CN1768738A - 丹酚酸b及它的盐和其它酚酸类的医学用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了丹酚酸B及它的盐和由丹酚酸B及它的盐、迷迭香酸、紫草酸、丹参素钠盐组成的组合物的医学用途。通过动物体内、体外实验证明丹酚酸B及它的盐具有对肺纤维化抑制作用，该作用与地塞米松治疗对照组相当。

Description

丹酚酸B及它的盐和其它酚酸类的医学用途

技术领域

本发明涉及从中药提取的有效成份的医学用途。更具体指丹参通过化学方法提取出丹酚酸B及它的盐和其它酚酸类的医学用途。

背景技术

丹酚酸B及它的镁盐理化数据为分子式C₃₆H₂₈MgO₁₆；分子量740.9154；[d]_D ²⁰+126.7(C 0.73，H₂O)；Uvλmax 210(ε1.92×10⁴)，286(ε1.35×10⁴)，306(ε1.20×10⁴)；IR3400；1700nm；1608，1519；1363；1288cm^-1均有吸收峰通过MS NMR.U.V.IR证明其结构为：

1：M⁺＝Mg²⁺/2

2：M⁺＝NH₄ ⁺+K⁺

丹酚酸B(lithospermate B)

C₃₆H₂₈MO₁₆

        迷迭香酸(rosmarinic acid)                          紫草酸(lithospermic acid)

        C₁₈H₁₆O₈                                        C₂₇H₂₂O₁₂

               丹参素(Danshensu)

                  C₉H₁₀O₅

1、MTB在高血脂动物模型主动脉条上，通过肉眼，光镜，电镜观察到有明显的抗AS作用，肉眼可见明显减少黄色斑块隆起，粥样硬化程度分级明显降低，光镜观察到内膜下泡沫细胞层数较少，平滑肌细胞增殖较轻，电镜下示内皮细胞改变较轻，泡沫细胞较少，收缩型平滑肌细胞所占比例较大，干滑肌细胞内内质网，高尔基体，线粒体较少，究肌丝含量较多，细胞分化程度较好；

2、MTB可调节血脂，降低TC，TG，LDL，LP(a)，升高HDL；抗脂质过氧化，提高SOD活性；

3、MTB可提高NO，减低内皮素血浆水平，保护内皮细胞，并通过抑制动脉粥样硬化组织Bfgf(碱性成纤维细胞生长因子)在动脉壁的表达，调控平滑肌细胞的迁移与增殖，干预AS的进程。

以上实验均是硝苯地平作阳性对照性，作用于优于硝苯地平。

1、丹酚酸B对CCl₄诱导的大鼠慢性肝损伤及肝纤维化形成有良好的抑制作用。

(1)有效抑制肝脏结缔组织增生，降低肝脏胶原含量，其效果优于秋水仙碱及原生药丹参；(2)抗肝细胞损伤，丹酚酸乙各剂量组均能显著降低模型大鼠较大幅度增高的血清ALT、AST活性及总胆红素含量，高剂量组显著提高血清Alb含量。综合作用于对照药物(丹参组对降总胆红素的作用于不明显，秋水仙碱对降AST的作用不明显)。(3)丹酚酸乙量效结果显示以中剂量(12.5mg/Kg鼠重)为佳。

2、丹酚酸乙对已形成的DMN诱导的大鼠肝纤维化有良好的治疗效果。

(1)显著促进肝内胶原的重吸收，降低肝组织Hyp含量及I型胶原的沉积；(2)促进损伤肝细胞的修复，提高血清Alb含量，降低血清ALT、AST活性；(3)显著降低大鼠腹水出现率；(4)作用优于秋水仙碱及原生药丹参；(5)具一定的量效关系，有效剂量区间为12.5mg/kg/d～25mg/kg/d。

3、丹酚酸乙有一定的促进机体体液免疫功能与细胞免疫功能作用。能促进小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能，提高小鼠血清中的溶血素含量，抑制小鼠的白细胞移动。增加小鼠抗体生成细胞的数量。

4、对体外肝星状细胞功能的影响。能显著抑制HSC的增殖，抑制活化HSC的TGFβ₁自分泌及活化；降低I型前胶原mRNA表达与胶原蛋白的生成，抑制TGFβ₁信号转导通路中MAPK的活化。

5、一般药理研究：本品剂量为3.8、7.5和15mg/kg灌胃对麻醉Beagle犬的呼吸和循环系统的功能无明显的影响；本品剂量15、30和60/kg灌胃对小鼠爬杆试验和Iruin行为分级试验均无影响。

