CN1774721A - 阵列元件的检测、解析及识别 - Google Patents

Abstract

一种用于分析光学薄膜阵列的图像分析工作站。各个独立阵列包括单个光学薄膜测试表面，该光学薄膜测试表面提供了多个离散寻址位置，每个位置又包括一个针对感兴趣分析物的固定化捕捉试剂。一个或多个离散寻址位置可以提供控制信号或基准信号。

Description

阵列元件的检测、解析及识别

技术领域

本发明涉及阵列元件的光学检测、解析及识别，特别是用在光学薄膜表面上的阵列元件的光学检测、解析及识别。

背景技术

下面简单地提供了关于本发明背景的描述以帮助理解本发明，但是不能认为这些描述公开了本发明，或者构成了本发明的现有技术。

在半导体领域，通过真空挥发、气相沉积、旋涂或者浸涂形成的膜一般被用于半导体制造过程的各个阶段。对于采用这种技术制造的设备的功能而言，监控薄膜层的实际厚度和物理性质是绝对必要的。在制造过程中以及制造过程之后，必须经常监测这些特性。“光学薄膜检测”是指确定在衬底表面形成的一个或多个薄层的厚度的方法。这种“薄膜”的厚度为约1nm-100μm。

一般地，光学薄膜测量依赖于从一个包括“光学薄膜测试表面”的衬底上反射回来的光线的一种或多种性质的变化。这种意味着，该表面可将入射光反射回去，并且可以通过对折射率(n)和吸收系数(k)的选择来配置和调整该表面，以产生某种因表面质量和厚度变化直接导致的信号。这个信号是通过用光照射表面得到的；光从该表面反射回来或者透射过该表面，然而由于干扰效应，该表面上的任何一个薄膜都会改变反射光或者透射光中一种或多种波长的颜色、椭圆率或者强度。这种改变的程度，以及由此可获得的信号，取决于所有表面膜的质量或厚度。

用于对薄膜进行光学测量的设备一般分成两种仪器类型：反射仪和椭圆仪。反射仪是基于测量从光学薄膜测试表面反射出来的光的颜色或者强度的改变；椭圆仪是基于测量从光学薄膜测试表面反射出来的光的偏振度的改变。这些方法在本领域中是公知的。例如参见，Tompkins and McGahan，Spectroscopic Ellipsometry and Reflectometry：AUser’s Guide，John Wiley and Sons，1999，其中讨论了材料的各种光学常数的性质、反射仪的仪器方面知识、椭圆光谱以及单波长椭圆光度法，以及收集和分析椭圆光度法和反射法数据的分析方法。

由于这种方法和设备能够灵敏地在分子级别上检测膜厚度，光学薄膜测量在生物系统中的应用已经被完善地建立起来了。例如，直接检测结合反应的方法和设备(如，在免疫分析，核酸杂交等中)已经被描述过，参见例如美国专利号6,483,585、6,335,429、6,287,783、6,060,237、5,955,377、5,639,671、5,631，171、5,629,214、5,552,272、5，550,063、5,494,829。虽然这类方法不依赖于信号产生元件(例如一种荧光、冷光或者色度结构(moiety))来产生信号，但是增强对结合反应的检测，也采用提供额外质量或者光学厚度的放大方法(例如沉淀物的催化制造，或者，诸如胶乳、金等颗粒的结合)。

发明内容

本发明涉及制造和使用高处理量(high-throughput)薄膜光学分析装置的设备、组合物和方法。下面的章节将描述光学薄膜测试表面阵列分析所要求的软硬件条件，这类分析用于下列医学或研究应用中，例如基因组学、蛋白组学、过敏原筛检、药物开发、高处理量筛选、医药基因组学、毒素基因组学，ADME(吸收分布代谢排泄)筛选、传染病筛检，针对特定疾病或者状态的SNP(单核苷酸多肽性)分析等。

第一方面，本发明涉及包括单个光学薄膜测试表面的独立阵列，其中单个光学薄膜测试表面提供有多个离散寻址位置，而每个位置包括一种针对感兴趣分析物的、固定化捕捉试剂。本文将其称为“阵列化光学薄膜测试表面”。优选地，一个独立阵列化光学薄膜测试表面所包括的离散寻址位置的数目为至少4个，更优选的是至少16个，更更优选的是至少32个，更加优选的是64个，最优选的是128个或者更多。一个或多个离散寻址位置可以提供控制信号(例如用于标准化信号或者进行正/负控制)或者基准信号(即，用来确定设备内阵列化光学薄膜测试表面的相对对准信息)。

在一个相关方面中，阵列化光学薄膜测试表面被包含在一个更大的“测试表面载体”中，该测试表面载体在单个空腔中提供了一个“阵列的阵列”，从而进一步增加了通量。优选地，一个独立的测试表面载体在单个空腔中所包括的离散阵列化光学薄膜测试表面的数目为至少一个，更优选的是至少两个，更更优选的是至少5个，更加优选的是至少10个，再更加优选的是至少20个，再更加更加优选的是至少50个，最优选的是至少90个或者更多。像阵列一样，一个测试表面载体可以具有基准位置，这些基准位置被用来提供用于确定测试表面载体内的光学薄膜测试表面的相对对准信息。

这里针对独立阵列所用的术语“离散”是指两个或者多个具有不连续表面的阵列。这里针对单个阵列上的独立位置所用的术语“离散寻址”是指一个表面的不连续区域，从该表面中可获得某种特定信号。

来自阵列化光学薄膜测试表面上离散寻址位置的信号是因膜厚度或质量发生变化而产生的，而膜厚度或质量的变化又是由于目标分子在该阵列内的某个位置处与相应的捕捉试剂发生特异反应而造成的。随着膜厚度或质量的变化，从该表面反射的光在偏振状态、相位或干涉色方面也会发生改变。捕捉试剂可以是小分子、多肽、蛋白质、环化多肽、肽类似物(peptidomimetic)、寡聚核苷酸适配子(aptamer)、抗体、单链抗体(scFv)、多糖、受体、多聚核苷酸，和/或多聚核苷酸类似物；同样地，目标分子可以是小分子、多肽、蛋白质、环化多肽、肽类似物、寡聚核苷酸适配子、抗体、单链抗体、多糖、受体、多聚核苷酸，和/或多聚核苷酸类似物。在本发明中任何具有特异性结合特性的材料的组合都可以用作捕捉试剂/分析物对。

本文所用的术语“小分子”是指分子量小于3000道尔顿的化合物，优选地小于2000或者1500，更优选地小于1000，最优选地小于600道尔顿。优选但是并非必要地，小分子不是一种寡聚肽。

本文所用的术语“多肽”是指由至少两个氨基酸单体通过酰氨键与相邻的氨基酸连接组成的共价聚合物。一种“寡聚多肽”是由一小段氨基酸序列(例如大于2到几百个氨基酸)组成的多肽。寡聚多肽一般是通过化学合成的方法制备，或者通过将更大的多聚肽片断化得到。多肽药物的实例包括但并不限于，治疗抗体、胰岛素、类胸腺荷尔蒙、多肽疫苗、以及抗生素例如万古霉素。新多肽药物的可能通过例如嗜菌体显示技术来识别。

本文所用的术语“抗体”是指通过体内或者体外免疫抗原响应的发生而获得的免疫球蛋白分子，包括多克隆、单特异性和单克隆抗体，和抗原结合片断(例如Fab片断)。“免疫抗原响应”是指适当的细胞与这样的抗原接触后针对一个或多个抗原而导致的抗体生成。

本文所用的术语“单链可变区片断”或者“scFv”是指通过共价联接而连接在一起的单个抗体轻链和抗体重链上一个可变的、抗原结合决定区域，这种共价联接具有足够的长度可以保证重链和轻链的部分可以形成一种抗原结合部位。这样的连接子可以只有一个共价键那样短；优选的连接子长度是2-50个氨基酸，更优选的是5-25个长度。

本文所用的术语“多聚核苷酸”是指由核苷酸共价聚合物组成的分子，核苷酸一般是通过相邻的核糖或者脱氧核糖单元上3’和5’羟其形成磷酯键连接的。一种“寡聚核苷酸”是一种由短碱基序列(例如，大于2到几百个核苷酸，25至50个核苷酸比较常见)组成的多聚核苷酸。多聚核苷酸同时包括RNA和DNA，可能形成三维形状例如棒槌头，哑铃等，可能是单链或者双链。多聚核苷酸药物可包括核酶RNAi结构，多聚核苷酸疫苗。多聚核苷酸也可包括一种或者多种取代物，例如一种核糖或者脱氧核糖在2’或者3’位置被烷基(例如氧甲基，氧乙基，氧丙基)，甲氧基乙氧基，烯丙基，氨基，或者氟代基。

本文所用的术语“多聚核苷酸类似物”是指与多聚核苷酸结构和功能类似的分子，但是它们不是通过磷酯键连接而成的核苷酸共价聚合物。肽核酸，由嘌呤和嘧啶碱基通过N-(2-氨乙基)-甘氨酸单元构成的骨架连接在一起的，是一种寡聚核苷酸类似物的例子。

本文所用的术语“多糖”是指由两个或者更多共价连接的糖单元构成的碳水化合物。一种“寡聚多糖”是一种短糖序列构成的多糖(例如，大于2到几千个糖单元)。

本文所用的术语“环化多肽”是指单个氨基酸单元构成的共价聚合物分子，其中每个分子至少由两个氨基酸单元通过酰氨键形成巨环分子。

本文所用的术语“肽类似物”是指与多肽结构和功能类似的分子，但并不是通过酰氨键连接的氨基酸共价聚合物。一种类肽，它是N取代甘氨酸单元的聚合物，是一种肽类似物的例子。

本文所用的术语“寡聚核苷酸适配子”是指结合非多聚核苷酸目标分子(例如多肽或者小分子)的多聚核苷酸。

一种优选的阵列化光学薄膜测试表面包括一种支撑光学薄膜测试表面的衬底。优选的衬底材料包括那些基本上为刚性的材料，例如玻璃、硬质塑料、金属、硅等。特别优选的衬底材料将在下文中具体描述。这些衬底可能本来就具有与待测薄膜效应的生成有关的反射表面，或者可通过加工来提供反射表面，例如通过气相沉积一个金属层。或者，在各种实施方式中，可优选透射性衬底。在下文所述的各种实施方式中，阵列化光学薄膜测试表面可进一步包括下列置于反射表面之上的附加层中的一个或多个：一个抗反射层；以及一个附着层，其提供共价或非共价连接以固定捕捉试剂。正如这里所描述的，这些层的每一个都是可选的，例如在本发明的所有方式中，抗反射层不是必需的；而捕捉试剂可以被直接固定到测试表面上。

一种优选形式是将各个独立的阵列化光学薄膜测试表面置于一个可以方便地进行试剂传送和分析操作(手动地或者利用摆放机器人(shelfrobotic))的设备中。因此在各种实施方式中，在各个独立阵列位置之间具有间隔的96位板(96-position plate)，被用来容纳在本文所述方法和设备中使用的多个独立阵列，这种96位板与市面上已有的96井板(96-well plate)有类似之处。应该理解的是，其他的板配置包含在本发明的范围之内，包括96的倍数(例如384，1536)个井，利用市面上已有的液体操作机器人可以方便地使用这些井。

在其它方面，本发明涉及构建阵列化光学薄膜测试表面和测试表面载体的方法。正如下文所要描述的，本发明的测试表面载体为超过光学薄膜方法的宽广范围的检测技术提供了优势。

本文所述的方法和设备对于样品中多种分析物是否存在或其数量的多路化检测(multiplexed detection)特别有用。术语“分析物”或者“目标”是指在分析中要检测的任何分子。分析物(或者目标)一般是通过将一种或者多种结合搭配物(在本文中称为“捕捉试剂”)固定在阵列化光学薄膜测试表面上测试位置上。这种结合搭配物固定住分析物，以便通过本文描述的方法进行检测。

优选的是生物样品。术语“生物样品”是指从一种有机体中得到的样品。获得此类样品是为了对临床病人进行诊断、预后检查或评估。在某些实施方式中，获得此类样品是为了确定某种正在发展的疾病的结果或者某种疾病的治疗方法的效果。优选的生物样品是血液样品，组织样品，便样，唾液样品，血清样品，血浆样品，脑脊液样品，尿样，以及其他从病人、有机体或者样品得到的液体。

在另外一个方面，本发明涉及针对从手动到全自动获取和处理图像的方法、软件以及相关硬件，其中所述图像是从一个阵列或者一个阵列的阵列上获取的。虽然本文是针对阵列化光学薄膜测试表面的分析来描述的，但本领域技术应该理解的是，这些方法、软件和硬件可以应用于一般的阵列分析，包括组织阵列(例如可从Xymed购买到的MAXARRAY^TM)；核酸阵列和微阵列(例如可从Affvmetrix购买到的GENECHIP)；蛋白或核酸阵列和微阵列(例如可从Panomics购买到的)；抗体阵列和微阵列(例如可从Clonetech购买到的)；蛋白阵列和微阵列(例如可从Ciphergen购买到的)。

在优选实施方式中，提供了一种集成的“图像分析站”，其包括下列元件中的一个或多个，更优选地是包括所有下列元件：一个测试表面载体，其包括本文所述的多个阵列；用于照射阵列的光学部件，其用以从多个离散寻址位置生成信号；所述光学部件包括一个漫射光源；一个数码相机，其用于记录一个或多个阵列的图像；用于所述数码相机聚焦和画面控制的光学部件；一个工作台，其用于使所述测试表面载体相对于所述数码相机的视场运动；工作台运动机构；所述工作台运动机构的手动控制器；所述数码相机的手动控制器；与所述工作台运动机构和/或所述数码相机集成在一起的计算机处理器；用于提供预先确定工作台运动和/或相机控制指令的软件；用于记录图像和结果的数字存储介质；和/或用于输入命令和/或观察图像和/或结果的用户界面。在优选实施方式中，对于测试表面载体上的所有反应阵列，图像分析都是在没有用户参与的情况下自动完成的。

