CN1275030C - 用于样品椭圆偏振光二维显示的装置,显示方法及具有空间分辨率的椭圆偏振光测量方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于样品椭圆偏振光二维显示的装置,上述样品安放在一入射介质中,在通过会聚光反射交叉的分析器和偏振器之间观察,其中处理由样品和一个衬底所形成的组件的椭圆偏振参数,上述样品安放在衬底上。衬底包括一个基底和一个基底叠层,并且衬底的椭圆偏振性能已知。衬底的椭圆偏振性能是这样的,即可以在其对比度高于没有上述衬底所产生的对比度的情况下显示样品椭圆偏振参数的变化。本发明还涉及一种显示方法和一种具有空间分辨率的椭圆偏振测量方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于样品椭圆偏振光二维显示的装置,一种显示方法及一种具有空间分辨率的椭圆偏振光测量方法。它尤其是适合于用椭圆偏振光对比度或干涉对比度显示。
背景技术
一种接收光和反射光的样品一般将改变其偏振。
可以采用这种性能来观察样品或者通过测量其偏振参数来表征所述样品,上述偏振参数一般用ψ和Δ表示。
在这方面,可以例如参见Azzam和Bashara在1979年出版的书。
起初,已经发现在Brewster角之下处理Fresnel系数的消光rp,可以提供准确的参数ψ和Δ的椭圆偏振光测量结果(椭圆偏振光测量法)或者提供很薄的薄膜特别是在水的表面处的灵敏显示(Brewster角显微法)。
此外,已经发现在一个入射光和一个方位下照射样品的一个区域,可以测量对应这个区域的参数ψ和Δ。
在本发明范围内的目的是提供对样品的许多点同时处理参数ψ和Δ的技术,上述点每个都由它们的坐标x,y限定。这叫做样品的椭圆偏振光二维显示或测量。
另外,本发明涉及可以在光学反射显微镜下观察,显示或测量的小样品。上述显微镜可以是常规显微镜,具有差分干涉对比的显微镜或荧光显微镜。
这类显微镜观察提出了特别的限制,因为一方面,显微镜透镜具有一大数字的孔径,所述大数字的孔径形成与常用椭圆偏振测量条件大不相同的观察条件,常用测量中光束,照明光束及测量光束(反射光束)一般是小孔径对准光束,和另一方面,在照明光束是最经常围绕正入射均匀分布处,亦即在入射角范围内,几乎不适合用椭圆偏振法。
还有,以前已经提出基于使用一种防眩衬底的显示方法,但它们依靠衬底的“非相干反射率”。以前所提出的那些衬底因此用于非偏振光或用于相对于入射面具有固定偏振方向的偏振光的防眩。这是与显微镜的使用不相容的。原理是基于方程(E4)等号右端的极小化。
式中rp和rs是衬底上每个偏振的复合反射系数,对其产生的影响简单取决于x和y,ΦN(θ,NP)是非偏振光中用于入射角θ反射的归一化通量。
显然,完全消光仅是对|rp|=|rs|=0才可能,这是一个极端严格的条件,因为二者的Fresnel系数值都是设定的。完全消光的条件,即|rp+rs|=0远远更为灵活,因为它唯一转变成Fresnel系数之间的关系,
rp=-rs E6
还提出了一些用于偏振光的防眩衬底,以便增强椭圆偏振仪的性能,但直到目前还认为椭圆偏振法和光学显微法不相容。
因此本发明的目的是提供一种物体的椭圆偏振光二维显示,所述物体具有很小厚度,在光学显微镜下可在已知与使用市售光学显微镜相容的观察条件下无法进行目测。
尽管这样,按照本发明,能够在显微镜下同时目测物体及测量物体的厚度和指数。
为此,将所研究的物体设置在一个特定的衬底上,所研究物体与衬底的组合形成详细研究之下的组件,我们称之为样品。衬底设计得便于所研究的物体即使很薄,也因它的存在而足以改变衬底的外观,因而导致物体的显示。
这样看来,衬底包括一个基底,所述基底用一个叠层覆盖,以便一方面,最后一层的厚度e证明条件d2/de2[ln|rp+rs|]=0,及另一方面,在e值集上量|rp+rs|的最小值是尽可能小。
同样,物体的存在在这些条件下足以改变在某种意义上于光学显微镜下可测量的衬底参数ψ和Δ,以便可以从样品的测得参数ψ和Δ中提取出物体的光学特性。
因此,设计衬底,以便对小入射角来说样品的参数ψ和Δ对其构成参数的小波动的灵敏度很大,因此与Brewster角有很大不同,另外,设计所提出的显示和测量方法,以使显微镜的径向几何结构变得可与处理这些椭圆偏振光特点相容。
在一个优选实施例中,提供一种差分干涉显微镜(DIC)(利用一种插入透镜后焦面附近的装置,例如Normarski装置或Smith装置),按照方位角_=0线性偏振的照明光束被DIC装置分裂成两个线性偏振的光束,所述两个线性偏振的光束按照方向_=45°和_=-45°并彼此相对横向偏移一个小量Δd,与这两个偏振有关的两个波面在样品上反射时,由于存在或缺少物体的均匀性而经历相位变化,因而在反射光束返回时进入DIC装置之后,然后在与偏振器交叉连接的分析器中,这些相位变化转变成颜色或强度变化。在这种观察方式中,物体的对化度由于调节包括在DIC装置中补偿镜而优化。这种调节包括切断由样品非感兴趣区域所反射的两个光束之间的干涉,而同时调节在它们产生干涉的装置处亦即分析器处的相移,因而这个消光量调节显示的量。这种消光的数学条件与前面所述相同,亦即rp+rs=0。在这种观察方式中,叠层最后一层厚度e上最大灵敏度的条件是d2/de2[ln|rp+rs|]=0。
