CN1772008B - 注射用银杏达莫的制备方法及质量控制方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种治疗心脑血管性疾病的化学复方制剂的制备方法，即注射用银杏达莫的制备方法，其特征在于先将银杏叶提取物进行聚酰胺颗粒精制处理，再进行复方制剂方法制备并采用一次升华于燥法冻干，以达到静脉注射的要求。为此制定了银杏叶提取物的内控质量标准。

Description

注射用银杏达莫的制备方法及质量控制方法

技术领域

本发明涉及一种化学复方制品的制备方法。尤其涉及一种治疗心脑血管系统性疾病的注射用银杏达莫的制备方法及质量控制方法。

背景技术

随着社会的进步，人类生活水平逐渐提高，进入21世纪，在社会大发展的同时威胁人类健康的因素也日益增多。最新研究统计，威胁人类的三大杀手分别为心脑血管性疾病、恶性肿瘤、糖尿病，而心脑血管性疾病，糖尿病的病理生理基础为血管、血流动力学改变和神经病变。对于其他种疾病来说，血管神经性病变也是重要的病理生理改变。针对于血管、血流变、神经方面有作用的药物是治疗以上疾病的主要药物。血管活性药物中以扩张血管、改善动脉顺应性、降低血黏度、抑制血小板聚集最为有效。与此同时，在治疗心脑血管性疾病、糖尿病及其并发症这类多因性、复杂性疾病，单一药物无法解决，而多种单一药物合用又会给患者生理、心理和经济上都带来压力和不必要的损失。因此，就需要有一种确切有效的、且为多组分、多途径的药物来治疗上述疾病。

随着植物疗法在国际上的地位日益提高，结合现代研究，用中草药有效提取物和化学制剂有机结合为新药研究的前瞻性进展。其优点在于：中草药为天然制剂，应用来源于实践，副作用和不良反应都少见，化学制剂为合成品，源于实验室，对人体作用可通过定量研究得到，两者结合可以互补优点而减少副作用。

银杏达莫正是在这样的研究环境下产生了，并得到广泛的重视，银杏达莫(GinkgoLeaf Extract and Dipyridamole)是2000年中国药典一部收载中草药银杏叶的有效提取物(extract of Ginkgo biloba，EGB)与化学品双嘧达莫(C24H40N8O4)的复合制剂。银杏叶用于草药始于明代，在我国民间以银杏叶治疗老年性心血管疾病，20世纪70年代后，德、法等欧洲国家先后开展了对银杏叶的研究，德国Schwade制药公司1991年专利生产了银杏叶标准提取物EGB761(Extracts of Gingkgo Biloba)，其质量指标为黄酮苷≥24％，萜内酯≥6％，银杏酸≤10ppm，此标准为许多国家所公用。银杏叶随着化学检测手段及临床应用的深入研究，在制作工艺、成分分析、药理作用、毒理实验和临床试验等方面国内外都有许多报道。银杏提取物中的有效成分为银杏总黄酮，有扩张血管、改善动脉顺应性、抗凝、保护中枢神经系统等方面的药理学作用，且安全范围大。双嘧达莫可以抑制血小板黏附和聚集，增强前者的抗凝作用。此复方制剂主要对保护和改善心脑血管和神经有作用。随着研究的深入，发现它的临床应用范围不断扩大。现在已经有关于对临床其他科疾病的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种注射用银杏达莫的制备方法及质量控制方法。

银杏达莫原料药中含有银杏叶提取物、双嘧达莫和辅料，本发明涉及银杏叶提取物制备和复方制剂的制备方法。银杏叶提取物的有效成份主要是黄酮类化合物，为了达到静脉注射的要求，申请人先通过聚酰胺处理的方法精制银杏叶提取物，再经过工艺制备银杏达莫并用一次升华干燥法制备冻干粉来达到复方静脉注射的要求。并且申请人制定了银杏叶提取物的内控质量标准。