本文所用的术语“图像分析”和“图像处理”是指从阵列上获得一个或多个数字图像，以及利用所收集的图像来确定一种或者多种分析物在所述阵列上的一个离散寻址位置处，优选是在多个离散寻址位置处是否存在或者存在的量。

本文所用的术语“用于照射阵列的光学部件”是指光源以及在阵列上提供所需入射光的相关光学元件。按照分析形式的不同，用于照射阵列的光学部件可能简单到仅是一束白光或者一个相干光源；或者可包括位于光源和阵列之间的滤光镜，以便去除不需要的光线波长(例如某种低通、高通或带通滤光镜)；位于光源和阵列之间的偏振器，以改变光的偏振状态；以及本领域技术人员在反射仪和/或椭圆仪中常用的其他部件。椭圆偏光法可能需要一个相干或单色光源。

本文所用的术语“漫射光源”是指在整个数码相机的视场上提供基本均匀的照度的光源。

本文所用的术语“数码相机”是指一种提供对应于该相机所获图像的数字输出信号的相机。合适的相机包括CMOS(互补性氧化金属半导体)、APS(活动像素传感器)、CCD、和非CCD相机，这是本领域中所公知的。CCD相机的优选类型是线性(Linear)，行间插入(Interline)，全桢(Full-Frame)，全桢转移(Frame-Transfer)。线性CCD包括单一行像素；为了定义一个图像，线性CCD必须扫描整个图像平面，一行一行地构建该图像。行间插入、全桢、全桢转移设计被认为是区域阵列(AreaArray)CCD，因为它们是由形成长方形或者正方形区域的多个行和列组成的。在一个行间插入CCD中，每个像素都具有一个光检测器和电荷存储区域。该存储区域是通过对部分像素屏蔽或掩蔽光而形成的，并且仅将其用于电荷变换过程。全桢CCD将所有像素都用于图像捕捉。因而，当电荷变换发生的时候，像素就处于繁忙状态，没法继续捕捉光子。为了防止像素在进行电荷转移时(可能会导致图像的光模糊)继续读取额外的光，通常要在相机的透镜之间或之后设置一个机械快门。最后，全桢转移CCD类似于全桢CCD，但是它们屏蔽出一半的阵列用于临时存储电荷，也就是所谓的“存储阵列”。连接到一个模数转换器的模拟相机也在这个术语的范围之内，因为这类相机提供了所需的图像数字输出，以用于被计算机处理器进一步处理。

如果一个图像被获取以便被计算机处理器处理，该图像就被说成是被一个相机“记录”。本文所述的所有或部分图像可被存储在相机的电子器件中(临时或者永久地)，或者可被传送到附带的数字存储设备上，或者不经存储直接传送到计算机处理器上。图像可被获取成一次一个测试表面或在单个图像中包括多个测试表面、静态图像或实时图像，连续或扫描模式图像的形式，这取决于特定设备的需求或者处理量的需求。

本文所用的术语“用于聚焦控制的光学部件”是指被用来将一个感兴趣的区域聚焦以便被数码相机记录的光学器件和相关机械硬件。类似地，“用于画面控制的光学部件”是指为数码相机提供缩放和摇摄控制的光学器件和相关硬件。

本文所用的术语“工作台”是指用于支撑和提供沿着测试表面载体的一个轴或多个轴运动的机械硬件。优选地，一个工作台提供沿着标记为X和Y的正交方向的移动；在某些实施方式中包括沿着Z轴方向的移动(与X/Y平面垂直)。

本文所用的术语“工作台运动机构”是指给工作台提供移动的部件(例如，步进电机、齿轮装置，齿轮齿条元件，轴承装置等)。

如果指令从一个手动控制器或者计算机处理器上传送到一个装置上，那么该手动控制或者计算机处理器就被“集成”到该装置上，以通过该装置提供后续动作。优选地，这种集成也提供从该装置到该手动控制器或计算机处理器的反馈。例如，一个与计算机处理器集成的数码相机可以接收来自处理器的指令以记录图像，和/或所有或部分图像数据可以从相机传送到处理器。集成可以有线方式提供(例如通过硬连线，串行端口(例如标准的RS-232端口)，USB端口，“火线”端口等)或者以无线方式提供(例如通过红外连接，射频连接，蓝牙连接等)。

本文所用的术语“软件”是指通过一个计算机处理器来执行的、一组存储在易失或者非易失性数字介质中的指令、程序和/或过程。这样的软件可存储在硬盘或软盘上，在易失或者非易失性存储器中，或光学介质上等。在本发明中，软件所提供的指令可：用于例如通过机器人系统进行一个试验；用于记录数字图像；和/或用于分析数字图像，如下文所述。

术语“计算机处理器”是指执行一个计算机程序的逻辑运算的数字化装置，通常也被称为“CPU”。一般地，一个计算机处理器包括带有算术逻辑单元(ALU)的数据通道来执行算术/逻辑运算，一个地址生成单元来提供存储器地址，和一个控制单元以向数据通道中的各种装置提供正确的控制信号来完成所需的操作。计算机一般有一个处理器、一个主存储器，一个辅助存储设备，一个连接处理器、主存储器和外围设备的总线。数码相机可以通过这一总线或者通过并行或串行端口连接到计算机。大量公知的计算机处理器中的任何一种，例如IntelCorporation，of Santa Clara，Calif的处理器可以用于本文所述的设备中。

本文所用的术语“数字存储介质”是指任何以数字形式存储信息的介质。这包括硬盘和软盘，光盘，随机存取存储器，只读存储器等。

本文所用的术语“用户界面”是指允许用户与本发明的设备交互的装置，包括下列中的一个或多个：键盘，鼠标，操纵杆，小键盘(keypad)，触摸屏，监视器等。

除非特别说明，否则本文所用的术语“大约”是指任何给定数值的±10％。

虽然本文所述的图像分析站的硬件是以检测薄膜变化的这些术语来表述的，但是本领域技术人员应理解的是，无论采用何种信号生成方法，本发明的各种部件(特别地包括软件)可以与任何图像分析方法结合使用。仅要求该图像所提供的信号与背景之间具有一定的反差，并对阵列内元件具有一定的空间分辨率即可，而且其可以按照某种合适的处理格式存储。因此这个软件可用于荧光，化学发光，和其他发色团。因此，在一个方面，本发明涉及用于自动图像分析的方法和设备(包括软件)，以确定在阵列上的一个离散寻址位置处，优选是多个离散寻址位置处，一种或者多种分析物是否存在或存在的量。

正如这里描述的，本发明的图像分析仪器适于在只有少量用户输入以及该阵列无用户位置的情况下分析大量阵列，最适于以完全自动化的方式来分析大量阵列。但是手动序列仍然可以被执行，如果需要的话。这个图像分析站已经被选用于读取一个高反射性的测试表面，这个表面生成信号是在表面上生成的薄膜与光作用之后产生的反射光中生成的。该表面的薄膜特性是该反应的永久记录，而且可以按照需要被分析许多次。生成的信号对光致漂白或者光腐蚀都不敏感，因此在整个分析过程中都很稳定。由于薄膜效应是设备的各层的固有特性，因此各反应区域之间没有交扰(cross-talk)，如在测量荧光或者其他发色团时观察到的。

为了便于使用，图像分析站被设计成分析那些装配在凹槽(depression——例如一个微量滴定井(microtiter well))底部的表面。这就提供了一种操作和传送样品和试剂的简单机构，但是需要图像分析站能够重复定位每个井，并聚焦到该井以获得图像，而不受井壁的干扰。同样的光学配置可以用于分析以各种其他传送方式(包括简单滑动方式或者独立的测试表面)来呈现的表面。工作台优选适于容纳每种类型形式，并适当地移动这些测试表面以对该设备中的每个阵列进行成像。

在下面优选的实施方式中描述的测试表面载体提供正方形的井来接收制好的测试表面，这些测试表面已经涂布了一组生物捕捉试剂的。虽然市面上的微量滴定板可以作为构造测试表面载体的模板，但是也将描述一种专门为这一具体应用而改进的微量滴定板。这种微量滴定形式的板的设计可以用于传送所需的任何类型的测试表面，特别是光学薄膜表面。光学薄膜表面可以通过上表面反射来分析或者根据光学支撑或者表面的设计与检测系统的光程通过透射测量来分析。所生成的信号是所用测试表面的一个功能。例如玻璃支撑可以与荧光或者化学发光的标签或者标记一起使用。可以通过反射或者透射模式进行测量。由于这种改进的测试表面载体或者微量滴定板保持了现有微量滴定板的印记，因此可与所有的现有自动化样品处理设备兼容。因此这种改进的测试表面载体适合于各种高处理量的应用。

当一个阵列的反应完成时，无论使用了何种信号生成方法，本领域技术人员通常使用的各种图像分析工具都需要使用者定义或者定位阵列的位置，阵列上元件的数目，阵列上元件的定位。这一般是通过用户选择阵的大小并生成一个与所选参数匹配的网格来实现的。然后，用户必须将网格拖动到该反应阵列的一个图像上，并保证每个网格元素对应于合适的阵列元素。因此用户要对阵列内元件的任何歪斜和摇摆或者未对准负责。虽然这些现有工具的性能已经非常适合于分析单个阵列(即使带有大量元素)，但是无论以任何分析频率，它们还不是非常适合于分析大量阵列，即使每个阵列只有少量的元素。新的“斑点寻找”方法(其以软件形式提供或者以被编程以完成本发明所需步骤的通用或者专用计算机的形式提供)，大大了减轻了各种高处理量应用。

上面所述本发明内容并不是限制性的，根据下文对优选实施方式的详细描述以及所附的权利要求，本发明的其他特征和优点将会变得更加明显。

附图说明

图1是一个流程图，示出了生成一个斑点位置和强度表格的方法的一种实施方式。

图2A-2F示出了本发明的测试表面载体的一种实施方式。

图3示出了一种实施方式的图像分析仪器的光程部件的装配图。

图4示出了用于图像分析仪器的底支撑板的一种实施方式。

图5A-5D和图6A-6D示出了用于图像分析仪器的侧支撑架的一种

实施方式。

图7A-7C示出了用于图像分析仪器的后支撑板的一种实施方式。

图8A-8B示出了用于图像分析仪器的相机支撑板的一种实施方式。

图9A-9C示出了用于图像分析仪器的延长管道支架的一种实施方式。

图10A-10B示出了用于图像分析仪器的延长管道夹的一种实施方式。

图11A-11C示出了在本发明的一种布局中示例性地形成的斑点。

图12A-12B示出了一个斑点阵列的梯度。

图13示出了用于梯度大小和方向的表决圈变换(voting circletransform)。

图14示出了一组实验的所有斑点平均值的示例性CV值。

图15示出了一系列实验的强度比；以及

图16为同质斑点(homozygous spot)示出了图15中所示的信息。

具体实施方式

如上所述，本发明的描述是针对阵列化光学薄膜测试表面的分析。本领域技术人员应该理解的是，这些方法、软件和硬件可以应用于一般性的阵列的分析。对于薄膜成像，该图像分析站包括下列部件或能力中的一个或多个，优选包括下列所有部件或能力：一个光学检测设备；一架CCD相机；一个同轴漫射光源；一个可选的偏振器；一个延长管道；聚焦透镜；可选的自动变焦和自动聚焦能力；一个x，y工作台(有或者没有闭环位置控制)；支撑结构；一个仪器壳体罩；一个光功率源(light power source)；一个工作台控制器；一个用于手动工作台控制的手柄；一个计算机或者用于软件和硬件控制的类似设备；一个用户界面；一个监视器；以及软件。

测试表面载体是一种格式化设备(formatting device)，其被设计成用于传送阵列化光学薄膜测试表面，每个阵列化光学薄膜测试表面都包括离散捕捉位置的一个图案化阵列，并用于提供试剂传送和分析处理，而且包括一个以稳固方式放入x，y工作台中的表面。传送平台可以是一个标准载物片的形状或者可以被设置成一个带有任意井数的标准微量滴定板。优选的实验方案采用正方形的井来接收测试表面。这种测试表面载体可以用于传送非薄膜应用的测试表面。

光学薄膜测试表面可以被切割、划线、或者被破碎成适合的尺寸，然后粘合或熔合到测试表面载体中。测试表面载体可以容纳一个或多个光学薄膜测试表面，这取决于测试表面载体的配置。测试表面载体的一种优选结构是一个具有96个井(well)的微量滴定板，其井间隙与市面上的常规微量滴定板一致。在优选实施方式中，每个井包含一个7mm×7mm的光学薄膜测试表面；因此，板上的井优选为正方形。如果采用光学薄膜测试表面的其他配置(例如长方形，圆形等)，每个被就被合适地设计成可以容纳测试表面。当微量滴定板被用于传送测试表面给一种分析方法时(无论采用何种信号生成方法)，各个独立阵列表面的尺寸应该被处理成适合于测试表面载体的尺寸。