发明内容

本发明的目的是提供一类具有对肺纤维化抑制作用的药物质(化合物)

本发明涉及的化合物为丹酚酸B及它的盐包括镁、铵、钾盐(DS-1)和丹酚酸B盐与其它酚酸类包括迷迭香酸、紫草酸、丹参素及/或它的盐的组合物(DS-2)的医学用途。

丹酚酸B及镁盐对心血管的作用及对肝损伤，肝纤维化已作了大量试验，特别是对心血管的作用具有调节血脂，降低TC，TG，LDL，LP及升高HDL作用。本发明对丹酚酸B及它的盐进行肺纤维化抑制作用的试验，通过体外、体内的试验，证明丹酚酸B及它的盐具有对肺纤维化抑制作用。

附图说明

图1是DS-1对TGF-β1刺激的WI-38细胞I型胶原合成增加的影响。

图2是DS-2对TGF-β1刺激的WI-38细胞I型胶原合成增加的影响。

图3是DS-1对WI-38细胞增殖的影响(^*p＜0.05vs.培养液对照(Con))。

图4是DS-2对WI-38细胞增殖的影响(^*p＜0.05vs.培养液对照(Con))。

图5是体内实验28天时大鼠病理解剖所见，其中：

A.空白对照组；

B.BLM模型组，肺表面出血、纤维化病灶明显；

C.DS-12.5mg/kg治疗组，肺表面出血、纤维化病灶明显减少、减轻；

D.DEX组，肺表面出血、纤维化病灶减少、减轻。

图6是体内实验28天时大鼠病理组织学检查所见，其中：

A.空白对照组；

B.BLM模型组，肺组织大面积纤维化，肺泡间隔明显增厚，炎症、出血病变明显；

C.DS-1 2.5mg/kg治疗组，肺组织炎症、出血明显减轻，纤维化病变程度明显改善；

D.DEX组，肺组织炎症、出血明显减轻，纤维化病变程度改善。

具体实施方式

试验物质：

丹酚酸B及它的盐，包括镁、铵、钾盐(DS-1)，丹酚酸B盐与其他酚酸类包括迷迭香酸、紫草酸、丹参素及/或它的盐的组合物(DS-2)。它们的含量以重量百分比计，丹酚酸B盐含60-75％，迷迭香酸5-20％，紫草酸为5-16％，丹参素为3-10％。

药理试验分为体外试验和体内试验二部分：

一、体外试验：

DS-1和DS-2对W1-38细胞增殖及TGF-β₁刺激的胶原合成的影响

1.实验目的

评价DS-1和DS-2体外对WI-38细胞增殖及TGF-β1刺激的胶原合成的影响。

2.材料与方法

2.1受试药物及试剂

DS-1和DS-2由中国科学院上海药物研究所天然药物化学研究室提供。

重组人TGF-β1购自美国R&D公司。

人I型胶原检测ELISA试剂盒购自美国Chondrex公司。

细胞增殖检测试剂盒，CCK-8购自日本Dojindo公司。

2.2细胞培养

WI-38，人胚胎肺成纤维细胞系购自美国ATCC。细胞培养条件为DMEM培养液(10％胎牛血清(FCS))，37℃、5％CO₂空气中贴壁孵育2h，更换培养液去除未贴壁之杂细胞。待细胞生长至70％融合时，用胰酶消化，按1∶4传代。实验用10-15代的细胞。用胎盘兰拒染方法判断细胞存活率。

用DMEM培养液(10％FCS)制成2×10⁵cell/ml的细胞悬液，按每孔100μl加入96孔板中，用于细胞增殖率测定。

用DMEM培养液(10％FCS)制成7.5×10⁴cell/ml的细胞悬液，按每孔1ml加入24孔板中，24h后去培养液，加入含0.4％FCS和50μg/ml抗坏血酸盐的培养液，继续培养24h后加入TGF-β1(10ng/ml)和不同浓度的DS-1/DS-2，用于I型胶原合成的检测。