本发明中复方制剂的药理作用为：①血流动力学方面：双向调节血管张力，纠正病理性毛细血管高渗透性，改善水肿；②自由基方面：抗氧化，清除自由基，保护血管内皮细胞，抑制基底膜增厚；③血液动力学方面：特异性拮抗PAF活性，同时抑制ADP、TXA2，双重阻断血小板聚集；抑制中性粒细胞、血小板的趋化和聚集，增加红细胞变形能力，降低全血粘度；④神经保护方面：保护神经细胞，加强神经传导，加快神经递质更新；⑤糖代谢方面：调节葡萄糖代谢及糖原的合成与分解。

本发明中复方制剂的毒理研究结果为：大鼠长期毒性实验表明，3个剂量组(人用量的125、62.5及31.25倍)腹腔注射给药30天，未见毒性反应。

本发明中复方制剂的临床研究应用情况：注射用银杏达莫为心脑血管扩张药，具有扩张冠状动脉、脑血管、微小动脉，抑制血小板聚集，提高cGMP浓度的作用。其水溶性强、起效时间快、作用显著、副作用少、不良反应罕见，使用安全性高。临床上适用于预防和治疗冠心病、血栓栓塞性疾病、糖尿病并发症、突发性耳聋、偏头痛、椎基底动脉供血不足等疾病中得到越来越广泛的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

注射用银杏达莫的制备方法，按下列重量配比称取原料药：银杏叶提取物适量(含银杏总黄酮5.0g)，双嘧达莫2.0g，甘露醇100.0g，注射用水5000ml；先取聚酰胺颗粒放入乙醇中浸泡处理除杂，将除杂处理好的聚酰胺装柱，将银杏叶提取物样品液与聚酰胺按体积比1∶0.5～2上聚酰胺柱，待银杏叶提取物有效成份吸附在聚酰胺柱上后，反复用纯净水洗聚酰胺柱，直到纯净水洗液呈无色，再用60～80％乙醇洗聚酰胺柱，直至乙醇洗脱液进行盐酸-镁粉反应呈阴性，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩成稠膏，真空减压干燥，粉碎即得。在洁净室中称取相当于5.0g银杏总黄酮的经处理符合针用标准的银杏叶提取物，置于已灭菌的容器中，加入注射用水4000ml，水浴加热使溶解，滤过，加入甘露醇100.0g，并调节pH值，加入0.2％的767型针用活性炭，60℃保温，搅拌15分钟，用无菌抽滤装置滤过脱炭；称取双嘧达莫2.0g，加入注射用水500ml，用1mol/L的盐酸调节pH值使溶解，加入0.1％的767型针用活性炭，搅拌30分钟，用无菌抽滤装置滤过脱炭，将两部分药液合并，补充注射用水至定量(含银杏总黄酮1mg/ml，双嘧达莫0.4mg/ml)，检测样品含量、pH合格后再经0.22μm微孔滤膜终端滤过后分装于10ml的钠钙管制注射剂瓶中，每瓶灌装5ml，低温下冷冻干燥，轧盖即可。

注射用银杏达莫的质量控制方法，其特征在于：

一、鉴别

(1)取本品银杏精制提取物0.1g，加甲醇溶解，再向溶液中加入少量镁粉振摇，再滴加2～3滴浓盐酸，呈红色至紫红色；

(2)在含量测定项下记录的色谱图中，供试品峰的保留时间应与对照品峰的保留时间一致；

二、检查

(1)水分不得过5.0％(中国药典2000版一部附录IX H第一法)

