CN1772036A - 黄芪提取物在制备抗疲劳药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了中药黄芪在制备抗疲劳药物中的应用。本发明通过采用小鼠趾长伸肌的离体疲劳模型，观察中药黄芪的抗疲劳试验，结果表明黄芪能改善能量代谢、促进酸碱平衡和内环境的恒定的作用，提供了中药黄芪在制备抗疲劳药物中的新用途。

Description

黄芪提取物在制备抗疲劳药物中的应用

技术领域：

本发明属于中药技术领域。具体涉及一种黄芪提取物在制备抗疲劳药物中的应用。

背景技术：

疲劳(Fatigue)是当今社会中工作时间长、节奏快、睡眠不足等因素引起的亚健康状态的信号，也是诱发各种疾病(心脑疾病、胃肠疾病、神经内分泌疾病)的主要潜在因素。另外，在世界竞技体育运动飞速发展的今天，运动员超负荷的训练和竞赛，产生耐力下降、运动能力不足，达不到原有的竞技状态和水平，出现运动性疲劳。可以说疲劳是现代人的百病之源，是危害人体健康的重要隐患。长期疲劳会导致慢性疲劳综合征，并严重地影响生活质量，这已成为21世纪人类健康的主要问题之一。

现代医学对疲劳的研究已经过了100多年的历程，对疲劳产生的机制有了较为深入的认识，提出运动性疲劳可分为外周性的与中枢性的，认为产生疲劳的位点主要有：1)兴奋性传入至高级运动中枢、2)兴奋性传至低级运动神经元、3)运动神经元的兴奋性、4)神经-肌肉接头传递、5)肌纤维的兴奋性、6)兴奋-收缩藕联、7)收缩机制、8)代谢能的供给和代谢产物的累积。上述1)-4)位点是中枢性的，5)-8)位点是与外周发生联系的。目前大量的研究成果证明产生疲劳的位点主要在外周，即上述5)-8)位点。此外，体内神经递质的改变、激素的调节、免疫功能的变化对疲劳的产生起到了重要的作用。

1.Fitts，R.H.Cellular mechanisms of muscle fatigue.Physiol Rev 1994；74：49-81

2.Westerblad，H，Lee，J.A，Lannergren，J，and Allen，D.G.Cellular mechanisms of fatigue inskeletal muscle.Am J Physiol 1991；261：C195-C209

近年来，中国在应用中医药治疗疲劳已作了大量的研究工作，证明中医药抗疲劳的作用是肯定的，有进一步挖掘、研究和开发的价值。中医学认为疲劳与脾、肾相关。脾为后天之本，气血生化之源。脾主肌肉，脾气盛，则肌肉丰满而充实。肾藏精，主骨髓，为先天之本，是体内产生的原动力和源泉。应用补肾益脾(补气填精)的中药能够提高人体的运动能力、改善能量代谢、促进疲劳的恢复。见文献报道：

1.刘雁峰，等.慢性疲劳综合征中西医研究概况(综述).北京中医药大学学报，1997，20(5)：48-50

2.陈家旭，等.中医药抗运动性疲劳研究概况与展望(综述).中国运动医学杂志，1997，16(1)：50-54

3.解丽芳，等.中医药抗运动性疲劳的研究展望(综述).中国运动医学杂志，1998，17(1)：67-69。

从目前中医药抗疲劳的研究中可以看到存在以下几个方面的问题：1)整体方面的研究比较多，细胞水平方面的研究很少；2)偏重于药效学的研究，其作用机制的研究不够详细；3)中药中抗疲劳的药物种类繁多，如何在中医理论指导下，从作用机制着手进行筛选；4)应建立能够真正评价疲劳的整体、离体和细胞水平的模型，严格控制实验条件和造模的标准化，使抗疲劳药物的筛选能够提高到一个新的水平。鉴于以上原因，本发明人认为研究中药的抗疲劳作用，应在中医基础理论指导下，从其药效物质基础和作用机理两个方面着手研究。挖掘、研究和开发出具有真正抗疲劳的新型药物，这将会产生重大的社会意义和社会价值。

黄芪(Astragalus membranaceus)属豆科植物，性味甘、微温，归脾、肺经，主要功效为补气固表，利尿托毒、排脓，敛疮生肌，是中药补气药中最重要的药物之一。现代医学研究证明黄芪具有调节免疫功能、延缓衰老、促进骨髓造血和血细胞生成。目前，对黄芪研究最多、最广泛和最深入的是在心血管效应方面。众多的临床观察和实验研究表明黄芪对心脏具有良好的保护作用，在临床上能用于治疗冠心病心绞痛、高血压、低血压、病毒性心肌炎、心律失常等。

