CN1780642A - 糖尿病治疗剂 - Google Patents

Abstract

本发明旨在提供一种与以往的糖尿病的治疗方法相比更为简便、安全且有效的治疗方法。通过给药1种或2种以上干细胞动员因子，既简单又安全地修复受损胰腺胰岛β细胞。因此，以1种或2种以上干细胞动员因子作为有效成分的本发明的治疗剂有助于糖尿病的治疗。这种干细胞动员因子，可举例为G-CSF这样的集落刺激因子。

Description

糖尿病治疗剂

技术领域

本发明涉及以干细胞动员因子作为有效成分的糖尿病治疗剂、胰腺胰岛β细胞再生剂、胰腺胰岛β细胞受损抑制剂。另外，本发明还涉及胰腺胰岛β细胞的制造方法，包括给予干细胞动员因子。

背景技术

糖尿病是伴随着由于胰岛素作用不足产生的慢性高血糖的多种特征的代谢异常的一类疾病。长期代谢异常的持续容易引起特有的并发症，也加速动脉硬化症。糖尿病可大致分为I型和II型。I型的特征是其发病机理是胰腺胰岛β细胞受损，II型发病与胰岛素分泌减少和胰岛素敏感性降低(胰岛素抵抗性)这二者相关。胰腺胰岛β细胞是构成胰岛(胰腺岛)的四种分泌细胞(α细胞、β细胞、δ细胞、PP细胞)中的一种，其分泌胰岛素。

据说在日本，糖尿病患者约有200万人。对于糖尿病的治疗方法，现在采用食物疗法、运动疗法和含有胰岛素的药物疗法。通过这些疗法，糖尿病可在一定程度上得以控制，但各种疗法中仍存在问题。

即，食物疗法是对卡路里进行限制、而且在并发肾病的情况下对蛋白质进行限制，因此这种疗法必须在每天长期持续进行。而且，由于通过患者本人或其家人其中大部分得到控制，许多脱落例也成为问题。

对运动疗法来讲每日坚持也很重要，如果仅进行运动疗法而忽略食物疗法，那么由于食欲增加反而对糖尿病控制产生反作用。

作为药物疗法，对于I型和一部分II型糖尿病采用的是胰岛素。但是，虽然对血糖的降低有显著的效果，但必需日复一日地自己注射，仅仅是对症治疗。口服降血糖剂中有磺酰脲(SU)药、缩二胍药等。但是，SU药存在着由于盲目使用产生的β细胞枯竭这样的问题，缩二胍药存在着乳酸酸中毒的副作用的问题。无论哪种药都是作为对照治疗使用的，目前的现状是没有根本的治疗药物。近年来，作为胰岛素抵抗性改善药被开发的噻唑啉衍生物也有许多其它的副作用，具有有效例和无效例被清楚地区分的倾向。

现在，在所谓根本治疗的概念中，通过在采用胎儿干细胞的β细胞移植或胰组织内β细胞前体中表达特定基因的分化诱导疗法的试验正处于前期临床阶段。

近年，已经明确的是骨髓中的干细胞具有多能性，其分化成血管或心肌细胞等。此外，已经清楚的是骨髓来源细胞还分化成内胚层组织的肠道细胞和胰腺β细胞，且其参与再生。

人G-CSF经发现作为粒性白细胞系造血干细胞的分化诱导因于被发现的造血因子，由于其在生物体内促进中性白细胞造血，现在其在临床中作为骨髓移植或癌症化学疗法后的中性白细胞减少症治疗剂得以应用。此外，除了上述作用外，人G-CSF还有着作用于干细胞刺激其分化增殖的作用和动员骨髓中的干细胞至周围血液中的作用。实际上基于后者的作用，在临床中为了促进实施强力化学疗法后的癌症患者恢复造血，进行移植由人G-CSF动员的周围血液造血干细胞的周围血液干细胞移植术。

发明内容

本发明旨在提供一种与以往的糖尿病治疗方法相比更为简便、安全且有效的糖尿病治疗方法。

本发明者们对利用G-CSF的干细胞动员作用对受损胰脏等的修复效果进行了研究。其结果是，通过给药G-CSF修复受损胰腺胰岛β细胞，从而发现G-CSF是一种有用的糖尿病治疗剂。基于上述认识得以完成本发明。

即，本发明提供了一种以干细胞动员因子作为有效成分的糖尿病治疗剂。

此外，本发明还提供了以干细胞动员因子作为有效成分的胰腺胰岛β细胞再生剂。

并且，本发明还提供了以干细胞动员因子作为有效成分的胰腺胰岛β细胞受损抑制剂。

并且，本发明还提供了一种制备胰腺胰岛β细胞的方法，其包括(a)给药干细胞动员因子后，收集干细胞的步骤和(b)将收集的干细胞分化诱导成胰腺胰岛β细胞的步骤。

附图的简要说明

图1是显示G-CSF给药对血中葡萄糖浓度的影响的图。

图2是用抗胰岛素抗体对胰腺胰岛β细胞免疫染色的图。左图表示的是正常小鼠组织，右上图表示的是链脲霉素给药后给予溶剂的小鼠组织，右下图表示的是链脲霉素给药后给予G-CSF的小鼠组织。