2.3人I型胶原检测

人I型胶原检测应用ELISA方法，按试剂盒说明书进行操作。读取490nm吸光度值。结果表示为微克I型胶原每毫克蛋白(μg/mg)。

2.4细胞增殖测定

融合的WI38细胞用胰酶消化，洗涤，离心后，用DMEM培养液(含10％FCS)制成2×10⁵cell/ml的细胞悬液，存活率＞95％，按每孔100μl加入96孔板中，在37℃、5％CO₂培养24h后，弃上清，每孔加入不同处理因素的浓度的DS-1或DS-2，继续培养21h，加入WST10μl，继续培养3h，读取OD450值。结果以OD 450表示。

2.5数据分析及统计方法

各检查指标数据录入SPSS进行统计学分析。结果用mean±SD表示。计量指标，若方差齐用ANOVA过程进行分析，最小显著级差法(LSD)进行各组间比较，方差不齐的用Student t test进行显著性检验。计数资料用卡方检验进行比较。显著性水准为p＜0.05。

3、结果

3.1 DS-1、DS-2对I型胶原合成的影响

为了检测DS-1、DS-2对人肺成纤维细胞胶原合成的直接作用，进行了体外实验。结果见图1和2。TGF-β1对WI-38细胞的I型胶原合成有明显的促进作用。而DS-1和DS-2对TGF-β1诱导的I型胶原合成增加有明显的抑制作用，并呈依剂量关系。

3.2 DS-1、DS-2对细胞增殖的影响

DS-1和DS-2对细胞增殖的影响见图3和4。DS-1和DS-2在100μg/ml的浓度下对WI-38细胞的细胞增殖有一定的抑制作用(p＜0.05).但在10，和1μg/ml浓度下对WI-38细胞的细胞增殖有促进作用(p＜0.05)。

4、小结

实验结果表明DS-1、DS-2在体外可以抑制由TGF-β1刺激的WI-38细胞I型胶原合成的增加；另外在DS-1和DS-2在100μg/ml的浓度下对细胞增殖均有抑制作用。这些结果与体内试验的组织病理学检查所观察到的DS-1，DS-2对BLM诱导的SD大鼠肺纤维化的抑制作用相一致。

二、体内试验

DS-1和DS-2对博来霉素A5诱导的SD大鼠肺纤维化的作用

1.实验目的

观察DS-1，DS-2对博来霉素A5(BLMA5)诱导的SD大鼠肺纤维化是否具有抑制作用。

2.受试药物

受试药物1：DS-1

受试药物2：DS-2

提供单位：中国科学院上海药物研究所天然药物化学研究室

含量：＞99％

对照样品

名称：醋酸地塞米松片

提供单位：上海信宜药业有限公司

批号：020601

含量：0.75mg/片

其他药品与试剂

注射用平阳霉素(BLMA5)，白色或淡黄色冻干粉，批号021002，天津太河制药有限公司，用0.9％生理盐水配制成注射液。

3.动物

3.1来源、种属、品系及试验前处理：

SPF级SD大鼠由由中英合资西普尔-必凯实验动物有限公司提供。许可证号：SCXK(沪)2003-0002。实验前经中国科学院上海药物研究所SPF级动物房1周适应性饲养，饲养合格证号：SYXK(沪)2003-0029。动物房条件控制：温度23±2℃，湿度60±10％，光照12h/24h，黑暗12h，动物饲料由西普尔必凯公司提供。适应期间动物每2只1笼。

3.2动物周龄、体重、性别：

实验开始时动物10周龄左右，70只，每组10只，体重200-250g，雄性。

4.实验方法

4.1 BLMA5诱导SD大鼠肺纤维化模型复制

采用一次性气管内滴注BLMA5的方法复制大鼠肺纤维化动物模型。大鼠麻醉后在颈部正中切口，剥离皮下组织及肌肉，暴露气管用1ml注射器将BLMA5/生理盐水缓慢注入气管，BLMA5剂量为5mg/kg。生理盐水对照组气管滴注等体积生理盐水。造模后连续给药28天后处死，进行各项指标的检测和评价。

4.2实验分组与处理：

1)生理盐水对照组(即空白对照)

2)模型组(BLMA5组)

3)DS-1 2.5mg/kg治疗组(DS-1高剂量组)

4)DS-1 1.25mg/kg治疗组(DS-1低剂量组)

5)DS-2 2.5mg/kg治疗组(DS-2高剂量组)

6)DS-2 1.25mg/kg治疗组(DS-2低剂量组)

7)地塞米松0.5mg/kg治疗对照组(DEX组)