黄芪的化学研究表明黄芪中主要的活性成分为黄酮类、皂甙类、多糖类以及氨基酸、磷脂及微量元素。黄芪中的主要黄酮有芒柄花素、毛蕊异黄酮、黄芪异黄烷甙等近20种。黄酮类化合物的主要功效很可能在于抗自由基损伤。皂甙类以三萜类为主，主要有大豆类皂甙、胡萝卜甙、黄芪皂甙。黄芪皂甙是主要的活性成分，据报道黄芪皂甙具有较广泛的药理作用，是正性肌力和降压的主要有效成分。多糖类，目前已分离得到的主要有三种，分别是黄芪多糖I、黄芪多糖II和黄芪多糖III，前两种为葡聚糖，其主要药理活性是免疫调节功能。

黄芪在心血管药理效应方面的研究证明单味药黄芪在治疗心肌梗塞方面能够限制和缩小心肌梗塞的面积，提高心肌梗塞患者红细胞超氧化物岐化酶活性，降低血浆过氧化脂质含量，其机制可能为黄芪能够稳定缺血、缺氧心肌细胞膜，保护线粒体和溶酶体，调节cAMP/cGMP比例，增加抗缺氧能力，抑制氧自由基产生，从而保护心肌细胞，减轻细胞的损伤程度。在心肌缺血再灌注损伤研究中发现单味黄芪能升高再灌注损伤心肌组织中SOD及GSH-Px活性，降低MDA及胞内Ca²⁺含量，维持心肌细胞氧化和抗氧化平衡，干预氧自由基的产生并增强清除氧自由基的功能；并能使内源性腺苷释放增加和肌钙蛋白-T释放减少。以上结果表明增加心肌抗缺氧及抗再灌注损伤的作用，黄芪对心肌缺血再灌注损伤的保护在于清除氧自由基和抑制脂质过氧化反应，并能抑制Ca²⁺内流，减轻Ca²⁺超载，提高心肌组织内cAMP含量等，起到保护心肌的作用。黄芪具有较明显的强心作用，有人报道，其作用与Na⁺-K⁺-ATPase活性无关，可能与抑制磷酸二酯酶活性有关，磷酸二酯酶是cAMP的分解酶，磷酸二酯酶活性被抑制后，cAMP的分解减少，心肌组织中cAMP的浓度升高，激活cAMP依赖性蛋白激酶，导致心肌细胞兴奋-收缩藕联加强，此即黄芪的强心机制。另外，黄芪能增加心肌细胞膜上受体的数目，其增加可能是使心肌细胞受体外移或增加受体合成，这也可能是黄芪强心的机制之一。

有效部位或有效成分的研究表明黄芪中具有正性肌力作用的主要成分是黄芪总皂甙，在整体心肌缺血再灌注损伤实验中发现黄芪皂甙具有较明显的强心作用。在实验性心力衰竭的实验中发现黄芪皂甙的正性肌力具有浓度依赖性。在离体乳头肌标本实验中观察到黄芪皂甙的正性肌力与磷酸二酯酶活性的抑制有关；在培养的心肌细胞实验中发现黄芪皂甙的强心作用可能与Na⁺-K⁺-ATPase的抑制有关。也有人认为黄芪皂甙的正性肌力与哇巴因不同，可能与钙调蛋白结合钙离子有关。黄芪中黄酮的作用很可能在改善心肌缺血缺氧和保护大鼠心肌缺血再灌注损伤中起着很重要的作用。在整体心肌缺血再灌注损伤实验中发现黄芪总黄酮对心脏有较明显的保护作用。在对由黄嘌呤-黄嘌呤氧合酶诱导的卵磷脂过氧化抑制实验中发现黄酮类化合物具有明显的抑制脂质过氧化作用。应用Langendorff法和电子自旋共振波谱仪观察到黄芪总黄酮能减少大鼠心肌缺血再灌注损伤氧自由基的生成。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题在于在中医“脾主肌肉”理论为指导，进一步研究开发黄芪的抗疲劳作用的药效。

目前的研究表明产生疲劳的主要位点在于外周肌纤维，肌纤维发生疲劳后，将会引起能量代谢障碍、有氧代谢减少、无氧代谢增加、造成细胞内ATP、磷酸肌醇、糖元含量降低、乳酸堆积、无机磷含量升高。细胞的离子转运机制发生变化，细胞内Na+和H+离子活度增加，K+离子活度减少，造成细胞肿胀和坏死。离子环境的变化和能量代谢的障碍将进一步直接造成肌纤维横桥活动和间接造成兴奋-收缩藕联活动的异常，最终导致疲劳程度进一步加剧。

本发明基于上述疲劳的细胞机制，采用以下方案来研究中药黄芪的抗疲劳作用。

1.应用超强低频电刺激脉冲造成小鼠趾长伸肌(EDL)的离体疲劳模型。低频电刺激引起的疲劳比高频电刺激更符合人体的疲劳状况，所以选择低频电刺激造成离体肌肉疲劳模型

2.通过测定离体肌纤维等长性张力，分析肌纤维疲劳后的机械特性变化，说明肌纤维发生疲劳后横桥和兴奋-收缩藕联活动的变化，以及黄芪对横桥和兴奋-收缩藕联活动改变的作用。

