua purificada (2,5 % de solucion) y se calienta con una agitacion frecuente y ebullicion durante 1 minuto para disolver completamente el polvo.
Una solucion del 2,5 % de Caldo de Infusion de Ternera comprendido por litro:
Carne de magro de ternera, infusion: 10 g Proteosa Peptona: 10 g Cloruro sodico 5 g
[0110] El medio fue distribuido en botellas esterilizadas y sometidas a autoclave durante 15 min a 121 °C. Soluciones/medio de sal de bilis:
[0111] La mezclas de sales de bilis fueron preparadas imitando la composicion fisiologica y concentracion de sales de bilis en la bilis de cerdo y las sales de bilis fueron disueltas en el medio de Caldo de Infusion de Ternera como se
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preparan arriba para dar una concentracion final de sal de bilis de 8 mM.
Las sales de bilis conjugadas fueron taurodesoxicolato (Sigma T-0875, EEUU) y glicodeoxicolato (Sigma G-9910, EEUU) y el deoxicolato de sal de bilis desconjugada (Sigma D-5670 EEUU) y la solucion final 8 mM de salina de bilis mezclada contenfa 60 % del taurodesoxicolato, 30 % del glicodeoxicolato y 10 % de deoxicolato.
Antes de esterilizarlas durante 15 minutos a 121 °C, las soluciones se ajustaron a pH 7,4 utilizando hidroxido sodico. Los medios preparados de sal de bilis de 8 mM fueron diluidos para obtener concentraciones de sal de bilis de 0, 1, 2, 4, 6 y 8 mM.
[0112] Las sales de bilis fueron anadidas al medio de Caldo de Infusion de Ternera en una forma concentrada.
[0113] Por consiguiente, la cantidad final de infusion de magro de ternera, proteosa peptona y cloruro sodico fueron esencialmente con respecto al 2,5 % de medio de Caldo de Infusion de Ternera antes de que las sales de bilis fueran adicionadas.
Suspensiones de esporas
[0114] Para distinguir entre celulas vegetativas y esporas y para asegurar productos de espora puros para inoculacion, las cuentas de espora del producto de bacillus fueron determinadas utilizando +/- tratamiento termico a 80 °C durante 10 min. Despues del tratamiento termico y enfriamiento posterior de la camara temperatura, las diluciones seriadas con un factor de dilucion de 10 se dirigieron al agua de peptona de solucion salina.
Se inocularon duplicados de placas de agar-sangre triptosa (Difco 0232-01) con 0,1 ml de las diluciones de decimal apropiadas.
Las platcas fueron incubadas a 37 °C hasta el dfa siguiente.
Basadas en determinaciones de cuenta de espora precedentes de los productos, se prepararon suspensiones de esporas en agua destilada esterilizada para alcanzar una concentracion de espora calculada final de 108 UFC/ml.
Las cuentas de celulas vegetativas y esporas en los inoculos finales fueron determinadas utilizando el metodo anteriormente descrito.
La concentracion final de 108 UFC/mL correspondfa a un inicio OD630 a 0,2-0,3.
Medicion de crecimiento: mediciones de densidad optica
[0115] Se utilizaron las placas del pocillo de microtitulacion con la parte plana de abajo esterilizada 96 (Greiner Bio- one GmbH, Alemania).
Cada pocillo se lleno de 0,150 ml VIB inoculado con esporas (<1x108 esporas por ml equivalente/correspondiente a un inicio OD630< 0,2-0,3) y las placas fueron incubadas durante 20 horas a 37 °C con un ciclo de agitacion de 1 minuto de intensidad 4 (alta) antes cada lectura.
[0116] Para evitar la condensacion en el interior de la cubierta de la placa, las tapas fueron expuestas a una solucion dilufda de Triton X-100.
[0117] La germinacion y crecimiento cinetico de cepas de Bacillus fueron medidas utilizando un espectrofotometro con una longitud de onda de 630 nm (OD630) (Bio-tek Instruments, Inc. VE).
Las lecturas se realizaron con intervalos de 10 minutos y se analizaron utilizando el software KC4™ (Bio-tek Instruments, Inc. USA).
Despues de 20 h, los datos fueron exportados a hojas de calculo de Excel® para otro analisis, importados en version SAS 9.0 y analizados estadfsticamente.
Ejemplo 2: ensayo de aminoacido
[0118] El metodo para medir y cuantificar los aminoacidos producidos por las celulas de bacillus usadas en este estudio es un metodo GC-MS estandar para muestras acuosas, usando cloroformato de metilo como agente de derivatizacion.
Crecimiento de celulas de Bacillus
[0119] Las celulas de bacilos se inoculan y crecen en uno o mas medios de crecimiento de sales mfnimo a 37 °C, 150 r.p.m. y crecen durante 2 dfas y cantidad de aminoacido luego se mide en el sobrenadante como se describe abajo.