如果将载物片作为测试表面载体，那么单个1″×3″的测试表面就可以装入检测设备中，或者大量的更小的条带或者正方形可以装入大小仍然是1″×3″的测试表面载体上。

不论使用何种分析格式或者检测方法，测试表面都是通过将一组捕捉试剂固定到测试表面上来制备的。这种捕捉试剂可以是一种复杂的组合材料，被设计成针对一定范围的不同分析物、基因、基因产物、基因组DNA、小分子、SNP、或者其他感兴趣的材料对样品进行检查。每种捕捉试剂可以特别地捕捉一个目标核苷酸序列，蛋白质，糖，脂类，激素，或者其他分析物。例如捕捉试剂可以是一种对样品中一定范围的细胞活素类的抗体。或者捕捉试剂可以是一组寡聚核苷酸，其对作为某种特异性疾病的标记或者指示的基因组合具有特异性。或者捕捉试剂可以是一组寡聚核苷酸，其对某种特定基因中的SNP突变具有特异性，该特定基因为某种疾病(例如囊肿性纤维化(CF))指示出某个个体的载体状态。或者捕捉试剂可以是对于一组用于过敏筛选的过敏原具有特异性的抗体，或者可以是对细菌或病毒抗原(或用于基因的寡聚核苷酸)具有特异性的抗体，以用于传染病(例如呼吸道传染病)的致病源的鉴别诊断。

专门用于各个独立阵列图像分析的软件将自动识别和确认阵列中每个检测元素的位置和信号强度。为了自动地处理分析过程，该优选实施方式，如果可能将首先定位图像中测试表面的边缘。如果边缘被发现，在进一步的分析中将去除图像边缘以外的区域。接着，在该图像中定位任何具有正确大小、形状和强度的可能特征。然后计算这些特征的数目。这些特征的数目被用于确定该图像中样品的类型。例如，被反应的病人样品的特征数目可能位于一定范围之内；空白可能有另外一个不同的范围；一个空井可能具有另外一个典型数目范围。一旦确定了样品类型，就利用一组启发式规则(heuristic rule)来除去伪噪音特征。例如，测试表面边缘的少量像素内的一个斑点很有可能是由于清洗问题而非真实反应造成的，因而可以在进一步的分析中去除。接着，该算法试图定位剩余斑点位置的网格结构。一种聚类算法和额外的启发可以用于确定该斑点网格的各行各列的位置。对于那些含有很少或者未含有反应区域的行和列，可以根据其他含有较多斑点的行和列的位置和间距来估计它们的位置。最终，斑点被匹配到网格上，且信号被测量到。为了进一步分类，将生成一个斑点位置和信号强度表格。下文所述的软件和测试表面载体一般也适合于非薄膜应用。下面将参考图1来描述生成斑点位置和信号表格的方法的一种实施方式。

该系统的软件需求包括一个图像获取协议、工作台移动和位置控制、阵列识别、阵列元素识别，阵列元素量化，阵列偏斜校正，按阵列元素排布的结果表的生成，背景获取，背景校正，数据处理和解释，以及结果报告。大量的图像获取和工作台控制的商业化资源都是可用的。CCD相机和工作台的供应商也提供可以用于这些功能的软件，然后再集成成一个最终软件包。Scanalytics提供一套集成了图像获取和工作台控制以及其他用于收集和分析图像化之后的阵列的软件协议的软件包。然而，即使是分析很小的阵列，这个软件也需要大量的用户交互。

测试表面设计

用于光学薄膜分析的光学薄膜测试表面的设计方法在本领域是公知的。参见美国专利号5,629,214，在此将其全部内容(包括所有的表格、附图和权利要求)并入本文。很多种刚性材料可以用来形成衬底，包括玻璃、熔融硅、塑料、陶瓷、金属和半导体材料。这些衬底可以是任何期望厚度。柔性光学衬底包括塑料及类似材料制成的薄板。大多数衬底在后续层被沉积到其上之前，仅需要一种标准的溶剂、电浆蚀刻或者酸洗，这对于本领域技术人员而言是公知的。

光学薄膜测试表面一般是反射表面，优选为硅或者硅涂布的衬底材料。对于基于反射的分析应用，选择衬底的主要要求就是要保证仅在上表面发生反射。刚性材料(例如玻璃和半导体材料，例如硅，金属等)的表面如果被刨光的话，都是足够光滑的，可以提供镜面反射。提供反射表面也可以通过在衬底上气相沉积一层薄金属膜来轻松实现，后续层的附着也可以通过各种本领域技术人员公知的技术来实现。例如，一个玻璃衬底的最上层表面可以涂布一个层以阻止下层表面产生不希望有的反射。

希望反射表面能够允许在支撑材料上施加抗反射(AR)膜叠层。AR层的使用也可适用于透射模式检测(下面的衬底是透射性的)。由于光学测试表面上的膜厚度不同，抗反射膜叠层会通过相消干涉来产生信号。一般地，衬底(玻璃，石英等)上涂布有薄层材料，以致来自该膜外表面的反射和来自该衬底外表面的反射通过相消干涉彼此抵消。单层涂布中的反射光线产生完全相消的两个条件是：这些反射的相位差为180°(弧度II)；具有相同的强度。单层抗反射膜的厚度应该是四分之一波长的奇数倍，以达到相消的正确相位。如果有三个或者更多的反射层参与，通过仔细地选择任意相位和相对强度可以实现完全相消。这是两层抗反射涂布的基础，其中这些层被调整以适合可用材料的折射率，反之亦然。对于一个给定的材料组合，常常有两个组合的层厚度在给定波长处为零反射。许多光学系统(特别是成像系统)都采用多色光(不止一个波长)。为了使系统具有平坦的光谱响应，透射光学器件都用宽波段或者二向色抗反射涂层来涂布。

对于来自光学测试表面的反射光或透射光的相消干涉，可以用数码相机(例如CCD)以颜色的变化来检测或者用一个灰度相机以灰度值的变化来检测。在没有抗反射膜叠层的情况下，一个反射表面也适合于类椭圆光分析(ellipsometric-like analysis)，不过在光程的检测端需要一个额外的偏振元件。在这种情况下，反射光支撑物上的薄膜可以用于生成入射光的相位变化，然后直接在检测器上以反射光或者透射光的强度变化来测量这些相位变化。

常规的抗反射膜叠层可能是在硅衬底上涂布一层氮化硅。这种叠层对于蓝光波长是抗反射性的，从而产生一个金色背景。当表面厚度由于目标分子的捕获而改变时，抗反射波长开始转变，从而产生一种蓝紫色。

一旦光学薄膜测试表面被提供，就需要考虑捕捉试剂的附着，例如小分子，多肽，蛋白质，环化多肽，肽类似物，适配子，抗体，scFv，多糖，受体，多聚核苷酸，多聚核苷酸类似物。分子附着到表面的方法，例如通过共价附着，静电附着，疏水附着等，这在本领域是公知的。这些材料可以被直接附着到光学薄膜测试表面上，如果其上有足够的位点来结合足够量的捕捉试剂，以提供光学分析中的信号。优选地，一个附着层会介于光学薄膜测试表面和捕捉试剂之间。附着层可以用来，例如从表面中扩展捕捉试剂以便有效结合。另外，附着层由多价分子形成，例如由枝状聚合物(dendrimer)、星形聚合物、自组装聚合物、多聚硅氧烷，以及制膜胶乳组成的组合，因而使用附着层可以扩大光学薄膜测试表面上结合位点的数目。

对于一个光学薄膜设备，优选对表面进行如下处理。为了清楚起见，将针对AR涂布表面进行描述，但是AR层也是可选的。对于视觉分析、色度分析或者灰度成像，一般都需要AR层。监测椭圆率的变化并不需要AR层。通过气相沉积工艺为硅晶片(直径大小并不重要)涂布了一层氮化硅。对厚度和折射率进行选择以适合该应用。一个优选设置是，厚度为500±15，折射率为1.985±15。其他的AR材料也是适合的，并且对于本领域技术人员而言是已知的。

AR涂布晶片是在旋涂工艺中用一层枝状硅氧烷来涂布的。硅氧烷是优选的附着层涂层，但是表面的其他化学变化也是可能的。接着一层长链氨基酸(多聚苯丙氨酸-多聚赖氨酸)通过浸液涂布工艺被涂布到硅氧烷层上。多聚苯丙氨酸-多聚赖氨酸表面提供了一个氨基层，用于共价附着到一个捕捉试剂阵列，以及具有足够的疏水性以适合于附着到硅氧烷化表面上。如果不需要共价连接，那么对于许多基于蛋白质的捕捉试剂而言，可以不需要这一层。对于那些不需要高强度表面操作、高分析严谨度、或者频繁清洗的表面而言，捕捉试剂的被动附着也不失为一个很好的方案。不同共价附着方案的表面变化是本领域技术人员所公知的。氨基可以被大量化学试剂激活，激活之后就可以于其他氨基反应。可以激活表面氨基，或者可以激活捕捉试剂上的氨基。被激活的氨基与相应的未变化的氨基反应。其他的化学作用包括将巯基、醛、亚氨基醚、联胺、异氰酸等用作反应基团。

阵列形成

可以利用不同强度的阵列对测试表面进行斑点化(spot)。单个阵列内斑点的数目将取决于所进行的分析。同一阵列的多次重复可以应用于测试表面的各个离散区段，而且可依赖或者不依赖某些类型的物理屏障来隔开产品表面上的各个独立阵列。或者具有独特内容的多个阵列(每个阵列中都有大量元素)也有可应用于测试表面。同样，某种物理屏障也可用于分隔各个独立阵列。

对于某些应用可能需要在一个特定捕捉试剂的阵列中提供多个拷贝。例如，当对人群中具有高频率的SNP进行基因性状筛选时，可能需要构建用于该SNP的两个捕捉试样的多重拷贝。或者对于一种特定的致病生物或者其株系特异的捕捉试剂可能需要在阵列中有额外的拷贝。这样，就可以容易地在单次分析中验证阵列中关键的元素。除了针对将要检测的分析物或者疾病图谱特异的捕捉试剂之外，也可在阵列中提供控制试剂和定向试剂。

在每个应用的捕捉试剂布局设计中一个重要的考虑就是在阵列中各行各列例行生成的信号数量。这个设计因素对于下面将要描述的自动阵列识别算法非常重要。每个列和行中的足够元素必须生成信号，以便在处理所获取图像的过程中，提供对每个列和行的优化和快速识别。

阵列中捕捉试剂的设计和筛选包括许多因素。所有固定在阵列内的捕捉探针必须在常规反应条件下工作，并同时保持最终完成的测试表面所需要的灵敏性和特异性。因此斑点化试剂(spotting reagent)必须被设计成可以为测试表面上斑点尺寸一致的产品提供类似的表面张力。这种斑点化试剂也应该提供一种可以将阵列中每个捕捉试剂保持成离散和独立区域的表面张力(连同表面化学，如果有的话)。但是它们也必须提供一个环境，该环境可促进特定捕捉试剂粘附到表面上或者使所用附着物的化学性质最大化。这种斑点化试剂也需要防止极少量的斑点化捕捉试剂在表面反应固定时间内的干化。

可以通过多种不同的斑点化技术将捕捉试剂施加成离散斑点。如果斑点化技术允许，并且取决于要生成的阵列元素的数目，所有组成阵列的捕捉试剂可以同时被施加到测试表面上。然后，斑点化头(spotting head)或测试表面再被调整到一个新的位置，接着产生下一个阵列。或者，每个捕捉试剂可以被单独地按次序施加到测试表面上的某个特定位置，直到整个阵列形成。为了便于生产，优选将这些捕捉试剂施加到大块测试表面(bulk test surface)上，其中可以同时或者按次序生成大量阵列(取决于大块测试表面的尺寸)。一旦捕捉试剂被固定到大块测试表面上，该测试表面就可以被处理成大量的离散阵列，以便于测试表面载体内的固定。例如如果将一个4″的硅晶片分成7平方毫米的检测片，那么就可以产生大约124个阵列。

在利用阵列斑点化技术来制备阵列化光学薄膜测试表面过程中，必须小心避免表面磨耗(abrasion)，因为最终阵列的表面形貌的偏差可被视作背景信号或阵列上的伪测试位置。对所用斑点化方法的选择必须平衡将所需捕捉试剂传送到光学表面(常常是疏水)的需要以及避免损伤光学叠层的需要。

对正负控制(positive and negative controls)、信号强度标准以及基准信号来说，也可保持阵列上的某些离散位置。在后一种情况中，本领域技术人员应该理解的是，如果来自阵列斑点化方法的背景信号已经被最小化，那么在化验中并不能检测到未反应阵列上的捕捉位置。假设一个有16个斑点的4×4阵列，无法分辨每个拐角斑点和其他的拐角斑点；因此，不可能正确确定阵列的“左上”位置。无论是在进一步的制造过程或者是在图像的分析过程中，可以利用阵列上一个或多个预先确定的、而且在未反应状态下可以观察到的斑点来确定捕捉位置的相对方位。

一旦所有的阵列在大块或产品级测试表面上生成，就可能需要一些额外的处理。这包括保温、清洗和干化处理、过涂布处理以保证稳定性或者降低非特异性结合。所有这些处理都发生在通过切割、划线、激光切割或者其他将大块测试表面分成合适尺寸的测试表面以便适于并入测试表面载体之前。对于某些应用，测试表面的结构可以直接出现在测试表面载体的下层表面上。当在一个大块测试表面上生成各个独立阵列的多个拷贝时，阵列设计的部分必须包括针对分离处理的足够的环绕区域，以保证切割或分离各个独立阵列时不会损坏该阵列。该独立测试表面的外边缘对于将测试表面安放到测试表面载体上的放置设备来说也是非常重要的。这是用于该设备的接触点。一旦各个独立测试表面被全部生成，它们就必须被放置到测试表面载体上。需要采用某种方式将测试表面粘附到测试表面载体上。这可以通过胶合、热封、化学焊接、或者其他技术来实现，它们可以合适地处理测试表面和载体的成分，以及捕捉试剂的稳定性和灵敏度。各个独立测试表面必须以正确的方向，很少的倾斜(平面度)，以及很少的偏斜插入到载体中。