3.通过生物化学的方法，测定肌纤维中糖元(glucogen)、三磷酸腺酐(ATP)、乳酸(lactate)、磷酸肌醇(PCr)和无机磷(Pi)的含量，观察肌纤维疲劳后细胞能量代谢的变化和黄芪对疲劳后肌纤维能量代谢障碍的改善作用。说明黄芪在抗疲劳过程中，改善能量代谢、促进酸碱平衡和内环境的恒定的作用。

通过上述试验证实了中药黄芪提取物具有显著的抗疲劳作用。

本发明提供了黄芪提取物在制备抗疲劳药物中的应用。

本发明所述的黄芪提取物是通过下述方法制备的：

1)原料：黄芪药材(饮片)：

药材为山西省浑源产的膜荚黄芪。

2)二次醇沉法提取黄芪浸膏：

黄芪药材(饮片)加水(第一次为黄芪药材重量的5倍量，第二、三次3倍量)煎煮，每次煮沸后，煎煮1.5小时，合并三次煎液，浓缩至浸膏，加94％乙醇至醇溶液含醇量为70％，冷藏过夜，滤过，滤液浓缩至浸膏。加无水乙醇使浸膏含醇量为85％，冷藏过夜，滤过，滤液浓缩至浸膏，与黄芪药材重量比较，浓缩100倍；

3)提取黄芪提取物：

用相当于步骤(2)制得的黄芪浸膏重量4倍量的60％乙醇加入黄芪浸膏中，进行沉淀，去沉淀物(多糖部分)，浓缩乙醇部分，浓缩部分再用相当于该浓缩物重量的80％乙醇沉淀，去沉淀部分(单糖部分、小分子)，浓缩乙醇部分得黄芪提取物，与步骤(2)所得黄芪浸膏重量比较，浓缩5倍，呈微黄色的粉末状。

上述提取物经上海中医药大学化学研究室HPLC测试，该提取物含有的主要成份有皂甙IV、皂甙II、毛芯异黄酮、毛芯异黄酮糖甙和多糖(见图5)等。

本发明对中药黄芪提取物在离体小鼠趾长伸肌的实验中揭示了黄芪提取物具有明显促进低频疲劳恢复的作用，因而可用于制备抗疲劳药物。

附图说明：

图1.黄芪提取物对低频电刺激造成肌肉疲劳后的强直收缩力(P₀)恢复的作用。应用频率50Hz，波宽0.1ms的超强直流电串脉冲，以1次/秒速率刺激肌纤维标本5分钟(共300次)，造成离体小鼠趾长伸肌疲劳模型。疲劳后张力恢复的观察时间分别为0、1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60min。(A)强直收缩(P₀)，(B)P₀/+dT/dt，(C)P₀/-dT/dt。

图2.黄芪提取物对低频电刺激造成肌肉疲劳后的单收缩力(P_t)恢复的作用。应用频率50Hz，波宽0.1ms的超强直流电串脉冲，以1次/秒速率刺激肌纤维标本5分钟(共300次)，造成离体小鼠趾长伸肌疲劳模型。疲劳后张力恢复的观察时间分别为0、1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60min。(A)P_t，(B)P_t/+dT/dt，(C)P_t/-dT/dt，(D)CT，(E)1/2RT。

图3说明疲劳组(■)、黄芪提取物(○)和咖啡因组(△)小鼠在经低频电刺激造成肌肉疲劳后60min趾长伸肌单收缩恢复过程中的P_t、P_t/+dT/dt、Pt/-dT/dt、CT及1/2RT(X±SE)的变化。

图4说明疲劳组(■)、黄芪提取物(○)和咖啡因(△)组小鼠在经低频电刺激造成肌肉疲劳后60min趾长伸肌强直收缩恢复过程中的P₀、P₀/+dT/dt、P₀/-dT/dt(X±SE)的变化。

图5本发明的黄芪提取物HPLC测试图谱。

具体实施方式：

本发明人通过下列方案的具体实验，说明黄芪的抗疲劳作用。

一、材料与方法

1、离体小鼠趾长伸肌疲劳模型制作：

Babl/C种小鼠，体重18-20克，雄性，经麻醉后，仔细分离出趾长伸肌，置入容积约10ml的浴槽内，浴槽中营养液(mmol/L)的组成为NaCl 115、NaHCO3 25、KCl 5.0、CaCl2 2.5、MgCl2 1.2、NaH2PO4 1.0、glucose 5.0，该溶液的pH调节至7.35-7.40之间，温度保持在25℃，并持续充灌100％氧气。肌纤维的一侧固定在浴槽低部，另一侧连接张力换能器，待肌纤维在浴槽内平衡40分钟到1小时后，应用频率50Hz，波宽0.1ms的超强直流电串脉冲，以1次/秒速率刺激肌纤维标本5分钟(共300次)，造成离体肌纤维的疲劳模型。