[0120] Las celulas de bacillus se propagan en un medio de sales mfnimas, segun Chapman (1972) con la composicion siguiente:
(NH4)2SO4 (Merck 1.01217.1000) 1 g/l K2HPO4 (Merck 1.05101.1000) 7 g/l KH2PO4 (Merck 1.04873.1000) 3 g/l MgSO4-7H2O (Merck 1.05886.1000) 0,1 g/l
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Se ha sometido a autoclave durante 15 min a121 °C y se ha anadido glucosa sometida a autoclave a una concentracion final de 0,5 %.
[0121] La incubacion esta hecha en tubos con 10 ml de medio durante 2 dfas a 37 °C y 150 r.p.m.
Ensayo de aminoacido
[0122] El ensayo de aminoacido se realiza en sobrenadantes celulares, ya que los aminoacidos se segregan a los medios.
Las muestras se filtran esteriles y se mantienen a -20 °C hasta el analisis.
[0123] Reactivos:
Reactivo 1: solucion estandar interna. Norvalina 1 mM: 0,0172 g norvalina + 100 ml MQW Reactivo 2: metanol/piridina 32/8 (v/v) (Catalizador)
Reactivo 3: Cloroformato de metilo p.a. (MCF) (agente de derivatizacion)
Reactivo 4: 1 % MCF/CHCh (v/v) (extraccion): 1 ml de cloroformato de metilo p.a. + cloroformo hasta 1000 ml.
[0124] Preparacion de la muestra:
Pipeta 150 pl (25 pl + 125 p MQW) muestra en frasco de inyeccion de 2 ml.
Anadir 150 pl IS
Anadir 200 pl 1-Metanol/piridina 32/8 % (v/v). Mezclar bien.
Anadir 25 pl MCF (metilo cloroformato).
Mezclar bien hasta que se produzca el desarrollo del gas.
Anadir 500 pl 1 % MCF/CHCl3 (v/v), tapar y mezclar energicamente.
La fase de separacion se produce en minutos.
Si la fase de separacion es demasiado lenta, centrffugar el frasco (500 rpm/10 min).
[0125] Si la norvalina se usa como antimetabolito, en su lugar deberfa usarse un estandar externo u otro estandar interno adecuado y el 150 pl IS sustituido con el MQW o muestra.
[0126] Las muestras se realizan en GC-MS con una columna y protocolo de aminoacido estandar.
Ejemplo 3: seleccion de celula de Bacillus subtilis resistente a la bilis DSM 19467
[0127] La celula de Bacillus de inicio fue la celula de Bacillus subtilis GalliPro®.
[0128] GalliPro® fue mutagenizada para obtener una agrupacion de celulas nuevas de bacillus individuales.
Las esporas se hicieron y se seleccionaron por una germinacion y crecimiento rapidos de espora a celula vegetativa en presencia de un medio de sal de bilis que comprende 4 y 6 mM de sal de bilis como se describe en ejemplo 1 de arriba.
[0129] Celula de Bacillus subtilis DSM 19467 fue seleccionada.
[0130] La tabla 1 de abajo muestra los datos de germinacion y crecimiento.
[0131] Tiempo (horas) de 108 UFC/mL correspondientes a OD 0,2-0,3 hasta OD 0,4 se alcanza (medio de 3 replicas).
- B.subtilis
- 4 mM de bilis 6mM de bilis
- Producto existente GalliPro® (DSM 17231)
- >20 >20
- Tolerante a la bilis (DSM 19467)
- 13h40m 15h
- Producto comercial: Calsporin
- >20 >20
[0132] Algunos de los datos de este ejemplo se realizaron por la prueba de sobreexpresion de fitasa DSM 19489.
De no ser por el resultado tecnico de este ejemplo, esto es aquf relativamente irrelevante, ya que DSM 19467 tiene una germinacion y crecimiento aproximadamente como DSM 19489.
Ver PCT/EP2008/057296 y EP2011858A1 para detalles adicionales.
Conclusion
[0133] DSM 19467 es una cepa resistente a la bilis y que claramente germina y crece mas rapido que GalliPro®.
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Ejemplo 4: seleccion de aminoacidos que sobre-producen celulas de Bacillus DSM 19467
[0134] La celula de Bacillus de inicio fue la celula de Bacillus subtilis DSM 19467 seleccionada en el ejemplo 3.
[0135] La DSM 19467, bien tipo salvaje o mutantes producidos por, por ejemplo, mutagenesis de UV crecio en sales mfnimas de medio agar, descritas en el ejemplo 2B de arriba y le fue anadido un 1,5 % de agar, que contiene analogos de aminoacido en cantidades inhibitorias adecuadas.