空白对照组和模型组每日1次灌胃灭菌双蒸水，DEX组给予0.5mg/kg地塞米松。

给药体积为10ml/kg体重。

5.剂量设置及理由

大鼠灌胃DS-1，DS-2 2.5，1.25mg/kg对CCl4和DMN诱导的大鼠慢性肝损伤和纤维化形成有良好的抑制作用。为此设DS-1，DS-2预实验的高剂量均为2.5mg/kg，每日1次灌胃，低剂量减半，为1.25mg/kg 2个剂量组，共4个治疗组。

6.观察指标

6.1一般临床表现

主要观察造模后大鼠是否出现发绀，呼吸急促等呼吸困难表现，其它如毛松，精神萎靡等一般毒性表现。

6.2病理解剖观察

6.2.1肉眼观察肺组织的颜色、病变部位和程度；

6.2.2肺湿重及脏器系数：

大鼠麻醉后，开胸，行右心室插管，PBS灌流冲去肺组织中的血液。取左肺称湿重，并计算脏器系数。取左肺，10％中性福尔马林固定，做病理组织学检查。右肺在-80℃冰箱冰存，做组织生化学检测。

6.3肺组织生化学检查

肺组织羟脯氨酸(HP)含量采用改进的氯胺T法。

6.4病理学组织学检查

病理组织学检查：肺组织经固定，常规石蜡包埋、切片，HE染色。显微镜下观察肺组织炎症、出血和纤维化等病变，并进行图像分析，对肺泡炎和纤维化程度进行评价。

7.数据及统计学分析

各检查指标数据录入SPSS进行统计学分析。结果用mean±SD表示。体重，肺湿重及相对重，肺组织羟脯氨酸含量，肺组织切片图像分析结果等计量指标，若方差齐用ANOVA过程进行分析，最小显著级差法(LSD)进行各组间比较，方差不齐的用Student t test进行显著性检验。计数资料用卡方检验进行比较。

8.实验结果

8.1死亡情况

一些大鼠造模后给药期间出现死亡，BLMA5组死亡3只。DS-1 1.25mg/kg组死亡1只。DS-2 2.5和1.25mg/kg组分别有3只，4只大鼠死亡。各组死亡率总结见表1。

表1各组大鼠死亡率

组别	死亡动物数	死亡率(％)
			空白对照模型(BLMA5)DS-1 2.5mg/kg1.25mg/kgDS-2 2.5mg/kg1.25mg/kgDEX	0301342	030010304020

8.2临床表现

模型组大鼠气管内滴注BLMA5后出现萎靡，少动，毛松，第3天至第9天呼吸急促，发绀等呼吸道症状表现明显，并伴有消瘦、体重减轻。第10天之后上述症状逐渐稍有改善，但至给药28天时仍有以上临床表现。DS-1各剂量和DS-2高剂量组治疗组上述的临床表现与模型组相比明显减轻，约10天左右症状明显改善，约15天左右，与空白对照相比，无明显差别。DEX治疗组大鼠也出现相似的临床表现，但呼吸急促，发绀的程度较模型组轻。

8.3左肺湿重与相对重％

DS-1，DS-2对BLMA5诱导肺纤维化的SD大鼠肺湿重和相对重的影响见表1。结果显示，与模型组相比，各治疗组左肺湿重和相对重量略有下降，且DS-1各治疗组的下降有统计学意义。

表2各组大鼠肺湿重和相对重

组别	左肺湿重(g)	左肺相对重(％)
			空白对照BLMDS-1 2.5mg/kg1.25mg/kgDS-2 2.5mg/kg1.25mg/kgDEX	0.48±0.080.101±0.29**0.60±0.08##a0.64±0.12*##0.69±0.11*##0.82±0.18**0.72±0.15**，##	0.127±0.0080.325±0.138**0.249±0.045##a0.247±0.045*##0.258±0.035*##0.301±0.057**0.269±0.059**，##

^*p＜0.05  ^**p＜0.01vs.空白对照组；^#p＜0.05，^##p＜0.01vs.BLM组；a：p＜0.05vs.DEX组；

相对重％＝左肺湿重(g)/体重(g)×100％

8.4肺组织生化学检查

HP含量是衡量组织胶原蛋白含量的特异性生化指标。灌胃DS-1，DS-2对肺组织胶原蛋白含量的影响见表3。结果显示BLM模型组及各治疗组的HP含量均显著高于空白对照组(p＜0.05)。DS-1各治疗组和DS-22.5mg/kg剂量组的HP含量低于BLM组，差别有统计学意义。