2.肌纤维收缩性能的测定

对每条肌肉在其整个长度范围内经铂金丝电极进行电场刺激。每条趾长伸肌标本都被调节至最佳(适宜)长度(optimal length)，然后引出最大单收缩。通过应用超强的波宽0.5ms的电脉冲刺激引出等长性单收缩(isometric twitch contraction)，通过应用超强的波宽0.1ms、频率为50Hz的电脉冲刺激引出最大强直收缩(peaktetanic contraction)。所测的收缩力经张力换能器输出和桥式放大器放大后，输至四通道高速记录仪记录，并通过PowerLab/4SP生物信号处理和分析系统进行实验数据的分析和统计。进一步分析单收缩的时间(CT，即经刺激后收缩力达到最大值所需的时间)1/2的松弛时间(1/2RT，即最大收缩力下降到50％所需的时间)，最大单收缩力及其上升与下降速率(P_t、P_t/±dp/dt)以及最大强直收缩力及其上升与下降速率(P₀、P₀/±dp/dt)。

3.生化指标和能量代谢测定

动物的离体肌纤维在收缩性能测试完毕后，用0.9％NaCl冲洗后，将水分用滤纸吸干，快速置入液氮冷冻，并保存在-70℃低温冰箱中。在测试生化指标过程中，骨骼肌经复温后，将其分离成1-2mm长的纤维束。经称重后，根据酶学方法测定糖元(glucogen)、三磷酸腺酐(ATP)、乳酸(lactate)、磷酸肌醇(PCr)和无机磷(Pi)的生化和能量代谢指标。

4.中药黄芪提取物提取的制备和主要成分提取：

黄芪提取物(黄芪提取物)

1)原料：黄芪药材(饮片)：

药材为山西省浑源产的膜荚黄芪。

2)二次醇沉法提取黄芪浸膏：

黄芪药材(饮片)加水(第一次用相当于黄芪重量的5倍量，第二、三次3倍量)煎煮，每次煮沸后，煎煮1.5小时，合并三次煎液，浓缩至浸膏，加94％乙醇至醇溶液含醇量为70％，冷藏过夜，过滤，滤液浓缩至浸膏。加无水乙醇使浸膏含醇量为85％，冷藏过夜，滤过，滤液浓缩至浸膏，与黄芪药材重量比较，浓缩100倍；

3)提取黄芪提取物：

用相当于步骤(2)制得的黄芪浸膏重量4倍量的60％7醇加入黄芪浸膏中，进行沉淀，去沉淀物，浓缩乙醇部分，浓缩部分用相当于该浓缩物重量4倍量的80％乙醇沉淀，去沉淀部分，浓缩乙醇部分得黄芪提取，与步骤(2)制得的黄芪浸膏重量比较，浓缩5倍，呈微黄色的粉末状。

黄芪中主要成分

经HPLC测试的黄芪主要成分有皂甙IV、皂甙II、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮糖甙、多糖等，由上海中医药大学中药化学研究室提供(见图5)。由于上述成分对低频电刺激造成的疲劳均无明显效果。为此，重点研究黄芪富集物对低频电刺激造成小鼠趾长伸肌疲劳的作用。黄芪富集物的用量为0.1mg/ml，对照药咖啡因的用量为1mmol/L。

5.统计分析

全部实验结果除图中的实验数据以均数±标准误表示，其它以均数±标准差(X±SD)或均数±标准误(X±SE)表示。用students t-检验或one way ANOVA比较组间数据的显著性，P值小于0.05，表示具有显著性意义。在疲劳后的恢复过程中，各项肌力恢复率(P₀、P₀/±dp/dt、P_t、P_t/±dp/dt)的百分比根据以下公式计算：肌力恢复率＝(恢复值-最低恢复值)/(对照值-最低恢复值)×100％。

二、结果

1.离体小鼠趾长伸肌的收缩特性：

本实验选用的动物为BALB/C纯系雄性小鼠，体重18-20g。通过对12个动物的体重，趾长伸肌最大长度和肌肉湿重的测定，表明平均体重为19.3±0.8g，肌肉的最大长度为11.18±0.37mm，肌肉湿重为7.12±0.6lmg。根据肌肉截面积＝湿重/(长度×1.05)的公式换算得出小鼠趾长伸肌的截面积，此处的1.05是骨骼肌的密度，根据公式计算出小鼠趾长伸肌的截面积为7.12/(11.18×1.05)＝0.57mm²。在实验中将所得的实测值，按照上述截面积换算成标准的肌肉张力单位(mN/mm²)。