因此所提出的显示方法对于在显微镜下交叉连接的偏振器和分析器之间的所有观察都是全局最优的,即使在显微器中包括DIC装置时也如此。
因此本发明涉及一种用于样品椭圆偏振光二维显示的装置,所述样品包括物体,它安放在一种入射介质中,在一会聚光交叉反射的分析器和偏振器之间观察,其中处理包括物体和该物体安放于其上的衬底这一组件的各椭圆偏振光参数。
发明内容
按照本发明:
衬底包括一个基底和一个叠层,并且它的椭圆偏振性能已知,
衬底的椭圆偏振性能是这样,即由于物体以对比度大于没有这种衬底时所产生的对比度显示而使样品的椭圆偏振参数发生变化。
本发明还涉及一些特点,这些特点在下面的说明中将看起来很清楚,并且这些特点将单独考虑或是按照它们所有技术上可能的组合考虑:
穿过一个大孔径透镜如显微镜透镜照射样品,
显微镜是一种具有差分干涉对比的显微镜,
显微镜是一种荧光显微镜,
本实施例对于显示或检测具有毫微米尺寸的物体最有效。因此目的是在没有解的情况下显示。它尤其能目测所有各个的线形物体,亦即一个其量远大于显微镜横向分辨率,其长度大于1微米(聚合物,微细管道,胶原,脱氧核糖核酸(DNA),核糖核酸(RNA),碳毫微米管,毫微米线等)。
与物体接触的叠层厚度e可以使衬底的复合反射系数rp和rs证明条件d2/de2[ln|rp+rs|]=0,
衬底的光学性能可以使在整个e值组范围内量|rp+rs|所取的最小值尽可能小。
-装置包括一个多色光源,
-装置包括一个单色光源,
-基底是在硅中,
更一般地说,基底有利地是一种吸收介质,一种金属或一种半导体,它们的光学折射率的实数部分大于3.3,
-叠层包括一个单层,
-这层有利的是一种包括SiO/SiO2按适当比例配成的混合物的无机物,
-这层是二氧化硅层,
-二氧化硅层的厚度约为1025_,入射介质简单地是空气,
-这层是氟化镁层,
MgF2层的厚度约为1055_,入射介质简单地是空气,
-这层是一种聚合物层,
-这层是一种具有光学指数基本上等于1.343的聚合物层,入射介质简单地是空气,
-这层是一种具有光学指数基本上等于1.74的无机物层,入射介质简单地是空气,
-这层是一种具有光学指数基本上等于1.945的无机物层,入射介质简单地是具有光学指数为1.5的油,
-这层是不连续的,由二氧化硅试块组成并且指数为1.343,所述二氧化硅试块的相同高度描述为该层的厚度并且剖面尺寸显著小于10微米,入射介质简单地是空气,
-这层是一种具有指数基本上等于1.343的间隙孔或毫微米孔的无机或有机层,入射介质简单地是空气,
-这层是一种具有指数基本上等于1.343的无机气凝胶,入射介质简单地是空气,
-装置包括一个显微镜,所述显微镜包括一个取纵向缝隙形式的孔径光阑,所述孔径光阑可围绕显微镜的轴线调节,它能把照明锥体限制在选定方向上的一个入射面上,
-装置包括一个显微镜,所述显微镜包括一个取环件形式的孔径光阑,所述孔径光阑围绕入射角限制样品的照明锥体,
-物体是一种薄的膜,并且叠层包括一个斜切层,所述斜切层的厚度沿着表面在x方向上以单调的形式变化。
这个方法和这种显示装置可相容,并可以有利地加到任何光学扫描显微法上,加到任何不可见光的光学技术(紫外或红外)上,加到任何光谱法技术上,加到非线性光学技术上,加到任何扩散或衍射技术上,及加到所有它们的组合上。它们尤其是可与荧光技术,微-Raman微技术,共焦显微镜技术,双光子显微镜技术相容,及与所有它们的组合相容。
用荧光显微镜实施本发明尤其有利。实际上,由荧光样品发射的光偏振作用与入射光束的偏振作用常常不同。因此荧光标记物造成光的消偏振,在消偏振时本发明的装置特别灵敏。而且,本发明的装置自身入射光的消光因子显著减少了伴随荧光信号的噪音。
最后,用荧光显微法实施本发明能在同样的荧光物中识别使光消偏振,相应于很独特分子环境的那些荧光物。
这种实施方法用于观察埋入荧光介质中的那些表面特别有效。它可以有效地用于阅读生物芯片的荧光信号,其中包括观察杂化动力学。
本发明还涉及一种测量方法,其中:
-显示装置平行于方向X切成两个元件,
-将一个薄膜设置在这些元件的其中之一上,
-将两个元件安放在偏振显微镜下方的交叉反射式偏振器和分析器之间,所述偏振显微镜用多色光照明,以便在每个元件上都形成彩色干涉条纹,
-测量分别在每个元件中形成的条纹的偏移,以便由其得到设置在每个元件上的层性能。
本发明还涉及如上所述的样品显示装置,其中衬底是Petri箱的底部。
本发明还涉及如上所述的用于显示样品的装置,样品是一种多传感器矩阵,而矩阵的每个试块或试片都可以形成叠层的最后一层。这种多传感器可以是一种细菌芯片,病毒芯片,抗原芯片,抗体芯片,蛋白质芯片,DNA芯片,RNA芯片或染色体芯片,因而所述装置构成一种平行阅读装置。
本发明还涉及一种用于椭圆偏振法测量样品的方法,所述样品在偏振显微镜下具有空间分辨率,而偏振显微镜形成样品的图片,其中:
-样品用一照明光束照射,所述照明光束通过一个孔径光阑进行线性偏振,
-用一个偏振器-分析器分析样品所反射的光,其特征在于它的偏振方向相对于偏振器偏振方向的相对取向φ,
-通过照明光束和偏振器-分析器的偏振的相对旋转调制所反射的强度,
按照这种方法:
-照明光束的孔径光阑是一个环件,所述环件定心在一个入射角的光束轴线上,