(2)溶液澄清度取本品适量，加水制成1％的水溶液，溶液应澄清；

(3)有关物质：

树脂：取本品约0.1g，加水10ml使溶解，取5ml，置分液漏斗中，加氯仿10ml振摇提取，依法测定(中国药典2000年版一部附录IX S)，应符合规定；

蛋白质：取本品0.1g，加水10ml使溶解，取2ml，置试管中，滴加鞣酸试液1～3滴，不得产生浑浊(中国药典2000年版一部附录IX S)；

鞣质：取本品0.1g，加水10ml使溶解，取1ml，依法测定(中国药典2000年版一部附录IX S)，应符合规定；

草酸盐：取本品0.1g，加水10ml使溶解，用稀盐酸调节pH值至1～2，滤去沉淀，调节pH值至5～6，取2ml，加3％氯化钙溶液2～3滴，放置10分钟，不得出现浑浊或沉淀(中国药典2000年版一部附录IX S)；

钾离子：精密称取本品0.12g，依法测定(中国药典2000年版一部附录IX S)，应符合规定；

重金属：不得过百万分之二十(中国药典2000年版一部附录IX E)

砷：不得过百万分之二(中国药典2000年版一部附录IX F)

炽灼残渣：不得过0.5％(中国药典2000年版一部附录IX E)

三、含量测定

总黄酮醇苷照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VI D)测定；

色谱条件与系统适用性试验  用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.4％磷酸溶液(50∶50)为流动相；检测波长为360nm；理论板数按槲皮素峰计算应不低于2500；山柰素峰与异鼠李素峰的分离度应大于1.5；

对照品溶液的制备  分别精密称取经五氧化二磷干燥过夜的槲皮素对照品，加甲醇制成每1ml分别含0.06mg的溶液，作为对照品溶液；

供试品溶液的制备  精密称取本品35mg，加甲醇-25％盐酸(4∶1)的混合溶液25ml，置水浴中加热回流30分钟，迅速冷却至室温，转移至50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.5μm)滤过，取滤液，即得；

测定法  分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，其中最大的三个高峰，按保留时间依次为槲皮素(Q)、山萘素(K)、异鼠李素(I)，以外标法计算Q、K、I，以下式计算总黄酮醇苷的含量；

Q×2.50+K×2.59+I×2.44

本品以干燥品计，含总黄酮醇苷不得少于24.0％；

萜类内酯照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VI D)测定；

色谱条件与系统适用性试验  用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以正丙醇-四氢呋喃-水(1∶15∶84)为流动相；用蒸发光散检测器检测；理论板数按白果内酯峰计算应不低于2500；白果内酯峰与银杏内酯C峰的分离度应大于1.5；

对照品溶液的制备分别精密称取白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C对照品适量，加甲醇制成每1ml各含2mg、1mg、1mg的混合溶液，即得；

供试品溶液的制备精密称取本品约150mg，加水10ml，置水浴中温热使溶散，加2％盐酸溶液2滴，用醋酸乙酯振摇提取4次(15ml、10ml、10ml、10ml)，合并提取液，用5％醋酸钠溶液20ml洗涤，分取醋酸钠液，再用醋酸乙酯10ml洗涤；合并醋酸乙酯提取液及洗液，用水洗涤2次，每次20ml，分取水洗液，用醋醋乙酯10ml洗涤，合并醋酸乙酯液，回收醋酸乙酯至干，残渣用丙酮溶解并转移至5ml量瓶中，加丙酮至刻度，摇匀，即得；

测定法分别精密吸取对照品溶液10μl、15μl，供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程分别计算白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C的含量，即得；

本品以干燥品计，含萜类内酯以白果内酯(C₁₅H₁₈O₈)、银杏内酯A(C₂₀H₂₄O₉)、银杏内酯B(C₂₀H₂₄O₁₀)和银杏内酯C(C₂₀H₂₄O₁₁)的含量之和计，不得少于6.0％；

银杏酸  照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VI D)测定；

色谱条件  用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇∶3％醋酸溶液(92∶8)为流动相，流速1.0ml/min，柱温40℃，检测波长310nm；

标准曲线的绘制  准确称取银杏酸对照品，用无水甲醇溶解，定容后，用0.45μm(What man)一次性针头过滤器过滤，得银杏酸标准溶液；分别吸取不同体积进样，每个进样量平等测定3次，求其峰面积的平均值；以峰面积为横坐标，银杏酸进样量为纵坐标作图，得标准曲线；