通过给予波宽0.5ms、电压40V的电脉冲经电场刺激引出离体小鼠趾长伸肌等长性单收缩(isometric twitch contraction)，95标本的测试表明最大单收缩力(P_t)为33.4±3.3mN/mm²，最大单收缩力上升速率(P_t/+dT/dt)为1819.9±137.1mN/mm²/sec，最大单收缩力下降速率(P_t/-dT/dt)为1497.4±246.7mN/mm²/sec，CT为20.9±3.0ms，1/2RT为15.9±11.0ms。通过给予波宽0.1ms、频率50Hz、电压40V的电脉冲经电场刺激引出最大强直收缩(peak tetanic contraction)。95个标本的测试表明最大强直收缩力(P₀)为101.9±17.4mN/mm²，最大强直收缩力上升速率(P₀/+dT/dt)为1754.5±268.9mN/mm²/sec，最大强直收缩力下降速率(P₀/-dT/dt)为3797.4±119.6mN/mm²/sec。

黄芪提取物对低频电刺激造成小鼠趾长伸肌疲劳恢复过程收缩性能的影响：

应用频率50Hz，波宽0.1ms的超强直流电串脉冲，以1次/秒速率刺激肌纤维标本5分钟(共300次)，造成离体小鼠趾长伸肌疲劳模型。经测试，黄芪主要成分皂甙IV、皂甙II、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮糖甙、多糖等对低频电刺激造成的疲劳均无明显效果。为此，重点研究黄芪提取物对低频电刺激造成小鼠趾长伸肌疲劳恢复的作用。黄芪提取物的用量为0.1mg/ml，阳性对照药选择咖啡因(Sigma)，其用量为1mmol/L。当5分钟持续低频电刺激造成趾长伸肌疲劳后，用药组立即加入0.1mg/ml黄芪提取物或1mmol/L咖啡因，观察黄芪提取物和咖啡因对疲劳恢复的作用。图1为应用频率50Hz，波宽0.1ms的超强直流电串脉冲，以1次/秒速率刺激肌纤维标本5分钟(共300次)，造成离体小鼠趾长伸肌疲劳模型后的张力恢复曲线，疲劳后张力恢复的观察时间分别为0、1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60min。图中的A、B、C分别代表单纯疲劳的、应用黄芪提取物和咖啡因的张力恢复曲线。图2为应用频率50Hz，波宽0.1ms的超强直流电串脉冲，以1次/秒速率刺激肌纤维标本5分钟(共300次)，造成离体小鼠趾长伸肌疲劳模型以及疲劳后的P₀/±dT/dt恢复曲线，疲劳后P₀/±dT/dt恢复的观察时间同上。图中的A、B、C分别代表单纯疲劳的、应用黄芪提取物和咖啡因的P₀/±dT/dt恢复曲线。

实验结果表明疲劳组(n＝32)小鼠趾长伸肌在造模前P_t为32.7±3.4mN/mm²，P_t/+dT/dt为1769.6±119.9mN/mm²/sec，P_t/-dT/dt为1459.2±294.6mN/mm²/sec，CT为21.8±3.6ms，1/2RT为17.9±8.3ms；P0为99.2±17.3mN/mm2，P₀/+dT/dt为1700.5±228.4mN/mm²/sec，P₀/-dT/dt为3822.1±633.8mN/mm²/sec。黄芪提取物组(n＝32)造模前P_t为33.4±3.9mN/mm²，P_t/+dT/dt为1828.9±152.3mN/mm²/sec，P_t/-dT/dt为1509.1±230.5mN/mm²/sec，CT为19.7±3.3ms，1/2RT为14.9±3.9ms；

表1.黄芪提取物对低频电刺激(50Hz)造成的小鼠趾长伸肌疲劳后强直收缩恢复的作用

gourps	times(min)	P0(mN/mm2)	P0/+dT/dt(mN/mm2/sec)	P0/-dT/dt(mN/mm2/sec)
					Fatigue(n＝32)	control103060	99.2±17.334.6±9.240.1±9.341.4±9.5	1700.5±228.4896.8±199.11015.5±220.21086.1±237.7	3822.1±633.8925.4±343.61277.6±389.91429.7±404.5
黄芪提取物(n＝32)	control103060	103.4±19.131.0±9.5ΔΔ54.8±11.3**ΔΔ75.3±12.1**Δ	1842.1±215.8818.8±167.6ΔΔ1052.4±165.4ΔΔ1211.6±193.1*ΔΔ	3772.1±398.9770.6±279.1*ΔΔ1811.3±389.4*ΔΔ2696.0±517.8**ΔΔ
					Caffine(n＝31)	control103060	103.3±15.851.3±8.6**77.7±10.3**81.7±11.8**	1719.6±334.91189.4±182.8**1302.9±165.1**1399.0±157.6**	3797.7±763.51304.1±263.4**2607.1±424.3**3109.3±505.4**