在本发明中，在测试表面上获得必须的平面度优选需要将每个阵列以相对于水平面大约±10°的倾斜公差放置到载体上，更加优选的是倾斜公差为相对于水平面大约±5°，最优选的是倾斜公差为相对于水平面大约±1°。

阵列中使用的捕捉试剂的数目是按照将要进行的测试的分析需要，所选格式的测试表面的大小，以及所施加的捕捉试剂斑点的大小来决定的。例如，一个至少有59个寡聚核苷酸的阵列需要用来分析一个病人样本的与囊性纤维化相关的CFTR基因中的SNP突变(25个突变和6个多态性)。其中一个捕捉探针对于野生型序列(wild typesequence)是特异的，而另一个对于该基因在特定待分析SNP位置的突变是特异的。其中三个多态性需要一个捕捉探针。这一板待测突变是根据来自American College of Medical Genetics的建议而决定的。

测试表面载体的设计和制造

虽然已经商业化的正方形96井板可以用作测试表面载体，但是采用新设计的载体可以获得在仪器性能和产量上的巨大提高。这种载体保持了96井板的格式，因为可处理这种格式的设备非常普遍。参见图2A-2F，改进的测试表面载体保持了标准96井板的外观尺寸，因此它仍然与所有设计用于96井板的机器人兼容。参见图2A至2D。

为了改进测试表面的放置和方向，井壁的高度已经降低了，因而填满一个井的试剂体积从620μL降到320μL。这样设计降低了机器人必须调整以进入井内放置测试表面的深度，而且潜在地降低了来自与井壁的阴影所造成的伪成像。可被施加到测试表面的试剂体积的减少应该不会对分析的性能造成明显的影响，反而可能对于分析过程中的试剂消耗有正面的影响。而且，更浅的井可以促进实验规程中的清洗步骤。

改进后的设计产生的载体相对已经商业化的96井板具有更好的几何公差。“几何公差”意指在井中心与井中心之间的测量中、井壁形貌、井底直径、载体的总体平面度、载体的总体扭曲度的差异。这使得载体中测试表面的自动定位更加容易，对于已反应测试表面的图像分析也变得更加容易。所有的几何公差被设置成±0.5°。

改进后的载体的模具设计包括那些将会导致载体外表显现为无光泽或细微纹理的特征。它还包括图案化识别目标，例如在每个井或凹穴的右上角或左下角具有一个可识别特征(在示例性的实施方式中是光滑的、有光泽的圆)。这些特征为测试表面自动定位仪器提供了方向和方位标记，这样在测试表面放置到井中时，机器视觉系统就可以用来评价排列情况。它们也可以被用于最终的图像分析过程中以促进井的排列、识别、定位和分隔，如果需要的话可以将其用于在成像之前。另外，该载体的每个井具有8个对准肋条(井的每个边分别具有两条)，它们被设计用来辅助测试表面在井内的支撑。这些肋条可以控制井内测试表面的方位放置(“扭曲”或者“偏斜”)。当测试表面定位在井内时，这些肋条将会与测试表面的边缘相邻接。参见图2E。在对准肋条内部是一个从井壁中延伸出来的延长的窗口框架，它也可以支撑测试表面并辅助保持井内测试表面的平面度。这一特征能够改善自动分配胶水的能力，因为它提供了胶水分配的凹坑，而且机器视觉系统可以用来控制分配的胶水相对延长窗口的量。所放置的测试表面一旦在井中被紧紧地密封，这将最大程度地降低在分析过程中滞留在测试表面下方的试剂、清洗液等的体积。这种特征还可最大程度地降低后续实验步骤中的污染。

图像分析设备设计和制造

光学部件设计的一个可接受的起点是Scanalytics的Elispot设备(酶联免疫点设备)。然而对于一般的高处理量使用还需要更加坚固的支撑结构和仪器内部构造。这种图像分析设备包括一个具有至少0.5″的检测器表面和不超过10μm×10μm的像素大小，以及至少640×480像素阵列的CCD相机。优选的最小扫描面积是6.3mm×4.8mm。相机应该提供数字温度补偿以及至少8比特的数字偏移控制，但优选的是12比特或者更多。最少25000个电子满容量的井是优选的。动态范围至少是8比特，优选是12比特，16Mhz的扫描速度是优选的。读出噪音不应该大于16个电子，光谱范围应该位于280-1000nm。大于1000的抗浮散因子(anti-blooming factor)也是优选的。

相机应该装配在一个延长管或者其他光学定位硬件以提供合适的聚焦距离和深度。任何所需的光学放大部件也应该包括在光程的这一部分上。

对于薄膜应用来说黑白相机是优选的，但是彩色相机也是可接受的。

在一种实施方式中，包括聚焦、成像距离和放大倍数的光程是预设好的，不需要调整。在实际应用的另一种实施方式中(其中也许需要在一个阵列的一个子部分上聚焦)，可能需要一个可以调节的放大和聚焦。可调节的放大和聚焦需要额外电机控制和软件。这样一个自动放大、自动聚焦的延长管设备可以从Thales Optem获得。

当信号发生的方法是一种薄膜变化以提供强度一致的大范围表面覆盖时，漫射光源是优选的。当使用镜面反射的反射表面时，漫射光源也会将来自该反射表面的反射中的假象降到最小。光源的强度和波长需要将取决于测试表面和所用的薄膜信号生成方法。光源应该提供恒定一致的照度。薄膜生成方法可以采用随机偏振或者部分偏振的白光源。线性偏振光也可以用于降低镜面反射的假象。这种光源可被过滤以提供单色入射光。一根光纤可被用于将光从光源引导到光程的入口。同轴散射器模块是向该光学系统提供输入光一种选择。

应该提供一个支撑系统，其包括足够硬度和重量的底座，以最大程度地降低工作台在在向各个方向移动时的振动。一个0.5″厚的铝板适合于这个目的。该板的尺寸取决于工作台和光学部件的尺寸，但是一个15″×18″的板一般来说是足够的。为了最大程度地降低杂散的表面反射，该铝板一般被阳极化处理或者涂成无光泽的黑色。

支撑板在各个位置含有钻孔。其中部分钻孔是用于连接x，y工作台的支撑栓，而另一部分钻孔是用于连接支撑结构，这些支撑结构用于连接所述相机和光学部件。对于一个Ludl Biopoint x，y工作台，有4个支撑栓固定在支撑板上。工作台通过大小合适的内六角螺钉固定到这些支撑栓上。支撑栓高度的选择需要使电机和控制电缆与支撑板不接触而且没有任何结合，但也要使支撑栓的高度尽量低，以保持最大的稳定性。支撑栓的直径优选地被设计成与工作台上的机器位置匹配，而且足够大以提供工作台到支撑板的稳定连接。

图3示出了一个图像分析站的组装。首先，从Zoom 70XL模块(Optem Part号399510-309)上移除透镜帽。然后用内六角扳手拧松低模块耦合器(Optem Part号33-03-63)的上部固定螺钉。将Zoom 70XL模块安装到低模块耦合器中直至它与低模块耦合器外表面齐平，然后拧紧螺钉。从0.5x的TV管(Optem Part号29-90-70)中移除透镜帽，然后用螺纹连接到Zoom 70XL模块的上部分。用内六角扳手拧松低模块耦合器底部的固定螺钉，然后安装到与同轴光照室(Optem Part号30-14-00)齐平，而且光供给管连接在后部(所有Optem的标记应该面对其他部件的前端)。拧紧固定螺钉。用螺纹将偏振器单元(OptemPart号29-69-02)连接到同轴光照室。用螺纹将光纤室(Optem Part号30-16-02)连接到偏振器。拧松光纤室的螺钉，然后插入10mm的光纤适配器(Optem Part号30-16-01)。拧紧螺钉。光学模块已经准备好可以安装了。

如果需要自动缩放和自动聚焦功能，组装过程按照下面的描述修改。用螺纹将0.5x的TV管(Optem Part号29-90-70)连接到自动缩放/自动聚焦单元。拧松所连接的同轴光照室(其是自动缩放/自动聚焦单元的一部分)上的螺钉，插入10mm的光纤适配器(Optem Part号30-16-01)。拧紧螺钉。这个单元已经准备好可以安装了。

将支撑框架置于台架顶端上，并将基底滑动到台架边缘使得底座下面的底部钻孔可见。应用两个橡胶支撑脚，并按紧粘合剂，然后用两个1032×1/2的内六角螺钉稳固连接。旋转底座并对该底板的后边缘重复这一步骤。参见图4。在每一边用3个内六角螺钉将左支撑架(图5A-5D)和右支撑架(图6A-6D)连接到后支撑件(图7A-7C)上，然后再将该组件固定到图4所示的位置。用4个内六角螺钉将相机支撑板(图8A-8B)连接到左支撑架和右支撑架的顶部。

用4个1032×1/2″的内六角螺钉将电动工作台部件安装到四个工作台支撑栓上，以致工作台上的电机位于该支撑结构的后部。将x工作台和y工作台控制电缆连接到所标记的电机上，然后将箝位装置滑动入位。根据反馈控制的需要，一种可接受的工作台是Ludl ElectronicsBiopoint或者Bioprecision工作台。将控制电缆的另一端穿过后支撑板(图7A一7C)的中心孔。将用于工作台控制的控制盒和手柄安放在支撑框架的一侧。将电源电缆连接到控制盒，然后将电源电缆插入到电涌保护的电源出口或者插到一个电源调节单元上。将手柄控制电缆连接到控制盒，并将计算机串口电缆连接到控制盒上正确的插口上。

用配套扳手将一个测微器通过螺纹方式连接到三个线性工作台中的每一个。将其中一个完成的线性工作台安放在相机支撑板上，以致从前面看的时候，测微器位于工作台的右边，而且开放滑动结构位于组件的上表面(图8A-8B)。用440×1/2的内六角螺钉将线性工作台拧紧在支撑板上。这样可以允许相机沿y轴移动。线性工作台可以从Thermo Oriel或者Newport购买到。

将第二个完成的线性工作台和第一个线性工作台摆放成90°角，并用4个440×1/2的内六角螺钉拧紧。测微器安放在仪器的后面，而开放平滑结构位于该组件的顶部。这样可以允许相机沿x轴运动。用4个440×1/2的内六角螺钉将角架(Newport)拧紧到第二个线性工作台使得该支架的一面朝向仪器的前端而另一面覆盖着线性工作台。

将第三个完成的线性工作台连接到角支架的前面，而且测微器需朝下指向，开放平滑结构从角支架处朝外。这样可以允许相机在z轴方向上运动。

用四个632×3/8内六角螺钉将延长管支撑块连接到线性工作台上，参见图9A-9C。安放完成的光学组件，以使延长管以支撑块的井为中心，70XL缩放模块的上部分位于支撑块的底部(与底部相邻)并在该位置固定。用2个半圆夹，参见图10A-10B，将延长管连接到支撑块，对每个半圆夹使用两个632×3/8内六角螺钉。确保光学组件在机罩内位于一条直线上而且坚固地连接在一起。

通过相机上的螺纹将CCD相机连接到光学组件的延长管的上端。相机应该和朝向系统前端的相机安装板表面完全契合。通过插入到相机顶端将相机控制线缆连接上，并将该线缆穿过后支撑板的中心孔。

将光纤束的一端插入到光学组件的光纤适配器并拧紧固定螺钉，以确保光纤电缆的牢固。将光纤束穿过后支撑板的中心孔。

将光源安放在台架上工作台控制器的邻近位置，连接上电源线并插到一个带电涌保护的电源出口上或者电源调节单元上。将光纤电缆的另一端引到光源外出端口上并拧紧固定螺钉。小心地滑动位于光学部件和将所有电缆穿过仪器内部插入物的工作台之上的机罩组件。光纤电缆和相机电缆穿过中心支撑结构，而工作台电缆穿过一个侧插入物。机罩组件是通过将0.5厘米厚的聚碳酸酯片切割成合适大小制成的。这些聚碳酸酯片的断片与铝杆及橡胶垫片连接成方形盖，其适合于如图4所示的底支撑板。如果检测系统对背景光敏感，那么古铜色的或者烟灰色的聚碳酸酯可以帮助去除室内环境光。将聚碳酸酯的左侧和左下前板封合到铝支撑杆上，这些杆通过铰链连接产生两个检修门。侧检修门可以提供接入整个系统，如果有任何维护或者清洗需要的话。前检修门提供了将测试表面载体插入到工作台定位的插入处的接口。每个铰接的检修门都包括所附把手和磁力锁定特征以用来封住这些门。聚碳酸酯机罩也为工作台和光学部件在测量之间或者测量过程中提供了防尘以及防其他污染物的功能。机罩组件高23.75″，这使得相机及其电缆等这些在设备中占据最高位置的部件之上还有一些空间。聚碳酸酯的后部分含有为所有来自各种部件连接到计算机或者合适的控制器的电缆而设的出口。

小心地滑入外壳系统至台架前端，露出一小部分支撑底座的底部，用3个1032×1/2内六角螺钉将盖子与底座连接。在前门需要三个螺钉是因为有检修门。旋转该仪器并用两个螺钉对后面重复连接过程。将仪器转到正确的方位并将其放置在台架的中心使得仪器完好地离开边缘。