Dependiendo del aminoacido que se va a sobreexpresar, varios analogos de aminoacido podrfan ser usados, por ejemplo, norvalina o 4-aza-DL-leucina para la sobreproduccion de leucina (Bardos, 1974, Topics in Current Chemistry 52,63-98).
Colonias resistentes al analogo de aminoacidos fueron escogidas, crecidas en medio de sales mfnimo y ensayadas para la produccion de aminoacido.
Las celulas vegetativas fueron seleccionadas para producir una cantidad alta de aminoacidos usando el metodo GC- MS descrito en ejemplo 2B de arriba.
Se selecciono una celula de Bacillus subtilis de alta produccion de aminoacidos.
Resultados de mediciones de aminoacidos
[0136] Se selecciono un numero de cepas que producfan leucina de aminoacido esencial en una cantidad que era significativamente superior a la celula de Bacillus de referencia DSM 19467.
[0137] Un numero de cepas seleccionadas produjeron al menos 5 veces mas leucina que DSM 19467.
Conclusiones:
[0138] Este ejemplo muestra que uno puede - basandose en las instrucciones de aquf - seleccionar e identificar una cepa rutinariamente, que produce al menos un aminoacido esencial (aquf ejemplificado por leucina) en una cantidad que fue significativamente superior a la celula de Bacillus de referencia DSM 19467.
[0139] DSM 19467 es originaria de GalliPro® y no se selecciona para la alta produccion de aminoacidoa esenciales. Por consiguiente, se cree que GalliPro® produce aproximadamente la misma cantidad de aminoacidos esenciales como DSM 19467.
Ejemplo 5: "control" de resistencia a la bilis de celulas de bacillus de alta produccion de aminoacidos esenciales.
[0140] Las celulas de bacillus de alta produccion de aminoacidos esenciales seleccionados en el ejemplo 4 se controlaron de nuevo por su capacidad de germinacion y crecimiento rapidos de espora a celulas vegetativas como se describe en el ejemplo 1.
[0141] Los resultados son que estas - como estaba previsto - mantuvieron aproximadamente la misma buena germinacion y crecimiento rapidos como la celula de inicio DSM 19467 usada para obtener estos.
Referencias
[0142]
1. Antonie van Leeuwenhoek. 2006 Aug; 90(2): 139-46.
Epub 2006 Jul 4
2. US2003/0124104A
3. US6255098
4. PCT/EP2008/057296 y EP2011858A1
Claims (9)
- 5101520253035404550556065REIVINDICACIONES1. Composicion de Bacillus subtilis, que comprende de 105 a 1012 CFU/g de celulas de espora de Bacillus subtilis, donde la composicion de Bacillus subtilis se caracteriza por el hecho de que:(i) : las esporas de Bacillus subtilis tienen una germinacion y crecimiento rapidos de espora a celula vegetativa en presencia de un medio de sal de bilis que comprende 4 mM de sales de bilis y en presencia de un medio de sal de bilis que comprende 6 mM de sales de bilis, definido por el hecho de que las esporas de Bacillus subtilis alcanzan un punto de crecimiento de celula vegetativa de 0,4 OD630 dentro de menos de 18 y 19 horas, respectivamente, donde el punto de crecimiento de celula vegetativa es el punto en la curva de crecimiento donde el valor OD comienza a aumentar (debido a crecimiento de las celulas vegetativas) en un cierto sentido continuo y alcanza un OD630 de 0,4;(I) : donde el medio de sal de bilis es el medio de Caldo de Infusion de Ternero no selectivo (VIB) del ejemplo 1 aquf suplementado con una mezcla de sal de bilis que comprende el taurodesoxicolato de sales de bilis conjugadas y glicodeoxicolato y el deoxicolato de sal de bilis desconjugada en las proporciones 60 % del taurodesoxicolato, 30 % del glicodeoxicolato y 10 % de deoxicolato; y(II) : donde el analisis de ensayo OD se realiza por los pasos siguientes:(a) : rellenar un pocillo en una placa de microtitulacion con 0,150 ml medio de sal de bilis con 108 esporas de Bacillus subtilis por ml medio (es decir, este es tiempo cero); y(b) : incubar la placa a 37 °C bajo condiciones atmosfericas y medir los valores OD630, utilizando un espectrofotometro y con agitacion antes cada lectura, para obtener una curva de crecimiento representativa a lo largo del tiempo;y(ii) las celulas vegetativas de Bacillus subtilis producen una enzima o un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en fenilalanina, valina, treonina, triptofano, isoleucina, metionina, leucina, lisina, cistefna, tirosina, histidina y arginina;y con la condicion de que las celulas vegetativas de Bacillus subtilis no son celulas, como se describe en la reivindicacion 1 de PCT/EP2008/057296 y la solicitud de prioridad de esta, EP07111 939.0, publicada como EP2011858A1, donde las celulas vegetativas de bacillus del punto (ii) segun la reivindicacion 1 de PCT/EP2008/057296 y EP2011858 A1producen fitasa en una cantidad de al menos 1,25 veces mas de la celula de Bacillus de referencia DSM 19467, donde la cantidad de fitasa producida se mide por el ensayo de fitasa del ejemplo 2 de PCT/EP2008/057296 y EP2011858A1 despues de 4 horas de crecimiento a 37 °C en el medio de Caldo de Infusion de Corazon (HIB) no selectivo del ejemplo 2 de PCT/EP2008/057296 y EP2011858A1, y donde el analisis de ensayo de fitasa se realiza por los pasos siguientes:(a) : hacer un cultivo de celulas vegetativas de bacillus durante toda la noche en un medio de cultivo enriquecido; y(b) : transferir un 1 % de inoculo del cultivo a un medio HIB (es decir, este es tiempo cero) durante toda la noche e incubar a 37 °C hasta la medicion de actividad de fitasa.