具体实施方式

本发明的糖尿病治疗剂以干细胞动员因子作为有效成分。

本发明的糖尿病治疗剂的作为对象的糖尿病没有特别限定，I型和II型糖尿病二者都可以，优选是II型糖尿病。

作为干细胞，可举例为胚胎干细胞(ES细胞)、胰腺导管中所具有的未分化的细胞、肝脏的肝干细胞、肠道干细胞等。

干细胞动员因子只要有干细胞动员作用，无论什么样都可以采用。干细胞作为动员因子的具体例子可举例出例如集落刺激因子(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)等)、干细胞因子(SCF)、红细胞生成素(EPO)等，优选集落刺激因子，更为优选的是粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。

作为本发明的糖尿病治疗剂的有效成分的合适的G-CSF，无论哪种G-CSF都可以使用，优选高度精制的G-CSF，更为具体的是哺乳动物G-CSF、尤其是人和G-CSF实质上具有相同生物学活性的物质。G-CSF的来源没有特别限定，可以采用天然来源的G-CSF，由基因重组法获得的G-CSF等，优选由基因重组法获得的G-CSF。由基因重组法获得的G-CSF中，可以与天然来源的G-CSF氨基酸序列相同(参照序列号1)，或该氨基酸序列中的1个或多个氨基酸被缺失、取代、附加等具有与天然来源的G-CSF相同生物学活性的物质等。氨基酸的缺失、取代、附加等可按照本领域技术人员的公知方法进行。例如，本领域技术人员采用位点特异的变异诱导法(Gotoh，T.等(1995)Gene 152，271-275；Zoller，M.J.和Smith，M.(1983)Methods Enzymol.100，468-500；Kramer，W.等(1984)Nucleic Acids Res.12，9441-9456；Kramer，W.and Fritz，H.J.(1987)MethodsEnzymol.154，350-367；Kunkel，T.A.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82，488-492；Kunkel(1988)Methods Enzymol.85，2763-2766)等，通过在G-CSF的氨基酸中导入合适的变异，制备出与G-CSF功能等同的多肽。此外，氨基酸的变异也在自然界中产生。一般而言，在被取代的氨基酸残基中，优选取代或保留氨基酸侧链性质的其它氨基酸。例如作为氨基酸侧链的性质，可举例出疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、w、Y、V)、亲水性氢基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、具有脂肪族侧链的氨基酸(G、A、V、L、I、P)、具有含羟基侧链的氨基酸(S、T、Y)、具有含硫原子侧链的氨基酸(C、M)、具有含羧酸和酰胺侧链的氨基酸(D、N、E、Q)、具有含碱基侧链的氨基酸（R、K、H)、具有含有芳香族的侧链的氨基酸(H、F、Y、W)(括弧内表示的是氨基酸的文字标记)。已经知道的是具有对某氨基酸序列经一个或多个氨基酸残基的缺失、附加和/或由其它氨基酸取代而修饰的氨基酸序列的多肽保持了其生物学活性(Mark，D.F.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81，5662-5666；Zoller，M.J.&Smith，M.Nucleic Acids Research(1982)10，6487-6500；Wang，A.等，Science 224，1431-1433；Dalbadie-McFarland，G等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982)79，6409-6413)。

并且，也可以用G-CSF和其它的蛋白质融合的融合蛋白质。例如，可以如按连接编码G-CSF的DNA和编码其它蛋白质的DNA以使框架一致，将其导入表达载体中，在宿主中表达，制备融合多肽。与本发明的G-CSF融合而添加的其它蛋白质没有特别的限定。

并且，也可以使用化学改性的G-CSF。化学改性的G-CSF的实例是，例如糖链的结构进行了变换、添加、缺失操作的G-CSF，或结合有聚乙二醇/维生素B12等、无机或有机化合物等化合物的G-CSF等。

本发明中所使用的G-CSF，无论采用什么样的方法制造的都可以，例如可以采用培养人肿瘤细胞或产生人G-CSF的杂交瘤细胞株，用各种方法从中提取分离精制的G-CSF，或采用通过基因工程的方法由大肠菌、酵母菌、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、C127细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞、BHK细胞、昆虫细胞等产生，用各种方法从中提取分离精制的G-CSF等。本发明中所使用的G-CSF优选通过基因工程的方法制造的G-CSF，优选采用哺乳动物细胞(尤其是CHO细胞)制造的G-CSF(例如特公平1-44200号公报、特公平2-5395号公报，特开昭62-129298号公报、特开昭62-132899号公报、特开昭62-236488号公报、特开昭64-85098号公报)。