与Fatigue比较：^*P＜0.05，^**P＜0.01与Caffine比较：^ΔP＜0.05，^ΔΔP＜0.01

P₀为101.9±17.4mN/mm²，P0/+dT/dt为1754.5±268.9mN/mm²/sec，P₀/-dT/dt为-3797.4±119.6mN/mm²/sec。咖啡因组(n＝31)造模前P_t为33.4±3.3mN/mm²，P_t/+dT/dt为1819.9±137.1mN/mm²/sec，P_t/-dT/dt为-1497.4±246.7mN/mm²/sec，CT为20.9±3.0ms，1/2RT为15.9±11.0ms；P0为103.3±15.8mN/mm²，P₀/+dT/dt为1719.6±334.9mN/mm²/sec，P₀/-dT/dt为-3797.7±763.5mN/mm²/sec。在正常情况下三组间的对照值非常接近，组间无差异(表1、表2)。

疲劳后小鼠趾长伸肌肌力的恢复过程见图3和图4。图3说明了疲劳组、黄芪提取物和咖啡因组小鼠在经低频电刺激造成肌肉疲劳后60min趾长伸肌单收缩恢复过程中的P_t、P_t/+dT/dt、P_t/-dT/dt、CT及1/2RT的变化。图4说明了疲劳组、黄芪提取物和咖啡因组小鼠在经低频电刺激造成肌肉疲劳后60min趾长伸肌强直收缩恢复过程中的P₀、P₀/+dT/dt、P₀/-dT/dt的变化。

表2.黄芪提取物对低频电刺激(50Hz)造成的小鼠趾长伸肌疲劳后单收缩恢复的作用

Gourps	Times(min)	Pt(mN/mm2)	Pt/+dT/dt(mN/mm2/sec)	Pt/-dT/dt(mN/mm2/sec)	CT(ms)	1/2RT(ms)
							Fatigue(n＝32)	control103060	32.7±3.419.7±3.419.3±3.419.7±3.5	1769.6±119.91211.5±199.41197.4±212.71229.1±219.7	1459.2±294.6663.3±213.7723.2±201.6813.1±203.9	21.8±3.618.1±5.417.6±5.516.2±4.9	17.9±8.317.7±7.014.7±4.714.5±5.8
黄芪提取物(n＝32)	control103060	33.4±3.919.2±4.6ΔΔ21.2±4.0ΔΔ24.2±4.9**	1828.9±152.31153.3±227.8ΔΔ1258.8±195.1ΔΔ1414.8±226.8**	1509.1±230.5537.5±172.9ΔΔ711.7±177.2ΔΔ1008.6±225.3**Δ	19.7±3.316.7±5.1ΔΔ18.2±5.5ΔΔ19.4±4.6*	14.9±3.922.5±7.3**ΔΔ19.9±6.8**ΔΔ14.9±3.5
							Caffine(n＝31)	control103060	34.0±2.528.7±3.8**25.4±3.2**25.2±3.1**	1863.2±123.91612.5±188.9**1479.3±159.0**1486.0±160.3**	1524.5±209.0996.4±242.6**989.5±213.5**1148.0±215.1**	21.2±1.121.4±2.7**21.5±2.6**19.5±4.3*	14.9±3.517.5±7.615.2±7.313.9±3.9

与Fatigue比较：^*P＜0.05，^**P＜0.01与Caffine比较：^ΔP＜0.05，^ΔΔP＜0.01

P₀为101.9±17.4mN/mm²，P₀/+dT/dt为1754.5±268.9mN/mm²/sec，P₀/-dT/dt为-3797.4±119.6mN/mm²/sec。咖啡因组(n＝31)造模前Pt为33.4±3.3mN/mm²，P_t/+dT/dt为1819.9±137.1mN/mm²/sec，P_t/-dT/dt为-1497.4±246.7mN/mm²/sec，CT为20.9±3.0ms，1/2RT为15.9±11.0ms；P₀为103.3±15.8mN/mm²，P₀/+dT/dt为1719.6±334.9mN/mm²/sec，P₀/-dT/dt为-3797.7±763.5mN/mm²/sec。在正常情况下三组间的对照值非常接近，组间无差异(表1、表2)。

从上述两图中可以看到小鼠趾长伸肌经低频电刺激造成疲劳后，除CT及1/2RT的变化外，其余各项指标的数值明显下降，并且在恢复过程中，进一步的下降，大约在疲劳后恢复的15分钟时，各项指标不再下降和趋于平稳。同时各项指标恢复的幅度也很少。疲劳组经电刺激造成疲劳后恢复至60min，与恢复最低值比较，P₀、P₀/+dT/dt、P₀/-dT/dt分别上升了24.3％、24.4％、31.1％。P_t、P_t/+dT/dt、P_t/-dT/dt分别上升了4.4％、7.4％、18.8％。

咖啡因组小鼠趾长伸肌在用电刺激造成疲劳后，立即给予1mmol/L的咖啡因，在单收缩肌力恢复方面，引起即刻的P_t、P_t/+dT/dt、P_t/-dT/dt恢复，然后，出现一个缓慢的下降，大约在疲劳恢复后的20min，趋于稳定，不再下降，但恢复也较少；在强直收缩肌力恢复方面，在给药5min内，引起一个快速的P₀、P₀/+dT/dt、P₀/-dT/dt上升，然后，呈现缓慢的上升，约在给药40min后，P₀、P₀/+dT/dt、P₀/-dT/dt各数值趋于稳定，即上升很少。咖啡因组经电刺激造成疲劳后恢复至60min，与恢复最低值比较，P₀、P₀/+dT/dt、P₀/-dT/dt分别上升了72.4％、50.2％、80.2％。P_t、P_t/+dT/dt、P_t/-dT/dt分别上升了1.1％、3.8％、36.1％。