-在样品所得图片的每个点处同时测量平均反射通量φM(x,y)及其调制幅度φm(x,y),
-处理测量结果φM(x,y)和φm(x,y),以便在样品的每个点根据下列公式同时由其得到椭圆偏振参数Ψ(x,y)和Δ(x,y)及反射系数|rs|2(x,y)的两种组合:
-处理测量结果φM(x,y)和φm(x,y),以便根据下面公式由其得到单个椭圆偏振参数Ψ(x,y)和Δ(x,y)的组合sin(2Ψ)cos:
φm=φM(1-sin(2ψ)cosΔ)
可能,在测量步骤中:
-分析器相对于偏振器的取向设定到一个与π/2模π不同的值,
-照明光束的孔径光阑是一种可围绕安装在图示一个入射角的环件上的显微镜的光轴线调节的缝隙,
-对缝隙至少两个不同的和非冗余的取向测量反射光束的强度,
-根据下面关系度处理这些强度测量结果:
-在样品的每个点处同时由其推导得到椭圆偏振角Ψ(x,y)和Δ(x,y)二者的值及反射系数模|rp|和|rs|的那些值,
可能,在补充步骤中:
-分析器固定在一个非垂直于偏振器的取向中,例如φ=0,
-照明光速的孔径光阑是一种可围绕安装在描述一个入射角的环件上的显微镜光轴调节的缝隙,
-测量对缝隙的两个取向_=0和_=π/2反射的强度,
-按照下面三个公式处理这些强度的测定结果,以便得到tanΨ,同时
求它们比值的平方根:
可能,在测量步骤中:
-将分析器相对于偏振器的取向设定到一个与π/2模π不同的值,
-通过光阑D围绕光轴旋转调制反射的强度,
-在样品的每个点处同时测量平均反射通量φM(x,y)及其调制幅度φm(x,y),
-根据下面的关系式处理测量结果φM(x,y)和φm(x,y),以便由其得到椭圆偏振角Ψ(x,y)和Δ(x,y)二者及反射系数的模数|rp|和|rs|:
可能,在补充步骤中:
-将分析器相对于偏振器的取向设定到φ=0,
-通过光阑D围绕光轴旋转调制反射的强度,
-在样品的每个点处同时测量平均反射通量φM(x,y)及其调制幅度φm(x,y),
-根据下面关系式处理测量结果φM(x,y)和φm(x,y),以便由其得出椭圆偏振角Ψ(x,y)和Δ(x,y)二者及反射系数的模数|rp|和|rs|:
本发明还涉及一种用于样品椭圆偏振光测量的方法,所述样品在偏振显微镜下具有空间分辨率,上述偏振显微镜形成样品的一个图片,其中:
-样品用一照明光束照射,所述照明光束通过孔径光阑线性偏振,
-用偏振器-分析器分析样品所反射的光,其特征在于它的偏振方向相对于偏振器偏振方向的相对取向φ,
-通过照明光束和偏振器-分析器的偏振的相对旋转调制反射的强度,
按照这种方法:
-照明光束的孔径光阑是一种定心在这个光束轴线上的圆盘,
-在样品所得到的图片每个点处同时测量平均反射量φM(x,y)及其调制幅度φm(x,y),
-处理测量结果φM(x,y)和φm(x,y),以便根据下面公式在样品每个点处由其同时得到有效椭圆偏振参数Ψeff(x,y)和Δeff(x,y)及有效系数反射|rseff|2(x,y)的两种组合,
-处理测量结果φM(x,y)和φm(x,y),以便根据下面公式由其得到单个有效椭圆偏振参数Ψeff(x,y)和Δeff(x,y)的组合sin(2Ψ)cos:
本发明还涉及一种用于在具有横向空间分辨率的显微镜下椭圆偏振光测量的装置。
按照这种装置:
-它只包括一个偏振器,该偏振器安放在照明镜和样品之间在透镜的无论哪一侧上,
-它包括一个缝隙,所述缝隙在它的孔径光阑平面中旋转,上述缝隙安装在一个环形光阑上,以便能通过下面公式利用缝隙三种不同取向的至少三个测量结果提取出样品的椭圆偏振参数:
加到这三个测量结果上,其中参数rs,Ψ和Δ可以是在存在的所有入射角范围内平均所得的有效参数:
按照这种装置:
-偏振器和分析器具有一个设定的相对取向,
-孔径光阑是一个孔或一个环件,
-透镜后焦面的图片通过Bertrand透镜在目镜的焦面物体中形成,
-一个电荷耦合器件(CCD)摄像机设置在这个焦面中,
-利用下面的通用公式处理在CCD摄像机每个点处得到的强度测量结果:
以便直接得到样品的椭圆偏振参数组。
按照这种装置:
-反射强度的调制通过分析器和偏振器的相对旋转得到,
-孔径光阑是一个孔或一个环件,
-透镜后焦面的图片通过Bertrand透镜在目镜的焦面物体上形成,
-将一个CCD摄像机或者可能是三镜头CCD摄像机设置在这个焦面中,
-利用下面的通用公式处理在CCD摄像机的每个点处或者可能是在三镜头CCD摄像机每个点处及每个色成分得到的强度测量结果:
以便直接得到样品的椭圆偏振参数组。
按照这种装置:
-透镜后焦面的图片通过Bertrand透镜在目镜的焦面物体中形成,
-将一个CCD摄像机设置在这个焦面中,
-利用下面通用公式处理CCD摄像机每个点处得到的强度测量结果:
以便直接得到样品的椭圆偏振参数组。
摄像机是一种三镜头CCD彩色摄像机,并且在每个点处时对每种色进行强度测量和处理。
有利的是,所研究的物体安放在一个衬底上。与上述物体接触的叠层厚度e同以使衬底的复合反射系数rp和rs证明条件d2/de2[ln|rp+rs|]=0
优选的是,物体安放在一个衬底上,所述衬底光学性能是这样,即可以使在整个e值组范围内量|rp+rs|所取的最小值尽可能小。
附图说明
下面将参照附图更准确地说明本发明的一个实施例,其中:
图1和2限定光相对于传播矢量K的偏振参数P和S及在光学系统中半径的取向参数,即入射角θ和方位角φ;
图3示出与显微镜透镜相对的样品;
图4是按照本发明所述操作的偏振显微镜示意图;
图5是按照本发明所述厚度直接测量装置的示意简图;
图6A和6B是在本发明的某些实施中实施的多传感器显示装置的图示。
具体实施方式
现在将用图1和2中的标记说明本发明,图1和2中P是由样品上入射角θ一个半径所传送的光的偏振矢量。
此外,用样品1意思是指影响测量的组件。这个样品通过一个入射介质3与透镜2分开,它包括从入射介质开始依次为一个研究的物体4(应当显示的一个),一个叠层5和一个基底7,叠层5的最外层6是与样品接触的这层。叠层和基底7形成衬底8。
图4A和4B是表示可按照本发明使用的装置;类似元件用相同标号表示。
因此将假定是平面和各向同性的样品1放在一个反射操作的光学显微镜下。显微镜装配有一个透镜10和一个K_hler型照明系统,所述照明系统包括至少两个透镜12和13及一个孔径光阑或光瞳14,该照明系统通过透镜10后焦面的透镜13共轭,在图4A上用虚线表示。偏振器P通过半反射板15使射向样品的光偏振。偏振器P的方向用作参考。由物体发送的光经过分析器A处理。
图4B相应于差分干涉对比(DIC)显微镜,它包括一个偏振元件16,所述偏振元件16或是一种Wollaston双棱镜,或是一种Nomarksi棱镜和补偿镜。
此外,正如已知的,它还能用圆偏振代替线偏振。
因此,代替交叉连接的偏振器和分析器,将有半透明镜,第一偏振器,四分之一波(λ/4)板,透镜,样品,然后作为一种反馈,再是透镜,λ/4板,上述偏振器和半透明镜。
在差分干涉对比(DIC)显微镜情况下,那么将有半透明镜,偏振器,偏振元件,λ/4板,透镜,然后作为一种反馈,再是透镜,λ/4板,偏振元件,上述偏振器和半反射镜。
半径的入射角是θ。显微镜装配一个线性偏振器和一个分析器,它们位于光路上样品的无论哪一侧。照明是反射投影和单色光。分析器是旋转式并与偏振器形成一个角φ。归一化的反射通量ΦN作为反射通量与参考能量之比来度量。参考通量是一假定完全反射的样品情况下,没有偏振器和分析器时简单调节的同一台仪器上所得到的通量。完全反射的样品通过对平行(P)偏振和垂直(S)偏振的Fresnel复合系数定义为rp=rs=1。对任何角φ:
在特定情况下,当偏振器和分析器交叉连接(φ=π/2)时,这个公式简化为:
公式(E1)的等号右端可以直接解。它包括两项:
第一项即cos2φ(|rp|2+|rs|2)是消光系数的积和强度反射系数的积,它们现在将称之为反射率。这种反射率可以量化为“非相干平均反射率”,因为它通过忽略rp和rs之间亦即平行反射分量和垂直反射分量之间的干涉,及通过将所有可能的方位角_亦即相对于偏振器方向入射的所有可能的平面取向进行平均得到。简约到它的第一项,则方程(E1)提供通过颠倒光路上样品和分析器的顺序得到的反射,因为表面在这里只起吸收元件的作用。当φ=π/2时,这个第一项统统消失:在交叉连接的偏振器和分析器之间,在没有(消)偏振元件时,没有什么东西通过。
方程(E1)的第二项说明了rp和rs之间的干涉。它将叫做“相干反射率”。它表示入射光束通过表面的消偏振作用,上述偏振作用使线性入射偏振转变成椭圆偏振。这个椭圆率对每个方位,亦即对每个由其与偏振器方向的夹角_所限定的入射平面都不同,并且这个第二项说明平均反射率,所述平均反射率由照射的锥形几何产生。对于φ=π/4它消失,此处所有方位角的影响相互抵消,并且对于rp=-rs它也消失。它降低了平行的偏振器和分析器之间的总反射率,而当它们交叉连接时则使它们增加。
显示技术,本发明的目的,直接处理这个第二项。我们选择φ=π/2,并且(E1)的第二项保持只存在一个。消光,或者是在一种更精制的型式中,非相干反射率的准消光是本发明的基础之一。叫做“相干反射率”的东西也可以叫做“椭圆偏振反射率”,因为它由反射偏振的椭圆率(方位角_的函数)产生。
与(E1)等效的公式是:
这个公式能将存在偏振元件时得到的信号与没有偏振元件时亦即非偏振光时得到的信号进行比较,上述没有偏振元件时得到的信号只由第一项提供。它表示为:
在存在偏振器时,仍能通过令φ=π/4用实验方法接近这个量,如方程E3所示。
为了显示所研究物体4的边缘,将所研究对象以薄膜形式安放在表面上,通过观察薄膜和裸露表面处理所收集的强度,薄膜和裸露表面分别用lf和ls表示。它们与相应的规一化通量成正比。
薄膜边缘的对比度是:
为了正确地显示薄膜,应当将C优化,因此If/Is之比值应变成最大(Is→0,趋向于对比度为1)或最小(If→0,趋向于对比度为-1)。然后必须使表面或薄膜消光。这样,灵敏的过程一方面依赖于正确消光和另一方面依赖于选择性消光。
我们的技术将下面两种消光因子结合:
i)交叉连接或几乎交叉连接的偏振器和分析器,
ii)用于这种观察方式的抗反射衬底。
方程(E3)突出我们消光的双重性质:交叉连接的偏振器和分析器使方程等号右边的第一项消除,我们的抗反射衬底使第二项消除。然后可将它定义为用于相干反射率的抗反射衬底。它是我们显示技术的第二基础。