样品的预处理和银杏酸含量的测定准确称取水溶性银杏叶提取物，加入石油醚300ml于85℃Soxhlet提取器中提取12h，提取液减压浓缩至干，用石油醚溶解后，于5ml量瓶中定容，进样20μl，计算银杏酸峰的总面积，根据标准曲线求出银杏酸的总含量；

本品银杏精制提取物以干燥品计，银杏酸含量应低于1ppm。

附图说明

附图1本发明的制作流程示意图。

具体实施方式

银杏叶提取物的精制：

(1)聚酰胺的处理

用95％乙醇浸泡聚酰胺颗粒2小时，回流乙醇提取物，每次2～3小时，直至提取液透明并达到蒸干后无残渣。

(2)标准液和样品液的制备

银杏酸标准溶液的制备  准确称取银杏酸对照品，用无水甲醇溶解并定量稀释至2μg/ml，0.45μm过滤，取续滤液作为银杏酸标准溶液。

样品溶液的制备  准确称取水溶性银杏叶提取物20g，加入石油醚300ml于85℃索氏提取器中提取12小时，提取液减压浓缩至干，用无水甲醇溶解后，转移至10ml量瓶中并稀释至刻度，摇匀，0.45μm过滤，取续滤液作为样品溶液。

银杏酸的测定  分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品溶液的色谱图中如显银杏酸峰，峰面积不得大于对照品溶液的主峰面积(百万分之一)。

取银杏叶提取物加注射用水加热使溶解，配成含银杏总黄酮约为1.5mg/ml，将样品液滤过至澄清备用。

(3)最大吸附量考察

取已处理好的聚酰胺50ml，装入层析柱(φ3cm)，加样品液，第1次上样10ml，用100ml水洗脱，收集洗脱液，以总黄酮为指标，用盐酸-镁粉反应进行定性检测(盐酸-镁粉反应：将流出液蒸干，残渣加甲醇溶解，再向甲醇溶液中加入少量镁粉振摇，再滴加2～3滴盐酸，即呈现颜色反应)，以后每次加样5ml，用100ml水洗脱，收集洗脱液，以盐酸-镁粉反应进行检测，结果当上样液总体积为50ml时盐酸-镁粉反应呈阳性，故选择聚酰胺与样品液体积比为1∶1。

(4)洗脱液醇浓度的选择

根据黄酮类化合物的性质及相关资料，申请人选择60％、70％至80％醇浓度进行洗脱，至盐酸-镁粉反应呈阴性时，再分别用95％乙醇洗脱，收集洗脱液进行盐酸-镁粉反应。结果用60％洗脱再用95％乙醇洗脱后收集洗脱液用盐酸-镁粉反应检测呈阳性。表明60％乙醇洗脱不完全。70％和80％乙醇洗脱后再用95％乙醇洗脱后盐酸-镁粉反应呈阴性。表明70％和80％乙醇已将有效成分洗脱完全，考虑到节约生产成本，申请人选择70％乙醇作为洗脱醇浓度。

(5)银杏叶提取物的精制工艺

将处理好后的聚酰胺装柱，将银杏叶提取物样品液(约含总黄酮1.5mg/ml)与聚酰胺按体积比1∶1上样，反复用纯净水洗聚酰胺柱，至纯净水洗液呈无色，再用70％乙醇洗柱，收集乙醇洗脱液，至洗脱液进行盐酸-镁粉反应呈阴性，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩成稠膏，80℃真空减压干燥，粉碎，按内控标准检验，合格后，备用。