将计算机监视器，键盘，鼠标，和计算机塔(computer tower)放置在光源和工作台控制器的旁边。将电源线接入监视器并插到一个电涌保护的电源出口上。将计算机连接到监视器上。根据制造商的说明将计算机塔盒打开，安装图像获取板和任何所需的工作台控制板。重新包装好塔盒。将电源线连接到计算机塔并插到一个电涌保护的电源出口或者电源调节单元上。将工作台控制电缆连接到面板接口上。将相机数据线连接到串口接口上。按照制造商的说明将监视器电缆，鼠标电缆，和键盘电缆连接到计算机塔上。

通过该系统分析的测试表面可以构建成类似于载物片，x、y工作台将会含有一个插入装置保证载物片在工作台上具有可重复的定位。测试表面可以装配在具有任何井尺寸的井板(welled plate)的底部，同样一个插入装置用来保证该板在工作台上重复定位。

软件设计

生物或者化学阵列的图像分析软件包的目标将是完全不需要用户的介入。除了初始的设置和校正之外，所有的步骤应该是自动发生的。合适的设置和校正步骤包括设置一个光源的起始光强度，手工确认测试表面与工作台定位控制器是否对准也应该包括在内。优选地，所有步骤都在软件的控制之下。

本文所公开的实施方式可以利用很多方式来实现。例如，本文所公开的方法可以被实现成软件或者固件。进一步的实施方式包括硬件实现，这包括例如，现场可编程门阵列(FPGA)。

目前实现这个目标的主要限制是确定阵列在测试表面的位置和校正图像中阵列的偏斜、处理斑点的大小和形状变化、反射，斑点组成的“波浪”状的行和列，以及正确地估计阵列中元素的数目和位置。而且，斑点形态差异的处理，或者在其每个行和列中具有较低斑点冗余度或很少元素的阵列，也会阻止该过程的完全自动化。对所收集的数据进行定性和定量处理是可能的。

对于初始的讨论，假设一个阳性或正(positive)阵列元素将会被监测成亮背景中的一个暗特征。然而，算法可以非常容易地实现检测暗背景中的白色元素或者一个特定颜色与另外一个颜色——实际在任一种情况下，都在阳性阵列元素和其背景之间产生足够的对比度。

图像分析算法的实施方式提供一个应用编程接口(API)，其允许该算法可以通过一个特定目的的用户接口而运行，例如为测试目的而完成，以及作为一个更加一般化目的软件包，例如图像捕捉和报告程序的一个扩展。进一步地，这种模块化的API背后的算法促进了其跨工作台的可移植性。例如，这种算法可以打包成微软Windows上的动态链接库(DLL)，或者打包成Linux上的一个共享库。另外，这种API使得算法更加不依赖于在一个系统的其他部分所用的编程语言。例如，这个算法已经用C语言实现了，但是也可以被C++，Delphi，VisualBasic和Java编写的其他程序使用。

在测试表面生产过程的很多步骤中均可能造成阵列偏斜。用来施加各个独立捕捉试剂的斑点化技术可能引入斑点的系统错位，结果产生偏斜的阵列。用来生成各个独立测试表面的分割过程可能会因为不准确或者产生非一致的边缘而引入偏斜。定位装置可能会将测试表面不准确地放入到载体中。测试表面材料的任何固有弯曲可能会产生最终定位阵列的偏斜，正如测试表面载体本身的弯曲一样。一个边缘可以是单个测试表面的物理边缘，或者是一个物理屏障或者标记用来分离单个阵列以提供相对于图像或者测试表面的其他部分的对比度。

一个合适的斑点寻找算法是达到所需结果的第一步。这个程序不但要处理图像化阵列的任何扭曲，而且还要处理图像化阵列的平面度，总体质量差的阵列，阵列中的非特异性结合，以及照明不足。这样的一个算法在第一步使测试表面的图像正方形化(square)。这样减少了不是由于阵列元素的错位而导致的、在图像各行或列的斑点中的任何左右或上下漂移。

测试表面的正方形化包括形成两个像素和的矢量。一个向量代表图像中所有列像素的和。另一个代表图像中所有行像素的和。对于每个和向量，生成该向量一阶导数的平方。采用在NucleoSight图像工作站中使用的图像大小，这个过程是通过利用一个Savitsky-Golay滤光镜来完成的，其内核尺寸(kernal size)为20或者一个与被分析的图像和信号相适合的值。每个平方导数中的两个强峰代表边缘。边缘的质量可以通过平方导数中的峰高来估计。平方导数的标准偏差的倍数可以作为边缘的质量标准。如果平方导数的峰没有使标准偏差比平均值增加好几倍的话，边缘可能会被认为质量太差而需要继续进行正方形化操作。

如果令人满意的边缘被检测到，一个简单的搜索被进行，用来旋转图像以生成一阶导数的平方的最强峰。一般地，尝试旋转0.25度，上面的求和以及求导过程被重复。如果平方导数的峰值下降，则反转旋转方向。否则，进行额外的旋转，所得到的峰值强度被检验。重复这个过程，直到峰值强度超过最大值。在那一点，原始图像被反方向旋转一步，降低的峰值就会被观察到。这个反转将图像返回到产生最佳峰值的旋转。这对应着测试表面的边缘最水平和最垂直的旋转。在旋转搜索过程中的任一时刻，如果发现来自四条边的结果不一致，那么就会利用一个投票算法来决定搜索是否继续。那种情况下，为了继续搜索，必须对四条边中的三条进行改进。

对测试表面的图像进行了正方形化处理之后，要尝试定位该图像中的斑点网格。由于斑点排列在相对规则的行和列中，行像素和列像素的和在斑点所在的行和列的位置会表现出不同的峰值。这些像素和中的峰值可以用于整体定位该斑点网格。为了这个过程的进行，测试表面的所有四个边缘必须都要在图像中被检测到，否则该过程停止。实际上这些“和”首先被“反转”，通过从各行各列的最大和中减去每个像素行和列的像素和。这个操作将数据变换成一种形式，其中，这些“和”中的正向(positive-going)峰值代表了一列或一行斑点的存在。然后生成像素和倒数的二阶导数，一个用于水平像素和，一个用于垂直像素和。一个Savitsky-Golay平滑/导数化多项式被用来产生这样的导数。平滑内核的大小设置成大于常用来抑制不重要细节的情况。这会使得斑点列和行的位置不变，但却平滑掉了宽度信息。

二阶导数的一个区域被用来搜索测试表面边缘之间的最小值。在测试表面边缘的一个“插图(inset)”中开始和停止搜索将进一步减少了搜索的面积。只有测试表面的宽度或长度的3％的插图似乎工作得很好。这个插图使搜索从测试表面边缘的二阶导数的巨大变化上移开。二阶导数的最小值代表这些“和”中的峰值。对于一个要考查其有效性的最小值，它的绝对值必须超过某个预先确定的“截止(cutoff)”值。如果一个峰值符合这个截止值，它的位置就被记录下来供以后使用。

当搜索许多列或者行的斑点时，如果列的占有率与阵列中其他列或行相比为最小时，那么对二阶导数的峰值搜索操作就会稍微有些不同。算法检测高占有率的列或行，并对未检测到的列的位置进行插值。算法通过对那些检测到的行或列之间的距离进行检查来确认插值的列或行的有效性。分隔距离应该是几乎规则的。如果一个无关的行或列被检测到，分隔距离就不会如此规则。如果没有检测到足够数目的强峰，例如对于空井或者没有反应的测试表面，算法停止进一步分析并返回一个编码指示分析被停止的原因。这个编码被返回到结果图表中以便使用者可以看到失败的原因。

当所有的列和行已经被检测或者被插值之后，算法移到后来在算法中用来校正单个斑点位置的网格的起始位置。接着，任何需要的图像的预处理就完成了。例如，平滑，扩张等。目前的算法版本进行一个内核尺寸为3.0的中值过滤操作。内核尺寸的选择将取决于被分析的图像和信号。

下一步是对所处理的图像应用一种自适应阈值操作。这个过程为后续的分析步骤对图像进行二进制化(binarize)。之所以使用自适应阈值是因为，由于测试表面背景的变化、测试表面倾斜而造成的照度变化等因素决定了并不存在一个能够可靠地对图像进行二进制化的单一阈值。平均自适应阈值和中值自适应阈值都己被使用。没有观察到一个方法比另一个方法更有优势。

在这一点上应用一种形态愈合(closure)处理(在侵蚀之后进行扩张)。阈值化图像中的小“洞”可能会对后续的斑点搜索算法造成干扰，而这个过程将使这些小“洞”愈合。愈合中使用的内核尺寸非常小，对于侵蚀是2个像素，对于扩张是3个像素。用于侵蚀的较大内核被发现以连接背景区域。用于扩张的较大内核在某种程度上可以帮助分解相连的背景区域。对于量化分析，这个步骤可能不被推荐。

当获得了图像的阈值化版本之后，便需要检查合适大小和形状的斑点。一个默认的网格用来估计反应斑点应该出现的位置。这个程序通过检查每个网格单元格正中心的像素，在每个单元格中开始它的搜索。如果该像素是黑的，程序通过在水平和垂直方向上搜索下一个白色的像素来寻找该中心。如果搜索表明起始点并不位于中心，不论是水平的或者是垂直的，那么将该起始点移向中心，并重复搜索步骤。对于大多数的真实斑点而言，只需要几个搜索步骤就可以确定中心。总之，对于薄膜图像分析，中心点搜索步骤被限制在5步之内。

如果开始时在单元格中心的像素不是黑的，那么该算法就将单元格分成四个四分之一部分，估计每个四分之一部分的平均强度，并试图从最黑的四分之一部分的中心重新开始搜索。如果最黑的四分之一部分的中心像素也是白的，搜索停止。否则，对斑点中心的搜索按照上一段的描述继续。如果检测到的斑点的宽度和高度在预定范围之内，宽度和高度的比例也在预定范围之内，那么就将这个单元格移到一个新位置。

当搜索了该网格上的所有单元格之后，检查这些单元格以确定邻近的单元格是否被移动到相同的位置。当初始网格位置处于一个使测试表面上的真实斑点被几乎平分的位置上时，就可能发生这种“冲突”。任何发生冲突的单元格均被返回到它们的原始位置。

经过逆转了冲突之后，被可靠检测的斑点(它们具有可接受的大小和形状)，需要检查距离起始位置的系统水平和垂直偏移量。该程序对水平方向上偏移量的确定是通过对所有在列1、3、5和7中可靠地检测到的斑点在水平位置上距离起始位置的差异求平均而实现的。类似地，该程序通过检查第一行和最后一行中的可靠地检测到的斑点来决定垂直方向上的偏移量。这些行和列可用于一个特定组的分析物，并且可以为测试表面上的不同分析物布局而被改变。当确定了垂直和水平方向上的偏移量之后，就通过这些偏移量来调整原始网格的位置，并将其重新应用到阈值化图像，并重复斑点搜索过程。虽然在这个步骤后从来没有发现过斑点冲突现象，但是本算法仍然会寻找斑点冲突，而且一旦检测到便逆转它们。

虽然第二个搜索步骤很少检测到额外的强斑点，但是它为弱斑点或未反应斑点提供了非常好的估计位置。如果没有这个调整，那么对背景信号的估计将不会很好，因为可能一起错过未反应斑点和弱斑点。

当完成了斑点搜索算法之后，通过从排列在每个单元格中心周围的“边框”中的像素的平均强度中减去该中心内的圆形区域(其直径为22个像素)的平均强度，来确定每个单元格的“信号”。此时，该边框的每一边具有35个像素，其厚度为两个像素，即有大约270个像素会影响这个平均值。是否使用长方形边框并不重要，这只是为了计算方便。像素的选择将基于单个元素的尺寸(斑点尺寸)和图像获取参数，例如折叠放大倍数(fold magnification)等。

为了获得每个单元格的信号，暗中心区域的平均强度被从较亮的周围边框的平均强度中减去。由于较高的强度值代表着较亮的像素，按照这种方式进行计算将对“较强”斑点产生更加正向或阳性(positive)的信号。当对测试表面的所有信号处理完成时，用于信号计算的位置在图像上以一个小“+”号标记在每个斑点的中心。虽然这个过程对于用户来说发生得太快，以致在实际的板运行过程看不到，但每个井的图像都与这些标记一起被记录下来用于以后参考，如果需要的话。

即使是在测试表面图像由于斑点化、破裂、检测载体放置，工作台移动、或者用户对准问题造成未对准的情况下，该程序也可以定位斑点网格。如果一个测试表面具有反应斑点，而且该测试表面的所有边在图像上都是清晰可见的，那么该算法将可以正确定位这些斑点。空井以及那些测试表面未被利用的井常常是在分析过程的早期就会被检测到。一旦检测到这些井，就不会再对它们进行额外的分析。如果该算法确定某个特定的井不应该被分析，那么它会返回一个编码告知用户该分析失败的原因。

当本算法为特定的井生成了数据表时，这个表包括图像中每个斑点的位置，以及前景、背景和净信号。虽然该信息不需要被用在全自动板运行的整个过程中，但它们可以用于手工分析各个独立测试表面。该算法在每个斑点中心的位置处添加了一个小的“+”号标记。带有标记的图像在全自动运行中被保存。如果对一个斑点是否被成功检测存在任何疑问，那么就可以取回该图像，并检查标记的位置。

其中这个区域的阵列元素的值可以通过计算大于一个阈值的像素数目或者其他计算得到。对于所识别的元素的各个独立像素响应也可以被记录下来，或者可以生成像素强度的组织分布图。该数据的其他显示方式也是可能的，而且这些显示方式在本领域中是公知的。