但良好的消光对灵敏的显示是不够的。If或Is应为消除,但不能二者同时消除。当所显示的薄膜很薄时,因此当它的所有物理参数几乎不干扰裸露表面的那些参数时,意味着消光一定是很关键。换句话说,对表面的很小改变,消光一定失去。我们衬底抗反射质量的这个关键元件是我们显示技术的第三个基础。
一种显示方法的若干性能可以通过在所观察的薄膜变得极薄时所得到的对比度进行量化。在这种情况下,If或Is变得很接近并且dl=If-Is接近一个微分元。
因此C可以写成为:
式中Δe是薄膜当光学指数等同于上层的光学指数能够采取的厚度,及式中dl/de是由裸露的衬底所反射的强度相对于叠层最后一层厚度e的导数。在衬底包括一个用一层介电层覆盖的固体基底的情况下,e是这一层的厚度。对薄膜和最后的介电层采用相同的反射指数不是强制执行,但它简化了说明,并表明我们的方法不取薄膜和衬底之间反射的优点。因此这里可以把薄膜看成是一种最外层的简单厚度波动。
我们技术的灵敏度以_-1为单位表示成C与Δe之比:
对一种覆盖有一层的固体,rp和rs的表示是按常规(例如参见AZZAM):
在K=S或P情况下,按照偏振作用考虑及在
情况下,指数1涉及所述层,指数2涉及基底和指数0涉及入射介质。
这个方程可写成为:
式中бij和Пij分别代表rij(p)和rij(s)的和与积。
和б是λ/2的光学厚度N1e的周期性函数。它的模量|б|一般显示每个周期两个极小和两个极大。对Ln|б|情况相同。而且函数|б|是一种图示函数,它仍然很正则并且它相对于e的导数决不会值得注意。相反,当|б|趋向于0时函数Ln|б|发散,并且当消光是全消光时,方程E7所规定的灵敏在极小的无论哪一侧上绝对值都变得很值得注意。对比度在极小的左手侧总是负的和在右手侧总是正的。结果得到极小的条件将被称为“对比度反转条件”。
总之,快的对比度反转转化因此相应于|rp+rs|相对于e的极小,而很快对比度反转是在|rp+rs|的这个极小趋向于0时得到。
方程E3示出了使用荧光显微镜的意义:在存在荧光信号时,这个荧光的消偏据分量加到方程(E3)的等号右边而不改变其它两项的消光。于是信号/噪音增加。这也可以转换成Raman信号。
本发明还涉及椭圆偏振光测量法,该方法不需要依靠特定的衬底也可以操作。
椭圆偏振角Ψ和Δ定义为
在下面4个方程中任选的2个方程都足够确立在反射率的椭圆偏振参数之间是有用的匹配:
|rp|2+|rs|2=|rs|2(1+tan2ψ) E11
|rp+rs|2=|rs|2(1+tan2ψ+2tanψcosΔ) E12
|rp-rs|2=|rs|2(1+tan2ψ-2tanψcosΔ) E13
这些方程中第一个方程表明椭圆偏振参数Ψ可通过测量非相干反射率达到。其余三个方程每个都表明第二椭圆偏振参数Δ确定也要求测量相干反射率(或两个反射率的组合)。利用相干反射率信号能够确定Ψ和Δ。
测量按两个步骤进行:
i)第一步基于分析器的旋转。通过一个CCD摄像机或任何其它的两维检测器分析样品的图片。方程E3表明,所反射的信号以正弦波形式围绕非相干反射率振荡,对角度φ振荡幅度为|rp-rs|2和周期为π。各种操作要求至少两次测量,上述操作能得到三个参数|rs|2,tanΨ,和cosΔ的两种组合,例如|rs|2(1+tan2Ψ)和2|rs|2tanΨcosΔ。这已经能确定各单个椭圆偏振参数的组合Sin2ΨcosΔ,但不足以分开确定Δ和Ψ。
ii)第二步要求中断照明的径向对称,这可以用两种方式实施:
或是通过改变孔径光阑的实际几何开形状,所述孔径光阑必须变成一个缝隙或者一种由两个垂直缝隙组成的十字,或者一个角形扇体δ_(模π),所述扇体δ_严格地小于π/4,其顶点与光学轴线或2个或4个相同角形扇体的连接混淆,上述角形扇体围绕显微镜的光轴规整地间隔开,能作为分析器绕显微镜的光轴旋转,或者是通过分析孔径光阑的共轭面中存在的强度分布,上述孔径光阑安放在反射光的光路上,显微镜用Korhler照明。显微镜装配有CCD摄像机以便摄取样品的图片,这种分析可以很简单地通过把一个Bertrand透镜放入摄像机的透镜和光瞳之间进行。因此它是一种锥光偏振测量。对这种容易实施的解决方案感兴趣的是,入射角θ和方位角_在共轭平面中是两个能从布局上分开的参数,并且然后可以得到整个函数ΦN(θ,_,λ),同时λ指定是照明光束的波长。通过数字装置可以调节所保持的孔径角范围,探测方位角,或对照明滤光。这种解决方案还能在没有Bertrand透镜时同时在一不均匀样品的几个区域进行分析的第一步,并因此能通过平行测量确定量(sin2ΨcosΔ)(x,y),对于用Bertrand透镜完成分析,然而还必须用视场光阑或共焦几何学选定样品的均匀区域。因此这种解决方案不能完成样品不同点的平行分析。相反(光阑具有中断的径向对称),第一种解决方案能全部平行分析,因为样品图片总是保持在CCD摄像机上。
当一个很小的角形扇体δ_在照明锥体上选定一特定的方位角_时,通过使方程E1-E4相等所提供的反射强度I现在是:
一般说来,这个强度是周期π的周期性函数_,并且还包括周期π/2的各项。
如果分析器和偏振器的相对取向设定,并且:
-如果缝隙通过一个在频率ω下绕光轴的均匀旋转运动驱动,则将样品每个点所反射的强度进行调制,并且这种调制可以提取出所要求的量|rs|,Ψ和Δ的不同组合。为了那样做,可以实施几种技术,值得注意的是处理与时间有关的强度平均值和极端幅值的光度测量式技术或同步检测技术,所述同步检测技术能将在2ω和4ω处反射的强度分量的幅值和相位进行比较。