表3各组大鼠右肺组织HP含量

	HP(ug/right lung)
		空白对照BLMDS-1 2.5mg/kg1.25mg/gDS-2 2.5mg/kg1.25mg/kgDEX	330.6±30.8851.6±107.4**a679.2±29.9**##763.9±113.0**#738.5±132.5**#836.7±74.9**a717.1±82.2**##

^*p＜0.05  ^**p＜0.01vs.空白对照组；^#p＜0.05，^##p＜0.01vs.BLM组；a：p＜0.05vs，DEX组

8.5病理解剖和病理组织学检查

实验第28天，各组动物解剖时可见，DS-1各治疗组和DS-22.5mg/kg组与模型组相比，肺组织表面出血点和纤维化病灶有不同程度减少(5)。病理组织学检查显示，模型组大鼠肺组织可见出血，较多淋巴细胞、单个核细胞浸润，肺泡壁明显增厚并可见较多成纤维细胞，部分肺泡腔消失，或被淋巴细胞、成纤维细胞团和胶原纤维填塞。与模型组相比，DS-12.5mg/kg组动物肺组织出血、炎细胞浸润明显减少，肺纤维化病变程度明显减轻(图6)。DS-11.25mg/kg治疗组和DS-22.5mg/kg组剂量组肺组织出血、炎症和纤维化程度减轻不如DS-12.5mg/kg组明显，并与地塞米松组的结果相似。

对各组大鼠肺组织切片进行图像分析，结果显示，DS-1各治疗组、DS-22.5mg/kg组和DEX治疗对照组浅染区面积百分比明显较模型组减少，说明在该剂量下对BLM引起的肺纤维化有一定的抑制作用；各治疗组肺泡炎病变程度(见深染区面积百分比)与模型组相比有不同程度的减轻。

表4各组大鼠肺组织切片图像分析结果

	浅染区百分比(％)	深染区百分比(％)	无染区百分比(％)
				空白对照BLMDS-1 2.5mg/kg1.25mg/kgDS-2 2.5mg/kg1.25mg/kgDEX	13.254.6**28.5**，##36.1**##44.9**##50.0**a34.6**##	2.221.4**8.5**##a8.9**##a10.9**##13.5**##11.4*##	84.624.0**63.0**##a55.0**##44.3**##36.4**#a53.8.0**##

^*p＜0.05  ^**p＜0.01vs.空白对照组；^#p＜0.05，^##p＜0.01vs.BLM组；a：p＜0.05vs.DEX组

浅染区代表肺间质纤维化程度，深染区代表炎症区域，代表炎症反应程度，无染区为肺泡腔。

9.小结

SD大鼠灌胃DS-1对BLMA5诱导的肺纤维化的作用为：

●DS-1可以明显减少BLMA5引起的大鼠死亡

●对存活大鼠的一般临床表现有改善作用；

●降低BLMA5引起的肺湿重增加；

●对BLMA5诱导的肺组织HP含量增加有一定的抑制作用，病理组织学检查显示与模型组相比，DS-1各治疗组对肺纤维化病变有不同程度的改善，呈依剂量关系DS-1高剂量组的抑制作用优于地塞米松治疗对照组。

SD大鼠灌胃DS-2对BLMA5诱导的肺纤维化的作用为：

●对存活大鼠的一般临床表现有改善作用，但没有DS-1明显；

●降低BLMA5引起的肺湿重增加；

●对BLMA5诱导的肺组织HP含量增加有一定的抑制作用。病理组织学检查显示，与模型组相比，肺纤维化病变有所改善。高剂量组于地塞米松治疗对照组相当，而低剂量组的抑制作用不明显。

Claims (3)

1、丹酚酸B及它的盐或丹酚酸B盐和丹参酸类化合物组成的组合物的医学用途，作为在制备预防、治疗人的肺纤维化药物中应用。

2、根据权利要求1所述的丹酚酸B及它的盐或丹酚酸B盐和丹参酸类化合物组成的组合物的医学用途，其特征在于丹酚酸B及它的盐、迷迭香酸、紫草酸、丹参素钠盐组成的组合物作为制备预防、治疗人的肺纤维化药物中应用。

3、根据权利要求1所述的丹酚酸B及它的盐或丹酚酸B盐和丹参酸类化合物组成的组合物，其特征在于该组合物为(以重量百分比计)

丹酚酸B盐   60-75％

迷迭香酸    5-20％

紫草酸为    3-16％

丹参酸为    3-10％。

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