该斑点寻找算法的一个优选方案就是要利用一种方法简单地识别和确认出阵列中各个元素的方位，从而消除在图像上放置网格(对应于该阵列中的元素个数)的需要。为了识别阵列上各个元素，这个算法必须首先确定符合待分析阵列大小所期望的、元素的粗略大小、形状和位置。为了这个目的，将采用霍夫变换。这个算法根据所用的准确变换来特别地搜索几何基元(geometric primitive)，例如线或圆形。它也可以用于寻找与真实空间或图像中一个目标的位置相对应的变换空间中的最大值。这些变换已经被用于检测各种行星图像上的火山口和用于工程制图的数字化。火山口检测技术非常有价值，因为它可以在不均匀照射或者不均匀背景的条件下工作。它也在圆圈不是严格排列的条件下，以及两个圆圈都比背景亮和暗的条件下，以及圆圈直径不是常数的条件下工作。

这个流程中的步骤为任意图像产生了反应斑点位置的列表。然后根据预先设置的选择规则确定哪个斑点位置是噪音，并去除该噪音。任何被识别为真实斑点位置的斑点均被按照预先确定的阵列图分配到一个特定元素。基于阵列上已识别的元素之间的距离，将未反应的斑点在该阵列上分配一个位置。根据每个分配位置的强度数据，就可以确定该阵列中每个元素是否存在或者确定每个元素的绝对值。

薄膜检测分析的一个独特的特征就是对于非常强烈的反应，该位置的膜厚度或结合质量(bound mass)导致颜色的变化形成一个第二彩色边缘，这个反应产生一个比灰度测量中的背景更亮的斑点。因此阳性斑点可能会比背景暗或者比背景亮，但都仍然是有效的阳性结果。另外，形成的斑点的厚度可能不一致。参见图11A-11C。对于这种类型的测试表面，以及对于其他信号发生的方法，所选算法要正确地检测阳性信号，并将阳性信号正确分配到暗斑点、强反应斑点以及非一致性斑点，而且甚至在有噪音背景存在的情况下也不会召集(call)未反应斑点。如果在分析过程中生成了背景，那么未反应斑点能够表现为暗背景中的亮斑点。参见图11C。图像处理的方法必须恰当地解决这类处理问题。

在这种情况下，单独的霍夫变换是不够的，因为处理时间太长。我们注意到，这类薄膜分析产生的图像在斑点中心处都产生一个从亮到暗的强信号梯度，而且在其他应用中也是这样。未反应斑点同样也有强信号梯度，但是它朝向斑点中心是从暗到亮的。参见图12A-12B。

对于这些表面具有最佳性能的处理算法由下列步骤构成，如图1中的方法100所示。首先定位测试表面图像，虽然这是一个可选步骤。然后，图像被裁剪以去除图像上来自板井(plate well)的黑边。同样这也是一个可选步骤，但其可减少将要检查的数据量，使算法运行更快。而且另一个好处就是任何在边缘附近的噪音信号不用被检测或者检查。为了完成裁剪，形成图像在水平方向和垂直方向上的投影。两个投影的一阶导数通过阶数为3，内核尺寸为21个元素的Savitsky-Golay平滑/派生多项式产生。根据具体的应用、仪器格式和信号发生方法可以选取其他的值。然后这些导数被平方，并且从边缘到中心对这些导数进行扫描以搜索高于该平方导数的平均值4个标准偏差的第一个峰。这样根据每个平方导数检测到的两个峰的中心被认为是测试表面的边缘沿相关轴的位置。测试表面的边缘被检测到以后(块102)，图像被裁剪到这些边缘位置(块104)，一般表现为图像大小缩小约25％更少像素。如果没有检测到测试表面边缘，那么就跳过块104中的步骤，在没有减少图像大小的情况下继续处理过程。

用来检测平方导数的峰的、高于平均值的四个标准偏差根据经验选取。所选择的值被设置成去除了将反射作为实际的测试表面边缘的错误检测。较低的值导致反射被不正确地认为是测试表面边缘。设置尽量高的截止值会在实际的测试表面边缘和图像中测试表面的旋转造成限制。如果测试表面边缘是破碎的、不平整的，或者被非特异性结合隐匿，那么裁剪操作可能会失败。同样，如果测试表面被旋转超过4°或5°，裁剪操作也可能失败。可接受的旋转度数会因测试表面图像的其他质量(例如测试表面背景的总亮度、“清晰度”等)而不同。

如上所述，裁剪图像失败对于斑点搜索算法不是致命的。它仅会导致稍稍延长的分析，并可能需要处理更多的伪噪音斑点。

在块106，在水平方向和垂直方向上同时产生图像梯度。这些梯度是通过采用Ando提出的5×5系数集(Shigeru Ando，“ConsistentGradient Operators”，IEEE Transaction on Pattern Analysis and ModuleIntelligence，22(3)：252-265，2000.)对图像进行卷积而生成的。取垂直梯度除以水平梯度的反正切函数生成梯度方向(块108)。如果哪个方向上的梯度小于该系统最小可表示的单精度浮斑点数的绝对值，那么该方向被设置成0。注意，生成梯度方向的量级以及平方梯度的大小和阈值(将在稍后描述)，并不被认为会是非常大的。在块110，对水平方向和垂直方向上的梯度进行平方，然后将这些结果相加，生成图像梯度的平方大小。一个更加传统的方法将会通过求该和的平方根来生成图像梯度大小。去除求平方根的步骤不但使运算速度更快，而且也使本算法不存在平方根操作中可能出现的值域问题。平方根梯度可以通过一个阈值操作(块112)被二进制化。平方梯度大小高于平方梯度大小平均值的所有像素在图像的阈值化版本中被设置成1。而平方梯度大小较低的所有像素被设置成0。

采用平方梯度大小的平均值的倍数对图像进行阈值化是根据经验实现的。对样本图像进行实验，从而得到该平均值的那种倍数会工作得很好。平均值的一倍数值对薄膜图像工作良好。利用其他测量平方梯度大小的方法也是可能的，例如方差或中值的倍数。典型图像的总体质量也有可能影响截止值的选择。这一步骤对于该算法的剩余操作并不是绝对必须的。然而，它将剩余的工作的焦斑点集中在感兴趣的像素上。这通常会为进一步的检查去除大约90％的图像像素，从而大大地加快分析速度。

在这个算法的下一步中，即块114中，从梯度方向、梯度大小和可接受的斑点半径中得到的信息被组合生成原始图像的一个变换，该变换可以揭示可接受斑点的位置。

在一个圆的边缘处，梯度“指向”一条垂直于切线的线。梯度可以指向该圆的中心或者远离它，这取决于该圆是亮背景上的暗圆还是暗背景上的亮圆。对于一个理想定义的圆，所有沿梯度指向圆心的线都会在圆心相交。由于该圆的形状会偏离理想形状，因而这些交叉斑点可能会变得模糊，但仍然会趋向于位于该圆的中心。

当其进行从亮背景到暗圆的变换时，梯度的意义被定义成指向各圆的中心。这导致梯度指向圆心，无论是对于亮背景上的暗圆圈，对于白色的圆圈(其由于测试表面的物理性质而具有一个暗环围绕在白色中心的周围)，还是对于“环形圈”(其中指示可能已经剥落，而仅在亮背景上留下一个暗圈)。如果一个未反应的斑点被暗色的、非特异性结合的材料围绕，那么这个被暗背景包围的亮斑点将导致梯度从圆心向外指向，正如所期望的。对于该算法的这个步骤，一个新的空图像(全为0)被产生。对于阈值化平方梯度大小中的每个非零像素，梯度方向被返回。梯度方向被用于构建一条线段，其指向一个可能的圆的中心。可接受的圆半径决定了该线段的结束端斑点。对应于该线段中一个像素的、新建图像中的每个像素得到一个“投票”。也就是说，每个这样的像素的强度都增加了1。随着阈值化平方梯度大小内的连续像素被检查和线段被生成，新图像中对应于合适大小的圆心的斑点趋向于积累更多投票。在这个过程的最后，梯度大小和方向已经被变换成原始图像的某种表示，其中圆心具有比背景更高的强度值，参见图13。虽然这种方法被设计用来处理光学薄膜测试表面，但该算法可以处理图像变化类型能够消极影响图像解释的任何检测格式。

对于线段未准确穿过像素中心时邻近像素之间投票的“划分”，这个步骤目前的实施方式并没有进行优化。该实施方式也未包含关于线段生成的优化，例如某种Bresenham线生成器。如果需要，可以进行这样的改进，但是迄今为止还不存在这样的情况。

正如利用平方梯度大小一样，利用阈值操作来生成该变换的二进制版本(图1的块116)。这种情况下，阈值标准将要采用该变换中最高票数的某个分数。实验研究表明，将最高票数的七分之一作为阈值对于薄膜图像而言效果很好。因此，在阈值化变换中，这样的像素被设置为1，它们对应于该变换中票数高于最高票数的七分之一的像素。所有其他的像素被设置为0。利用其他阈值标准也是可能的。采用最高票数的某个分数可使空井图像中的许多伪斑点被检测到。由于没有哪个像素可以得到非常之多的票数，因此许多像素(常常多于1000个像素)，可以获得足够多的票数以超过阈值。在本算法的稍后阶段中，将会声明这些图像和无法解释的伪斑点，并且去除它们。

阈值化变换中的斑点常常由连续的多组像素来表示。在本算法的这一阶段，在块118中，这些连续的像素被检测到。所有在同一连续区域中的像素被分配一个标记。一个小的正整数用来表示斑点数目。对于阈值图像中每个像素连续区域，只有一个像素用来代表斑点的位置(程序块120)。合成来自变换和标记区域的信息，该区域中对应变换中具有最多票数的像素的像素被设置成1。这个区域的所有其他像素被设置成0。有时会发生一个斑点，或者一个斑点和噪斑点，在阈值化变换中被两个或者多个连续区域表示。算法的下一步，第一阶段被压制的像素被检查邻近的周边像素。“亲近”是利用生成变换中同样的斑点大小标准来定义的。如果两个或者更多的像素被识别成位于另外一个斑点可接受的半径之内，变换中除了单个具有最多票数的像素之外所有像素都被设置成0，这样就可以去除紧邻像素(程序块122)。

通过算法的这一步，所有可接受的斑点都已经被检测到了，并定位到单个可以最好地代表斑点位置的像素上。除了通过斑点大小进行的选择，算法对于这个斑点是完全通用的，可以应用到任何斑点定位任务。算法的后续步骤应用阵列布局的知识将每个斑点于一个阵列元素联系在一起，并决定测试表面上何处需要进行测量。这些步骤构建出于阵列布局匹配的网格。

网格中可能的行与列通过一个叫作“领导者—跟随者”算法的聚类算法来估计。所采用的聚类标准是基于在霍夫变换中采用的同样的最大斑点大小标准。在程序块124中，某些斑点或者斑点簇可能会被当作噪音斑点去除，而一个斑点网格可能会被定位。假的斑点簇可能会被去除如果它们太靠近测试表面的边缘。这一步依赖于上述裁剪阶段测试表面边缘的成功检测。如果离边缘的一些关键距离之类的斑点簇被检测到，它们可能会由于破损，清洗效应，或者其他碎片的原因被去除。

剩下的斑点被计数以决定应用于测试表面的样本类型，如果有的话。斑点计数用于在空白，病人样本，高密度样本，或者空井之间分离样本。对于这样样本的斑点计数范围不需要是连续，因为存在有些计数是不可能被任何合法的样本类型产生的。

在这个阶段，一系列启发式的尺度用来验证剩下的斑点和斑点簇。如果一个斑点簇不符合那个特定位置的设定条件时，这个斑点簇就会被去除，接着新的斑点簇被验证。常常有这样的强况，聚类信息没有完全地指定阵列中所有行和列的位置。例如，在图12A-12B的阵列中，8个列常常没有任何斑点出现，没有产生任何斑点簇。在这些情况下，算法将要试图插值缺失的斑点簇的位置。例如当只有7个合法的列被检测到的时候，算法将会检查检测到的列之间的距离，决定缺失的列是其中一个边缘还是位于网格中的一个内部列。一旦决定被执行，对于缺失列的估计位置就可能根据来自检测到的斑点簇的距离信息被得到。

当所有需要的网格行和列被检测到或者从聚类信息中被估计出来，所有参考斑点的列表被验证用来寻找与每个网格行与列的交叉斑点相近的斑点。当一个匹配被发现，网格的位置移到斑点的位置。如果没有适合的参考斑点被发现，网格交叉斑点不移动。决定一个斑点是否与网格位置“足够近”的标准再一次是依据在霍夫变换步骤中使用的可接受的斑点半径基础上制定的。

每个网格位置的信号，不管该处是否有一个斑点被检测到，是通过加和可接受的最大斑点半径之内的梯度大小来生成的(块126)。如果一个斑点在网格位置附近被检测到，就像在前一步确定的一样，该斑点位置的信号被测量。图像可以被返回到获取软件包，并且测量位置的中心位置标记了一个小加号“+”标记(块128)。这些信号值，与测量中心的位置一起，用来构建一样返回到界面/获取软件包的信息表，并记录为对该测试表面的读取。

通过将斑点变换应用到整个梯度大小而且不是阈值版本，我们可以增加检测器的灵敏度。检测结束之后，信号可以通过对检测到的斑点周围的梯度作平均进行测量。聚类质量尺度可能需要调整。一系列在算法中使用的不同的截止值可能需要设置成最不严谨的值以增加灵敏度或者斑点信号的分化。这个过程必须与算法输出结果中的任何伪斑点检测的增加或者背景影响相平衡。特别是投票约数应该被调整到一个更大的数目。采用目前的算法寻找斑点然后依据一个或多个采用阈值的互动流程的方法可能会产生更加灵敏的斑点检测。第一个算法可能用于确认合适的斑点位置，第二个算法可能用于在那个位置的斑点的真实强度。