-如果缝隙的取向可用人工调节,则可以对至少2个缝隙的几个取向测量收集的强度,以便从上述通用公式推导出各参数|rs|,Ψ和Δ的不同组合值,所述通用公式能完全确定这些参数值;
-如果分析器由绕光轴的均匀旋转运动驱动,则信号1用一周期π(超过φ)调制,并且对不同的_值测量1变得更准确;
-如果最终分析器和缝隙二者都由不同频率下的均匀旋转驱动,则函数1(_,φ)可以完全识别,并且各参数|rs|,Ψ和Δ可以用常规三参数数字调节法进行测定而具有很大准确度。
在最简单的特定情况下,当角φ固定和当测量1是对缝隙的两个取向_=0(模数π)和_=π/2(模数π)进行时,可以分别得到下式:
ΦN(θ,φ,_=0)=1/2|rp|2cos2φandΦN(θ,φ,_=π/2)=1/2|rs|2cos2φ
因此它足以取这两种强度比值的平方根以便得到量值tanΨ。因此这种测量与上述两个测量相结合能完全确定|rs|2,Ψ,和Δ,并因此也能确定|rp|2。
应该注意,单个参数Ψ和Δ的测量可以通过专门采用具有测得强度的比值得到,并因此而不需要用任何参考衬底。
感兴趣的特殊情况是当Φ=0时的情况,Φ=0相应于一种平行的偏振器和分析器,并因此可以从单个偏振器安排在照明镜和透镜之间或甚至安排在透镜和样品之间的情况得到。在这种情况下反射的强度可以写成:
这表明,一旋转光阑包括:一个缝隙;一个十字线,该十字线包括两个垂直的缝隙在它们的轴上相互交叉,一个角形扇体,其顶点安放在显微镜的光轴上及方位角幅度小于45°,或者围绕光轴规则排列的同样类型的两个或四个角形扇体的联结,上述光阑或许安装到一个环件上以便图示一个入射角,它足以用光阑三种不同的和非冗余的取向进行三次反射强度测量,以便由其推导出样品椭圆偏振参数组。例如,在当光阑是一个缝隙或一个很小的用其取向_标出的角形扇体情况下,在样品图片每一点处的反射强度变成:
对于_=0
对于_=π/2
因此它足够计算I1/I2,以便由其得到tanΨ,然后计算I3/I2,以便由其得到cosΔ。
这个实例说明:
-用缝隙的三种不同取向测量三种强度,如何能通过采用专用的强度比,因此不用附加校正,来确定椭圆偏振参数组;
-调制包括这三个测量但还有另一些测量的反射强度如何能在增加准确度情况下得到相同的信息;
-在光学显微镜下或在双目放大镜下一个椭圆偏振仪如何可以通过利用一个偏振器和一个旋转缝隙实现。
当陈述测量方法时,采用适用于一个入射角θ的方程。当|rs|2,Ψ,和Δ取决于θ时,考虑下列方案:或是通过用一个环形孔径光阑得到用于一个角θ的这些量,或是得到在一个入射角范围[θmin,θmax]内平均的量,上述入射角范围最经常情况是θmin=0。
同样的公式应用于有效量,所述有效量加有下标“eff”,根据θ平均值定义。然后必须说明:
因此测量I能确定有效量及尤其是椭圆偏振角Ψef和Δeff,上述有效量可以与计算得的值比较,以便当按常规由一个入射椭圆偏振角进行时由其得到物体或样品的性能。
实际上,该方法的兴趣主要是在显微镜下进行椭圆偏振测量,以便将椭圆偏振光测量和成像结合。因此应该考虑到照明的自然几何学是围绕法线的光锥。另外,各椭圆偏振参数几乎不因小的入射而改变。这说明了为什么椭圆偏振法是在高入射角下唯一灵敏的技术的原因。我们方法的对应部分是,在照明锥体上进行的平均仅是稍微精选可利用的信号。在没有优化的衬底中,在显微镜下进行椭圆偏振光测量的缺点是它的灵敏度差。但正如所提出的在有优化的衬底存在时,对样品实际参数测量的灵敏度再次变得极好,实际上可以围绕Brewster角常规测量的灵敏度相比,因而所利用的信号仍然对入射角不太敏感。这可以解释为因为在交叉式连接的偏振器和分析器之间,相干反射率的消光仍然在法向入射方向上完成,结果只有非零入射参与构成所利用的信号。在非零入射的良好消光条件上,在照明锥体入射组上消光良好。
可以优化最后一层任何材料的厚度。
实际上,现已证明,函数|б(e)|=|rp+rs|仍具有或多或少明显的极小,所述极小相应于对比度反转的情况。该对比度对于e的那些特定值于是为零。另外若是周期性的和连续的,它在这些值的左手侧达到一个极小,而在右手侧上达到一个极大。因此仍可以选择厚度e,以便达到这些极值的其中之一。不管衬底的性质,介电层的厚度都可以通过计算|б(e)|优化。当逐渐变得更接近临界条件时,这变得特别有趣。
各种衬底的临界组成由于存在方程|б(e)|=0的解而被限定。一种临界衬底具有一个接近这种方程解的层厚。方程|б(e)|=0的解必需相应于|б(e)|的一个极小值。因此它是一种对比度反转厚度。这些值当中的最小值ec当然起一种特殊的作用。另一些对比度反转厚度因此由ec,k=ec+KN1λ/2规定。
按照方程E9,所讨论的方程为:
σ01+σ12(1+П01)e-2jβ1+σ01П12e-4jβ1=0 E15
在叠层减少到一层的情况下,e的各ec值是由方程E9推导出的方程E15的解:
σ01+σ12(1+П01)z+σ01П12z2=0 E16