黄芪提取物组小鼠趾长伸肌在用电刺激造成疲劳后，立即给予0.1mg/ml的黄芪提取物，在单收缩肌力恢复方面，先出现一个肌力下降的过程，这样一个过程大约持续15-20min，然后P_t、P_t/+dT/dt、P_t/-dT/dt开始逐渐回升，一直持续到实验结束；在强直收缩肌力恢复方面，在给药后，肌力开始上升，与咖啡因的效应进行比较，P₀、P₀/+dT/dt、P₀/-dT/dt回升是一个逐渐上升的过程，存在于整个实验过程。这与咖啡因的效应完全不同，其机制有待于进一步的研究。黄芪提取物组经电刺激造成疲劳后恢复至60min，与恢复最低值比较，P₀、P₀/+dT/dt、P₀/-dT/dt分别上升了64.2％、39.6％、68.3％。P_t、P_t/+dT/dt、P_t/-dT/dt分别上升了35.2％、41.0％、48.5％。

3.黄芪提取物对低频电刺激造成小鼠趾长伸肌疲劳恢复过程生化指标的影响：

疲劳组、咖啡因组和黄芪提取物组三组小鼠离体趾长伸肌在收缩性能测试完毕后，经冷冻和复温后，测定肌纤维中糖元(glucogen)、三磷酸腺酐(ATP)、乳酸(lactate)、磷酸肌醇(PCr)和无机磷(Pi)的变化。为了与正常趾长伸肌中的生化指标进行比较，增加一组正常的、未经电刺激造模的对照组。疲劳后，肌肉生化代谢发生明显的变化，肌糖原、ATP和PCr的含量下降，乳酸和无机磷的含量升高。从表3中可见正常对照组的肌糖原含量为178.2±29.5μmol/g dry wt，疲劳组的肌糖原含量为77.4±26.7μmol/g dry wt，两组比较，疲劳组的肌糖原含量为对照组的43.3％，约下降了一倍以上；黄芪提取物组的肌糖原含量为162.5±26.4μmol/g dry wt，与疲劳组比较，为疲劳组的213.4％，约增加了一倍以上，接近对照组的数值，说明黄芪提取物能够明显地增加疲劳时肌糖原的含量；咖啡因组的肌糖原含量为139.5±25.9μmol/g dry wt，与疲劳组比较，为疲劳组的180.2％，约增加了一倍左右，说明咖啡因同样能够明显地增加疲劳时肌糖原的含量。小鼠的趾长伸肌在发生疲劳后，ATP的利用明显增加，使细胞内ATP含量急剧下降，正常时ATP含量为34.22±9.4μmol/g dry wt，当疲劳发生后，下降到13.64±1.9μmol/g dry wt，应用黄芪提取物和咖啡因能不同程度地增加细胞内ATP含量，与疲劳组进行比较，P值分别小于0.05和0.01。对于PCr而言，黄芪提取物和咖啡因均不能对抗其下降。疲劳时，肌纤维内乳酸和无机磷(Pi)含量增加，黄芪提取物和咖啡因均抑制疲劳引起的Pi含量的升高，但不能逆转乳酸含量的升高。

表3.黄芪提取物对低频电刺激(50Hz)造成的小鼠趾长伸肌疲劳后的肌肉生化代谢指标(X±SD)的影响

Gourps	Glucogen(μmol/g dry wt)	ATP(μmol/g dry wt)	Lactate(μmol/g dry wt)	PCr(μmol/g dry wt)	Pi(μmol/g dry wt)
						ControlFatigue黄芪提取物Caffine	178.2±29.5(10)**77.4±26.7(10)162.5±26.4(10)**139.5±25.9(10)**	34.22±9.4(10)**13.64±1.9(10)18.19±6.1(10)*27.23±11.8(10)**	16.9±6.9(8)**57.4±18.8(9)51.0±13.4(10)51.2±10.5(10)	39.8±10.1(6)**9.3±3.8(6)10.6±3.2(6)11.4±2.9(6)	15.4±2.52(6)**32.3±2.8(6)13.2±2.33(6)**20.9±3.50(6)*

与Fatigue比较：^*P＜0.05，^**P＜0.01

()内数值为样本数

本发明根据中医传统理论和长期临床用药经验，对一定数量的补肾益肝填精中药进行了筛选，发现经过浓缩提取的黄芪提取物对低频疲劳具有明显的恢复作用。本实验应用离体小鼠趾长伸肌作为标本，通过给予低频电刺激造成的疲劳，观察到黄芪提取物具有明显促进低频疲劳的恢复。