[6]注射用银杏达莫的制备

在洁净室中称取相当于5.0g银杏总黄酮的经处理符合针用标准的银杏叶提取物，置于已灭菌的容器中，加入注射用水4000ml，水浴加热使溶解，滤过，加入甘露醇100.0g，并调节pH值，加入0.2％的767型针用活性炭，60℃保温，搅拌15分钟，用无菌抽滤装置滤过脱炭；称取双嘧达莫2.0g，加入注射用水500ml，用1mol/L的盐酸调节pH值使溶解，加入0.1％的767型针用活性炭，搅拌30分钟，用无菌抽滤装置滤过脱炭，将两部分药液合并，补充注射用水至定量(含银杏总黄酮1mg/ml，双嘧达莫0.4mg/ml)，检测样品含量、pH合格后再经0.22μm微孔滤膜终端滤过后分装于10ml的钠钙管制注射剂瓶中，每瓶灌装5ml，低温下冷冻干燥，轧盖即可。

质量标准控制方法：

一、鉴别

(1)取本品0.1g，加甲醇溶解，再向溶液中加入少量镁粉振摇，再滴加2～3滴浓盐酸，呈红色至紫红色。

(2)在含量测定项下记录的色谱图中，供试品峰的保留时间应与对照品峰的保留时间一致。

二、检查

(1)水分不得过5.0％(中国药典2000版一部附录IX H第一法)

(2)溶液澄清度取本品适量，加水制成1％的水溶液，溶液应澄清。

(3)有关物质：

树脂：取本品约0.1g，加水10ml使溶解，取5ml，置分液漏斗中，加氯仿10ml振摇提取，依法测定(中国药典2000年版一部附录IX S)，应符合规定。

蛋白质：取本品0.1g，加水10ml使溶解，取2ml，置试管中，滴加鞣酸试液1～3滴，不得产生浑浊(中国药典2000年版一部附录IX S)。

鞣质：取本品0.1g，加水10ml使溶解，取1ml，依法测定(中国药典2000年版一部附录IX S)，应符合规定。

草酸盐：取本品0.1g，加水10ml使溶解，用稀盐酸调节pH值至1～2，滤去沉淀，调节pH值至5～6，取2ml，加3％氯化钙溶液2～3滴，放置10分钟，不得出现浑浊或沉淀(中国药典2000年版一部附录IX S)。

钾离子：精密称取本品0.12g，依法测定(中国药典2000年版一部附录IX S)，应符合规定。

重金属：不得过百万分之二十(中国药典2000年版一部附录IX E)

砷：不得过百万分之二(中国药典2000年版一部附录IX F)

炽灼残渣：不得过0.5％(中国药典2000年版一部附录IX E)

三、含量测定

总黄酮醇苷  照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VI D)测定。

色谱条件与系统适用性试验  用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.4％磷酸溶液(50∶50)为流动相；检测波长为360nm。理论板数按槲皮素峰计算应不低于2500。山柰素峰与异鼠李素峰的分离度应大于1.5。

对照品溶液的制备  分别精密称取经五氧化二磷干燥过夜的槲皮素对照品，加甲醇制成每1ml分别含0.06mg的溶液，作为对照品溶液。

供试品溶液的制备  精密称取本品35mg，加甲醇-25％盐酸(4∶1)的混合溶液25ml，置水浴中加热回流30分钟，迅速冷却至室温，转移至50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.5μm)滤过，取滤液，即得。

测定法  分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，其中最大的三个高峰，按保留时间依次为槲皮素(Q)、山萘素(K)、异鼠李素(I)，以外标法计算Q、K、I，以下式计算总黄酮醇苷的含量。

Q×2.50+K×2.59+I×2.44

本品以干燥品计，含总黄酮醇苷不得少于24.0％。

萜类内酯照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VI D)测定。

色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以正丙醇-四氢呋喃-水(1∶15∶84)为流动相；用蒸发光散检测器检测。理论板数按白果内酯峰计算应不低于2500。白果内酯峰与银杏内酯C峰的分离度应大于1.5。

对照品溶液的制备分别精密称取白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C对照品适量，加甲醇制成每1ml各含2mg、1mg、1mg的混合溶液，即得。