它具有两个复解Z1和Z2,上述两上复解Z1和Z2是入射介质指数,层的指数,衬底的复合指数,及入射角θ0(或者以等效方式,层的折射角θ1)的函数。当这两上解的其中之一模量等于1时,达到临界条件。这个问题用数字研究相当简单。在分析上,可以利用每一项高达θ1中的阶4,因为每一项只有很少取决于接近法线的角。然后可以求出“Taylor-made”解。实际上,常常利用两个极限介质,并且它是应测量的层指数和厚度。然后相对于几个随机相对于厚度给出相对于厚对比度,并可以观察对比度中的单调变化。因此它足以朝当事情改善直至它们质量开始下降时的方向前进。从那以后,围绕最佳值恢复研究而同时细调指数变化。文献中发表的大量结果在Ψ和Δ方面也可以用于单层。所要求的情况同时相应于:
tanψ=1和Δ=π E17
用数值法所求的解与下列经验式非常接近:
特别有趣的结果通过实施硅衬底覆盖满足下列参数的一层得到,照射光优选的是单色并具有波长为λ=540nm,及照明锥体的孔径角采用为30°:
N0 | N3 | N2 | e |
1.00(空气) | 3.88-0.02i | 1.343 | 1060±5_ |
1.34(水) | 3.88-0.02i | 1.749 | 814±5_ |
1.50(油) | 3.88-0.02i | 1.945 | 750±10_ |
当N0环境介质的指数时,N3是衬底的基底的指数,N2是所述层的指数及e是它的厚度。
最优厚度e是λ的一个线性函数,但不能与λ成正比。对于在空气中的观察,
具有指数为1.74和1.945的各层可以用许多种方法如PECVD法淀积物生产。具有指数为1.345的各层更难实现。它们可以用水凝胶,气凝胶,聚合物或是非均匀的,例如用具有固定厚度和具有很小尺寸的块体形成。它还可以是一种水,糖,盐,或聚合物…中的溶液。
用于目测很薄的薄膜光学厚度(N1×e1)的特别有意义的方法可以用如下所述本发明中实施的衬底实现,如图5上所表示的。
在基底20上实现一层具有可变厚度取斜切形式的淀积物21(图5A,图5B)。
然后将这种衬底20切开,以便得到两个相同的元件22,23(未示出的23等同于22)(图5C)。
然后用待研究的薄膜24盖住这些元件的其中之一(图5C)。
在用一个标记,一个切口或楔形件25将这两个元件相对定位在它们的相对初始位置之后,然后在用一个盘形光瞳,白光照射的显微镜下观察这两个元件。
然后分别在每个元件上观察白光条纹26和27,并且它们的相对偏移Δ入能测量淀积在这些元件其中之一上这一层的性能。
本发明特别适合于显示包括在多传感器中的元件。
一种化学或生物(生物芯片)多传感器包括一个基底30,在基底30上淀积若干晶片(=斑点)31,每个所述晶片31由不同层形成,上述不同层能在一种液体混合物(生物芯片)或气体(人工鼻)内选择性地固定待识别的不同物种,并在它们之间形成一个沿着表面排列的元件矩阵。每个晶片都具有几平方微米的表面积和一个常常是分子数量级的厚度。
多传感器使用如下:将它放成与应分析的混合物接触。每个晶片31,32…俘获当它在混合物中存在时可以识别的物种。在现场或是清洗之后,目的是发现已变成加载的试块32和对这些已知混合物组成仍然是空试块31。一个固定的物种形成一个可在试块处目测的过大厚度,试块31,32在矩阵中的位置叙告知所识别物种的性质。这个步骤是多传感器的阅读步骤。
我们的显微术方法足够灵敏,以致能在许多多传感器中显示一空试块和同一试块加载时的差别。因此它提供一种简单的对所有多传感器直接和平行阅读的方法。
在一优选实施例中,它实现在特定类型的多传感器上:生物芯片。它们包括例如DNA芯片,抗体芯片,细菌芯片,病毒芯片,染色体芯片,蛋白质芯片等。
在DNA芯片的实施例中,每个试块都包括一个分子层,所述分子层具有若干能与并且只与它们的互补的链杂化的同样微成核物。待分析的DNA切成合适长度的链,用PCR技术放大,所述放大意思是指每个链都重复大量次数,然后转入与芯片接触的溶液中。所识别的各链用相应晶片固定。
我们的方法能识别加载的晶片。这样看来,采用其厚度规整并已知的晶片作为多层体层的元件,以便包括基底+多层+试片或试块的组件构成一很高灵敏度的优化衬底。在这些条件下,杂化之后附加链的存在很容易通过我们显示方法在观察试片时所包含的强度或颜色加载进行检测。在晶片上存在的材料量也可以通过我们的测定方法定量评估。
Claims (34)
1.一种用于样品椭圆偏振光二维显示的装置,包括一种物体,所述物体发放在一入射介质中,在一交叉反射会聚光的分析器和偏振器之间观察,其中对由上述物体和物体安放于其上的衬底组成的组件的椭圆偏振参数进行处理,其特征在于:
衬底包括一个基底和一个叠层,并且它的椭圆偏振性能已知,
衬底的椭圆偏振性能是这样,即由于物体以对比度大于没有衬底时产生的对比度来显示,所以样品的椭圆偏振参数发生变化。
2.按照权利要求1所述用于样品二维显示的装置,其特征在于:用一个大孔径透镜如显微镜透镜照射样品。
3.按照权利要求2所述用于样品二维显示的装置,其特征在于:显微镜是一种具有差分干涉对比的显微镜。
4.按照权利要求2所述用于样品二维显示的装置,其特征在于:显微镜是一种荧光显微镜。
5.按照权利要求1-4其中之一所述的用于样品二维显示的装置,其特征在于:叠层与物体接触的厚度e是这样的,使衬底的复合反射系数rp和rs验证条件d2/de2[Ln|rp+rs|]=0。
6.按照权利要求5所述用于样品二维显示的装置,其特征在于:衬底的光学性能是这样的,使在整个e值组范围内由量|rp+rs|所取的最小值尽可能小。