对于相关领域技术人员来说，可以对本文所述的方法和应用进行其他合适的修改是非常明显的，但这并没有脱离本发明或其中任一实施方式的范围。现在已经详细了描述了本发明，但参考下面的实例可能会更加清楚，其中这里的实例只是说明性的，并无意限定本发明。

实例

实例1

下面所描述的阵列被设计成，从PCR扩增后的样本中检测涉及囊性纤维化(“CF”)的基因组目标DNA序列。测试表面是一个光学薄膜表面，其检测目标序列与互补的固定化捕捉序列之间的杂交。生成的光学信号是由于杂交事件而导致的光学厚度变化的函数。光学表面反射入射白光，以致特定波长的光被减弱或者去除，结果导致特定颜色的变化。在没有光学厚度变化的条件下，反射光保持原始颜色或背景颜色。

被CF表面检测的基因组序列对CFTR基因中的25个突变和多态性是特异的，它们被示于下面的表格中：

FM

2184delA

2184del

5T

7T

9T

CC

Neg

	WT	A Mut
								ΔF508WT	ΔF508Mut	I148TWT	I148TMut	ΔI507WT	ΔI507Mut	G542xWT	G542xMut
G551DWT	G551DMut	W1282xWT	W1282xMut	N1303KWT	N1303KMut	R553xWT	R553xMut
								621+1G＞T WT	621＋1G＞T Mut	R117HWT	R117HMut	1717-1G＞AWT	1717-1G＞AMut	A455EWT	A455EMut
R560TWT	R560TMut	R1162XWT	R1162XMut	G85EWT	G85EMut	R334WWT	R334WMut
								R347PWT	R347PMut	711+1G＞TWT	711+1G＞TMut	1989+1G＞AWT	1989+1G＞AMut	3120+1G＞AWT	3120+1G＞AMut
1078delTWT	1078delTMut	3849+10kbC＞TWT	3849+10kbC＞TMut	2789+5G＞AWT	2789+5G＞AMut	3659delC WT	3659delC Mut
								FM	F508CWT	F508CMut	I506VWT	I506VMut	I507VWT	I507VMut	FM

FM-基准标记

CC-化学对照

Neg-阴性对照

每个CF光学薄膜测试表面含有64个阵列元素。该阵列由针对25个突变中每一个的成对突变和野生型位置组成。另外CF测试表面还含有检测6个多态性的位置。在这个64个元素的阵列中有9个探针序列来检测这些多态性。除了59个阵列元素之外，该阵列还含有3个基准标记和两个过程对照。

试剂制备：

1X杂交缓冲液        250mL            20×SSC缓冲液

                    10mL             10％SDS

                    5gms             酪蛋白

                    至1L             无RNase/DNase水

                    pH＝             7.0±0.2

一种不溶性沉淀会立即出现。加热至50℃直至全部溶解。用一个0.2μ的醋酸纤维素过滤单元来过滤。分装到50mL的锥形离心管中。

在2-8℃存放直至使用。

变性溶液           5mL           2N NaOH

                   4mL           0.5M EDTA

                   91mL          无RNase/DNase的水

用一个0.2μ的醋酸纤维素过滤单元来过滤。室温保存。抗生物素HRP偶联抗体1mg/mL偶联储液             将0.5毫克偶联物

                                          (conjugate)重新

                                          溶解在0.5mL的

                                          水中，并在室温下

                                          放置15分钟。

在2-8℃存放直至使用。偶联物从Jackson ImmunoResearchLaboratories公司购买的。

清洗液A             5mL          20×SSC

                    10mL         10％SDS

                    985mL        无RNase/DNase的水

                    pH＝         7.0±0.2

用一个0.2μ的醋酸纤维素过滤单元来过滤。室温保存。

清洗液B                5mL            20×SSC

                       995mL          无RNase/DNase的水

                       pH＝           7.0±0.2

用一个0.2μ的醋酸纤维素过滤单元来过滤。室温保存。

实验设置：

在50℃预热1X杂交缓冲液大约20分钟或者直至使用前全部溶解。

移取一份四甲基联苯铵(TMB)衬底，使它在台架上预热到室温至少15分钟。分析一块板一共需要14.4mL，但是待分析的每块板不会消耗超过16mL。

通过将抗生物素HRP偶联抗体偶联储液在杂交缓冲液中稀释1000倍来为待分析的板的数量准备足够的偶联物(15mL/板)。放置在室温下直至需要的时候。稀释的偶联物可以最多可以1小时内使用。

将CF板从热封包装袋中取出，但是在开始实验之前不要移去粘附的板密封物。

实验方法：

移去粘附的板密封物，加入180μL1X杂交缓冲液到每一个含有测试表面的井当中。替换板密封物，然后在51℃下在SOLO HT加热块(或等效物)上预热30分钟。在30分钟的保温时间之后20分钟开始步骤2。

注意：保持板的温度对于正确的杂交非常关键。室温可能会影响实验的温度并且应该被仔细地监测。

加入PCR扩增样品到试管或者板上，以及足够的水使得总体积达到10μL。加入10μL变性溶液到扩增样中，用移液器一次上下混匀。在室温下保温10分钟。

移开板板密封物并保存。从CF板上每个井中移取50μL预热的杂交缓冲液，加入到变性的PCR产物中。混合并将所有的变性PCR产物(大约70μL)加入到合适的CF井中的杂交缓冲液中。通过重复地用移液器吸入吹出来充分混合。用板密封物覆盖板。在51℃保温10分钟。

从加热块上将板拿下，移去板密封物。在室温下用清洗液A的水流剧烈清洗板(4次)，接着用清洗液B的强水流清洗(4次)。

注意：板的清洗是通过将合适的清洗液水流直接冲向井的一角直至井被溶液充满为止。每次清洗之后，溶液被倒出。最后一步清洗之后，井被打开，板被反扣在台面上以去除多余体积的清洗液，或者用一个设置成合法程序的板清洗器。

5)加入125μL 1μg/mL的在杂交缓冲液中稀释的抗生物素HRP偶联抗体偶联物到每个井中。在室温下没有覆盖物的情况下保温10分钟。

用清洗液B的强水流清洗(6次)

加入150μL TMB衬底到每个井中。在室温下保温5分钟。

通过用水充满每个井来清洗(5次)，然后通过加入甲醇充满每个井来干燥(3次)，最终抹去多余的甲醇。允许剩下的甲醇在用图像分析系统分析之前挥发。

实例2

这样研究被设计用来测定图像分析站对于将要按照x—和y方向被成像的样品的倾斜的耐受性能。一个带有反应的和没有反应的区域的测试表面被安放在一个位于光学视场中的测角仪上，该光学视场的场深，聚焦的水平，和分辨率都和将在分析一个96井板的井中的测试表面的完全一样。测角仪允许对应用到测试表面上的倾斜角度的非常细微的调节。带有应用到x和y方向的倾斜的测试表面被评估。单个反应斑点的读数在正负倾斜的各个角度被记录，如下表中所标示的。

倾斜角度	对比度(正-负)	总计
			-10	525	811
-5	843	1316
			-4	914	1477
-3	920	1484
			-2	992	1560
-1	990	1548
			0	1014	1496
1	1027	1446
			2	1028	1427
3	1007	1361
			4	1021	1383
5	1001	1369
			6	1008	1363
7	943	1247
			8	887	1156
10	795	1058

在x和y方向上的数据是一样的。

从-2°到6°只有少于5％的对比度损失。这允许在标准偏差为3σ的时候有±4°的倾斜差异，这在图像工作站中是极好的耐受度。表面相对于真实的0°位置的微小位置偏移是由于范围中心斑点非零的事实导致的。

实例3

为了了解环境光对采用图像分析站测量反应斑点的信号强度造成什么样的影响，如果有的话，一个带有多个反应表面的板被安放在工作台上的板支持器上，并在相机下排列以适合成像。反应测试表面的各个斑点的信号强度在存在和不存在环境光的条件下被测量。这些反应表面被测量，测量条件是偏振器的设置为45°(中心斑点)的刻度盘范围，灯位置是刻度标记刚好位于最上面的位置，代表一个中等输入强度。测量在不同测试表面上的一系列位置进行。E8井中所有斑点位置的单个斑点强度对于有和没有环境光的相关性系数是94.6％。因此环境光似乎对于光学薄膜阵列的分析具有很小的影响。

实例4

这个研究被设计用来测定图像分析站的合适的光强度设定和偏振器位置。96井板上一系列具有反应区域和没有反应区域的单个测试表面被挑选出来，然后采用光设定和偏振器位置的不同组合来分析。偏振器室具有90°的旋转，因此导致饱和信号(没有偏振)的位置被标记成1号位置，而且看作0°位置。从1号位置相反90°的位置被标记成2号位置(90°位置)，而中心斑点或者偏振器的45°位置被标记成3号位置。光源具有从数字编号1到9的光设定，5是中斑点设置。

一个可接受的光/偏振器组合将不会饱和背景(例如用12比特CCD时产生4095的灰度值)，将会表现出阴性斑点和阳性斑点之间最大的对比度，将不会采用可能导致信号丢失的全交叉的偏振器设置，将不会采用最低的光设置因为可能会损失信号强度和对比度，将不会采用可能降低灯寿命的最高光设置，将会采用一些偏振以平衡贯穿测试表面的光照和缺，以及校正透镜发射。

被检测的设定组合如下表所示：

条件	灯设定	偏振器设定
			1	1	0
2	1	45
			3	1	22.5
4	1	67.5
			5	3	0
6	3	22.5
			7	3	45
8	4	0
			9	4	45
10	5	0
			11	5	45
12	6	90

总体最好的光条件是在条件4，8和9得到的。所有这些条件都给出了阳性和阴性结果的良好分离。条件5和6也是可能的设定。为了更加仔细地考虑偏振器对于数据的影响，这些数据按照灰度差异与光设定在不同的偏振器设定下作图。条件4(67.5°偏振器，光设定1)和条件8(0°偏振器，光设定4)给出了最好的信号差异，但是在偏振器为45°设置时候获得的信号强度完全与光设定无关。这是一个非常适合的条件，因为光强度随着时间可能发生较小的变化，而45°偏振器设置应该不会影响信号的质量。当没有偏振器使用的时候和在偏振器全设置(90°)低光设置(可保护灯的寿命和质量)下照明不足以产生信号的时候，光设置非常明显地影响信号。

虽然完全没有偏振器也是可接受的，例如偏振器的0°设置，我们选择了45°的设置以利用在这个偏振器设置下没有对光设定的依赖的优斑点。同样在没有任何光偏振存在的前提下，系统在中等灯设置处饱和，而饱和不是最好的条件。一个中等的灯设定明显给出最好的整体信号对比度，这是优选的灯设定。光设定和偏振器设定的耐受是相当高的。

实例5

一个实验与实验之间的再现性研究被执行以测定包含在设置光学识别和板读取的误差。一个含有24个测试表面的96井板被用于这项评估。每个测试表面具有一个64元素的阵列，如实例所示。每个测试表面上反应的斑点的数目决定于用于分析的输入样品的基因型。板名称为021202。

了解包含在每次实验的设置中先天的差异型非常有趣。为了测定这个差异性，一块板在统一个仪器上被实验5次。其中包括每次重新设置以保证每次实验的独立性。每个独立实验之间的相关性用相关性数据分析包例如Excel来计算。相关系数p是通过协方差和相应的标准偏差按照下面的方式计算的

${\mathrm{\ρ}}_{X,Y}=\frac{\mathrm{Cov}(X,Y)}{{\mathrm{\σ}}_X}$

这个过程在021202板上进行，一块非常干净带有排布好的分开的斑点。这个板在3个行中有测试表面：A，D和H。这个板伴随着一个测试表面拉伸功能和斑点寻找功能被进行实验。021202板上的测试表面不是所有的都带有同样的同源或者异源突变。为了说明这种差异，同源测试表面上的突变/缺失野生型的斑点的数据斑点在对那个特定的斑点作平均的时候不被考虑。突变斑点从异源斑点中被去除。对于斑点5T，7T和9T，因为绝大多数芯片表现出一个7T斑点，所以5T和9T斑点在它们出现的地方被去除，而且那些没有表现出7T的斑点也不被考虑。斑点4和6没有出现，而斑点5出现了。另外一方面，绝大多数的响应被保持。去除了不恒定的斑点，相关性数据被计算出来，被列表在下面的表格中。

	第1行	第2行	第3行	第4行	第5行
						第1行	1
第2行	99.962％	1

第3行	99.987％	99.987％	1
						第4行	99.959％	99.907％	99.929％	1
第5行	99.994％	99.957％	99.982％	99.957％	1

对于021202板的实验之间的相关系数是非常好的。最小的相关系数是实验4和实验2之间的99.907％。所有这些小的差异都在所获得的标准偏差内。

实验与实验之间的恒定性非常好。计算得到相关性表明板021202上最大的差异是位于实验3和2之间，位于0.8％的级别。这个差异和其他任何差异都更占包含在斑点平均中标准偏差。这些结果说明板之间在数据上的任何差异都更有可能不是由于设置光灯或者由操作者进行的手工排列造成的。只要来自用户手册上的好几个操作指导都被执行了，这个结论就是正确的。排布必须尽可能好地将斑点配合到排布网格的方块中。