本发明的糖尿病治疗剂，可以按照其给药方法和剂型相据需要，适当添加悬浊化剂、增溶剂、稳定剂、等渗化剂、防腐剂、防吸附剂、表面活性剂、稀释剂、赋形剂、pH调整剂、无痛化剂、缓冲剂、含硫还原剂、抗氧化剂等。

作为悬浊化剂的实例，可以列举有甲基纤维素、聚山梨酸酯80、羟乙基纤维素、阿拉伯树胶、龙须胶粉末、羧甲基纤维素钠、聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯等。

作为增溶剂，可以列举有聚氧乙烯固化蓖麻油、聚山梨酸酯80、烟酰胺、聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯、聚乙二醇、蓖麻油脂肪酸乙酯等。

作为稳定剂，可以列举有葡聚糖40、甲基纤维素、明胶、亚硫酸钠、偏亚硫酸钠等。

作为等渗化剂，例如可以列举有D-甘露糖醇、山梨糖醇等。

作为防腐剂，例如可以列举有对羟苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸乙酯、山梨酸、苯酚、甲酚、氯甲酚等。

作为防吸附剂，例如可以列举有人血清白蛋白、卵磷脂、葡聚糖、环氧乙烷/环氧丙烷共聚物、羟丙基纤维素、甲基纤维素、聚氧乙烯固化蓖麻油、聚乙二醇等。

作为含硫还原剂，例如可以列举有N-乙酰基半胱氨酸、N-乙酰基同型半胱氨酸、硫辛酸、硫二甘醇、硫代乙醇胺、硫代甘油、硫代山梨醇、巯基乙酸及其盐、硫代硫酸钠、谷胱甘肽、碳原子数为1-7的硫代链烷酸等含硫氢基的物质。

作为抗氧化剂，例如可以列举有异抗坏血酸、二丁基羟基甲苯、丁基羟基茴香醚、α-生育酚、乙酸生育酚、L-抗坏血酸及其盐、L-抗坏血酸棕榈酸酯、L-抗坏血酸硬脂酸酯、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、没食子酸三戊酯、没食子酸丙酯或乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、焦磷酸钠、偏磷酸钠等螯合剂等。

进而，也可以含有氯化钠、氯化钾、氯化钙、磷酸钠、磷酸钾、碳酸氢钠等无机盐；柠檬酸钠、柠檬酸钾、乙酸钠等有机盐等常见添加成分。

本发明的糖尿病治疗剂可以作为注射剂(皮下、皮内、肌肉内、静脉内、腹腔内等)给药，或以适于经皮肤、经粘膜、经鼻等给药的剂型或适于口服给药的剂型(片剂、胶囊剂、颗粒剂、液剂、混悬剂等)给药。本发明不受给药途径及剂型等限制。

本发明的以干细胞动员因子作为有效成分的糖尿病治疗剂的给药量、给药次数可以由本领域技术人员考虑给药对象的疾病患者的病状作出适当决定。通常，每个成人0.1-500μg/kg/天，优选可以以1-50μg/kg/天的用量给予干细胞动员因子。给药次数可以是一周1-7天给药。但是，本发明并不受干细胞动员因子的用量限制。

通过给药本发明的糖尿病治疗剂，骨髓中和周围血液中的干细胞得以增加后，可以在收集细胞的试管中分化诱导成β细胞。分化诱导的β细胞可以返回到体内用于治疗。

人G-CSF已经作为噬中性粒细胞减少症治疗剂等得以临床应用，因此人G-CSF的给药对动员干细胞至周围血液中、补充受损的胰腺β细胞是适合的。

在给药除干细胞动员因子之外的β细胞再生因子时，认为通过同时给药干细胞动员因子增强了治疗效果。可以期待采用干细胞动员因子的糖尿病的治疗与SU药、缩二胍药和噻唑啉衍生物等现在糖尿病所用的药物一起给药增强治疗的效果。此外，还可以同时给予多种干细胞动员因子。并且，也可以结合基因治疗或采用编码干细胞动员因子的基因，将本发明的糖尿病治疗剂本身应用于基因治疗。

如实施例1和图2中所示，在糖尿病模型小鼠中胰腺β细胞受到破坏，而通过G-CSF给药，确认了一定水平的β细胞的存在。因此，本发明的糖尿病治疗剂作为胰腺胰岛β细胞的受损抑制剂或再生剂也是有效的。