7.按照权利要求1所述的用于样品二维显示的装置,其特征在于:它包括一个多色光源。
8.按照权利要求1所述的用于样品二维显示的装置,其特征在于:它包括一个单色光源。
9.按照权利要求1所述的用于样品二维显示的装置,其特征在于:基底是在硅中。
10.按照权利要求1所述的用于样品二维显示的装置,其特征在于:叠层包括一个单层。
11.按照权利要求10所述用于样品二维显示的装置,其特征在于:所述单层为二氧化硅层。
12.按照权利要求10所述用于样品二维显示的装置,其特征在于:二氧化硅层的厚度约为1025_,入射介质简单地是空气。
13.按照权利要求10所述用于样品二维显示的装置,其特征在于:所述单层为氟化镁层。
14.按照权利要求10所述用于样品二维显示的装置,其特征在于:所述单层为一种聚合物层。
15.按照权利要求10所述用于样品二维显示的装置,其特征在于:所述单层为一种具有光学指数等于1.343的聚合物层,入射介质简单地是空气。
16.按照权利要求10所述用于样品二维显示的装置,其特征在于:所述单层为一种具有光学指数等于1.74的无机物层,入射介质简单地是水。
17.按照权利要求10所述用于样品二维显示的装置,其特征在于:所述单层为一种具有光学指数等于1.945的无机物层,入射介质是一种具有光学指数为1.5的油。
18.按照权利要求10所述用于样品二维显示的装置,其特征在于:所述单层是不连续的并且包括二氧化硅试块以及光学指数为1.343,所述单层厚度的同样高度并具有小于1微米的剖面尺寸,入射介质简单地是空气。
19.按照权利要求10所述用于样品二维显示的装置,其特征在于:所述单层为具有光学指数等于1.343的间隙孔或毫微米孔的无机层或有机层,入射介质简单地是空气。
20.按照权利要求10所述用于样品二维显示的装置,其特征在于:所述单层是具有光学指数等于1.343的无机气凝胶,入射介质简单地是空气。
21.按照权利要求2所述的用于样品二维显示的装置,其特征在于:它包括一个显微镜,所述显微镜包括一个取纵向缝隙形式的孔径光阑,该孔径光阑可围绕显微镜的轴线调节,能把照明锥体限制到在一选定方向上的一个入射平面上。
22.按照权利要求1所述的用于样品二维显示的装置,其特征在于:它包括一个显微镜,所述显微镜包括一个取环件形式的孔径光阑,该孔径光阑围绕入射角限制样品的照明锥体。
23.按照权利要求1所述用于样品二维显示的装置,其特征在于:物体是一种薄膜,和叠层包括一个斜切层,其厚度沿着表面在方向X单调变化。
24.用权利要求23所述装置的测量方法,其特征在于:
显示装置平行于方向X切成两个元件,
薄膜设置在上述两个元件的其中之一上,
两个元件设置在用多色光照明的偏振显微镜下交叉反射的偏振器和分析器之间,以便在每个元件上形成彩色干涉条纹,
测量分别在每个元件中形成的条纹偏移,以便由其得到设置在每个元件上的层的性能。
25.按照权利要求1所述的用于样品二维显示的装置,其特征在于:衬底是Petri箱底部。
26.按照权利要求1所述的用于样品二维显示的装置,其特征在于:样品是一种矩阵式多传感器。
27.按权利要求26所述的用于样品二维显示的装置,其特征在于:矩阵的每个试块或试片构成叠层的最后一层。
28.按权利要求26所述的用于样品二维显示的装置,其特征在于:多传感器是一种细菌,病毒,抗原,抗体,蛋白质,DNA,RNA,染色体芯片。
29.用于样品椭圆偏振光测量的方法,所述样品在形成样品图片的偏振显微镜下具有空间分辨率,其中:
用一照明光束照射样品,所述照明光束通过一个孔径光阑被线性偏振,
用偏振器/分析器分析样品所反射的光,它的偏振方向相对于偏振器偏振方向的相对取向φ,
反射的强度通过照明光束的偏振和偏振器/分析器的相对旋转调制,
其特征在于:
照明光束的孔径光阑是一个环件,所述环件定心在图示一个入射角的光束轴线上,
在样品所得图片的每一点处同时测量平均反射通量φM(x,y)及其调制幅度φm(x,y),
处理测量结果φM(x,y)和φm(x,y),以便根据下面公式在样品的每个点处由其同时得到椭圆偏振参数ψ(x,y)和Δ(x,y)及反射系数|rs|2(x,y)的两种组合:
处理测量结果φM(x,y)和φm(x,y),以便根据下面公式由其得到一个椭圆偏振参数ψ(x,y)和Δ(x,y)的组合sin(2ψ)cos:
φm=φM(1-sin(2ψ)cosΔ)
30.按照权利要求29所述用于样品椭圆偏振光测量的方法,所述样品在偏振显微镜下具有空间分辨率,待研究的物体安放在一个包括一个物体的衬底上,其特征在于:与物体接触的叠层厚度e是这样的,使衬底的复合反射系数rp和rs验证条件d2/de2[Ln|rp+rs|]=0。
31.按照权利要求29所述用于样品椭圆偏振测量的方法,所述样品在偏振显微镜下具有空间分辨率,其特征在于:物体安放在一个衬底上,衬底的光学性能是这样的,使在整个e值组范围内由量|rp+rs|所取的最小值尽可能小。
34.按照权利要求33所述的装置,其特征在于:摄像机是三镜头CCD彩色摄像机,及在每个点处进行强度测量结果和对每种颜色进行处理。
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