实例6

这个实验的目的是验证图像分析的信的斑点寻找算法的有效性。斑点寻找算法被设计用来通过定位网格默认位置之外的斑点来允许斑点定位的极大可塑性。这个功能利用在实验开始系统地未对准的拐角测试表面(96井板的拐角)被检测。被分析的板含有如实例1中被斑点化了CF阵列的光学薄膜测试表面。信号的解释是用一个用来对样品基因型分类的软件包装进行的。对于这个实验，报告的分类与输入样本的已知分类相比。在集成这个新软件算法前后的性能的恒定性之间的对比将会用来建立与原始的斑点寻找路径相比的任何在功能方面的缺失。斑点信号和强度值的解释在进行这些比较时都将会被考虑。

这项研究是用上述的图像分析系统和一个名称为EW042502的板来进行的。板被独立地分析了8次，每次都改变初始的排布位置。光强被一次设置，剩下的实验都用同样的设置。初始排列网格在测试表面的4个拐角被系统地调整，同时保持图像上测试表面的边缘。

实验1-正常排列，网格被放置使得它可以很好地包围阵列上的斑点。

实验2-网格被放置在四个拐角的井中斑点的左边。

实验3-网格被放置在这些斑点的右边。

实验4-网格被放置在这些斑点的上边。

实验5-网格被放置在这些斑点的下边。

实验6-网格按照对角线向上放置在左边。

实验7-网格按照对角线从4个拐角的斑点向外放置。A1井在这些斑点的左上，A12井在这些斑点的右上，H1井在这些斑点的左下而H12井位于这些斑点的右下。

实验8-网格按照对角线从4个拐角的斑点向内放置。A1井：下/右，A12井：下/左，H1井：上/右，H12井：上/左。

每个未对准之后，这个板被实验并对基因型进行分类。结果得到的数据被比较以决定斑点寻找算法是否实际上偏移误差的未对准进行调整。基因型召集和信号强度的数据都被用于该比较。

在基因型分类中产生好几种差异。没有趋势对应于未对准的类型。每次实验中不正确基因型分类的数目的表可以在下表中发现：

实验号码	错误的数目
		1	1
2	3
		3	2
4	8
		5	0
6	1
		7	3
8	6

这些错误调用给出一个错误代码24，除了井A4之外。代码24表示一个井含有没有定义边缘的测试表面。这可能是由于边缘位于成像区域的外面，塑料井边的反射，芯片边缘和拐角不是清楚的线的带有阴影或者破损的芯片导致的。这个例外，A4井，在所有的实验除了实验3之外都被一样地解释。来自制造商的额外的胶水提供了一个零星发生的问题，该问题是与定位在载体内部的测试表面的过程同时出现。

对于量化数据分析，野生型的变异系数(“CV”)值对每个实验都计算，同样也对所有实验在一起计算。这似乎不是一个错配类型到产生的错误类型的相关系数。例如，实验1(正常)排列产生一个错误而实验4(网格位于斑点下方)没有失败。所有的错误(除了井A4，实验3)都是属于为“差芯片”准备的24型。这些是没有清楚定义边缘和拐角的的测试表面。4个拐角的井如此扭曲产生的阴影/反射效应在这些案例中影响了边缘。这是一个属于斑点寻找算法范围之外的话题了。

不同结果的CV值遵循一个类似的趋势。所有实验的平均值之间的CV被展现在图14中，最大的偏差达到1.2％。这个结果表明针对井位于图像的不同位置的解释的同等性。

图15说明每个单独实验的强度比例(背景对信号)。同样，这个数据遵循一个类似的趋势。最大的偏差是位于斑点711+1，其中对于实验3的比例几乎比实验5要的0.2个单位。如果考虑更多数据预计这个差异会更加确定。

图16表示的是同源斑点的同样的图。这里最大的差异是实验3和实验8之间的差异，数量为0.04个单位。

上面所示的差异处于再现性研究所期待的差异之内。这说明了当斑点不在期望范围中时，该斑点寻找算法仍然能够定位这些斑点。

在不同位置中发现斑点的灵活性，以及在低于理想状况下对于上面所述的不同放大倍数的灵活性，表明了在整个过程中并入该算法是一个改进。

在此，以引用方式将本文提到或引用过的论文、专利和专利申请、以及所有其他文献和电子版信息的全部内容并入本文，就像单独地将每个文献以引用方式并入本文一样。申请人保留将来自任何这样的论文、专利、专利申请、或者其他文献信息物理地并入本申请中的权利。

本文已示例性地描述了本发明，但是在缺少任何一个或多个元素或限制情况下仍可能实施本发明，尽管这在本文中没有具体公开。因此，例如“组成”，“包括”，“含有”等术语应被广意地、没有限制地理解。另外，本文所用的一些术语和表达方式已经被用作描述性的非限制性术语，在使用这些术语和表述方式的过程中，并无意排除所示和所述特征或其某些部分的任何其他等同物，而且应该认识到的是，各种的修改都有可能落入本发明所要求的保护范围之内。因此应该理解的是，虽然已经通过优选实施方式和可选特征具体地公开了本发明，但本领域技术人员能够对本文所公开的发明进行修改和变化，而这样的修改和变化应被认为是在本发明的范围之内。

本文已经广泛地、一般性地描述了本发明。任何落入该一般性公开范围之内的较窄具体形式和下位集合也是本发明的一部分。这包括本发明的一般性描述具有从类别概念中去除任何主题内容的条件性或否定性限制，而无论所排除的内容在本文中是否有明确记载。

其他实施方式落入所附权利要求的范围之内。另外，在以马库什组合的形式来描述本发明特征或方面的地方，本领域技术人员将会意识到，本发明也由此以马库什组合中的任何单独成员或者成员子集的形式被描述。

Claims (38)

1.一种识别测试表面上阵列位置的方法，其包括：

a)获取所述测试表面的电子图像；

b)对所述图像进行正方形化，从而使像素的各个列和行分别被定向成一种基本垂直和水平的方式；

c)对所述图像上所述列和行的网格进行定位；并

d)利用一个信号强度阈值对所述图像进行二进制化，从而识别所述网格上的斑点位置。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述进行正方形化的步骤包括：

检测所述图像的边缘；并

旋转所述图像。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述检测边缘的步骤包括：

为所述图像中的一组像素列形成像素和的第一向量；

为所述图像中的一组像素行形成像素和的第二向量；

生成所述第一和第二向量的一阶导数的平方；并

检测所述一阶导数的平方的峰值。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述定位网格的步骤包括：

检测对应于所述网格的行和列的信号峰值的一个网格。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述检测信号峰值的一个网格的步骤包括

生成像素和倒数的二阶导数；并

定位所述二阶导数的最小值。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述二进制化步骤采用一种自适应阈值。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述自适应阈值是一种平均自适应阈值。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述自适应阈值是一种中值自适应阈值。

9.根据权利要求1所述的方法，进一步包括：

e)使所述网格与一个默认网格相关，所述网格对应于所述阵列。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述相关包括：

f)使步骤e)中定位的每个所述斑点的中心与所述默认网格中的一个斑点相关。

11.根据权利要求10所述的方法，其中步骤f)包括：

确定所述默认网格中所述斑点处的一个信号是否对应于步骤d)中定位的所述斑点中一个斑点的所述中心；并且

当所述确定的结果为否时，使所述斑点相对于所述默认网格回到中心。

12.根据权利要求1所述的方法，进一步包括：

d)对步骤d)中定位的所述斑点进行霍夫变换，从而为所述阵列估计所述斑点与一个期望斑点的相关性。

13.一种识别测试表面上阵列位置的方法，其包括：

a)在两个基本垂直的方向上为一个图像生成梯度；

b)生成对应所述生成梯度的平方梯度大小；

c)利用所述平方梯度大小的阈值对所述梯度大小进行二进制化；

d)基于所述梯度生成一个变换图像；

e)利用为步骤d)的变换计数得到的最大票数的阈值，将所述图像二进制化，从而产生一个阈值化变换图像；

f)在所述阈值化变换图像中检测连续的像素组；

g)构建对应于所述阵列一个布局的网格；

h)测量所述网格的各个斑点位置的信号强度；并

i)生成一个斑点位置和强度表格，所述斑点位置表明了斑点中心。

14.根据权利要求13所述的方法，进一步包括：

在步骤a)之前检测所述测试表面的边缘；并

将所述图像裁剪至所述边缘。

15.一种程序产品，其包括使机器执行下列方法步骤的机器可读程序代码：

a)对所述测试表面进行正方形化处理，从而使像素的各个列和行分别被定向成一种基本垂直和水平的方式；

b)定位所述图像的所述列和行的一个网格；并

c)利用一个信号强度阈值对所述图像进行二进制化，从而识别所述网格上的斑点位置。

16.根据权利要求15所述的程序产品，其中所述正方形化的步骤包括使机器执行下列方法步骤的程序代码：

检测所述图像的边缘；并

旋转所述图像。

17.根据权利要求16所述的程序产品，其中所述检测边缘步骤包括使机器执行下列方法步骤的程序代码：

为所述图像中的一组像素列形成像素和的第一向量；

为所述图像中的一组像素行形成像素和的第二向量；

生成所述第一和第二向量的一阶导数的平方；并

检测所述一阶导数的平方的峰值。

18.根据权利要求15所述的程序产品，其中所述定位网格的步骤包括使机器执行下列方法步骤的程序代码：

检测对应于所述网格的行和列的信号峰值的一个网格。

19.根据权利要求18所述的程序产品，其中所述检测信号峰值的一个网格的步骤包括使机器执行下列方法步骤的程序代码：

生成像素和倒数的二阶导数；并

定位所述二阶导数的最小值。

20.根据权利要求15所述的程序产品，其中所述二进制化步骤采用一种自适应阈值。

21.根据权利要求20所述的程序产品，其中所述自适应阈值是一种平均自适应阈值。

22.根据权利要求20所述的程序产品，其中所述自适应阈值是一种中值自适应阈值。

23.根据权利要求15所述的程序产品，其中所述程序代码使机器进一步执行下列方法步骤：

d)使所述网格与一个默认网格作相关，所述网格对应于所述阵列。

24.根据权利要求23所述所述的程序产品，其中所述相关包括使机器执行下列方法步骤的程序代码：

e)使步骤c)中定位的每个所述斑点的中心与所述默认网格中的一个斑点相关。

25.根据权利要求24所述的程序产品，其中步骤e)包括使机器执行下列方法步骤的程序代码：

确定所述默认网格中所述斑点处的一个信号是否对应于步骤c)中定位的所述斑点中一个斑点的所述中心；并且

当所述确定的结果为否时，使所述斑点相对于所述默认网格回到中心位置。

26.根据权利要求15所述的程序产品，其中所述程序代码使机器进一步执行下列方法步骤：

d)对步骤c)中定位的所述斑点进行霍夫变换，从而为所述阵列估计所述斑点与一个期望斑点的相关性。

27.一种程序产品，其包括使机器执行下列方法步骤的机器可读程序代码：

a)在两个基本垂直的方向上为一个图像生成梯度；

b)生成对应所述生成梯度的平方梯度大小；

c)利用所述平方梯度大小的阈值对所述梯度大小进行二进制化；

d)基于所述梯度生成一个变换图像；

e)利用为步骤d)的变换计数得到的最大票数的阈值将所述图像二进制化，从而产生一个阈值化变换图像；

f)在所述阈值化变换图像中检测连续的像素组；

g)构建对应于所述阵列一个布局的网格；

h)测量所述网格的各个斑点位置的信号强度；并

i)生成一个斑点位置和强度表格，所述斑点位置表明了斑点中心。

28.根据权利要求27所述的程序产品，其中所述程序代码使机器进一步执行下列方法步骤：

在步骤a)之前检测所述测试表面的边缘；并

将所述图像裁剪至所述边缘。

29.一种测试表面载体，其包括

多个凹穴，其中每个凹穴被配置成容纳一个离散阵列化光学薄膜测试表面，并在所述测试表面之上提供一个体积以在所述凹穴内容纳液体，并且其深度被配置成去除图像分析过程中的干扰；以及

位于每个所述凹穴内的阵列化光学薄膜测试表面，所述阵列化光学薄膜测试表面包括多个离散测试位置，所述离散测试位置包括一个捕捉试剂检测位置以及一个或多个基准位置。

30.一种测试表面载体，其包括：

一个用于图像分析应用的无光泽表面，其中所述无光泽表面减少来自所述测试表面载体的伪反射。

31.一种测试表面载体，其包括：

多个凹穴，用以接收多个测试表面；以及

在每个凹穴处的一个或多个图案化识别目标，其中所述图案化识别目标改进了每个凹穴内一个或多个测试表面的放置。

32.根据权利要求31所述的测试表面载体，其中所述图案化识别目标用于在一个自动化生产过程中放置所述测试表面。

33.根据权利要求31所述的测试表面载体，其中所述图案化识别目标是光滑的。

34.根据权利要求31所述的测试表面载体，其中所述图案化识别目标是一个几何形状。

35.根据权利要求34所述的测试表面载体，其中所述几何形状是一个圆。

36.根据权利要求31所述的测试表面载体，其中所述图案化识别目标被用于图像分析过程，以识别、定位、确认距离、以及对准所述凹穴。

37.一种测试表面载体，其包括：

多个凹穴，用以接收多个测试表面的；以及

所述凹穴内的对准肋条，其中所述对准肋条用于支撑所述测试表面；

其中所述对准肋条在所述测试表面载体的生产过程中控制所述测试表面在所述凹穴内的定向或偏斜。

38.一种测试表面载体，其包括：

多个凹穴，用以接收多个测试表面；以及

所述凹穴内的扩展窗框特征，其中所述扩展窗框用于支撑所述测试表面；

其中所述扩展窗框造成一个凹坑以容纳胶水，其中在所述测试表面载体的生产过程中，所述胶水的液面是通过相对于所述凹穴中所述扩展窗的机器视觉处理来控制的。

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