并且，本发明还涉及一种胰腺胰岛β细胞的制备方法，其特征在于给药干细胞动员因子后，收集干细胞，将收集的干细胞分化诱导成胰腺胰岛β细胞。

干细胞可以通过公知的方法收集，例如从周围血液中分离提取单核细胞的方法、或者对具有CD34、c-kit或CD133等干细胞标记的血液进行拣选(sorting)的干细胞划分的方法等。

分化诱导成胰腺胰岛β细胞的方法，没有特别的限定，可以列举与胰腺胰岛β细胞分化诱导因子一起培养的方法、在干细胞中处理胰腺胰岛β细胞分化诱导因子的方法、通过细胞融合增殖的方法等。

本发明中所用的胰腺胰岛β细胞分化因子只要是能够将干细胞分化诱导成胰腺胰岛β细胞的因子即可，没有特别的限制。这样的因子的具体实例可以列举有bFGF、Reg基因、TGF、IGF1、苯丙酸诺龙A、NGF、VEGF、干扰素等。

本发明的方法由于自身的骨髓细胞分化诱导成β细胞，因此比现在所认为的使用胚胎干细胞的β细胞移植所产生的排异反应要小，在伦理方面也有优势。而且，由于得到根本治疗，使糖尿病患者由胰岛素注射中解放出来成为可能，生活的质量得到显著改善。

实施例

下面，列举实验例说明本发明。

实验例1

通过对小鼠以100mg/kg的用量在腹腔内给药链脲霉素，制作胰腺细胞受损的糖尿病模型。链脲霉素给药一天后用G-CSF 300μg/kg或溶剂一天一次连续9天皮下给药。链脲霉素给药前，给药1、2、4、7、14和22日后进行血中葡萄糖浓度的测定。结果示于图1。链脲霉素给药小鼠中链脲霉素给药后血中葡萄糖浓度上升，但是G-CSF给药组与溶剂给药组相比，血中葡萄糖浓度值低。

而且，在同样的实验中，以160mg/kg用量腹腔给药链脲霉素，给药次日用G-CSF 300μg/kg或溶剂一天一次连续8天皮下给药。链脲霉素给药2周后摘出胰腺制作冷冻切片，通过用胰岛素抗体免疫染色对胰腺胰岛β细胞染色，与正常小鼠的胰腺进行比较。结果示于图2。通过链脲霉素给药，溶剂给药组中β细胞受损(右上图)，而G-CSF给药组中可以发现一定程度的β细胞的存在(右下图)。这认为是通过G-CSF给药对由链脲霉素引起的胰腺胰岛β细胞的受损得以减少或受损的β细胞获得再生。

通过本发明，有望获得糖尿病的根本治疗，患者的生活质量获得显著改善。按照本发明的治疗，与以往的治疗方法相比其更为简便、安全且有效。

                    序列表

<110>Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha

<120>糖尿病治疗剂

<130>YCT-921

<150>JP 2003-110561

<151>2003-04-15

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>174

<212>PRT

<213>人

<400>1

Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys

1               5                   10                  15

Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln

            20                  25                  30

Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val

        35                  40                  45

Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys

    50                  55                  60

Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser

65                  70                  75                  80

Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser

                85                  90                  95

Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp

            100                 105                 110

Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro

        115                 120                125

Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe

    130                 135                 140

Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe

145                 150                 155                 160

Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro

                165                 170

Claims (13)

1、一种糖尿病治疗剂，其以1种或2种以上干细胞动员因子作为有效成分。

2、根据权利要求1记载的糖尿病治疗剂，其中，所述干细胞动员因子是集落刺激因子。

3、根据权利要求2记载的糖尿病治疗剂，其中，所述集落刺激因子是粒细胞集落刺激因子。

4、一种胰腺胰岛β细胞再生剂，其以1种或2种以上干细胞动员因子作为有效成分。

5、根据权利要求4记载的再生剂，其中，所述干细胞动员因子是集落刺激因子。

6、根据权利要求5记载的再生剂，其中，所述集落刺激因子是粒细胞集落刺激因子。

7、一种胰腺胰岛β细胞受损抑制剂，其以1种或2种以上干细胞动员因子作为有效成分。

8、根据权利要求7记载的抑制剂，其中，所述干细胞动员因子是集落刺激因子。

9、根据权利要求8记载的抑制剂，其中，所述集落刺激因子是粒细胞集落刺激因子。

10、一种制备胰腺胰岛β细胞的方法，其包括(a)给药1种或2种以上干细胞动员因子后，收集干细胞的步骤和(b)将收集的干细胞分化诱导成胰腺胰岛β细胞的步骤。

11、1种或2种以上干细胞动员因子用于制备糖尿病治疗剂的应用。

12、1种或2种以上干细胞动员因子用于制备胰腺胰岛β细胞再生剂的应用。

13、1种或2种以上干细胞动员因子用于制备胰腺胰岛β细胞受损抑制剂的应用。

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