供试品溶液的制备精密称取本品约150mg，加水10ml，置水浴中温热使溶散，加2％盐酸溶液2滴，用醋酸乙酯振摇提取4次(15ml、10ml、10ml、10ml)，合并提取液，用5％醋酸钠溶液20ml洗涤，分取醋酸钠液，再用醋酸乙酯10ml洗涤。合并醋酸乙酯提取液及洗液，用水洗涤2次，每次20ml，分取水洗液，用醋醋乙酯10ml洗涤，合并醋酸乙酯液，回收醋酸乙酯至干，残渣用丙酮溶解并转移至5ml量瓶中，加丙酮至刻度，摇匀，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液10μl、15μl，供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程分别计算白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C的含量，即得。

本品以干燥品计，含萜类内酯以白果内酯(C₁₅H₁₈O₈)、银杏内酯A(C₂₀H₂₄O₉)、银杏内酯B(C₂₀H₂₄O₁₀)和银杏内酯C(C₂₀H₂₄O₁₁)的含量之和计，不得少于6.0％。

银杏酸照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VI D)测定。

色谱条件  用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇∶3％醋酸溶液(92∶8)为流动相，流速1.0ml/min，柱温40℃，检测波长310nm。

标准曲线的绘制  准确称取银杏酸对照品，用无水甲醇溶解，定容后，用0.45μm(What man)一次性针头过滤器过滤，得银杏酸标准溶液。分别吸取不同体积进样，每个进样量平等测定3次，求其峰面积的平均值。以峰面积为横坐标，银杏酸进样量为纵坐标作图，得标准曲线。

样品的预处理和银杏酸含量的测定准确称取水溶性银杏叶提取物，加入石油醚300ml于85℃Soxhlet提取器中提取12h，提取液减压浓缩至干，用石油醚溶解后，于5ml量瓶中定容，进样20μl，计算银杏酸峰的总面积，根据标准曲线求出银杏酸的总含量。

本品以干燥品计，银杏酸含量应低于1ppm。

Claims (1)

1.注射用银杏达莫的制备方法，处方由银杏叶提取物、双嘧达莫、甘露醇、注射用水组成，其特征在于：(1)、按下列重量配比称取原料药：含银杏总黄酮5.0g的银杏叶提取物，双嘧达莫2.0g，甘露醇100.0g，注射用水5000ml；(2)、银杏叶提取物的精制先取聚酰胺颗粒放入乙醇中浸泡处理除杂，将除杂处理好的聚酰胺装柱，将银杏叶提取物样品液与聚酰胺按体积比1∶0.5～2上聚酰胺柱，待银杏叶提取物有效成份吸附在聚酰胺柱上后，反复用纯净水洗聚酰胺柱，直到纯净水洗液呈无色，再用60～80％乙醇洗聚酰胺柱，直至乙醇洗脱液进行盐酸-镁粉反应呈阴性，收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩成稠膏，真空减压干燥，粉碎即得；(3)、注射用银杏达莫的制备在洁净室中称取相当于5.0g银杏总黄酮的经处理符合针用标准的银杏叶提取物，置于已灭菌的容器中，加入注射用水4000ml，水浴加热使溶解，滤过，加入甘露醇100.0g，并调节pH值，加入0.2％的767型针用活性炭，60℃保温，搅拌15分钟，用无菌抽滤装置滤过脱炭；称取双嘧达莫2.0g，加入注射用水500ml，用1mol/L的盐酸调节pH值使溶解，加入0.1％的767型针用活性炭，搅拌30分钟，用无菌抽滤装置滤过脱炭，将两部分药液合并，补充注射用水至其中含银杏总黄酮1mg/ml，双嘧达莫0.4mg/ml，检测样品含量、pH合格后再经0.22μm微孔滤膜终端滤过后分装于10ml的钠钙管制注射剂瓶中，每瓶灌装5ml，低温下冷冻干燥，轧盖即可。