由于肌纤维的最大缩短速度(V₀)与肌丝水解ATP的速率呈高度相关。在长时间运动过程中，最大缩短速度(V₀)很少或无改变。但在高强度作功时，V₀能降低到疲劳前的40％，说明疲劳时肌丝水解ATP的速率受到限制。在横桥周期速率中的速率限制步骤，目前还不清楚，很可能涉及到ADP解离步骤(肌动球蛋白-ADP→肌动球蛋白+ADP)。在去皮纤维实验中，已说明H⁺和ADP能降低V₀，相反，P_i的增加，即使到达20mM也不影响V₀。在疲劳的起始相，力快速下降而V₀无变化。早期疲劳P_i的迅速增加是因为收缩活动开始时ATP循环增加。在疲劳的第二相，P₀出现缓慢下降和V₀开始下降，这能够通过H⁺的增加来解释；在该相中，力的缓慢下降是由于ADP的增加，ADP增加已知能够抑制V₀和P₀。在疲劳的最后相，肌质网(sarcoplasmic reticulum，SR)中Ca²⁺的释放受到抑制，所以，力的下降归结于细胞内钙([Ca²⁺]i)瞬时释放的幅度降低。此外，疲劳肌的收缩时间(CT)和1/2松弛时间(1/2RT)的延长表明[Ca²⁺]i瞬时释放延长。在强收缩活动时，[Ca²⁺]i瞬时释放延长部分是由于SR泵蛋白受到H+的抑制。ATP含量下降引起的ATP水解自由能的减少和ADP和Pi的增加都能够损害SR泵的功能。肌肉疲劳恢复的研究表明恢复分快速和缓慢两个时相，快速恢复时相大约在2分钟内完成；缓慢恢复时相需要30-60分钟，这一时相的恢复与H+和Pi的含量高度相关。快速时相的恢复发生在H+和Pi含量的恢复之前，所以，快速恢复时相与H+和Pi的含量无关，这样，快速恢复时相很可能与兴奋-收缩偶联(excitation-contractioncoupling，E-C偶联)中的某些环节相关。在低频活动情况下，对低频反应的力需要几小时才能恢复；特别是在长时间的低频活动时，对低频反应的力需要几天而不是几小时能恢复，这种疲劳称为低频疲劳。目前认为低频疲劳是由于抑制了SR的Ca²⁺释放通道而不是SR Ca²⁺释放的耗竭。

根据实验结果，黄芪提取物能够使疲劳肌的P₀、P₀/+dT/dt、P₀/-dT/dt值和P_t、P₀t/+dT/dt、P_t/-dT/dt值在一个小时内恢复到一个可观的水平，与咖啡因的结果进行比较，咖啡因引起的恢复是非常快速的，而黄芪提取物引起的恢复是一个逐渐缓慢上升的过程。另外，在单收缩力的测定中观察到黄芪提取物对CT和1/2RT影响不同于疲劳组和咖啡因组，疲劳时，黄芪提取物组的CT和1/2RT明显长于疲劳组和咖啡因组，说明黄芪提取物能够延长[Ca²⁺]_i瞬时释放。因此，黄芪提取物和咖啡因增加疲劳肌肌力的作用机制方面是有所不同的。有一点肯定是黄芪提取物将能够影响细胞内Ca²⁺含量和SR的Ca²⁺释放通道。这在应用黄芪有效成分抗慢性心力衰竭的工作中已发现能增加细胞膜上Ca²⁺-ATPase的活性。

Claims (2)

1、一种黄芪提取物在制备抗疲劳药物中的应用。

2、根据权利要求1所述的一种黄芪提取物在制备抗疲劳药物中的应用，其特征在于该黄芪提取物是通过下列方法制备的：

1)原料：黄芪药材饮片：

药材为山西省浑源产的膜荚黄芪；

2)二次醇沉法提取黄芪浸膏：

黄芪药材饮片加水，第一次为黄芪药材重量的5倍量，第二、三次3倍量煎煮，每次煮沸后，煎煮1.5小时，合并三次煎液，浓缩至浸膏，加94％乙醇至醇溶液含醇量为70％，冷藏过夜，过滤，滤液浓缩至浸膏，加无水乙醇使浸膏含醇量为85％，冷藏过夜，滤过，滤液再次浓缩至浸膏，与黄芪药材重量比较，浓缩100倍；

3)提取黄芪提取物：

用相当于步骤(2)制得的黄芪浸膏重量4倍量的60％乙醇加入上述黄芪浸膏中，进行沉淀，去沉淀物，浓缩乙醇部分，该浓缩部分再用相当于该浓缩物重量4倍量的80％乙醇沉淀，去沉淀物，浓缩乙醇部分得黄芪提取物，与步骤(2)制得的黄芪浸膏重量比较，浓缩5倍，呈微黄色的粉末状。

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