- 2. Composicion de Bacillus subtilis, segun la reivindicacion 1, donde las celulas de espora de Bacillus subtilis de la composicion estan presentes como celulas de espora secas (por ejemplo, secado por atomizacion).
- 3. Composicion de Bacillus subtilis, segun la reivindicacion 1 o 2, donde las esporas de Bacillus subtilis alcanzan el punto de crecimiento de celula vegetativa al menos 3 horas antes que las celulas de esporas de Bacillus subtilis de referencia depositadas como DSM 17231 ("GalliPro®") bajo las condiciones del punto (i) segun la reivindicacion 1.
- 4. Composicion de Bacillus subtilis, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde las celulas vegetativas de Bacillus subtilis del punto (ii) segun la reivindicacion 1 producen enzimas o aminoacidos en una cantidad que es superior a la celula de Bacillus subtilis de referencia DSM 19467, donde la celula vegetativa y la celula de Bacillus subtilis de referencia DSM 19467 crecen bajo condiciones identicas.
- 5. Composicion de Bacillus subtilis, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la enzima del punto (ii) segun la reivindicacion 1 es mananasa.
- 6. Composicion de Bacillus subtilis, segun cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde las celulas vegetativas de Bacillus subtilis del punto (ii) segun la reivindicacion 1 producen al menos un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en fenilalanina, valina, treonina, triptofano, isoleucina, metionina, leucina, lisina, cistefna, tirosina, histidina y arginina en una cantidad que es superior a la celula de Bacillus subtilis de referencia DSM 19467, donde la cantidad de aminoacido producida se mide por el ensayo de aminoacidos basado en el metodo estandar GC-MS del ejemplo 2 de aquf despues de dos dfas de crecimiento a 37 °C en el conocido medio de crecimiento de sales mfnimas estandar del ejemplo 2 de aquf.
- 7. Metodo para alimentar a un animal que comprende la administracion de la composicion de Bacillus subtilis, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, a un animal conjuntamente con otros ingredientes de pienso para animales.
- 8. Metodo para alimentar un animal, segun la reivindicacion 7, donde el animal es un animal seleccionado del grupoque consiste en aves, rumiantes, terneros, cerdos, conejos, caballos, peces y animales domesticos.1015
- 9. Metodo para la seleccion y aislamiento de una celula de Bacillus subtilis que comprende los pasos siguientes:(a) : seleccion y aislamiento de una agrupacion de celulas de espora de Bacillus subtilis individuales una celula de espora de Bacillus subtilis que es capaz de germinar y crecer tan rapidamente que esta alcanza un punto de crecimiento de celula vegetativa dentro de menos de 18 y 19 horas bajo las condiciones de punto (i) segun la reivindicacion 1;(b) : realizacion de una celula de Bacillus subtilis vegetativa de la celula de espora aislada del paso (a) y mutacion de la celula seleccionada y aislada para obtener una agrupacion de celulas vegetativas de Bacillus subtilis individuales;(c) : seleccion y aislamiento de un agrupamiento de celulas vegetativas de Bacillus subtilis individuales del paso (b) una celula vegetativa de Bacillus subtilis que es capaz de la produccion de una enzima que no es fitasa o un aminoacido seleccionado del grupo que consiste en fenilalanina, valina, treonina, triptofano, isoleucina, metionina, leucina, lisina, cistefna, tirosina, histidina y arginina de interes; y (d): analisis de la celula vegetativa de Bacillus subtilis de alta produccion del paso (c) para confirmar que esta ha mantenido una germinacion y crecimiento rapidos del paso (a) y aislamiento de la celula de Bacillus subtilis seleccionada.
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